CN107828670A - 一种长枝木霉菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种长枝木霉菌株及其应用，该菌株命名为长枝木霉菌（Trichoderma longibrachiatum）TL1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年4月10日，保藏编号为CCTCC NO.M2017184。该菌株对榨菜根肿病的病原真菌具有较强的抑制作用，尤其对涪陵榨菜的根肿病具有显著的防治作用。使用长枝木霉菌TL1发酵液对榨菜幼苗进行浸泡处理，榨菜的发病率降低了26%，产量提高了31%，具有良好的经济效益。并且该菌株的发酵工艺简单、稳定，因此，在农业方面有很大的应用前景。

Description

一种长枝木霉菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物防治领域，具体涉及一种长枝木霉菌株及其应用。

背景技术

茎瘤芥（榨菜）(Brassica juncea var. tumidaTsen et Lee)为十字花科芸薹属芥菜种叶芥亚种大叶芥变种的变种，以其为原料加工而成的榨菜已成为我国人民喜爱的一种腌菜，作为重要的榨菜产地——涪陵也因此而闻名全国。目前在榨菜的栽培过程中，根肿病和病毒病已经严重的制约了榨菜的生产，其中根肿病发病最为严重，导致榨菜产量和品质的严重下降，发病严重的地块将不再适宜榨菜的栽培，严重威胁榨菜产业的可持续发展。

根肿病（clubroot）是由芸苔根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woron)引起的专性寄生芸薹属作物的一种土传病害，对十字花科蔬菜严重危害，而且极难防治。根肿菌主要侵染十字花科蔬菜根部，形成大小不一、光滑或龟裂粗糙的肿瘤，后期被土壤杂菌感染而腐烂。而植株的地上部份生长迟缓、缺水蔫萎，后期基部叶片逐渐变黄死亡，严重时整株桔死。随着十字花科作物栽培种类增加及面积的扩大、商品种子和南北菜的交流调运、土壤的酸化，近年来我国十字花科根肿病发生面积逐年扩大，严重程度逐年加重，根肿病已成为制约我国十字花科蔬菜生产可持续发展的主要病害之一。

根肿病主要由土壤中的休眠孢子，通过菜株病苗、水流携带菌土等方式传播。该菌可在土壤中长期存活、其休眠孢子囊可在零下20℃长期存活，一旦田间发病，难以消除，田块若继续种植十字花科作物，其发病程度连年增加。由于榨菜属于低温生长植物，其生长期一般在10月到次年的2月，气温在0-20℃左右，同一时期缺少十字花科以外的代替品种，因此十字花科植物连作也是导致该病害猖獗的主要原因。目前生产上主要应用农药进行防治，但由于该病作用于榨菜根部，加之涪陵地区土壤粘度较大、石块较多、冬季雨水充足使土壤的翻耕难度大，农药难以发挥作用，同时长期大量使用农药会使根肿病病原菌产生抗药性，农药残留破坏环境污染等问题也日益突出。因此对真菌生防作用的研究具有重大的研究意义和巨大的应用前景。

近几年来真菌被作为植物病害生物防治因子而倍受关注，如土壤中分离到的毛壳菌属（Chaetomium）对多种土传植物病原菌具有抑制作用，如球毛壳菌其抑菌机制是产生抗生素和细胞壁降解酶，油菜内生真菌球毛壳菌产生的C¹⁶鞘氨醇和植物鞘氨醇能够明显降低根肿菌休眠孢子萌发率，能够使油菜根肿病发病率从76.74%降低到20%；油菜内生真菌Heteroconium chaetospira BC2HB1能为油菜提供氮素，还能促使油菜的茉莉酸、乙烯、生长素 病程相关蛋白基因的表达，从而提高植物的系统抗病性寄生在油菜根系皮层组织内，能够抑制油菜根肿病；粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea)能够上调苯丙氨酸、茉莉酸或者乙烯合成途径的基因表达，从而提高油菜对根肿菌的抗性。但目前的生防真菌不能适应低温、高湿环境，进而不能很好的发挥抑制植物病原真菌的作用。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种长枝木霉菌株及其应用，主要针对涪陵榨菜低温、高湿和石块较多的生长环境，解决现有生防真菌和农药对涪陵榨菜根肿病防治效果不佳的问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明提供了一种长枝木霉菌株，该菌株命名为长枝木霉菌株（Trichoderma longibrachiatum）TL1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2017年4月10日，保藏编号为CCTCC NO. M2017184。

本发明的长枝木霉菌株（Trichoderma longibrachiatum）TL1，属于半知菌门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，木霉属。菌落在PDA培养基上生长较快，从图2可以看出，菌落开始为白色，后被大部分绿色产孢区所覆盖，同心环纹初清晰，后变得不显著。

电镜观察可以看出（图1）分生孢子卵圆形，绿色，孢子壁光滑，没有刺突，菌落老熟时暗绿色。分生孢子梗对生在中轴上，顶端不膨大，上生分生孢子团。

上述的长枝木霉菌株TL1可以用来防治榨菜根肿病的病原菌。具体使用方法为：首先培养长枝木霉菌株TL1制备发酵菌液，再将截根处理的榨菜幼苗浸泡在所述发酵菌液中，浸泡时间为30~60min，然后将处理后的榨菜幼苗移栽到田间；所述发酵菌液中菌丝浓度为5~6mg/mL，无孢子。

一种榨菜根肿病防治剂，其有效成分为长枝木霉菌株TL1。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明通过实验证实本发明的长枝木霉菌TL1对榨菜根肿病具有良好的防治效果，并研究了具体应用时的最佳使用方法，实验结果表明，在榨菜幼苗进行田间移栽前，使用长枝木霉菌TL1发酵液对榨菜幼苗进行浸泡处理，榨菜的发病率降低了37%，产量提高了31%，具有良好的经济效益。并且该菌株的发酵工艺简单、稳定，因此，在农业方面有很大的应用前景。

2、本发明在榨菜根肿病发病程度较轻或不发病的田间榨菜根表分离得到长枝木霉菌TL1，该菌株能够耐低温、高湿环境，对温度、pH等自然环境条件的适应范围广，对不良环境的耐受力强，能维持生态平衡，适应病害生态系统，而且耐突变，因此完全能够适应涪陵地区冬季低温、高湿和土壤粘度较大、石块较多的不良环境，并且生长繁殖良好。长枝木霉菌TL1可以通过产生小分子的抗生素和大分子的抗菌蛋白或胞壁降解酶类来抑制榨菜根肿病病原菌的生长、繁殖和侵染，还可以通过快速生长和繁殖夺取水分和养分、占有空间、消耗氧气等，以削弱和排除同一生境中的榨菜根肿病病原菌，另外还可以诱导榨菜产生防御反应，因此长枝木霉菌TL1不仅能直接抑制榨菜根肿病病原菌的生长和繁殖，而且能诱导榨菜产生自我防御系统获得抗病性，因此降低了榨菜的发病率和提高了榨菜的产量。解决了现有的生防真菌和农药对涪陵榨菜根肿病的病原菌防治效果不佳的问题。

附图说明

图1为长枝木霉菌TL1的分生孢子电镜扫描图；

图2为长枝木霉菌TL1的菌落形态图；

图3为榨菜幼苗经长枝木霉菌TL1发酵液处理对榨菜根肿病发病指数的影响；

图4为榨菜幼苗经长枝木霉菌TL1发酵液处理对榨菜产量的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。

一、分离纯化

从重庆市涪陵区采取榨菜根肿病发病程度较轻或不发病的田间榨菜根系上的土样，称取5g土样于100mL的无菌水中，在涡旋仪上混匀后分别进行梯度稀释至10^-2、10^-3、10^-4和10^-5，再分别取1ml稀释液涂布于长枝木霉菌选择性培养基[氨苄青霉素（80mg/L）]表面上，25℃倒置培养5-7天。挑取培养基中长出的肉眼可见的真菌菌落，移入PDA平板上，恒温培养，直至纯化得到单菌落，然后将得到的单菌落转移至PDA培养基的试管斜面上保存。

PDA培养基制备方法是：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH自然(不控制pH值)。新鲜马铃薯去皮后切成边长0.5cm的小方块，加水1000mL，煮沸后再加热10分钟，然后，用四层纱布过滤，得土豆营养液，补足水至1000mL，分装至预先称有琼脂粉的三角瓶中，121℃灭菌20min后制成PDA斜面或平板。

选择性培养基：在PDA培养基中添加氨苄青霉素，使氨苄青霉素的终浓度为80mg/L。

二、菌种鉴定

用CTAB法提取本发明菌株TL1的DNA，然后采用通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增rDNA的ITS区域(核糖体-DNAITS)，得到的目的片段大小约为630bp并进行测序分析，具体序列如SEQ ID NO.1所示。测序结果在NCBI上进行BLAST比较，与文献报道Trichoderma longibrachiatum菌株核糖体DNAITS序列相似率达99％，亲缘关系最近。通过 ITS 序列分析鉴定表明本发明菌株为长枝木霉菌（Trichoderma longibrachiatum），命名为长枝木霉菌TL1。

实施例

将上述保存的长枝木霉菌TL1接种于PDA平板培养基上，25℃培养7d后，在平板上加入少量PDA液体培养基刮取菌丝，接种于200ml的PDA液体培养基上，25℃、150rpm培养36h后，用无菌水稀释10倍，每100mL中菌丝质量为0.53g，得到长枝木霉菌TL1发酵液，备用。

在榨菜幼苗移栽时期（10月15日~25日）挑取600棵长势一致的榨菜幼苗进行截根处理，并随机分为两组，一组为对照组（无菌水），一组为实施例组（长枝木霉菌TL1发酵液），然后分别将截根后的幼苗浸泡在无菌水或长枝木霉菌TL1发酵液中处理30min，然后将处理后的榨菜幼苗移栽到田间，田间进行随机分组实验，每个小区面积6.7m²，栽植60棵榨菜。并将上述实验进行3次重复实验。

在榨菜收获时期（次年2月中下旬），统计全部成菜的榨菜产量，并计算平均值。

统计方法如下：

将榨菜根肿病严重度分级定为5级，其标准为：0级：健株。1级：侧根发病，肿瘤小而少，呈白色，对植株生长无或轻微影响，产量损失为0~5%。2级：肿瘤主要在主根中部、上、下侧根多，或侧根上肿瘤大而多，呈白色或米黄色，对植株生长有一定影响，但地上部分无明显症状，产量损失6~20%。3级：主根肿瘤大且变黑，表面粗糙龟裂，有少量侧根，地上部分生长受阻，中心叶片变为深绿色，在阳光下出现轻度萎蔫，产量损失21~35%。4级：主根肿瘤龟裂或腐烂变黑，几乎无侧根，地上部分生长严重受阻，株型矮小，叶色暗绿，菜头小且皮厚筋多，在阳光下，整株严重萎蔫，极易拔起，产量损失（不包括无实际收获价值的病株）在36%以上。

病情指数=∑（各级病株数×该病级值）/（调查总株数×最高级值）×100

如图3所示，经长枝木霉菌TL1发酵液处理后，榨菜的发病指数为0.67，而未经长枝木霉菌TL1发酵液处理，榨菜的发病指数为0.9；如图4所示，经长枝木霉菌TL1发酵液处理后，榨菜产量为14.5kg，而未经长枝木霉菌发酵液处理，榨菜产量为11.1kg。由此可见经长枝木霉菌TL1发酵液处理的榨菜的发病率降低了26%，产量提高了31%，具有良好的经济效益。经过连续两年的田间实验证实，长枝木霉菌TL1对榨菜根肿病的生防作用重复性良好。

以上实验证明，本发明长枝木霉菌TL1能在涪陵地区的低温、高湿的环境下生长良好。并且能高效的抑制涪陵榨菜根肿病的发生，具有较好的生物防治作用，且不会造成环境污染，解决了现有的生防真菌和农药对涪陵榨菜根肿病的病原菌防治效果不佳的问题。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 长江师范学院；

<120> 一种长枝木霉菌株及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 632

<212> DNA

<213> 长枝木霉菌(Trichoderma longibrachiatum)

<400> 1

ggtgaacctg cggagggatc attaccgagt ttacaactcc caaaccccaa tgtgaacgtt 60

accaatctgt tgcctcggcg ggattctctt gccccgggcg cgtcgcagcc ccggatccca 120

tggcgcccgc cggaggacca actccaaact cttttttctc tccgtcgcgg ctcccgtcgc 180

ggctctgttt tatttttgct ctgagccttt ctcggcgacc ctagcgggcg tctcgaaaat 240

gaatcaaaac tttcaacaac ggatctcttg gttctggcat cgatgaagaa cgcagcgaaa 300

tgcgataagt aatgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga acgcacattg 360

cgcccgccag tattctggcg ggcatgcctg tccgagcgtc atttcaaccc tcgaacccct 420

ccggggggtc ggcgttgggg atcggcccct caccgggccg cccccgaaat acagtggcgg 480

tctcgccgca gcctctcctg cgcagtagtt tgcacactcg caccgggagc gcggcgcggc 540

cacagccgta aaacacccca aacttctgaa atgttgacct cggatcaggt aggaataccc 600

gctgaactta agcatatcaa taagcggagg aa 632

Claims (6)

1.一种长枝木霉菌株，其特征在于，该菌命名为长枝木霉菌株（Trichoderma longibrachiatum）TL1，该菌株的保藏编号为CCTCC NO. M2017184。

2.根据权利要求1所述长枝木霉菌株，其特征在于，所述菌株的核糖体-DNA ITS序列如SEQ ID NO：1所示。

3.长枝木霉菌株的应用，其特征在于，如权利要求1所述长枝木霉菌株用于防治榨菜根肿病。

4.根据权利要求3所述长枝木霉菌株的应用，其特征在于，具体方法为：培养长枝木霉菌株TL1制备发酵菌液，再将截根处理的榨菜幼苗浸泡在所述发酵菌液中，浸泡时间为30~60min，然后将处理后的榨菜幼苗移栽到田间。

5.根据权利要求4所述长枝木霉菌株的应用，所述发酵菌液中菌丝浓度为5~6mg/mL，无孢子。

6.一种榨菜根肿病防治剂，其特征在于，其有效成分为权利要求1所述长枝木霉菌株TL1。