CN101705192B

CN101705192B - 丛枝菌根真菌菌株及其在抗根结线虫中的应用

Info

Publication number: CN101705192B
Application number: CN2009102423940A
Authority: CN
Inventors: 王幼珊; 张淑彬; 邹国元; 王美菊
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2009-12-10
Filing date: 2009-12-10
Publication date: 2012-08-22
Anticipated expiration: 2029-12-10
Also published as: CN101705192A

Abstract

本发明公开了一株丛枝菌根真菌菌株及其在抗根结线虫中的应用。该菌株为丛枝菌根真菌菌株摩西球囊霉(Glomus mosseae)96022CGMCC No.3451。本发明所提供的丛枝菌根真菌菌株摩西球囊霉(Glomus mosseae)96022可以在防治植物根结线虫引起的病害中得到应用。盆栽试验的结果表明，接种丛枝菌根真菌Glomusmosseae能够明显抑制根结线虫对黄瓜根系的危害，起到了一定的防治效果，其防治效应达到了41％。

Description

丛枝菌根真菌菌株及其在抗根结线虫中的应用

技术领域

本发明涉及一株丛枝菌根真菌菌株及其在抗根结线虫中的应用。

背景技术

根结线虫(Meloidogyne)是危害最严重的植物病原线虫之一，其种类多、分布广、致病性强，与其他病原菌复合侵染更加重了对作物的危害。我国蔬菜生产上的最主要的病原线虫种类有：南方根结线虫Meloidogyne incognita、北方根结线虫M.hapla、爪哇根结线虫M.Javanica和花生根结线虫M.arenaria，其中，南方根结线虫的发生面积较大，占发生总量的77％，危害蔬菜的种类最多，已成为危害蔬菜的优势种群。特别是近几年，由于我国北方保护地蔬菜的大面积种植，为根结线虫的越冬提供了更适宜的条件，使保护地蔬菜的根结线虫病呈明显加重趋势，已成为保护地蔬菜生产的严重障碍。而目前防治根结线虫病的主要方法是采取化学方法，但是多数化学杀线虫剂具有较高的毒性，无公害蔬菜生产中不允许使用。蔬菜根结线虫病的发生严重制约了蔬菜生产，降低了农民收入。因此，探索新的防治方法特别是生物防治方法是十分必要的。

丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是土壤中普遍存在的，能与植物的根系形成互惠共生体，植物为菌根真菌的生长提供了碳源和能量，真菌则通过其外生菌丝扩大根系的吸收面积，改善植物的营养状况，包括养分和水分的吸收，特别是能提高植物吸磷能力。除了在改善植物营养方面的作用外，丛枝菌根真菌与植物病害的关系也是研究的热门领域，其中抗线虫病害的研究也是一个重要的方向。

研究认为丛枝菌根真菌与宿主植物根系形成菌根后，其根外菌丝能够在土壤中纵横方向上延伸生长，增加了根系与土壤接触的范围和表面积，从而扩大了根系的吸收范围，改善了植株对土壤养分及水分的吸收，尤其是促进磷的吸收，增补的磷元素可补偿线虫带来的损失；丛枝菌根真菌还可以减少巨大细胞的形成，抵御线虫的入侵和进一步生长发育；接种AM真菌的番茄根中，丝氨酸(serine)和苯丙氨酸(phenylManine)的含量明显增加，从而对根结线虫的活性有抑制性作用；另外，丛枝菌根真菌可能改变植物的皮层结构，使其不再适宜线虫的取食，同时它可与线虫竞争皮层的入侵位点，减少线虫的入侵(王艳玲，胡正嘉丛枝菌根真菌和植物寄生线虫病[J].生物学杂志，1999，16(6)3～5)。正是因为AM真菌的这些作用，接种AM真菌能在一定程度上减轻根结线虫对作物的危害。

发明内容

本发明的目的是提供一株丛枝菌根真菌菌株及其应用。

本发明所提供的丛枝菌根真菌菌株摩西球囊霉(Glomus mosseae)96022，已于2009年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.3451。

所述丛枝菌根真菌菌株摩西球囊霉96022 CGMCC No.3451的基本培养形态特征为：孢子在盆栽培养物中单生，或1-2很少3个丛生在孢子果中。孢子果多为不规则球形，直径240-380μm，黄棕-浅褐色，内含1-3个孢子，由松散的网状菌丝形成孢被，孢被厚大约15-23μm。孢子浅黄-黄棕色，球形或近球形，有时不规则，大小为115-160μm。孢壁3层：外壁L1无色透明，易脱落，厚约1.7-2.1μm，Melzer’s试剂中呈浅粉红色至深粉红色；L2无色透明，1.0-1.3μm；内壁L3浅黄-黄褐色，层状壁，厚2.8-4.5μm。孢子内含物为大小不等的油滴或颗粒。连孢菌丝漏斗形，连点宽20-35μm，连点处菌丝壁稍增厚；连孢菌丝底部有一厚凹隔。

本发明所提供的丛枝菌根真菌菌株摩西球囊霉96022 CGMCC No.3451的用途是其在防治植物根结线虫中的应用；优选为在防治蔬菜根结线虫中的应用，最优选为在防治黄瓜根结线虫中的应用。

所述根结线虫选自下述至少一种：南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、北方根结线虫(Meloidogyne hapla)、爪哇根结线虫(Meloidogyne Javanica)和花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)。

以本发明所提供的丛枝菌根真菌菌株摩西球囊霉96022 CGMCC No.3451为活性成分的生物菌剂也属于本发明的保护范围。需要的时候，该菌剂还可包含菌剂制备的常用载体和辅料。

本发明通过盆栽试验的方法研究了摩西球囊霉96022对根结线虫的抗性，试验结果表明丛枝菌根真菌菌株摩西球囊霉96022能够显著增强黄瓜根系对养分的吸收能力，减轻根结线虫对黄瓜植株造成的危害，对黄瓜南方根结线虫病害的防治效应达到了41％。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、丛枝菌根真菌菌株摩西球囊霉96022的分离与鉴定

菌株的分离：2006年9月从云南采集辣椒根际土壤，并从采集的土壤上分离菌株。

分离方法如下：称取50克辣椒根际土壤，放入大烧杯中加1000ml水，搅拌，静置10秒后过双层分样筛(上筛20目，下筛300目)，用水收集300目筛子上的残留物于培养皿中，在体式显微镜下挑取该菌株的单个孢子，接种于粒径均为1-2mm等体积混合的河沙与沸石混合物中，并种植高梁，培养三个月后，收获内含有该菌株孢子、被侵染根段及根外菌丝的沸石沙混合物。(河沙与沸石均能从商业途经获得。)

菌株鉴定：称取50克含有该菌株孢子的沸石沙混合物(即上述分离方法得到的培养物)，放入大烧杯中加1000ml水，搅拌，静置10秒后过双层分样筛(上筛20目，下筛300目)，用水收集300目筛子上的残留物于培养皿中，在体式显微镜下挑取该菌株的孢子，置于载玻片上，在生物显微镜下，观察孢子形态，鉴定为该种。

形态学鉴定：孢子在盆栽培养物中单生，或1-2很少3个丛生在孢子果中。孢子果多为不规则球形，直径240-380μm，黄棕-浅褐色，内含1-3个孢子，由松散的网状菌丝形成包被，孢被厚大约15-23μm。孢子浅黄-黄棕色，球形或近球形，有时不规则，大小为115-160μm。孢壁3层：外壁L1无色透明，易脱落，厚约1.7-2.1μm，Melzer’s试剂中呈浅粉红色至深粉红色；L2无色透明，1.0-1.3μm；内壁L3浅黄-黄褐色，层状壁，厚2.8-4.5μm。孢子内含物为大小不等的油滴或颗粒。连孢菌丝漏斗形，连点宽20-35μm，连点处菌丝壁稍增厚；连孢菌丝底部有一厚凹隔。

丛枝菌根真菌菌株摩西球囊霉96022已于2009年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.3451。

实施例2、丛枝菌根真菌菌株摩西球囊霉96022对根结线虫的抗性鉴定

1材料与方法

1.1试验时间和地点

试验于2008年3月-2008年8月在北京市农林科学院植物营养与资源研究所温室完成。

1.2供试材料

供试作物：黄瓜(Cucumis sativus L.)，品种为北京204。

供试丛枝菌根真菌菌种：丛枝菌根真菌菌株摩西球囊酶96022 CGMCC No.3451。

供试线虫：南方根结线虫(Meloidogyne incognita)，从房山官道乡温室大棚番茄根系挑取线虫卵，室温下孵化得到二龄幼虫。

供试基质：高温灭菌粒径均为1-2mm的等体积沸石和河沙的混合物。

1.3试验设计

本试验设不接种G.mosseae也不接种M.incognita和仅接种M.incognita的2个对照处理CK0和CK，接种G.mosseae的处理，同时又接种M.incognita的处理，共计3个处理，每个处理4个重复。随即排列，育苗时接种G.mosseae，移栽后接种根结线虫。

1.4试验方法

试验采用高温灭菌等体积混合的沸石和河沙育苗基质，育苗盘为黑色的50穴，经84消毒液消毒后备用。每穴接种G.mosseae菌剂(每克菌剂含孢子约40个)4克，不接种AM真菌对照处理加入等量的灭菌菌剂和4ml菌种滤液，以保证其它微生物的种类相一致。出苗后30天定植到装有2500克上述灭菌基质的盆中，每盆定植一株，缓苗一周后每盆接种M.incognita二龄幼虫5000条。每盆每十天一次浇Hoagland营养液100ml，其他按常规管理。Hoagland营养液组成如下：磷酸二氢钾(0.136g/L)，硝酸钾(0.505g/L)，硝酸钙(1.18g/L)，七水合硫酸镁(0.493g/L)，硼酸(2.86mg/L)四水合氯化锰(1.81mg/L)，七水合硫酸锌(0.22mg/L)，五水合硫酸铜(0.08mg/L)，钼酸(0.02mg/L)，FeEDTA(EDTA7.45mg/L与七水合硫酸铁5.57mg/L组成)。

在盆栽条件下，黄瓜在温室生长至60天收获。植株在60-70℃下烘72小时，称干重并测定植株中的氮(凯氏法)、磷(钒钼黄比色)含量。菌根侵染率采用墨水醋染色法(Horst V，Andrew PC，Urs W，et al.Ink and vinegar，a simple stainingtechnique for arbuscular-mycorrhizal fungi.Applied and Environmental Microbiology，1998，64(12)：5004～5007.)，按加权平均方法计算根系侵染率。根结指数采用翟衡的方法(翟衡，管雪强，赵春芝等，中国葡萄抗南方根结线虫野生资源的筛选[J].园艺学报，2000，27(1)27～34)，病情指数采用刘维志的方法(刘维志主编.植物线虫学研究技术[M].沈阳：辽宁科学技术出版社，1995.36～42.郑长英，曹志平，陈国康，陈云峰，杨杭.番茄嫁接防治温室根结线虫病的研究.中国生态农业学报，2005，13(4)：164-156)进行根结线虫危害分级，0级为无根结；1级为根结小于5个；2级为根结小于25个；3级为根结26-100个；4级为有大量根结但大多数不连结在一起；5级为有大量根结且许多连结在一起；6级为根结非常多且大多连在一起，根生长受到轻微阻碍；7级为大量侵染，根生长微弱；8级为大量侵染，根停滞生长。

病情指数计算公式为：

病情指数(％)＝∑(各级植株数×级值)/(调查总株数×8)×100

防治效果(孙建华，齐军山，冯欣等，Sr18生物杀线虫制剂防治黄瓜根结线虫病研究[J].华北农学报，2005，20(4)：74～78)的计算公式分别为：

防治效果(％)＝对照区病情指数-处理区病情指数/对照区病情指数×100

应用SAS软件对试验数据进行统计分析，5％水平下LSD多重比较检验各处理平均值之间的差异显著性。

2结果与分析

2.1G.mosseae 96022 CGMCC No.3451对黄瓜根系的侵染率

从表1可以看出，未接种G.mosseae真菌的两个对照处理菌根侵染率在苗期和移栽后60天均为0，说明盆栽试验条件未出现不同AM真菌间的互相干扰侵染。苗期30天，接种G.mosseae处理的菌根侵染率为22.8％，基本建立了菌根共生体。在移栽后60天时，其菌根侵染率达到了80％以上，说明AM真菌G.mosseae与黄瓜根系建立了良好的共生关系。

表1 G.mosseae在苗期30天和移栽后60天对黄瓜根系的侵染率的影响

注：应用LSD法检验处理间差异程度，同一竖栏中的不同字母

表示差异达到5％显著水平(下同)。

2.2接种G.mosseae 96022 CGMCC No.3451和根结线虫对黄瓜植株生长的影响

表2接种G.mosseae和根结线虫对黄瓜生物量和株高的影响

从表2可以看出，只接种根结线虫而未接种G.mosseae的CK处理，其株高、地上部、地下部干重均低于对照CK0，且差异显著，表明在本试验条件下，接种根结线虫对黄瓜植株造成了危害。接种G.mosseae的处理，三个指标均显著高于只接种根结线虫的CK处理，且达到了未接种根结线虫CK0处理水平。表明接种G.mosseae能够减轻根结线虫对黄瓜植株造成的危害。

2.3接种G.mosseae 96022 CGMCC No.3451和根结线虫对黄瓜植株养分吸收量的影响

表3接种G.mosseae和根结线虫对黄瓜植株吸氮、吸磷、吸钾量的影响

只接种根结线虫处理的植株吸收氮、磷、钾的量显著低于未接种G.mosseae同时未接种根结线虫的CK0对照处理，也显著低于接种G.mosseae处理(表3)，说明本试验条件下，根结线虫严重抑制了黄瓜根系对养分的吸收，从而影响了黄瓜植株的生长，同时接种G.mosseae显著增强了黄瓜根系对养分的吸收能力，从而抑制了黄瓜根结线虫的危害。

2.4接种G.mosseae 96022 CGMCC No.3451对黄瓜根结线虫根结指数的影响

从表4可见，接种G.mosseae处理的黄瓜根结指数显著低于只接种根结线虫处理，病情指数下降。表明接种AM真菌能够明显抑制根结线虫对黄瓜根系的危害，起到了一定的防治效果，其防治效应达到了41％。

表4接种G.mosseae对黄瓜根结指数的影响

试验结果表明，丛枝菌根真菌Glomus mosseae对黄瓜南方根结线虫病害具有防治效果。

在上述试验中，接种AM真菌显著减低了黄瓜根结指数，这可能是由于AM真菌在根系上侵染扩展的部位与南方根结线虫占据的部位相同，存在空间竞争，此外二者也可能存在着养分竞争；也有可能是因为形成菌根后，一些线虫不喜欢取食这类根系，由于菌根的发育常常改变植物分泌物的种类和数量，这些变化有可能改变线虫对根系的趋化性，影响其需要孵化刺激因子的线虫的孵化作用或根组织内直接受到抑制；还有可能是因为丛枝菌根真菌侵染寄主根系时激起了寄主的防御反应，提高了与抗病性有关的酶活性，从而使寄主植物对病原物的再次进攻产生快速反应，提高了抗病性。

在设施栽培中，丛枝菌根的作用不仅体现在促进植物根系的养分吸收，更主要的是增强作物抗逆性、抗病性和改善土壤理化性状方面。AM真菌可以通过改善宿主植物的营养状况，激活寄主防御机制；促进合成一些次生代谢物质或生防物质，如酚类物质、黄酮类等；通过改变植物内源激素平衡状况影响微生物区分；与病原微生物竞争寄主侵染位点和光合产物等途径来减轻植物病害，特别是土传病害。

Claims

1.丛枝菌根真菌菌株摩西球囊霉(Glomus mosseae)96022，其保藏号为CGMCCNo.3451。

2.保藏号为CGMCC No.3451的丛枝菌根真菌菌株摩西球囊霉(Glomusmosseae)96022在防治植物根结线虫中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述植物为蔬菜。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述蔬菜为黄瓜。

5.根据权利要求2-4中任一所述的应用，其特征在于：所述根结线虫选自下述至少一种：南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、北方根结线虫(Meloidogynehapla)、爪哇根结线虫(Meloidogyne Javanica)和花生根结线虫(Meloidogynearenaria)。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述根结线虫为南方根结线虫(Meloidogyne incognita)。

7.一种防治植物根结线虫的菌剂，其活性成分为权利要求1所述的保藏号为CGMCC No.3451的丛枝菌根真菌菌株摩西球囊霉(Glomus mosseae)96022。

8.根据权利要求7所述的菌剂，其特征在于：所述植物为蔬菜。

9.根据权利要求7或8所述的菌剂，其特征在于：所述根结线虫选自下述至少一种：南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、北方根结线虫(Meloidogyne hapla)、爪哇根结线虫(Meloidogyne Javanica)和花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)。

10.根据权利要求9所述的菌剂，其特征在于：所述根结线虫为南方根结线虫(Meloidogyne incognita)。