CN107821023B

CN107821023B - 利用丛枝菌根真菌提高铁线莲属植物总黄酮含量及产量的方法

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Publication number: CN107821023B
Application number: CN201711158378.4A
Authority: CN
Inventors: 特布沁; 李骁; 刘婷; 曹乌吉斯古楞; 王晓琴; 孙兴姣; 李红娇; 武世奎
Original assignee: Inner Mongolia Medical University
Current assignee: Inner Mongolia Medical University
Priority date: 2017-11-20
Filing date: 2017-11-20
Publication date: 2020-05-29
Anticipated expiration: 2037-11-20
Also published as: CN107821023A

Abstract

本发明属于植物用菌领域，具体涉及一种利用丛枝菌根真菌提高铁线莲属植物总黄酮含量及产量的方法，在不同氮(N)、磷(P)水平下接种摩西球囊霉(Glomus mosseae)对铁线莲属植物在生长、生理生化特性和总黄酮积累产生影响，以及利用qRT‑PCR技术分析黄酮类生物合成途径中的关键酶基因响应不同N、P水平的表达特点，发现真菌对铁线莲属植物生长和有效成分含量积累中的影响机制，为丛枝菌根真菌在药用植物栽培、资源开发利用等提供依据。

Description

利用丛枝菌根真菌提高铁线莲属植物总黄酮含量及产量的方法

技术领域

本发明属于植物用菌领域，涉及一种利用丛枝菌根真菌提高铁线莲属植物总黄酮含量及产量的方法。

背景技术

丛枝菌根真菌，即AM真菌(Arbuscular Mycorrhiza Fungi，AMF)，是自然生态系统的一个重要组成成分，其广泛分布于自然界中，可与90％高等植物形成AM共生体，即菌根。目前，已分离获得200余种AM真菌，据估计全球至少1250种。

AM真菌资源丰富，生态适应性强，存在于各种生态环境中，如干旱地区、盐碱土壤、矿区、重金属污染土壤等。另外AM真菌是一类广泛分布于土壤中的有益微生物，能与绝大多数农作物、园艺植物、果蔬作物、药用植物和牧草共生，促进植物对营养元素和水分吸收，尤其是N、P等矿质元素，改善植物的营养状况，从而影响植物的生长、诱导基因的表达和提高次级代谢产物的积累，改善其品质，同时还可提高宿主植物的抗性，使植物在逆境条件下正常生长。

黄花铁线莲(Clematis intricata Bunge)为毛茛科铁线莲属草本植物，为旱中生植物，生于山地、丘陵、低湿地、沙地及田边、路旁、房舍附近。黄花铁线莲在我国北方各省都有分布，主要分布于甘肃、河北、辽宁、内蒙古、青海、陕西、山西和河南，境外的蒙古也有分布。

黄花铁线莲是一种透骨草类药材，在中药、蒙药、藏药中作为一种重要的药用植物被利用，有抗炎和镇痛活性，且毒性很小，外用主治风湿性关节炎，四肢麻木，拘挛疼痛，牛皮癣，民间常有用鲜草捣烂外敷治疗关节、软组织肿痛。其作为蒙药“阿拉格-特木尔-敖日阳古”收载于多部蒙医药书籍中。蒙医用其干燥带花叶枝条入药，治疗寒痞、“吾雅曼”病、疮疡、寒疾、肿瘤。如在六味光明盐散中，作为主药与光明盐、蛇床子、荜拨、干姜和诃子等量配伍用于温中、破痞、治食痞和胃痞。

自上世纪90年代以来，对黄花铁线莲的活性成分进行了大量研究，并分离得到了许多化学成分，包括黄酮类、皂苷类、生物碱、有机酸、香豆素、脂肪醇和甾体化合物等，其中黄酮类化合物为主要活性成分。大量研究表明，黄酮类化合物具有清除自由基、抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗菌、抗病毒和调节免疫、防治血管硬化、降血糖等功能，此外还具有低毒的特点，因此长期以来一直是天然药物和功能性食品研究开发的热点。

长期以来，中蒙药材大多来自野生药用植物，但随着对药用植物需求的不断增加，野生药用植物已经无法满足人们对药用植物的需求，加之人工栽培技术落后、栽培措施不配套等原因，导致药用植物种质退化、质量下降、入药性质不稳定等。

发明内容

为了解决药物植物质量下降的技术问题，通过引入真菌种质资源可以解决上述问题。因为，药用植物根际土壤中存在着丰富AM真菌种质资源，其能促进药用植物的生长发育，提高药用植物次生代谢产物的积累和抗逆性，改善植物药用品质。

本发明利用盆栽试验，研究不同氮(N)、磷(P)水平下接种摩西球囊霉(Glomusmosseae)对黄花铁线莲生长、生理生化特性和总黄酮积累等特性，以及利用qRT-PCR技术分析黄酮类生物合成途径中的关键酶基因响应不同N、P水平的表达特点，探讨AM真菌对黄花铁线莲生长和有效成分含量积累中的影响机制，为丛枝菌根真菌在药用植物栽培、资源开发利用等提供依据。

本发明的目的是提供一种提高铁线莲属植物产量的方法，其特征在于，在培养基中添加丛枝菌根真菌。

进一步地，铁线莲属植物为黄花铁线莲。

进一步地，丛枝菌根真菌为摩西球囊霉(Glomus mosseae)。

本发明的再一目的是提高铁线莲属植物产量的方法，其中，不同氮磷水平下真菌均可侵染铁线莲属植物根系并形成菌根，促进黄花铁线莲总黄酮积累。

进一步地，不同氮磷水平下AM真菌均可侵染铁线莲属植物根系并形成菌根，影响可溶性蛋白、游离脯氨酸、丙二醛、过氧化物酶的含量。

其中，优选的，氮磷水平如下：施氮量在10％N～20％N；施磷量在5％P～20％P。

本发明的再一目的是提供一种提高铁线莲属植物总黄酮含量的方法，其特征在于，在培养基中添加丛枝菌根真菌，真菌侵染铁线莲属植物根系并形成菌根，促进黄花铁线莲总黄酮积累。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步描述：

图1不同氮水平下黄花铁线莲菌根侵染率的变化：A为菌丝侵染率；B为泡囊侵染率；C为总侵染率；相同的字母表明不同氮水平之间无显著性差异；

图2不同氮水平下黄花铁线莲叶绿素(A)和叶面积(B)的变化：对照组(CK)和接种组(Gm)分别进行分析；对照组(CK)用字母A，B...表示；接种组(Gm)用字母a，b…表示；相同的字母表明不同氮水平之间无显著性差异；其中“—”、“*”和“**”分别表示在同一氮水平下对照组(CK)和接种组(Gm)组间在P>0.05、P<0.05和P<0.01水平下的显著性分析；

图3不同氮水平下黄花铁线莲株高(A)和生物量(B-D)的变化：地上鲜重(B)、地下鲜重(C)和全株鲜重(D)；对照组(CK)和接种组(Gm)分别进行分析；

图4不同氮水平下黄花铁线莲生理指标的变化：可溶性蛋白(A)、游离脯氨酸(B)、丙二醛(C)和过氧化物酶(D)；对照组(CK)和接种组(Gm)分别进行分析；

图5不同氮水平下黄花铁线莲总黄酮含量的变化；对照组(CK)和接种组(Gm)分别进行分析；

图6不同氮水平下黄花铁线莲黄酮生物合成途径相关酶基因表达的变化：A为CiPAL；B为CiCHS；C为CiCHI；D为CiF3H；E为CiFLS；F为CiDFR；

图7不同磷水平下黄花铁线莲菌根侵染率的变化：A为菌丝侵染率；B为泡囊侵染率；C为总侵染率；相同的字母表明不同氮水平之间无显著性差异；

图8不同磷水平下黄花铁线莲叶绿素(A)和叶面积(B)的变化：对照组(CK)和接种组(Gm)分别进行分析；

图9不同磷水平下黄花铁线莲株高(A)和生物量(B-D)的变化：地上鲜重(B)、地下鲜重(C)和全株鲜重(D)；对照组(CK)和接种组(Gm)分别进行分析；

图10不同磷水平下黄花铁线莲生理指标的变化：可溶性蛋白(A)、游离脯氨酸(B)、丙二醛(C)和过氧化物酶(D)；对照组(CK)和接种组(Gm)分别进行分析；

图11不同磷水平下黄花铁线莲总黄酮含量的变化；对照组(CK)和接种组(Gm)分别进行分析；

图12不同磷水平下黄花铁线莲黄酮生物合成途径相关酶基因表达的变化：A为CiPAL；B为CiCHS；C为CiCHI；D为CiF3H；E为CiFLS；F为CiDFR；

图13盆栽黄花铁线莲根系AM真菌：13A为AM真菌孢子；13B为AM真菌菌丝；

图14不同氮水平下黄花铁线莲的株高：Gm为接种株，CK为未接种株。株高为接种Gm处理3个月；

图15不同磷水平下黄花铁线莲的株高：Gm为接种株，CK为未接种株。株高为接种Gm处理3个月。

具体实施方式

为了更详细地进一步阐明而不是限制本发明，给出下列实施例。

实施例1.试验材料的准备

供试黄花铁线莲种子采集于内蒙古凉城蛮汗山。供试菌种为摩西球囊霉(GlomusMosseae-Gm)，购于丛枝菌根真菌种质资源库(BGC)。

供试营养液：全氮磷的Hoagland营养液包括3mM KNO₃、2mM NH₄NO₃、0.5mM KH₂PO₄、1mM MgSO₄、0.5mM KCl、0.5mM FeC₆H₅O₇、0.0125mM H₃BO₃、0.001mM MnCl、0.001mM ZnSO₄、0.00025mM CuSO₄和0.00025mM Na₂MoO₄，pH为6.5。

试验设6个施N水平(KNO₃和NH₄NO₃)和6个施P水平(KH₂PO₄)，分别用0N、10％N、20％N、50％N、100％N、200％N和0P、5％P、10％P、20％P、50％P、100％P表示，同一施N、P水平设接种(Gm)和不接种(CK)2个处理，每个处理重复3次，试验盆随机排列。

把黄花铁线莲种子直播于塑料盆(直径为13.5cm)中，每盆装灭菌河沙，不浇灌营养液，只浇水，在温室(温度为25±3℃，光照周期为16h/8h，湿度为50-60％，光强为3000lux)中培养。10d后出苗，待苗长到有2-3片真叶时，选取生长一致的幼苗移植于培养杯(6.7×6.7×7.7cm)中，每杯1株。Gm组：于每株幼苗根部接种75个Gm孢子。CK组：正常移植，不接种Gm孢子。生长期间，分别用不同氮磷水平的Hoagland营养液进行培养，每周1次，每次5mL。6个月后收获。

实施例2.试验项目与方法

1、不同氮磷水平下接种AM真菌对黄花铁线莲生理生长指标或有效成分含量的影响

(1)叶绿素含量测定：叶绿素测定仪SPAD-502。

(2)叶面积测定：LI-3000便携式叶面积仪。

(3)株高测定：测量法。

(4)生物量(地上鲜重、地下鲜重、全株鲜重)测定：称重法。

(5)可溶性蛋白含量测定：考马斯亮蓝G-250法。

(6)脯氨酸(Pro)含量测定：酸性茚三酮法。

(7)丙二醛(MDA)含量测定：TBA法。

(8)过氧化物酶(POD)活性测定：愈创木酚比色法。

(9)黄花铁线莲总黄酮的含量测定：紫外分光光度法

2、不同氮磷水平下接种AM真菌对黄花铁线莲黄酮代谢途径相关酶基因表达的影响

参考RT-PCR获得的CiActin cDNA序列，高通量测序结果CiCHI、CiF3H、CiFLS和CiDFRcDNA序列和RACE技术获得的CiPAL、CiCHScDNA序列，利用Primerpremier 5.0软件设计q-PCR引物，要求q-PCR产物大小为100～300bp。

表1q-PCR引物序列

实施例3.不同氮水平下接种AM真菌调控黄花铁线莲生长和有效成分含量的机制研究

1、不同氮水平下黄花铁线莲菌根侵染率

本发明在不同氮水平下黄花铁线莲接种Gm处理6个月后，对黄花铁线莲根系菌根侵染情况进行观察：接种株根细胞压片结果可以明显看到菌丝和泡囊的存在，未接种株菌根侵染率为0。从图1可以看出，不同氮水平下Gm均能侵染黄花铁线莲根系并形成菌根，除0N水平以外(根系泡囊侵染率为0)(图1B)。不同氮水平下菌根侵染率不同，但在一定的氮水平范围内，根系菌丝侵染率、泡囊侵染率和总侵染率都呈现先升高后降低的趋势，都在100％N水平下以上三种侵染率最高，分别为36.0％、12.0％和48.0％，且根系菌丝侵染率在50％N和100％N处理下无显著性差异。

2、不同氮水平下接种AM真菌对黄花铁线莲生长的影响

2.1、不同氮水平下接种AM真菌对黄花铁线莲叶绿素和叶面积的影响

本发明在不同氮水平下对黄花铁线莲接种Gm处理6个月后，对黄花铁线莲叶片进行叶绿素和叶面积的测定。不同氮水平下接种Gm后均增加了黄花铁线莲叶片中叶绿素的含量(图2A)，在10％N、20％N、50％N和100％N水平下，Gm组与CK组比较，差异显著(P<0.05)；除在10％N水平下外，接种Gm后提高了黄花铁线莲叶片叶面积，增加了个体同化面积。在10％N水平下，CK组与Gm组比较，组间没有显著性差异(图2B)。

2.2、不同氮水平下接种AM真菌对黄花铁线莲株高和生物量的影响

不同氮水平下接种Gm均显著性地增加了黄花铁线莲株高、地上、地下和全株鲜重(P<0.01)。在一定的氮浓度范围内，随着氮浓度的增加，黄花铁线莲株高和地上生物量均逐渐升高，都在200％N水平下达到最高(图3A、B)，而地下和全株生物量均先升高后降低，都在100％N水平下达到最高(图3C、D)。

2.3、不同氮水平下接种AM真菌对黄花铁线莲生理的影响

可溶性蛋白在植物生长中起着关键的作用，也是表征植物生理生化特性的重要指标之一。从图4A可以看出，除在100％N和200％N水平外，Gm组的可溶性蛋白含量均高于CK组。

游离脯氨酸作为渗透调节物质，使植物保持一定的含水量与渗透压，以维持细胞的正常功能。从图4B可以看出，除0N和20％N水平下外，Gm组的脯氨酸含量均高于CK组。

丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终产物,是反映生物膜损伤程度的主要生化指标之一。从图4C可以看出，不同氮水平下Gm组的MDA含量均高于CK组，在0N和200％N水平下，Gm组的MDA含量显著高于CK组，但在其他N水平下Gm组与CK组无显著性差异。

过氧化物酶(POD)广泛存在于植物体中，一般衰老的组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，因此经常把植物组织中POD活性作为其老化的一个生理生化指标。从图4D可以看出，不同氮水平下接种Gm降低了黄花铁线莲叶片中POD活性，缓解了其衰老程度，延长了生长周期，间接地促进了植物的生长发育。

2.4、不同氮水平下接种AM真菌对黄花铁线莲有效成分含量的影响

从黄花铁线莲中分离到的的活性成分包括黄酮类、生物碱、有机酸、香豆素、脂肪醇和甾体化合物等，其中黄酮类化合物为主要活性成分，具有清除自由基、抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗菌、抗病毒和调节免疫、防治血管硬化、降血糖等功能。本发明在不同氮水平下对黄花铁线莲接种Gm处理6个月后，运用紫外分光光度法测定了黄花铁线莲总黄酮含量。

从图5可以看出，不同氮水平下接种AM真菌后均增加了接种株中总黄酮含量。在0N～20％N水平下，接种株中总黄酮含量显著高于未接种株。在50％N～200％N水平下，接种株中总黄酮含量与未接种株比较，无显著性差异。在一定的氮浓度范围内，随着氮浓度的增加，接种株总黄酮含量先升高后降低，在10％N水平下达到最高，含量为29.4mg/g；在0N～50％N水平下，未接种株总黄酮含量先升高后降低，在10％N水平时最高。不同氮水平下，未接种株总黄酮含量最高出现在100％N水平时，含量为19.8mg/g，且与接种株相比，无显著性差异。

2.5、不同氮水平下接种AM真菌对黄花铁线莲黄酮生物合成途径相关酶基因表达的影响

摩西球囊霉可侵染黄花铁线莲根系并形成菌根，提高了黄花铁线莲总黄酮含量。为了寻找AM真菌诱导黄花铁线莲特异表达的基因，从分子水平上阐明菌根作用的机制即AM真菌对黄花铁线莲基因表达的影响，并为进一步进行AM真菌诱导黄花铁线莲基因表达的分析打下基础，本发明以黄花铁线莲黄酮生物合成途径中苯丙氨酸解氨酶基因(CiPAL)、查尔酮合成酶基因(CiCHS)、查尔酮异构酶基因(CiCHI)、黄烷酮3-羟化酶基因(CiF3H)、黄酮醇合成酶基因(CiFLS)和二氢黄酮醇还原酶基因(CiDFR)为研究对象，利用q-PCR技术分析不同氮水平下AM真菌诱导黄花铁线莲黄酮生物合成途径相关酶基因特异表达的情况。

由图6可见，与未接种株相比：

在0N水平下：接种株CiPAL和CiFLS的相对表达量显著下调，其他4个基因的表达量无显著性差异；

在10％N水平下：接种株CiPAL、CiCHS、CiCHI、CiF3H和CiDFR的表达量显著上调，而CiFLS的表达量显著下调；

在20％N水平下：接种株CiCHS、CiCHI、CiF3H、CiFLS和CiDFR 5个基因的表达量都显著上调，而CiPAL的表达量上调但无显著性差异；

在50％N水平下：接种株CiPAL、CiCHS、CiCHI、CiF3H、CiFLS和CiDFR的表达量均显著下调；

在100％N水平下：CiCHI、CiF3H和CiDFR的表达量显著上调，接种株CiPAL和CiFLS的表达量显著下调，CiCHS的表达量无显著性差异；

在200％N水平下：接种株CiCHI的表达量显著上调，CiFLS的表达量显著下调，CiPAL、CiCHS、CiF3H和CiDFR的表达量无显著性差异。

总之，在不同氮水平下：接种株CiPAL的表达量除在10％N和20％N水平下上调外，其他氮水平下均下调；CiCHS和CiCHI的表达量除在50％N水平下下调外，其他氮水平下表达量均上调；而CiFLS的表达量除在20％N水平下上调外，其他氮水平下表达量均下调。

实施例4.不同磷水平下接种AM真菌调控黄花铁线莲生长和有效成分含量的机制研究

1、不同磷水平下黄花铁线莲菌根侵染率

本发明在不同磷水平下黄花铁线莲接种Gm处理6个月后，对黄花铁线莲根系菌根侵染情况进行观察：接种株根细胞压片结果可以明显看到菌丝和泡囊的存在，未接种株菌根侵染率为0。从图7可以看出，不同磷水平下Gm均能侵染黄花铁线莲根系并形成菌根，且不同磷水平下菌根侵染率不同。根系菌丝侵染率、泡囊侵染率和总侵染率都在100％P水平下最高，分别为36.0％、12.0％和48.0％。在0P～50％P范围内，根系菌丝侵染率(图7A)和总侵染率(图7C)均先升高后降低，在10％P处理下最高，其中根系菌丝侵染率在10％P和100％P处理下无显著性差异。

2、不同磷水平下接种AM真菌对黄花铁线莲生长的影响

2.1、不同磷水平下接种AM真菌对黄花铁线莲叶绿素和叶面积的影响

不同磷水平下接种Gm后均显著增加了黄花铁线莲叶片中叶绿素的含量(图8A)，在0P水平下叶片叶绿素最高；接种Gm后极显著增加了黄花铁线莲叶片叶面积(P<0.01)，在10％P水平叶片叶面积最大(图8B)。

2.2、不同磷水平下接种AM真菌对黄花铁线莲株高和生物量的影响

不同磷水平下接种Gm均显著性地增加了黄花铁线莲株高、地上、地下和全株鲜重(P<0.01)。在一定的磷浓度范围内，随着磷浓度的增加，黄花铁线莲株高、地上和地下生物量先升高后降低，都在10％P水平下最高(图9A、B、C)，而全株生物量随着磷浓度的增加逐渐升高，在100％P水平下达到最高(图9D)。

2.3、不同磷水平下接种AM真菌对黄花铁线莲生理的影响

从图10A可以看出，Gm组的可溶性蛋白与CK组相比，除100％P水平外，在其他磷水平下均显著高于CK组，而在100％P水平下Gm组与CK组无显著性差异。

从图10B可以看出，除10％P水平下外，Gm组的脯氨酸含量均高于CK组，并在一定的磷水平下具有显著性差异，而在10％P水平下Gm组与CK组无显著性差异。

从图10C可以看出，不同磷水平下Gm组的MDA含量均低于CK组。在0P和5％P水平下，Gm组与CK组差异极显著(P<0.01)，在其他P水平下，Gm组与CK组无显著性差异(P>0.05)。

从图10D可以看出，在0P和10％P水平下，接种Gm后升高了黄花铁线莲叶片中POD活性；在20P～100％P范围内，接种Gm后降低了黄花铁线莲叶片中POD活性，并具有显著性差异。

2.4、不同磷水平下接种AM真菌对黄花铁线莲有效成分含量的影响

从图11可以看出，不同磷水平下接种Gm后增加了接种株总黄酮含量。在5％P、10％P和50％P水平，接种株总黄酮含量极显著高于未接种株(P<0.01)。在0P、20％P和100％P水平下，接种株总黄酮含量与未接种株比较，无显著性差异。在0P～50％P的磷浓度范围内，随着磷浓度的增加，接种株总黄酮含量先升高后降低，在5％P和10％P水平下达到最高，分别为17.4mg/g和17.3mg/g。在不同磷水平下，接种株和未接种株总黄酮含量都在100％P水平时最高，分别为20.2mg/g和19.8mg/g，但Gm组与CK组之间无显著性差异。

2.5、不同磷水平下接种AM真菌对黄花铁线莲黄酮生物合成途径相关酶基因表达的影响

由图12可见，与未接种株相比：

在0P水平下：接种株CiPAL、CiCHS、CiCHI、CiF3H和CiDFR的表达量显著上调，而CiFLS的表达量下调，且无显著性差异；

在5％P水平下：接种株CiPAL、CiCHS、CiCHI、CiF3H和CiDFR的表达量显著上调，而CiFLS的表达量显著下调；

在10％P水平下：接种株CiPAL和CiCHS的表达量显著上调，CiCHI、CiF3H和CiDFR的表达量显著下调，CiFLS的表达量无显著性差异；

在20％P水平下：接种株CiPAL、CiCHS和CiFLS的表达量显著上调，CiCHI、CiF3H和CiDFR的表达量无显著性差异；

在50％P水平下：接种株CiCHS的表达量上调，而CiPAL、CiCHI、CiF3H、CiFLS和CiDFR的表达量显著下调；

在100％P水平下：接种株CiCHS、CiCHI和CiF3H的表达量显著上调，CiFLS的表达量显著下调，CiPAL和CiDFR的表达量无显著性差异。

总之，在不同磷水平下：接种株CiPAL的表达量除在50％P水平下下调外，其他磷水平下表达量均上调；CiCHS的表达量均显著上调；而CiFLS的表达量除在20％P水平下上调外，其他磷水平下表达量均下调。

3、结果分析：

3.1不同氮磷水平下黄花铁线莲菌根侵染率

Gm作为一种优势菌(图13)和广谱菌与大多数药用植物存在着互利互惠的共生关系。本发明中，不同氮磷水平下Gm均能侵染黄花铁线莲根系，除0N水平以外(根系孢子侵染率为0)，可能当土壤中有效氮水平过低或者无氮时，土壤中氮水平不能满足Gm孢子的正常生长发育的要求，孢子侵染率降低，甚至不侵染。而高氮磷同样会抑制AM真菌的侵染，降低侵染率。本试验中，高氮磷水平降低菌根侵染率，所以，要适量施肥以保证菌根菌正常生长，提高其侵染率。

3.2不同氮磷水平下接种AM真菌对黄花铁线莲生长的影响

叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，是植物光合产物的缔造者，其含量的高低对植物的光合作用会产生一定影响，另外叶片是植株的主要同化器官，是植物进行光合作用的场所，与植物光合作用的代表源，与植物单株产量呈现显著正相关。而对植物产量影响最大的因素是株高和植株生物量。在一定程度上株高和植物生物量反映了植株健壮程度和生长速度的快慢，所以增加株高和生物量有利于增产。本发明中，不同氮磷水平下接种AM真菌后均显著增加了黄花铁线莲株高(图14-15)、地上生物量、地下生物量、全株生物量、叶片中叶绿素的含量和叶片叶面积，增加了个体同化面积，提高了黄花铁线莲的光合效率，直接地促进了植株的生长发育，提高了黄花铁线莲的产量。

AM真菌可提高植物对磷素的吸收利用，改善低磷环境中植物的磷素营养。许多药用植物上接种菌根真菌，显著增加了植物的含磷量，消除了植株的磷胁迫状况，促进了植株生长。AM真菌对氮素也有较强吸收和输送能力。菌根化洋葱能吸收不能直接被利用的土壤氮素，根系能吸收利用根系达不到区域的NO₃ ^—和NH₄ ⁺，促进植株对氮素营养的吸收，从而促进了植株生长。

3.3、不同氮磷水平下接种AM真菌对黄花铁线莲生理特性的影响

多数可溶性蛋白是参与各种代谢的酶类，并且绝大多数是与光合作用密切相关的，尤其是调节卡尔文循环和光呼吸途径的关键酶Rubisco(最高可达60％)，因此，人们常常通过测定可溶性蛋白含量来反映植物光合作用水平。本试验中，在一定的氮磷水平下接种AM真菌后显著增加了黄花铁线莲中可溶性蛋白含量，间接地促进了黄花铁线莲的光合作用，促进了植株的生长发育，提高了黄花铁线莲的产量。

游离脯氨酸(Pro)作为渗透调节物质，使植物保持一定的含水量与渗透势，稳定蛋白的结构，以维持细胞的正常功能。本试验中，在一定的氮磷水平下接种AM真菌显著增加了黄花铁线莲中Pro含量，其作为一种渗透调节剂，使黄花铁线莲保持一定的含水量与渗透势，维持细胞的正常功能，间接地促进了黄花铁线莲的生长发育。

丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化的最终产物，其累积可作为膜脂过氧化程度的指标之一，植物体内MDA含量越多说明植物受到的伤害越大，抗逆性越弱，反之则受损越小，抗逆性越强。研究发现，丛枝菌根真菌能降低植物体内MDA的含量，提高宿主植物的抗逆性。但本试验在0N和200％N水平下，Gm组的MDA含量显著高于CK组，可能原因是在低N和高N水平，Gm与黄花铁线莲根系表皮细胞作用密切，使根系受到损伤，造成一定的胁迫引起的；不同磷水平Gm组的MDA含量均低于CK组，接种AM真菌降低了黄花铁线莲膜脂过氧化程度，间接地促进了黄花铁线莲的生长发育。

过氧化物酶(POD)广泛存在于植物体中，是生物防御活性氧伤害的重要保护酶类，能有效阻止高浓度氧的快速积累。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为POD能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，因此经常把植物组织中POD活性作为其老化的一个生理生化指标。本试验在不同氮水平和20P～100％P水平下，接种AM真菌后均降低了黄花铁线莲叶片中POD活性，缓解了其衰老程度，间接地促进了植物的生长发育。但在在0P和10％P水平下，接种Gm升高了黄花铁线莲叶片中POD活性，可能是植株在无磷和缺磷条件下，O^2-等活性氧自由基增多，POD为有效阻止高浓度氧的快速积累，AM真菌适应性升高了黄花铁线莲叶片中POD活性，来减轻活性氧自由基增加所引起的细胞伤害作用。

总之，在一定的氮磷水平下，AM真菌能够通过影响黄花铁线莲叶片的POD膜保护酶的活性和渗透调节物质脯氨酸含量，调节植株体内的酶保护系统和渗透调节系统，间接地促进植株的生长发育。

3.4、不同氮磷水平下接种AM真菌调控黄花铁线莲有效成分含量及其机制的研究

不同氮磷水平下AM真菌均可侵染黄花铁线莲根系并形成菌根，促进黄花铁线莲总黄酮积累。接种株地上部总黄酮含量均高于未接种株(除20％P水平外)，接种AM真菌提高了黄花铁线莲总黄酮含量。在不同氮磷水平下接种AM真菌后CiCHS的表达量上调，而CHS是黄酮类物质生物合成途径中的第一个限速酶和关键酶，其表达量的高低直接影响了黄酮类物质的合成与积累。CiCHS的表达量与总黄酮含量变化基本上是相符的，CiCHS的表达量上调，黄酮合成量也增加。

考虑到黄花铁线莲的药用质量，施氮量和施磷量分别在10％N～20％N和5％P～20％P时，接种AM真菌对黄花铁线莲质量和产量的影响效果最好。而且，在相应的氮磷水平下CiCHS的表达量与黄花铁线莲总黄酮积累的相关性也最强。

Claims

1.一种提高铁线莲属植物产量的方法，其特征在于，在培养基中添加丛枝菌根真菌，真菌侵染铁线莲属植物根系并形成菌根，不同氮磷水平下丛枝菌根真菌均可促进植物中总黄酮积累和影响植物中可溶性蛋白、游离脯氨酸、丙二醛、过氧化物酶的含量。

2.根据权利要求1中提高铁线莲属植物产量的方法，其中，铁线莲属植物为黄花铁线莲。

3.根据权利要求1中提高铁线莲属植物产量的方法，其中，丛枝菌根真菌为摩西球囊霉(Glomus mosseae)。

4.根据权利要求1-3中任一提高铁线莲属植物产量的方法，其中，氮水平如下：施氮量在10％N～20％N。

5.根据权利要求1-3中任一提高铁线莲属植物产量的方法，其中，磷水平如下：施磷量在5％P～20％P。

6.一种提高铁线莲属植物总黄酮含量的方法，其特征在于，在培养基中添加丛枝菌根真菌，真菌侵染铁线莲属植物根系并形成菌根，促进黄花铁线莲总黄酮积累。

7.根据权利要求6中提高铁线莲属植物总黄酮含量的方法，其中，铁线莲属植物为黄花铁线莲。

8.根据权利要求6中提高铁线莲属植物总黄酮含量的方法，其中，丛枝菌根真菌为摩西球囊霉(Glomus mosseae)。