CN107849129A - 一种促细胞程序性坏死抗体及其应用 - Google Patents

一种促细胞程序性坏死抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种促细胞坏死的抗体，该抗体在TNF存在下，会使细胞发生程序性坏死。因此，所述抗体的抑制剂可用于治疗炎性疾病。进一步地，本发明提供所述促细胞坏死抗体在炎性疾病预后中的应用。

Description

一种促细胞程序性坏死抗体及其应用 技术领域
本发明涉及生物医药领域；具体地说，本发明涉及一种抗-TNF单克隆抗体及其在炎症治疗中的应用。
背景技术
肿瘤坏死因子α(TNF)是由各种细胞，主要是巨噬细胞和T细胞分泌的多功能细胞因子。TNF通过TNF受体1和2(TNFR1和TNFR2)行使多种生物学功能，其中TNFR2仅仅在免疫细胞中起到支持TNFR1的作用(1-3)。
许多TNF功能主要涉及三种胞内事件：1)刺激转录因子核因子kappa B(NF-κB)，从而导致细胞激活和细胞因子产生；2)诱导细胞凋亡的外部途径；和3)诱导坏死。这些活性的胞内信号传导途径共有一些组分但导致不同的结果：NF-κB激活导致促炎细胞因子分泌和细胞存活及激活；凋亡是细胞死亡的状态，特征在于胱冬酶-3激活、核断裂、在早期含有完整的细胞膜、炎性反应很少或没有；然而，坏死是细胞死亡的另一机制，其中没有胱冬酶-3的激活，细胞膜的完整性受损。坏死导致刺激强烈免疫和炎性反应的胞内物质释放(4,5)。在凋亡条件下，抑制胱冬酶可导致一种程序性细胞死亡形式，其发生时具备坏死的特征，称为“程序性坏死”(6-11)。由于此类程序性坏死是炎性过程，因此在临床上可能与诸如类风湿性关节炎、克罗恩病和银屑病等疾病相关。然而，迄今为止，尚未鉴定到触发这些疾病中程序性坏死的因子。
通过直接靶向TNF分子(单克隆抗体)或用作假受体的拮抗剂来中和TNF使得炎性疾病的治疗得到根本性变革(12)，但完全阻断TNF功能可能导致威胁生命的副作用，例如感染和肿瘤(13)。TNF在很多炎症性疾病(例如风湿性关节炎、炎性肠炎、牛皮癣等等)中都起很重要的病理作用。临床上用抗TNF治疗炎症性疾病非常有效。抗TNF的生物制剂包括：能够中和TNF的抗TNF的单克隆抗体，游离的TNF受体等等。抗TNF制剂的市场是每年150亿美元。
虽然有以上成果，但炎性疾病中细胞和组织破坏的机制仍未知：诱导NF-κB是促生存的，不直接导致细胞死亡-实际上，发现NF-κB信号在炎性肠病中阻止凋亡(14)。据信，凋亡是抑制炎症的(15)。程序性坏死可能是炎症和细胞/组织破坏的可能机制，但缺乏人临床相关性的证据。例如，在非病毒炎性致病机理中，不知道靶细胞外的何种因子触发程序性坏死(14,16)。显然，鉴定这些因子为诊断和治疗许多炎性疾病提供了生物标志物。
在脓毒症病人中，TNF显著升高并且与病情严重程度呈正相关。然而传统的TNF阻断型抗体和游离的受体均不能有效治疗脓毒症，暗示有其他因素或因子在致病过程中协同TNF起关键作用。
因此，本领域急需调控、甚至逆转细胞坏死的物质手段，从而能治疗炎性疾病。
发明内容
本发明的目的在于提供调控、甚至逆转细胞坏死的物质手段，从而能治疗炎性疾病。
在第一方面，本发明提供一种抗体的轻链可变区，所述轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO:1所示的CDR1，
SEQ ID NO:3所示的CDR2，和
SEQ ID NO:5所示的CDR3。
在优选的实施方式中，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在第二方面，本发明提供一种抗体的轻链，所述的轻链具有本发明第一方面所述的轻链可变区和轻链恒定区。
在优选的实施方式中，所述轻链的恒定区如SEQ ID NO:9所示。
在优选的实施方式中，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在优选的实施方式中，所述轻链的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
在第三方面，本发明提供一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:12所示的CDR1，
SEQ ID NO:14所示的CDR2，和
SEQ ID NO:16所示的CDR3。
在优选的实施方式中，所述重链可变区具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在第四方面，本发明提供一种抗体的重链，所述的重链具有本发明第三方面所述的重链可变区和重链恒定区。
在优选的实施方式中，所述的重链恒定区如SEQ ID NO:20所示。
在优选的实施方式中，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
在优选的实施方式中，所述重链的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示。
在第五方面，本发明提供一种抗体，所述抗体具有：
(1)本发明第一方面所述的轻链可变区；和/或
(2)本发明第三方面所述的重链可变区。
在优选的实施方式中，所述抗体具有：本发明第二方面所述的轻链；和/或本发明第四方面所述的重链。
在第六方面，本发明提供一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)本发明第一方面所述的轻链可变区的序列、本发明第二方面所述的轻链的序列、本发明第三方面所述的重链可变区的序列、本发明第四方面所述的重链的序列、或本发明第五方面所述的抗体的序列；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在优选的实施方式中，所述的标签序列包括6His标签。
在第七方面，本发明提供一种抗体，所述抗体特异性结合序列QLVVPSE。
在第八方面，本发明提供一种多核苷酸，它编码选自下组的多肽：
(1)本发明第一方面所述的轻链可变区的序列、本发明第二方面所述的轻链的序列、本发明第三方面所述的重链可变区的序列、本发明第四方面所述的重链的序列、或本发明第五方面或第七方面所述的抗体的序列；或
(2)本发明第六方面所述的重组蛋白。
在第九方面，本发明提供一种载体，含有本发明第八方面所述的多核苷酸。
在优选的实施方式中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
在第十方面，本发明提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明第九方面所述的载体或基因组中整合有本发明第八方面所述的多核苷酸。
在第十一方面，本发明提供一种药物组合物，它含有：
(i)本发明第一方面所述的轻链可变区、本发明第二方面所述的轻链、本发明第三方面所述的重链可变区、本发明第四方面所述的重链、本发明第五方面或第七方面所述的抗体、本发明第六方面所述的重组蛋白；以及
(ii)任选的药学上可接受的载体。
在优选的实施方式中，所述的药物组合物为注射剂型。
在优选的实施方式中，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤、细菌或病毒感染的药物。
在第十二方面，本发明提供一种促细胞坏死抗体抑制剂，其特征在于，所述促细胞坏死抗体抑制剂能够结合本发明第五方面或第七方面所述的抗体。
在优选的实施方式中，所述促细胞坏死抗体抑制剂是突变型TNF，与野生型TNF相比，所述突变型TNF能够结合本发明第五方面或第七方面所述的抗体，但不结合TNF受体。
在优选的实施方式中，所述突变型TNF如SEQ ID NO:23所示。
在第十三方面，本发明提供本发明第十一方面所述的促细胞坏死抗体抑制剂在制备治疗炎性疾病的药物中的用途。
在优选的实施方式中，所述炎性疾病包括类风湿性关节炎、克罗恩病、银屑病、脓毒症。
在第十四方面，本发明提供QLVVPSE所示片段或本发明第五方面或第七方面所述抗体在制备诊断炎性疾病或对炎性疾病患者进行分型的检测试剂中的用途。
在优选的实施方式中，所述用途是对患者进行分型。
在第十五方面，本发明提供一种诊断炎性疾病或对炎性疾病患者进行分型的检测试剂盒，其装有：
a.作为标准品的QLVVPSE所示片段或本发明第五方面或第七方面所述抗体；和
b.以QLVVPSE所示片段或本发明第五方面或第七方面所述抗体作为标准品检测来自患者的样品中是否存在特异性结合QLVVPSE的抗TNF自身抗体或与本发明第五方面或第七方面所述抗体竞争的抗TNF自身抗体的使用说明书。
在第十六方面，本发明提供一种对炎性疾病进行预后的方法，所述方法包括检测患者体液中是否存在与本发明第五方面或第七方面所述抗体竞争抗原结合位点的抗体。
在优选的实施方式中，所述体液包括血液或关节液。
在优选的实施方式中，所述炎性疾病包括类风湿性关节炎、克罗恩病、银屑病、脓毒症。
在第十七本方面，本发明提供一种炎性疾病的治疗方法，其特征在于，给予有此需要的患者促细胞坏死抗体抑制剂，所述促细胞坏死抗体抑制剂能够结合本发明第五方面或第七方面所述的抗体。
在优选的实施方式中，所述促细胞坏死抗体抑制剂是突变型TNF，与野生型TNF相比，所述突变型TNF能够结合本发明第五方面或第七方面所述的抗体，但 不结合TNF受体。
在优选的实施方式中，所述突变型TNF如SEQ ID NO:23所示。
在优选的实施方式中，所述炎性疾病包括类风湿性关节炎、克罗恩病、银屑病、脓毒症。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示从33株单克隆抗体中筛选能够结合TNF的单抗，其中ELISA试验证明244-12结合TNF最强；
图2显示本发明的抗体244-12与TNF结合不影响TNF与细胞表面受体结合，其中“Merge”表示合并，“alone”表示仅有抗体244-12；
图3显示本发明的抗体244-12在两个细胞株都阻断TNF引起的细胞凋亡(即活性胱冬酶-3表达)。其中，上图是L929细胞(小鼠成纤维细胞瘤细胞)；下图是C28I2细胞(软骨细胞)；
图4显示本发明的抗体244-12与TNF引起L929细胞坏死。图中纵坐标表示细胞凋亡(活性胱冬酶-3)；横坐标表示细胞坏死(细胞膜完整性破坏)。其中，TNF引起细胞凋亡(上图右)；加入对照抗体M26(阻断TNF结合受体)，L929细胞存活(中图右)；加入244-12与TNF，L929细胞坏死(下图右)；
图5显示本发明的抗体244-12+TNF引起的坏死可以被Nec-1抑制。其中，244-12+TNF加入Nec-1后(上图右)，细胞坏死又转变成细胞凋亡。说明细胞坏死是通过信号传导，即程序性坏死。
图6，其中6A显示突变的TNF(TNF-mu)能够结合本发明抗体244-12及关节炎病人(SF002和SF045)关节液中的抗体；6B显示突变的TNF(TNF-mu)能够逆转TNF加单抗244-12引起的程序性坏死；左一图：L929细胞:活细胞–93.1％(左下象限)；左二图：单独TNF：细胞凋亡-78.1％(左上象限)；左三图：TNF+244-12：细胞坏死-34.9％(右下象限)；左四图：TNF+244-12+TNF-mu：细胞逆转回凋亡–71.3％(左上象限)；
图7显示类风湿性关节炎患者滑液中的自身抗体触发程序性坏死；
图8显示脓毒症病愈患者(5人)与死亡患者(19人)中与本发明抗体244-12竞争抗原结合位点的抗体平均水平。二者相差非常显著。P<0.01；
图9是pNIC28Bsa4载体的示意图，其中显示了与克隆可表达相关的重要组成部分。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现抗体可以引起程序性坏死，具体地说，本发明人发现抗体244-12在TNF存在下，将TNF-诱导的凋亡转为程序性坏死。继而发现部分炎症病人如关节炎、脓毒症病人体内存在类似的引起程序性坏死的自身抗体，且这部分病人病情明显加剧。因此，通过不结合TNFR1的突变型TNF阻断患者的自身抗体可以治疗炎症但不产生严重的副作用。在此基础上完成了本发明。
本文所述的凋亡或细胞凋亡是指细胞程序性死亡，即，细胞通过信号传导的死亡。其特征在于细胞萎缩、细胞核断裂、但细胞膜完整。由于细胞膜完整而且凋亡的细胞很快被巨噬细胞吞噬，因此细胞凋亡不引起炎症。
本文所述的坏死或细胞坏死是指细胞受外力破坏而死亡，其特征在于细胞破碎，胞膜破坏而不完整。坏死时细胞释放出很多炎性物质比如核酸、尿酸、HMGB1等等，因此会引起炎症反应。
本文所述的程序性坏死或细胞程序性坏死是指细胞通过信号传导的死亡。其特征在于细胞破碎，细胞膜破坏而不完整。同上述细胞坏死一样，在程序性坏死过程中，坏死细胞释放出很多炎性物质，例如核酸、尿酸、HMGB1等等，因此会引起炎症反应。
TNF及其功能
TNF是主要由巨噬细胞和T细胞分泌的多功能细胞因子。其通过TNF受体1和2(TNFR1和TNFR2)行使多种生物学功能，包括刺激转录因子核因子kappa B(NF-κB)；诱导细胞凋亡的外部途径；和诱导坏死。
在大多数情况中，TNF刺激细胞主要激活NF-κB以供细胞存活。凋亡和坏死仅在NF-κB途径受抑制时触发(24)。有人提出TNF刺激膜结合复合物I(25)，其启动NF-κB激活但不启动凋亡/坏死。然而，如果NF-κB激活受阻止，TNF刺激其靶细胞在胞质中形成第二复合物(复合物II)，其将信号途径导向细胞死亡。
目前的所有研究强调TNF-TNFR1结合后的下游结果。然而，没有在可能导致观察到不同细胞功能的TNF-TNFR1相互作用的水平上研究过微妙的分子基础。常规的概念一般是，TNF-TNFR1结合足以启动所有的TNF功能，包括刺激NF-κB和诱导细胞死亡。
本发明的抗体
在本文中，“本发明的抗体”、“本发明的单克隆抗体”、“244-12”具备相同的含义，是指能够结合TNF，特别是能够特异性结合序列QLVVPSE的抗体。
本发明的单抗是一种能引起程序性坏死的单抗。该单抗不仅能结合TNF而且 形成的抗原抗体复合物能够进一步结合TNF细胞膜表面受体促进细胞程序性坏死。这种坏死是可以被Necrostatin-1抑制的。
此外，本发明的单抗包括特异性结合QLVVPSE的抗TNF的抗体，或者能与244-12竞争的抗体，这些抗体在TNF存在下，例如增加的情况下，也会加重炎症反应。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗体重链；抗体轻链。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determining region,CDR)”可互换使用。
如本文所用，术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。
在具体的实施方式中，本发明的抗体的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：SEQ ID NO:1所示的CDR1，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；SEQ ID NO:3所示的CDR2，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；和，SEQ ID NO:5所示的CDR3，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
在一优选例中，所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
在本发明的优选的实施方式中，所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻链恒定区。
在一优选例中，所述轻链的恒定区如SEQ ID NO:9所示。
在一优选例中，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在一优选例中，所述轻链的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
在具体的实施方式中，本发明抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQ ID NO:12所示的CDR1，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；SEQ ID NO:14所示的CDR2，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；和，SEQ ID NO:16所示的CDR3，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。
在一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示。
在具体的实施方式中，本发明的抗体的重链包含以上所述的重链可变区和重链恒定区。
在一优选例中，所述的重链恒定区如SEQ ID NO:20所示。
在一优选例中，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
在一优选例中，所述重链的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示。
在具体的实施方式中，本发明的抗体具有：
(1)以上所述的轻链可变区；和/或
(2)以上所述的重链可变区。
在一优选例中，所述抗体具有：SEQ ID NO:10所示的轻链；和/或SEQ ID NO:21所示的重链。
在以上所述抗体的基础上，本发明提供一种重组蛋白及其编码多核苷酸，所述的重组蛋白具有：
(i)以上所述的轻链可变区的序列、以上所述的轻链的序列、以上所述的重链可变区的序列、以上所述的重链的序列、或以上所述的抗体的序列；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。
在以上所述重组蛋白的基础上，本发明提供一种载体，含有所述重组蛋白的编码多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
在进一步的实施方式中，本发明提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有上述载体或基因组中整合有所述重组蛋白的编码多核苷酸。
通过对正常人、关节炎患者、脓毒症死亡患者、脓毒症存活患者的血清样本进行分析，本发明人发现人体内有类似的引起细胞程序性坏死的自身抗体存在。而且这类自身抗体可以竞争性的抑制本发明的单克隆抗体244-12与TNF的结合。图7显示了一个代表性患者(图中，SF8代表患者，其他相似患者也有同样结果；SF4代表阴性对照)；而且这些患者的血清或关节液与TNF共同作用可以引起细胞坏死(图7)。本发明人发现，有些患者体内含有抗全长的TNF蛋白的自身抗体TNF，如果不能与244-12竞争结合位点，则不引起细胞程序性坏死。这些能与244-12竞争结合位点的自身抗体与病情的轻重有较好的相关性，这可能是导致炎症加重的原因之一。
因此，在另一方面，本发明提供了检测能引起程序性坏死的抗TNF自身抗体的方法。该方法包括检测患者体内是否存在特异性结合QLVVPSE的抗TNF的自身抗体；或者检测患者体内是否存在能与本发明的单克隆抗体244-12竞争的抗TNF的自身抗体；如果存在特异性结合QLVVPSE的抗TNF的自身抗体，或者所检测的自身抗体能与244-12竞争，则这些自身抗体可能会在TNF存在下，例如增加的情况下加重炎症反应。在检测患者体内是否存在特异性结合QLVVPSE的抗 TNF的自身抗体；或者是否存在能与本发明的单克隆抗体244-12竞争的抗TNF的自身抗体后，可对患者进行分型，例如预后较好的患者或预后不佳的患者。
鉴于本发明的教导，本领域技术人员知晓QLVVPSE所示片段或本发明的抗体可以用作标准品来检测患者的样品中是否存在特异性结合QLVVPSE的抗TNF自身抗体或与本发明抗体竞争的抗TNF自身抗体；进而诊断患者是否具有炎性疾病以及对炎性疾病的患者进行分型。
进一步地，本发明提供一种诊断炎性疾病或对炎性疾病患者进行分型的检测试剂盒，其装有：
a.作为标准品的QLVVPSE所示片段或本发明的抗体；和
b.以QLVVPSE所示片段或本发明作为标准品检测来自患者的样品中是否存在特异性结合QLVVPSE的抗TNF自身抗体或与本发明抗体竞争的抗TNF自身抗体的使用说明书。
本发明进一步提供一种对炎性疾病进行预后的方法，包括检测患者体液中是否存在与本发明抗体竞争抗原结合位点的抗体。在具体的实施方式中，所述体液包括血液或关节液。在优选的实施方式中，所述炎性疾病包括类风湿性关节炎、克罗恩病、银屑病、脓毒症。
基于以上发现，本发明的抗体的拮抗剂、抑制剂或中和物质可以治疗、减轻、缓解炎性疾病，例如类风湿性关节炎、克罗恩病和银屑病。例如，在具体的实施方式中，能够结合244-12或与其类似抗体，例如炎性疾病体内的类似抗体，但不结合TNF受体的突变型TNF，或者本发明抗体244-12或与其类似抗体的特异性抗体能逆转244-12引起的坏死。
本发明还提供了炎性疾病的治疗方法，包括给予有此需要的患者促细胞坏死抗体抑制剂，所述促细胞坏死抗体抑制剂能够结合本发明的抗体。在优选的实施方式中，所述促细胞坏死抗体抑制剂是本发明抗体244-12或与其类似抗体的特异性抗体。
在一优选例中，所述促细胞坏死抗体抑制剂是突变型TNF，与野生型TNF相比，所述突变型TNF能够结合促细胞坏死抗体，但不结合TNF受体。
在一优选例中，所述突变型TNF的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示(突变：S162F,Y163H)。
此外，由于本发明的抗体244-12在TNF存在下能够引起细胞程序性坏死，而这种坏死会引起炎症并招徕免疫细胞引起特异性的免疫反应，因此，本发明的抗体可以用来治疗肿瘤或者病毒细菌感染。
基于此，本发明还提供一种药物组合物，它含有：
(i)以上所述的轻链可变区、以上所述的轻链、以上所述的重链可变区、以上所述的重链、以上所述的抗体、以上所述的重组蛋白；以及
(ii)任选的药学上可接受的载体。
本发明的主要优点在于：
1.本发明人首次发现，抗体可以引起细胞的程序性坏死；
2.本发明人的成果具备显著的临床意义；
3.本发明的抗体可用于检测与其竞争抗原结合位点的抗体，而消除这些自身抗体可能会治疗、缓解或减轻炎症反应；
4.由于本发明抗体与TNF能够引起细胞程序性坏死，而且这种坏死会引起炎症并招徕免疫细胞引起特异性的免疫反应，因此可以用来治疗肿瘤或者病毒细菌感染。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明实施例中所用的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。
材料与方法
患者
患者由Nuffield Orthopaedic Centre Oxford的风湿病诊所募集，所有样品保存在-80℃直至分析。作为治疗性关节穿刺术的一部分，滑液从炎性疾病患者的膝关节吸取。根据1987美国风湿病学院或2010ACR/EULAR分类标准定义类风湿性关节炎；其它炎性关节病基于临床和X光照相标准诊断。所有风湿病患者呈风湿病因子血清反应阳性，具有中等疾病活性。在捐献者知情同意下，完全按照国家和制度伦理要求(COREC number COREC06/Q1606/139)收集获得的样品和/或数据。
细胞系、TNF和肽
小鼠纤维肉瘤L929细胞和人淋巴细胞Jurkat A3细胞购自美国模式培养物保藏所(ATCC,Manassas,VA)。人C28I2软骨细胞由Mary B.Goldring博士提供。人SaOs-2成骨细胞购自Sigma。TNF购自Immunotools(德国)。
凋亡和坏死试验
在含或不含20μM z-VAD-FMK(R&D Systems,明尼阿波利斯,明尼苏达州)或20μM Necrotatin-1(PeproTech,Rocky Hill,新泽西州)的TNF(Immunotools,Friesoythe,德国)或TNF肽存在下，温育细胞过夜(或温育图中所示的时间)。在一 些实验中，TNF与细胞和所示浓度的单克隆抗体或滑液共培养。根据生产商手册的指导，利用活/死细胞染色试剂盒(Invitrogen,Paisley,英国)染色细胞，利用cytofix/cytoperm固定/透化溶液试剂盒(BD Pharmingen,牛津,英国)固定。然后利用FITC-偶联的抗-胱冬酶-3抗体(Cell Signaling Technology,Danvers,马萨诸塞州,美国)作胞内染色。用CyAn流式细胞仪(Beckman Coulter,Fullerton,加利福尼亚州)获取细胞，利用Flowjo(Tree Star Inc.Ashland,俄勒冈州)分析数据。
TNF细胞毒性试验
在有或没有放线菌素D(2-10μg/ml)(Sigma)存在下，将贴壁L929细胞(100μl,4x105/ml)与TNF在37℃、5％CO2下温育过夜。吸出所有上清液后，将50μl 0.05％结晶紫加入各孔以染色活细胞。洗去结晶紫后，测定贴壁细胞的活力。
NF-κB试验
收集在所示时间用TNF或其肽处理的Jurkat A3细胞(图1B和2A)，用含有蛋白酶混合物抑制剂(Sigma)的RIPA裂解缓冲液(Cell Signaling Technology,Danvers,马萨诸塞州,美国)裂解。通过SDS-PAGE分析细胞提取物，然后印迹到硝酸纤维素膜(Amersham Life Science,英国)，再采用化学发光法，利用IκB抗体(Cell Signaling Technology,Danvers,马萨诸塞州,美国)检测。
透射电子显微术
在一些实验中，细胞与肽温育后，加工细胞以供透射电子显微术检测(由Oxford Brooks University提供的服务)。简言之，用PBS配制的2.5％戊二醛固定细胞，在1％四氧化锇中作后固定。采用乙醇梯度脱水后，将样本包埋在TAAB'Premix'环氧树脂中(中等硬度)。用RMC PT-PC超薄切片机，以金刚石刀切割约60nm厚的切片，用200目未包衣(清洁的)铜网收集，用乙酸铀酰和柠檬酸铅染色，并利用Hitachi H-7650TEM以120Kv检测。
核DNA断裂
或者，除了利用活/死染色试剂盒和抗-胱冬酶-3抗体(BD)，用DAPI(Vector Laboratories,Burlingame,加利福尼亚州,美国)染色一些细胞。然后用荧光显微镜观察它们。
THP-1-X蓝NF-κB试验
THP-1-X蓝Nf-κB报道细胞获自invivoGen(San Diego,CA92121)。细胞与所示浓度的TNF-α肽温育。LPS和可溶性TNF-α是阳性对照。收集细胞培养上清液，按照生产商的使用说明书检测NF-κB。
ELISA
筛选单克隆抗体/抑制试验
4℃，用2μg/ml TNF包被ELISA平板过夜，或在37℃包被2小时，然后在37℃与单克隆抗体温育1小时。与HRP偶联的第二抗体用于检测反应。对于抑制试验，将TNFR1或滑液与单克隆抗体一起加入。
TNF结合TNFR1
如下所示通过ELISA测试TNFR1与TNF的结合：4℃，用1.5μg/ml TNF或mTNF-HA包被ELISA平板过夜，或在37℃包被2小时。37℃与TNFR1(1μg/ml)温育2小时后，与抗-TNFR1或抗-HA抗体再温育两小时，加入与HRP偶联的第二抗-小鼠IgG抗体，30分钟，然后加入其底物以供检测。显色，并利用Wallace Victor2 1420多标记计数器(PerkinElmer,Massachusetts,马萨诸塞州,美国)在OD 450nm下检测。
L929细胞免疫荧光显微术
室温下，将20ng/ml的TNF与2μg/ml的mAb M26或244-12温育1小时。TNF/M26或TNF/244-12的混合物在冰上与生长在盖玻片上的L929细胞再温育15分钟。用4％低聚甲醛(PBS配制)固定细胞10分钟，用含0.5％BSA和0.1％冷水鱼明胶的磷酸盐缓冲液阻断15分钟，然后再与家兔抗-TNFR1抗体(Abcam)温育1小时。用PBS洗涤细胞，然后与偶联于Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 568(Invitrogen)的相关第二抗体温育。然后用Gelvatol/DABCO(Sigma-Aldrich)安装PBS-洗涤的样本。用DAPI(Sigma-Aldrich)复染DNA。利用Nikon Eclipse 80i，以60x通过荧光显微术分析所有样品。利用Hamamatsu照相机，以NIS-Elements AR3.0软件获取图像。
实施例
实施例1.单克隆抗体244-12的制备及其结合表位的鉴定
发明人通过常规方法制备了33株单克隆抗体，并检验所制得的单克隆抗体与TNF的结合情况，其中，ELISA试验证明单克隆抗体244-12结合TNF最强。
随后，发明人鉴定了单克隆抗体244-12的结合表位，为QLVVPSE。
实施例2.单克隆抗体244-12将TNF相关凋亡转为程序性坏死
发明人研究了单克隆抗体(mAb)244-12对TNF功能的影响。
首先，图2中的共聚焦显微镜照片显示单克隆抗体244-12结合TNF并不影响TNF结合TNF受体。在共聚焦显微镜下，TNF受体染红色，244-12染绿色。其中，上图显示当有TNF存在时，绿色与红色重叠(黄色)，说明244-12与TNF及TNF受体重叠；下图显示没有TNF时，只有红色，说明244-12不能直接结合到细胞表面。
随后，发明人观察到TNF刺激L929细胞引起细胞凋亡(活性胱冬酶-3表达)，而当加入单抗244-12时，细胞凋亡受到抑制(活性胱冬酶-3抑制)。图3显示单克隆抗体244-12在两个细胞株，L929细胞(小鼠成纤维细胞瘤细胞，上图)和C28I2细胞(软骨细胞，下图)都阻断TNF引起的细胞凋亡(即，活性胱冬酶-3表达)。
然而，出乎意料的是，当单克隆抗体244-12加入TNF与L929细胞中时，虽然凋亡被抑制，但是细胞却发生了坏死。图4显示抗体244-12与TNF引起L929 细胞坏死。其中，TNF引起细胞凋亡(上图右)；加入对照抗体M26(阻断TNF结合受体)，L929细胞存活(中图右)；加入244-12与TNF，L929细胞坏死(下图右)。
发明人经过进一步研究证明，244-12+TNF引起的坏死是通过信号传导的。图5显示本发明的抗体244-12+TNF引起的坏死可以被Nec-1抑制。其中，244-12+TNF加入Nec-1后，细胞坏死又转变成细胞凋亡(上图右)。说明细胞坏死是通过信号传导，即程序性坏死。
实施例3.类风湿性关节炎患者滑液中的自身抗体触发程序性坏死
我们意外的发现，在一些未经治疗的风湿性关节炎或骨关节病的患者关节液中存在着很高的抗体(图7A)。这些抗体可以与244-12竞争抗原结合位点(图7B)。这些含有抗体的关节液能够引起细胞程序性坏死(图7C)。
其中，图7A显示在一些关节炎病人的关节液存在抗TNF的自身抗体。患者SF8的关节液含有很高的自身抗体。7B显示自身抗体与244-12竞争TNF结合点。在244-12与TNF结合试验(ELISA)中加入SF8关节液，则244-12与TNF结合被抑制。7C显示SF8关节液在TNF存在下引起程序性坏死。TNF引起L929细胞凋亡(上图右)，当加入SF8关节液，细胞转变成程序性坏死(中图右)。而对照关节液SF4则不引起坏死(下图右)。
发明人又观察了24位脓毒症患者，14位患者检测出与244-12竞争抗原结合位点的抗体，另外10位患者不含类似的抗体。14位含有与244-12竞争抗原结合位点的抗体的患者虽经精心护理和治疗，仍然全部死亡。而其它10位患者有5位死亡，另外5位在2-3周后痊愈出院(结果见表一)。死亡患者中抗体水平非常显著地高于病愈组(p<0.01)(图8)。
实施例5.在大肠杆菌中表达和纯化人TNF-α突变体
1.TNFa突变体S86F/Y87H的克隆。
根据氨基酸序列设计了突变体的编码DNA序列(SEQ ID NO:24)，为了利于克隆，在TNF突变体DNA的5’端添加TACTTCCAATCCATG，3’端添加TATCCACCTTTACTGTTA序列。以上DNA由GeneArt公司在人工合成后，用T4DNA聚合酶和dCTP处理30分钟。pNIC28Bsa4载体为牛津大学结构生物学实验室惠赠，载体中与克隆可表达相关的重要组成部分如图9所示。pNIC28Bsa4用BsaI酶切1小时后用1％琼脂糖凝胶电泳分离线性化的载体并用T4DNA聚合酶和dGTP处理30分钟。两种T4DNA聚合酶处理产物混合后，转化DN5α感受态，铺板挑去单克隆培养。菌液PCR鉴定阳性菌落。
2.TNFa突变体S86F/Y87H的表达
抽取阳性菌落的质粒DNA转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单菌落接种到LB培养液中并于37℃过夜培养后，用LB培养液以1:100的比例过夜稀释培养物并 37℃震荡培养至OD600＝1.0后，降温到18℃并加入0.2mM的IPTG进行蛋白的诱导表达，继续于18℃震荡培养16小时后，于4000rpm离心，收集菌体，并用Tis-HCL,250mM NaCl,5mM咪唑，pH 8.0重悬(每克湿菌用5毫升缓冲液)。
3.TNFa突变体S86F/Y87H的纯化
用超声法裂解细胞，15000rpm离心收集含目的蛋白的上清，使其通过Ni-NTA柱(每升细菌培养液获得的蛋白用1毫升的Ni-NTA柱进行纯化)，含有组氨酸标记单链重叠肽可以结合到柱子上，经过充分的洗涤(用相当于50倍Ni-NTA柱体积的缓冲液，洗涤液＝Tis-HCL,250mM NaCl,pH 8.0,15mM咪唑,pH 8.0)洗涤去掉杂蛋白后，TNFa突变体S86F/Y87H用5倍的Ni-NTA柱体积的洗脱液(Tis-HCL,100mM NaCl,300mM咪唑,pH 8.0含有咪唑的洗脱缓冲液)洗脱下来。
4.将Ni-NTA纯化的TNFa突变体S86F/Y87H后缓冲液置换成PBS。
用PBS平衡好PD10柱，加入2.5毫升的Ni-NTA纯化的蛋白，待蛋白溶液全部进入PD10柱柱后，加入3.5毫升PBS，洗脱获得在PBS中的TNFa突变体。
实施例5.突变型TNF逆转程序性坏死
发明人发现：突变型TNF(TNF-mu)能够结合244-12及关节液中的抗体(如图6A所示)；突变型TNF(TNF-mu)可以将程序性坏死逆转(如图6B所示)。
实施例6.
本发明人进一步研究了特异性结合其它TNF分子及片段的抗体，并没有发现这些抗体具有将TNF相关凋亡转为程序性坏死的效果；
此外，本发明人以全长TNF进行筛选，发现仅特异性结合QLVVPSE的抗体具有将TNF相关凋亡转为程序性坏死的效果。
讨论
基于我们的发现，我们提出炎症的新治疗策略。程序性坏死的机制涉及自身抗体和TNF。程序性坏死是炎症的原因之一。目前炎性疾病的治疗策略之一是通过抑制TNF来阻断TNF。该策略对于抑制炎症有效，但可能导致危及生命的副作用，例如TB或淋巴瘤。本发明人提出通过突变型TNF(不结合TNFR1)阻断自身抗体的替代方法。该策略的结果可能是在降低炎性负荷的同时抑制程序性坏死，但将TNF维持在原位，从而阻止肿瘤和严重的感染，例如TB。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
参考文献
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Claims (15)

  1. 一种抗体的轻链可变区，所述轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
    SEQ ID NO:1所示的CDR1，
    SEQ ID NO:3所示的CDR2，和
    SEQ ID NO:5所示的CDR3。
  2. 一种抗体的轻链，所述的轻链具有权利要求1所述的轻链可变区和轻链恒定区。
  3. 一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
    SEQ ID NO:12所示的CDR1，
    SEQ ID NO:14所示的CDR2，和
    SEQ ID NO:16所示的CDR3。
  4. 一种抗体的重链，所述的重链具有权利要求3所述的重链可变区和重链恒定区。
  5. 一种抗体，所述抗体具有：
    (1)权利要求1所述的轻链可变区；和/或
    (2)权利要求3所述的重链可变区。
  6. 一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
    (i)权利要求1所述的轻链可变区的序列、权利要求2所述的轻链的序列、权利要求3所述的重链可变区的序列、权利要求4所述的重链的序列、或权利要求5所述的抗体的序列；以及
    (ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
  7. 一种抗体，所述抗体特异性结合序列QLVVPSE。
  8. 一种多核苷酸，它编码选自下组的多肽：
    (1)权利要求1所述的轻链可变区的序列、权利要求2所述的轻链的序列、权利要求3所述的重链可变区的序列、权利要求4所述的重链的序列、或权利要求5或7所述的抗体的序列；或
    (2)权利要求6所述的重组蛋白。
  9. 一种载体，含有权利要求8所述的多核苷酸。
  10. 一种遗传工程化的宿主细胞，它含有权利要求9所述的载体或基因组中整合有权利要求8所述的多核苷酸。
  11. 一种药物组合物，它含有：
    (i)权利要求1所述的轻链可变区、权利要求2所述的轻链、权利要求3所述的重链可变区、权利要求4所述的重链、权利要求5或7所述的抗体、权利要求6所述的重组蛋白；以及
    (ii)任选的药学上可接受的载体。
  12. 一种促细胞坏死抗体抑制剂，其特征在于，所述促细胞坏死抗体抑制剂能够结合权利要求5或7所述的抗体。
  13. 如权利要求11所述的促细胞坏死抗体抑制剂在制备治疗炎性疾病的药物中的用途。
  14. QLVVPSE所示片段或权利要求5或7所述抗体在制备诊断炎性疾病或对炎性疾病患者进行分型的检测试剂中的用途。
  15. 一种诊断炎性疾病或对炎性疾病患者进行分型的检测试剂盒，其装有：
    a.作为标准品的QLVVPSE所示片段或权利要求5或7所述抗体；和
    b.以QLVVPSE所示片段或权利要求5或7所述抗体作为标准品检测来自患者的样品中是否存在特异性结合QLVVPSE的抗TNF自身抗体或与权利要求5或7所述抗体竞争的抗TNF自身抗体的使用说明书。
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