CN107760797A - 茄子品种dna指纹图谱及其建立方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种茄子品种DNA指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：茄子基因组DNA的提取；SSR引物扩增与筛选；PCR扩增及产物的电泳检测；DNA数字指纹即指纹图谱的建立；数字化二维码的建立。本发明还提供了依据上述方法建立的DNA指纹图谱及其用于茄子杂交种“沪茄五号”种子纯度鉴定的应用。本发明利用品种DNA指纹图谱和数字化二维码鉴定种子是以DNA的多态性为基础的分子标记方法，可以弥补和克服在种子纯度的形态学鉴定及同工酶、种子蛋白电泳鉴定的许多缺陷和难题；具体的，本发明利用SSR技术建立了设施栽培品种“沪茄五号”与其亲本“福‑2”、“江茄”的DNA指纹图谱及数字化二维码，可以为此品种的鉴定和纯度检测提供科学依据。

Description

茄子品种DNA指纹图谱及其建立方法和应用

技术领域

本发明属于茄子品种纯度鉴定技术领域，涉及一种茄子品种DNA指纹图谱及其建立方法和应用。

背景技术

茄子(Solanum melongena L.)是茄科茄属中的栽培种，为重要的蔬菜作物之一，其杂种一代在国内外广泛栽培。杂交种的纯度作为种子质量的关键，与育种单位和农民的利益密切相关。但是在杂交制种过程中，由于人工去雄和授粉导致茄子种子容易混杂，且一些品种之间植物形态非常接近，很难鉴别。如果通过茄子表型特征判断，鉴定周期长且耗时耗力；而DNA分子标记以其高度的个体特异性和环境稳定性，已被广泛用于作物种子的质量检测。

DNA分子标记以决定生物遗传特性的基因组DNA为研究对象，一定程度代表生物的遗传特性，且种质的性状变化与其息息相关。DNA指纹图谱是指DNA样品用特定分子标记技术处理显示出具有特定DNA片段的总称。随着生物技术的进步与发展，DNA指纹图谱技术在很多植物上得到广泛的应用。用于构建DNA指纹图谱的一种分子标记SSR(简单序列重复)，是一种基于微卫星序列发展起来的十分有效的分子标记，不仅数量丰富、广泛分布于基因组中，而且具有呈共显性、提供的信息量高，重复性好、试验成本低、操作简单、省时省力等优点。

发明内容

针对上述现有技术中的不足，本发明提供了一种茄子品种DNA指纹图谱及其建立方法和应用。

本发明的技术构思如下：

本发明利用品种DNA指纹图谱和数字化二维码鉴定种子是以DNA的多态性为基础的分子标记方法，可以弥补和克服在种子纯度的形态学鉴定及同工酶、种子蛋白电泳鉴定的许多缺陷和难题。本发明利用SSR技术建立了设施栽培品种“沪茄五号”与其亲本“福-2”、“江茄”的DNA指纹图谱及数字化二维码，可以为此品种的鉴定和纯度检测提供科学依据，进而保护生产者和使用者的合法权益。而现有技术中并未有关于该品种的此类公开报道。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种茄子品种DNA指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

S1、茄子基因组DNA的提取

采用CTAB微量法提取茄子基因组DNA并纯化；

S2、SSR引物扩增与筛选

用获得的高纯度茄子DNA为模版，利用19对SSR引物对沪茄五号杂交品种及双亲品种的DNA进行PCR扩增，筛选出多态性好的SSR引物；

S3、PCR扩增及产物的电泳检测

利用筛选出的SSR引物进行PCR扩增；PCR扩增产物通过6％的PAGE电泳分离，而后进行银染、显影、标记；

S4、DNA数字指纹即指纹图谱的建立

对扩增产物进行数据统计分析，以“1”和“0”分别代表某个等位基因位点扩增出的DNA条带的有和无，按照从上到下即由小片段向大片段的读带方向，将指纹图谱转换为由“1”和“0”组成的字符串，即构成对应品种的数字指纹。

S5、数字化二维码的建立

对亲本和杂交种的指纹图谱代码进行二维编码，录入每份供试材料的名称和指纹图谱代码信息，绘成亲本和杂交种的DNA指纹图谱二维编码。

优选的，步骤S1中CTAB微量法采用的CTAB缓冲溶液成分为：

100ml 1M TRIS，pH＝7.5；

140ml 5M NaCl；

20ml 0.5M EDTA，pH＝8；

740ml MiliQ H₂O；

20g CTAB，并在65℃水浴溶解。

优选的，PCR扩增采用10μL的反应体系，使用Vazyme的2×Taq MasterMix稀释1倍后取8.0μL，0.1μmol/L引物各0.5μL，50ng/μL模板DNA 1.0μL。反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30min，60℃退火30s(每个循环降温0.5℃)，72℃延伸45s，9个循环；94℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10min后4℃保存。

进一步的，步骤S3中，筛选得到2对特异引物SSR116和SSR171；

引物SSR116碱基序列为：

5'-TTAGAAATTTCGGAACAAAGAGA-3'；

5'-CCACATGAAACTTGGACCAATGAG-3'；

引物SSR171碱基序列为：

5'-CCTTCAATTGACC TCCCTCA-3'；

5'-GCATCTGGAAATTAGAGGCG-3'。

进一步的，步骤S4中，建立的数字指纹为：

引物SSR116：父本(福-2)为0111111，母本(江茄)为1011111，杂交种(沪茄5号)为1111111；

引物SSR171：父本(福-2)为11111111111，母本(江茄)为11000001100，杂交种(沪茄5号)为11111111111；

其中，所述数字“1”表示图谱中某个位置上有扩增带存在，数字“0”表示在某个位置上没有扩增带存在。

步骤S5中，将引物按照固定的顺序以字母的形式进行编号，再对引物扩增条带大小记录并赋值或者对引物位置顺序依次赋值，生成相应引物及其条带的带型编号；

按照固定顺序，对每份供试材料带型编号组合，生成该品种的指纹图谱代码，对双亲品种和杂交品种的DNA指纹图谱代码分别进行二维编码。

上述技术方案中，茄子杂交种“沪茄五号”及其亲本的数字化二维码，将引物按照固定的顺序进行编号(字母)，再对引物扩增条带大小记录并赋值(数值)，生成相应引物及其条带的带型编号。按照固定顺序，对每份材料带型编号组合，便生成了该品种的指纹图谱代码。由于每一条字符串都具有唯一性，可作为亲本种质的分子身份证，标识该亲本材料。并且，“沪茄五号”茄子杂交种及其亲本都有其特异的DNA指纹，可以相互区分开来。

本发明还提供了依据上述方法建立得到的DNA指纹图谱。

此外，还提供了上述DNA指纹图谱的应用，用于茄子杂交种“沪茄五号”种子纯度的鉴定。

本发明的有益效果在于：

1)本发明建立了“沪茄五号”茄子杂交种及其亲本的DNA指纹图谱和数字化二维码，公开了用DNA指纹分析技术对茄子种子鉴定的研究结果，该建立的方法开创性地从遗传本质上对茄子种子进行鉴定，因此得到的结果准确、可靠，具有法律效应。

2)利用本发明的DNA指纹图谱对“沪茄五号”茄子种子样品进行真实检测时，通过快速的微量DNA提取法提取待测样品的DNA，然后用提取的DNA作为模版，进行SSR分析，在若干小时内即可知晓该DNA指纹，因此，能够迅速地判断其真实性；便于实际推广应用。

3)此外，由于本发明的DNA指纹图谱是以图的形式表示，看起来比较直观、易懂；并且由于本发明将DNA指纹图谱转换成了数码形式，更便于计算机进行识读和分析；应用、发展前景良好。

附图说明

图1为本发明引物SSR116和SSR171的指纹图谱(其中P1为父本“福-2”；P2为母本“江茄”；F1为“沪茄五号”)。

图2(a)、图2(b)、图2(c)分别为本发明父本“福-2”、母本“江茄”和杂交品种“沪茄五号”的二维码。

具体实施方式

下面将结合本发明中实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

【实施例1】

一、材料

茄子杂交品种“沪茄五号”及其亲本“福-2”、“江茄”由上海市农业科学院园艺研究所所提供。

二、试剂

试验所用的提取DNA、PCR试剂均购自上海生工生物工程有限公司。

三、方法

3.1 DNA的提取及检测

DNA采用CTAB微量法提取步骤：

(1)2ml离心管加入离心管盖大小的新鲜叶片1～2片；

(2)加入200ul CTAB缓冲液，用研磨机进行研磨5min；

(3)研磨结束后，补加500ul CTAB缓冲液；

(4)65℃水浴1h；

(5)加入700μl体积比为24:1的氯仿/异戊醇，上下混匀15min，保证样品和氯仿充分混合；

(6)12000rpm离心10min；

(7)取上清液500μl，加入50μl 3mol/L KAc和500μl的冰乙醇，上下颠倒混匀；

(8)4℃冰箱静置30min以上；

(9)13000rpm离心10min，弃上清液；

(10)加入75％(体积分数)乙醇，洗涤片刻后，再次13000rpm离心10min，弃上清液；

(11)打开离心管口，晾干(24h以上为宜)；

(12)加入100μl ddH₂O(含1μl 10mg/ml的RNase)溶解DNA，溶解2h以上；

(13)分光光度计下进行样品DNA浓度的检测；

(14)根据样品DNA浓度，调整终浓度在50～100ng之间备用。

其中，CTAB缓冲溶液成分为：

100ml 1M TRIS，pH＝7.5；

140ml 5M NaCl；

20ml 0.5M EDTA，pH＝8；

740ml MiliQ H₂O；

20g CTAB(65℃水浴溶解)。

3.2 SSR引物扩增与筛选

用获得的高纯度茄子DNA为模版，利用19对SSR引物对供试材料进行PCR扩增，其中16对能得到较为稳定的扩增图谱，但大多数引物的扩增结果在双亲及杂种之间是一致的，不能起到鉴别作用。最终筛选出2对特异引物SSR116和SSR171(如图1所示)可以把杂交种F1与其父母本P1和P2分开。

其中，引物SSR116和SSR171均由上海生工生物工程有限公司合成。

引物SSR116碱基序列为：

5'-TTAGAAATTTCGGAACAAAGAGA-3'SEQ ID No.01；

5'-CCACATGAAACTTGGACCAATGAG-3'SEQ ID No.02；

引物SSR171碱基序列为：

5'-CCTTCAATTGACC TCCCTCA-3'SEQ ID No.03；

5'-GCATCTGGAAATTAGAGGCG-3'SEQ ID No.04。

3.3 PCR扩增及产物的电泳检测

利用筛选出的SSR引物进行PCR扩增；PCR扩增产物通过6％的PAGE电泳分离，而后进行银染、显影、标记。

上述3.2及3.3步骤中：

PCR扩增的具体步骤为：

SSR扩增反应采用10μL的反应体系，使用Vazyme的2×Taq Master Mix(Dye Plus)稀释1倍后取8.0μL，0.1μmol/L引物各0.5μL，50ng/μL模板DNA1.0μL。反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30min，60℃退火30s(每个循环降温0.5℃)，72℃延伸45s，9个循环；94℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10min后4℃保存。

PCR扩增产物检测的具体步骤为：

PCR扩增产物在6％的PAGE中电泳分离：

(1)洗干净的玻璃板至于玻璃板架上晾干；用乙醇擦洗玻璃板；

(2)带凹口的背板涂上硅化剂，面板则涂上粘合剂，防止电泳完毕发生撕胶和脱胶的可能(涂摸要均匀)；面板在下、背板在上，两侧用塑料板密封，并用夹子夹好，底部调节使之水平；

(3)将加入催化剂(APS和TEMED)后的凝胶沿凹口均匀倒下，插入适当的封条，用夹子夹紧封条部位；

(4)室温聚合30分钟，小心取出凹口处封条，用水冲洗加样孔(否则封条所残留的丙烯酰胺在加样孔聚合产生不规则表面，引起DNA带变形)；

(5)将凝胶固定在电泳槽里。带凹口背板朝里，面向缓冲液槽；

(6)用0.5×TBE灌满电泳槽的缓冲液槽，接上电极，打开电源。调试工作环境为电压2000-2200V，电流150-200mA，单板电泳功率为80W，预热30分钟左右；

(7)点样之前需切断电源，用枪将点样孔的气泡及胶吹出，然后插入点样梳，注意不要插得太深，否则点样胶面会变形，影响美观及点样；

(8)枪吸加样品，PCR产物先加loading buffer 10ul，再变性100℃5分钟左右，接着在冰水中冷却5分钟以上方可点样，点样完毕，电泳开始；

(9)电泳至所需位置后，切断电源，拔出导线，回收缓冲液，卸下玻璃板，在工作台上，将背板撬起，放回原处；

(10)将电泳完的面板首先在银染漂洗盆了漂洗干净，将加入银染液的银染盆放在摇床上后，将面板放入银染1小时左右；

(11)将面板从银染盆里取出，在银染漂洗盆里漂洗，震荡5-6次，取出后使其表面尽量无水，再放入已加入显影液的显影盆里(显影，显影液的配制及甲醛的加入都需要在通风橱的摇床上进行)显影过程大约10到15分钟，以DNA条带清晰可见为准；

(12)将显现完毕的板子在显影漂洗盆里漂洗后，方可读带。

其中：

6％的PAGE：尿素210g，10×TBE 25ml，丙烯酰胺28.5g，亚甲双丙烯酰胺1.5g，加水定容至500ml，过滤后使用；

10×TBE(Tris-硼酸-EDTA)：EDTA7.44g，硼酸55g，Tris 108g，加水定容至1000ml；

10％过硫酸氨(APS)：10g过硫酸氨，纯水定容至100ml；

硅化剂：二甲基二氯硅烷：无水乙醇＝13ml：500ml；

反硅化剂(粘合剂)：无水乙醇500ml(一瓶)，44ddH₂O，3.3ml冰醋酸，550ul Bindsilance(3，-Trimethoxysilyl propyl)配置完遮光4℃保存；

loading buffer：0.1g二甲苯氰，0.1g溴酚蓝，1ml 0.5mol EDTA，100mL甲酰胺；

银染液：称2.5至3.0g的AgNO₃加1200-1400ml水；

显影液：20g NaOH，0.6g Na₂CO₃，甲醛4.5ml，加水1200ml。

3.4数字指纹即指纹图谱的建立

根据上述扩增结果，以1和0分别代表某个等位基因位点扩增出的DNA条带的有无，按照从上到下即由小片段向大片段的读带方向，将指纹图谱转换为由1和0组成的字符串，即构成数字指纹。引物SSR116：父本(福-2)为0111111，母本(江茄)为1011111，杂交种(沪茄5号)为1111111；引物SSR171：父本(福-2)为11111111111，母本(江茄)为11000001100，杂交种(沪茄5号)为11111111111。其中所述数字“1”表示图谱中某个位置上有扩增带存在，数字“0”表示在某个位置上没有扩增带存在。

3.5数字化二维码的建立

将引物名称以字母形式编号，每个引物扩增条带按照位置顺序来赋值，自上而下，依次赋值为100、200、300(即100N，N＝次序)；引物编号和对应条带生成相应引物及其条带的带型编码，对每份供试材料带型编号组合，生成该品种的指纹图谱代码。

利用QRCode转化工具：QR精灵2.12(仙居朝歌软件有限公司)对亲本P1、P2和杂交种F1的指纹图谱代码进行二维编码，录入各个材料的名称和指纹图谱代码等信息，绘成亲本P1、P2和杂交种F1的DNA指纹图谱二维(QR)编码，如图2所示。

【实施例2】

本发明建立的DNA指纹图谱用于“沪茄五号”杂交种纯度的鉴定：

随机抽取发芽的杂交种120份、亲本各2份，用微量CTAB法提取DNA，用提取的DNA作为模版，用引物SSR116扩增，扩增产物在6％的PAGE上进行电泳分析。如果利用SSR116标记分析查出的单株DNA指纹是1111111，即为“沪茄五号”真杂交种，如果DNA指纹是1011111，即为母本“江茄”自交种，也就是假杂交种。然后用假杂交种数除以检测有带样品总数，即可获得制种基地生产的茄子杂交种的纯度，较大田种植调查纯度既省时又便捷，可以为茄子杂交种子的销售及时可靠地提供纯度信息。如果鉴定的纯度低于95％，就不能够作为商品种子进行销售，从而就可能避免假种子事件的发生。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种茄子品种DNA指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、茄子基因组DNA的提取

采用CTAB微量法提取茄子基因组DNA并纯化；

S2、SSR引物扩增与筛选

用获得的高纯度茄子DNA为模版，利用19对SSR引物对“沪茄五号”杂交品种及其双亲品种的DNA进行PCR扩增，筛选出多态性好的SSR引物；

S3、PCR扩增及产物的电泳检测

利用筛选出的SSR引物进行PCR扩增；PCR扩增产物通过6％的PAGE电泳分离，而后进行银染、显影、标记；

S4、DNA数字指纹即指纹图谱的建立

对扩增产物进行数据统计分析，以“1”和“0”分别代表某个等位基因位点扩增出的DNA条带的有和无，按照从上到下即由小片段向大片段的读带方向，将指纹图谱转换为由“1”和“0”组成的字符串，即构成对应品种的数字指纹；

S5、数字化二维码的建立

对亲本和杂交种的指纹图谱代码进行二维编码，录入每份供试材料的名称和指纹图谱代码信息，绘成亲本和杂交种的DNA指纹图谱二维编码。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中CTAB微量法采用的CTAB缓冲溶液成分为：

100ml 1M TRIS，pH＝7.5；

140ml 5M NaCl；

20ml 0.5M EDTA，pH＝8；

740ml MiliQ H₂O；

20g CTAB，并在65℃水浴溶解。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S2及S3中，PCR扩增采用10μL的反应体系，使用2×Taq Master Mix稀释1倍后取8.0μL，0.1μmol/L引物各0.5μL，50ng/μL模板DNA1.0μL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2及S3中的PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30min，60℃退火30s，每个循环降温0.5℃，72℃延伸45s，9个循环；94℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10min后4℃保存。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S3中，筛选得到2对特异引物SSR116和SSR171；

引物SSR116碱基序列为：

5'-TTAGAAATTTCGGAACAAAGAGA-3'；

5'-CCACATGAAACTTGGACCAATGAG-3'；

引物SSR171碱基序列为：

5'-CCTTCAATTGACCTCCCTCA-3'；

5'-GCATCTGGAAATTAGAGGCG-3'。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S4中，建立的数字指纹为：

对于引物SSR116：父本“福-2”为0111111，母本“江茄”为1011111，杂交种“沪茄5号)为1111111；

对于引物SSR171：父本“福-2”为11111111111，母本“江茄”为11000001100，杂交种“沪茄5号”为11111111111；

其中，所述数字“1”表示图谱中某个位置上有扩增带存在，数字“0”表示在某个位置上没有扩增带存在。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S5中，将引物按照固定的顺序以字母的形式进行编号，再对引物扩增条带大小记录并赋值，生成相应引物及其条带的带型编号；

按照固定顺序，对每份供试材料带型编号组合，生成该品种的指纹图谱代码，对双亲品种和杂交品种的DNA指纹图谱代码分别进行二维编码。

8.如权利要求1-7任一项所述方法建立得到的DNA指纹图谱。

9.如权利要求8所述的DNA指纹图谱的应用，其特征在于，用于茄子杂交种“沪茄五号”种子纯度的鉴定。