CN107753476A - 含4‑乙酰基‑安卓奎诺‑b的组合物用于制备抑制卵巢癌细胞生长的药物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明关于一种组合物用于制备抑制卵巢癌细胞生长的药物的用途，其中包含一有效量的式I化合物–4‑乙酰基‑安卓奎诺‑B(4‑acetyl‑antroquinonol B)或其医药上可接受盐、一抗癌药物及一医药上可接受载体。

Description

含4-乙酰基-安卓奎诺-B的组合物用于制备抑制卵巢癌细胞 生长的药物的用途
技术领域
本发明关于一种组合物用于制备抑制卵巢癌细胞生长的药物的用途，其中该组合物主要包含式I化合物–4-乙酰基-安卓奎诺-B (4-acetyl-antroquinonol B)。
背景技术
癌症一般可以视为恶性肿瘤，是一种疾病。其特征为恶性组织的不正常团块，起因于过度地细胞分裂。癌症细胞不具有正常细胞生长之限制，会侵入与占领正常留给其它细胞的范围。癌症治疗的种类包括化学治疗、手术、放射线以及这些治疗的结合。化学治疗通常包括使用一个或多个抑制癌细胞生长的化合物。
卵巢癌是女性妇科癌症中第二大死因，卵巢癌的可用治疗包含减积手术(debulking surgery)或再加上化学治疗，依照病程的阶段而不同，然而这些可用的治疗选项对末期的病人仍然没有治疗成效，超过70％的卵巢癌患者在化学治疗后会复发且预后不佳，同时五年的存活率低于20％，因此发展对有阻抗性的卵巢癌细胞的有效治疗策略是相当重要的。
发明内容
本发明是基于发现式I化合物–4-乙酰基-安卓奎诺-B (4-acetyl-antroquinonolB)或其医药上可接受盐，其可用于抑制癌细胞生长，甚至治疗或预防癌症，特别是卵巢癌。特定言之，本发明提供一种用于抑制卵巢癌细胞生长，甚至治疗或预防卵巢癌的医药组合物，包括有效量的式I化合物–4-乙酰基-安卓奎诺-B或其医药上可接受盐，与医药上可接受载体。
本发明提供一种用于抑制癌细胞生长的医药组合物为主，经实验证实式I化合物–4-乙酰基-安卓奎诺-B对四种卵巢癌症细胞株分别具有特殊意义。ES-2细胞株是源自于对包含顺铂治疗在内等化疗药物有高抵抗性且预后较差的亮细胞癌细胞株，SKOV-3和OV-2008 则是细胞株，而OV-2008是一种对含铂化疗药物反应明显的细胞株。本发明显示使用的所有种类卵巢癌细胞株都对式I化合物-4-乙酰基- 安卓奎诺-B有反应。有趣的是ES-2这株对顺铂抗性最高的细胞株对式I化合物-4-以酰基-安卓奎诺-B反应也最明显，这指出式I化合物 -4-乙酰基-安卓奎诺-B可能与肿瘤增生及对药物的抵抗性有某种程度的关联性。更重要的是，本发明的式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺 -B对细胞自噬的抑制效果非常显著，可减少细胞自噬蛋白质Atg-7 的表达量进而使得下游的Atg-5表达量也受到抑制。Atg-5在细胞自噬体延长阶段扮演重要的角色，所以Atg-5表达量降低也让成熟的细胞自噬体数量变少。本发明的结果说明式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B能通过抑制细胞自噬体的成熟而达到抑制细胞自噬的作用。此外，因为降低了细胞自噬的表达也同时降低了细胞存活力，所以在式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B处理后也降低了细胞群落的生成效率。本发明进一步以组合指数(combinational index，CI)探讨式I 化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B及顺铂的药物协同效应。CI是一个测定两种以上的药物之协同(CI<1)、加成(CI＝1)以及拮抗(CI>1) 效应的数值。结果显示，式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B和顺铂的合并使用呈现更佳的抗癌效应。综合上述，式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B应为潜力标靶卵巢癌细胞特性的化学治疗物质。
克服卵巢癌化学治疗抵抗性的关键是锁定那些对化学治疗有抵抗性的细胞，这些细胞的特性为衰老快速、有高代谢需求及细胞自噬高度活化(autophagic-flux)，因此透过调控细胞自噬(autophagy) 的路径或许有助于卵巢癌的治疗，在研究中我们现式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B这个新兴的化合物可以透过调控细胞自噬相关的基因(Atg-5)，而对卵巢癌中有化学治疗抵抗性的细胞发挥抗肿瘤作用，且可以单药治疗或与顺铂协同治疗。
此外，本发明利用恶性卵巢癌细胞株ES-2诱导NOD-SCID小鼠产生肿瘤，建立恶性卵巢癌动物模式，评估口服及腹腔式I化合物-4- 乙酰基-安卓奎诺-B对于卵巢癌治疗的功效。在卵巢癌动物模式中，以皮下注射方式植入恶性卵巢癌ES-2，模拟临床上恶性卵巢癌的症状，并同时开始每天喂食不同浓度式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B，持续六周，并分别在一到六周牺牲动物。每周游标量尺量测肿瘤大小，以肿瘤大小变化之倍率表示。单独投予式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B、cisplatin(CIS)及共同投予式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B及cisplatin(CIS)的小鼠的肿瘤皆小于对照组小鼠。其中以同时投予高剂量式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B及cisplatin(CIS)抑制肿瘤生长的效果最佳。两实验组的肿瘤体积仅增长约3倍大，而对照组的肿瘤则可增长到约9倍的体积。至于在安全性上，每周监测各组小鼠的体重变化。单独投予cisplatin的小鼠体重呈现持续下降，由原本接近26克下降到约21克，但当同时投予式I化合物-4- 乙酰基-安卓奎诺-B及cisplatin，小鼠体重与对照组间并无显著差异。对照其肿瘤生长状况，同时投予式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B及cisplatin皆可有效的抑制恶性卵巢癌细胞株-ES-2细胞的生长，但投予cisplatin时，辅以式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B却可防止小鼠体重过度下降，降低cisplatin对个体造成的伤害。最后，不论是口服或腹腔注射的卵巢癌动物模式，喂食式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B的实验组的肿瘤严重程度都较控制组来的低，显示式I化合物 -4-乙酰基-安卓奎诺-B不但可抑制肿瘤生长，更有与化疗药物 Cisplatin及FOLFOX(亚叶酸+5-氟尿嘧啶+奥沙利铂)对卵巢癌的加乘抑制能力。因此，在大肠癌及卵巢癌治疗过程中，I化合物-4- 以酰基-安卓奎诺-B具有相当潜力可以应用为一辅助治疗剂。
另外，本发明以Atg-5为标记的卵巢癌病患(n＝60)的组织数组切片(TissueArray)的免疫组织染色来研究Atg-5和卵巢癌病程发展的关连性。结果显示式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B对部分类型的卵巢癌有显著的细胞毒性，有趣的是那些对顺铂有较高抵抗性的细胞对式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B反应更明显，这是因为这些细胞有较高的代谢需求，细胞自噬也大量进行，本发明之组织免疫染色结果也与之相应。Atg-5以往被认为会促进卵巢癌(OR： 5.133；p＝0.027)，而式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B则能够成功抑制Atg-7及Atg-5的表达，进而减少细胞自噬的发生，这效果和一个正在进行临床试验的细胞自噬抑制剂hydroxychloroquin类似，然后式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B除了具有单药治疗的潜力之外，还能与顺铂协同治疗。
式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B可拥有一或多个对称中心，因此具有各种立体异构物形式。本发明中提及的式I化合物包括所有此等异构物。式I化合物具有选择性抑制癌症细胞生长的功效。由于其分子量极小，因此，可使用较低剂量的式I化合物及其医药上可接受盐，与医药上可接受载体，即可得到渴望的治疗效果。本发明为一抑制癌细胞生长，甚至治疗或预防癌症的药物，是将一有效量的式I 化合物及其医药上可接受盐，用于抑制癌细胞、或投予所需的病患 (此病患具有癌症、癌症的症状或倾向于癌症的体质)以治愈、恢复、减轻、缓和、改变、治疗、改善、改进或影响疾病、疾病的症状或倾向于疾病的体质为目的。此处使用的「有效量(an effective amount)」指有效量的式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B及其医药上可接受盐，具有抑制或治疗功效的量。有效量的改变是根据给药的途径、辅药使用(excipient usage)以及与其他共同使用(co-usage) 的活性药剂。
本发明提供一种组合物用于制备抑制卵巢癌细胞生长的医药组合物的用途，其中该组合物包含有效量的式I化合物–4-乙酰基-安卓奎诺-B(4-acetyl-antroquinonol B)
或其医药上可接受盐，与医药上可接受载体。
本发明的组合物另可包含一抗癌药物，该抗癌药物包含5-氟尿嘧(Fluorouracil)、奥沙利铂(Oxaliplatin)或5-氟尿嘧啶与奥沙利铂的组合。
本发明还提供一种组合物用于制备抑制卵巢癌细胞生长的药物的用途，其中该组合物包含一有效量的式I化合物–4-乙酰基-安卓奎诺-B(4-acetyl-antroquinonol B)或其医药上可接受盐、一抗癌药物及一医药上可接受载体，其中该抗癌药物包含5-氟尿嘧啶(Fluorouracil)、奥沙利铂(Oxaliplatin)或5-氟尿嘧啶与奥沙利铂的组合。本发明的组合物可防止个体因服用抗癌药物造成的体重降低。
在一实施例中，式I化合物–4-乙酰基-安卓奎诺-B的有效量为 0.01μM至1000μM。5-氟尿嘧啶的浓度为每毫升5毫克至每毫升300 毫克；奥沙利铂的浓度为每毫升0.5毫克至每毫升50毫克。
在另一实施例中，式I化合物–4-乙酰基-安卓奎诺-B的有效量为0.5μM至50μM。
式I化合物–4-乙酰基-安卓奎诺-B可拥有一或多个对称中心，因此具有各种立体异构物形式。本发明中提及的式I化合物包括所有此等异构物。式I化合物具有选择性抑制癌症细胞生长的功效。由于其分子量极小，因此，可使用较低剂量的式I化合物及其医药上可接受盐，与医药上可接受载体，即可得到所欲的治疗效果。本发明为一抑制卵巢癌细胞生长，甚至治疗或预防该癌症的医药组合物，系将一有效量的式I化合物及其医药上可接受盐，用于抑制癌细胞、或投予所需的病患(此病患具有癌症、癌症的症状或倾向于癌症的体质) 以治愈、恢复、减轻、缓和、改变、治疗、改善、改进或影响疾病、疾病的症状或倾向于疾病的体质为目的。此处使用的「有效量(an effective amount)」指有效量的式I化合物–4-乙酰基-安卓奎诺-B及其医药上可接受盐，具有抑制或治疗功效的量。有效量的改变是根据给药的途径、辅药使用(excipient usage)以及与其它共同使用 (co-usage)的活性药剂。
此处之「癌症」意指细胞肿瘤。癌症细胞具有自主生长 (autonomous growth)的能力，即在不正常的状态或条件下迅速增殖细胞生长。此处所指的癌症包含所有种类的细胞不当增生 (cancerous growth)或致癌过程(oncogenic processes)、转移性的组织或恶性转换的细胞、组织或器官(与组织病理学型态无关)或侵入阶段。癌症的例子包括，但不限定于：癌症(carcinoma)与恶性肉瘤(sarcoma)，例如乳癌(breast cancer)、血癌(leukemia)、恶性肉瘤(sarcoma)、淋巴瘤(lymphomas)、恶性骨肉瘤 (osteosarcoma)、神经胶质瘤(glioma)、嗜铬细胞瘤 (pheochromocytoma)、肝恶性肿瘤(hepatoma)、黑色素瘤(melanoma)、卵巢癌(ovarian cancer)、皮肤癌(skin cancer)、大肠癌(colorectalcancer)、胃癌(gastric cancer)、胰脏癌(pancreatic cancer)、肾脏癌(renal cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、睪丸癌(testicular cancer)、头部与颈部的癌症(Head andneck cancer)、脑癌(brain cancer)、食道癌(esophageal cancer)、膀胱癌(bladdercancer)、肾上腺皮质癌(adrenal cortical cancer)、肺癌(lung cancer)、支气管癌(bronchus cancer)、子宫内膜癌(endometrial cancer)、鼻咽癌(nasopharyngealcancer)、子宫颈癌(cervical cancer)、肝癌(cervical or liver cancer)或未知起始位置的癌症。
式I化合物–4-乙酰基-安卓奎诺-B是以有机溶剂萃取牛樟芝菌丝体(一真菌类)，并经硅胶管柱分离纯化制备而得；或另以化学合成方法制备而得。例如：由「牛樟芝菌丝体萃取」指自较适成长程度的牛樟芝菌丝体所萃取出的牛樟芝菌丝体萃取物。为取得该牛樟芝菌丝体萃取物，可使用本技术领域中众所周知的萃取技术，例如可将经干燥与研磨的该牛樟芝菌丝体悬浮在一溶剂或者两种或多种溶剂的混合液于一足够长的时间；适合的溶剂的例子包括，但不限定为：水、甲醇、乙醇、二氯甲烷(methylene chloride)、三氯甲烷(chloroform)、丙酮(acetone)、醚类(ether)(例如乙醚(diethyl ether))与乙酸乙酯酯类(ethyl acetate)与己烷(hexane)。之后移除固体残余物(例如通过过滤)得到该牛樟芝菌丝体萃取物溶液，其可经硅胶管柱纯化制备得式I化合物–4-乙酰基-安卓奎诺-B。基本上，全世界近二十余年在牛樟芝所含天然化合物的研究，除多醣体等大分子外，总共发表了七十八个小分子化合物，其中包括三十一个三萜类化合物且大都有相关药理活性研究报告，尤其着重在与之相等的抗癌活性，只有三萜类化合物各别分子仍须在较高使用量，才能达到癌症临床化学治疗药物的效果【Geethangili M and Tzeng YM,Review ofpharmacological effects of Antrodia camphorata and its bioactive compounds，Evidence-based Complementary and Alternative Medicine，Aug.17,2009；doi:10.1093/ecam/nep108】。同时，本发明发现式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B对不同卵巢癌症细胞株 (ES-2细胞株是源自于对包含顺铂治疗在内等化疗药物有高抵抗性且预后较差的卵巢癌细胞株，SKOV-3和OV-2008则是浆液性囊腺卵巢癌细胞株)具高度抑制性。在此必须再强调的是：式I化合物-4- 乙酰基-安卓奎诺-B乃是牛樟芝所含各种天然化合物中，经实验证实抑制卵巢癌症细胞株效果较优的少数牛樟芝所含天然化合物之一。
在使用本发明的组合物治疗时，式I化合物–4-乙酰基-安卓奎诺 -B或其医药上可接受盐类可同时给药或分开给药，以口服、非口服、经由吸入喷雾(inhalation spray)或通过植入贮存器(implanted reservoir)的方式。此处所使用的「非口服」是指皮下(subcutaneous)、皮内(intracutaneous)、静脉内(intravenous)、肌肉内(intramuscular)、关节内(intraarticular)、动脉内(intraarterial)、滑囊(腔)内(intrasynovial)、胸骨内(intrasternal)蜘蛛膜下腔内(intrathecal)、疾病部位内(intraleaional)与头颅内(intracranial)注射以及灌注技术。
本发明所使用式I化合物–4-乙酰基-安卓奎诺-B及/或其医药上可接受盐类可与至少一种固体、液体或半液体状的赋形剂或辅助剂一同形成适当的药剂形式。其形式包括，但不限定于，药锭、胶囊、乳剂(emulsions)、水性悬浮液(aqueous suspensions)、分散液(dispersions)与溶液。药锭一般所使用的载体(carrier)包括乳糖与玉米淀粉。一般也将润滑剂(lubricating agent)，例如硬脂酸镁 (magnesium stearate)加至药锭中。用于胶囊形式的稀释剂(diluents) 包括乳糖与经干燥的玉米淀粉。当口服给药为水性悬浮液或乳剂时，可悬浮或溶解有效成分(active ingredient)于与乳化或悬浮剂结合的油相(oilyphase)。如果需要，可加入特定甜味、调味与着色剂。
本发明所使用式I化合物–4-乙酰基-安卓奎诺-B或其医药上可接受盐类也可配制成无菌注射成分(例如，水或油的悬浮液)，例如利用本技术领域中已知的技术使用适合的分散或增湿剂(例如 Tween 80)与悬浮剂。无菌注射调剂也可以将无菌注射溶液或悬浮液加入无毒性非口服之稀释剂或溶剂，例如1,3丁二醇 (1,3-Butanediol)中。可使用的载具(vehicles)与溶剂包括甘露醣醇(mannitol)、水、林格氏液(Ringer’s solution)与等渗透压氯化钠溶液。此外，无菌、固定油常作为溶剂或悬浮媒介(例如合成的单-或双-甘油酯(glycerides))。脂肪酸，例如油酸(oleic acid)与其甘油酯衍生物也可用在注射剂的调制，其为天然药学上可接受的油，例如橄栏油、蓖麻油(castor oil)，特别是于其聚氧乙基化的 (polyoxyethylated)变化形式。这些油溶液或悬浮液也可包含一长链醇类稀释剂或分散剂，或者羧基甲基纤维素(carboxymethyl cellulose)或类似的分散剂。
本发明所使用式I化合物–4-乙酰基-安卓奎诺-B或其医药上可接受盐类也可根据此技术领域中所熟知的技术来配制成吸入成分。例如可制成盐类溶液，利用苯甲醇(benzylalcohol)或其它适合的防腐剂、增强生物可利用性(bioavailability)的吸附促进剂、碳氟化合物(fluorocarbon)或其它本技术领域中熟知的助溶或分散剂来配制。
用于医药组合物的载体必须是「可接受的」，其与配方的有效成分兼容(以及较佳为具有稳定有效成分之能力)以及不对病患有害。例如，助溶剂(例如环状糊精(cyclodextrins))(其与一个或多个萃取物的活性化合物形成特定更可溶解的复合物)，为了有效成分的传送而作为药理学上的辅药。其它载体的例子包括胶状二氧化硅(colloidalsilicon dioxide)、硬脂酸镁、纤维素与烷基硫酸盐(sodium lauryl sulfate)。
另外，由于抗癌剂如以高剂量投予病患易产生毒性。是以，本发明的医药组合物为含有安全有效量的式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B，用于抑制癌细胞生长，其中该安全有效量为0.01μM至1000 μM，较佳为0.5μM至50μM。施予个别病人的特定剂量是依所有可能存在因素而定，例如：所使用的特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、进食状况、施用时间与路径、排泄率、医药物质的组合、以及所欲治疗的疾病的严重程度等。
附图说明
图1为式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B对卵巢癌细胞株的细胞存活率及蛋白表达量影响；1A为式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B 结构图；1B为SRB分析评估式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B对不同卵巢癌细胞株(包括：卵巢癌细胞株-ES-2及OV-2008)的细胞毒性；1C为Atg5、Atg7和LC3BII在ES-2及OV-2008细胞株的表达量；1D为Atg5、Atg7和LC3BII在ES-2及OV-2008细胞株的荧光染色图；
图2为不同浓度的式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B对细胞自噬的影响；2A为式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B及抗癌药物对于 LC3BII在细胞株内的表达量免疫组织染色图；2B为式I化合物-4- 乙酰基-安卓奎诺-B及抗癌药物对于LC3BII在细胞株内的表达量西方墨点图；2C为不同浓度式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B对Atg-7 及Atg-5的影响的西方墨点图；2D为不同浓度式I化合物-4-乙酰基- 安卓奎诺-B处理后的细胞群落生成图；
图3为不同处理时间的式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B在ES2 及OV-2008细胞株中对AKT/mTOR/GSK-3β/p70S6K信号分子的影响结果图；
图4为式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B及顺铂的药物协同效应；4A为不同浓度的式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B及Cisplatin 对细胞毒性的影响；4B为式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B及 Cisplatin的combinational index(CI)；
图5为式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B及抗癌药物在腹腔暨口服卵巢癌动物模型的之抗癌功效及安全性评估；5A为口服试验对肿瘤生长的影响；5B为腹腔试验对肿瘤生长的影响及照片；5C为腹腔试验对动物体重的影响(安全性)；
图6为60位卵巢癌病人的不同临床组织样本图。
具体实施方式
以下实施例仅用于解释本发明，但本发明的保护范围并不仅限以下实施例。为了让本发明的上述和其他目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，作详细说明如下：
实施例一、式I化合物–4-乙酰基-安卓奎诺-B的制备
牛樟芝菌丝体3公斤以95％乙醇10公升加热回流萃取四次，萃取液经过滤后浓缩，减压干燥得乙醇萃取物384公克，将乙醇萃取物悬浮于水以等量乙酸乙酯进行分配(partition)划分，乙酸乙酯层经减压浓缩可得乙酸乙酯层划分部157.57公克及水层划分部159.51 公克。
上述乙酸乙酯层划分部157.57公克以硅胶管柱(10cm i.d x30 cm)进行层析，依次以正己烷→正己烷-乙酸乙酯(10：1→10：2→ 10：3→10：4→10：5→1：1→1：2，v/v)→乙酸乙酯→甲醇每种比例各10L进行冲提，每1L收集成一划分部。其中正己烷-乙酸乙酯 (10：4)冲提的划分部56-63(3.015g)，以逆相制备级管柱Tosoh ODS-80Ts(21.5mm x300mm,10μm)进行层析，以H2O-CH3CN (20:80)为移动相，流速10ml/min进行层析，以265nm为检测波长，管柱控温40℃，可获得4-乙酰基-安卓奎诺-B(131mg)。
实施例二、生物活性分析方法
1、冷冻细胞的活化
冷冻细胞的活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞的死亡。细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表达才会恢复正常﹙例如产生单株抗体或是其他蛋白质﹚。冷冻的细胞快速解冻的方法为：将冷冻管由液氮或干冰容器中取出，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在3分钟内全部融化，以70％酒精擦拭保存管的外部，移入无菌操作台内。取出解冻的细胞悬浮液，缓缓加入有培养基的培养容器内(稀释比例为1：10～1：15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。在解冻培养后隔日更换培养基。
2.人类癌症细胞的培养
细胞株培养本研究所使用的卵巢癌细胞株包含：ES-2、OV-2008 及SKOV-3，来源为American Type Culture Collection(ATCC)。ES-2 是对铂化学治疗有高抵抗性的亮细胞癌细胞株，相较于其他种类癌症类型，亮细胞癌在研究中被发现预后较差，SKOV-3和OV-2008 则是相对于ES-2作为较良性的细胞株。细胞培养液使用McCoy5A 培养液(GIbco，16600-082)加上1％抗生素(Gibco，15140)以及 10％胎牛血清(FBS，Sigma，F7524)，细胞在标准培养箱中(Shel Lab，Sheldon Manufacturing，USA)以37℃和5％CO2培养。
3.细胞药物处理：
所有实验的细胞皆培养于含10％胎牛血清的培养液中，待细胞长到约八成满时，将旧培养液抽干并以PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液) 溶液清洗细胞后，加入10毫升不含血清的培养液。依实验目的不同加入不同的药物，于37℃恒温培养箱中进行反应。
4、细胞毒性实验(cytotoxicity)：
将卵巢癌细胞株ES-2、OV-2008及SKOV-3放置于96孔培养盘 (2000细胞/孔)，以及将其隔夜培养于100μl的完全DMEM中。将50μl包含式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B(0.5-50μM)的完全 DMEM等量样品加入培养盘的不同孔中。另外，控制组则只加入100 μl的完全DMEM。于培养2天之后，以磺酰罗丹明B (sulforhodamine B)(一蛋白质结合染剂)分析测定每孔中的细胞数目。简单地说，固定细胞于10％三氯醋酸(trichloroacetic acid) 中，与以0.4％磺酰罗丹明B将其染色。染色20分钟后再以1％乙酸清洗，之后，将与细胞结合的磺酰罗丹明B溶解于10mM的Tris base中。以微量滴定盘检测器(microtiter plate reader)在562nm下测定吸光值(optical density)。
5、细胞群落分析(clonogenicity)
细胞群落分析在六孔盘的每一格中分别种600个细胞，培养液为 McCoy5A加上10％胎牛血清。
6、西方墨点法(Western blot)
以标准程序进行西方墨点法。细胞先以PBS清洗两次后加入细胞溶解液，接着以离心去除细胞碎片藉以收集蛋白质降解物，蛋白质浓缩物以BCA assay kit(Pierce，ThermoScientific，USA)定量，每个样本取等量的蛋白质降解物至10％SDS-PAGE电泳，再转印至PVDF膜，之后加入抗细胞自噬关基因(Atg-7、Atg-5、及LC3BII) 的一级抗体，并以抗β-actin的抗体作为对照组，目标蛋白质和一级抗体隔夜反应后加入连接HRP的二级抗体，最后以冷光照胶系统 (UVP，LLC，USA)测定目标的讯号。
7、药物组合指针(combinational index，CI)分析
以Chou-Talalay algorithm及Compusyn software(ComboSyn Incorporated，Paramus，NJ，USA)用以分析两种药物之组合效应以探讨4-AAQB与顺铂的药物组合功效。CI是一个测定两种药物的协同(CI<1)、加成(CI＝1)以及拮抗(CI>1)效应的分析指标。
实施例三、生物活性测定的结果
1、式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B可抑制不同卵巢癌细胞的生长。
首先以细胞存活率的试验测试式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B (图1A)对两种不同的卵巢癌进行细胞毒性。该两种卵巢癌细胞株分别具有特殊的意义，ES-2细胞株是源自于对包含顺铂治疗在内等化疗药物有高抵抗性且预后较差的卵巢癌细胞株，OV-2008则是浆液性囊腺癌细胞株。实验结果显示本发明中使用的所有种类卵巢癌细胞株都对I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B有反应，有趣的是ES-2 这株对顺铂抗性最高的细胞株对I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B反应也最明显(图1B)，这指出I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B可能与肿瘤增生及对药物的抵抗性有某种程度的关联性。
2、对药物的抵抗性与细胞自噬的发展呈现负相关性
细胞自噬基础表达量的高低与对化学治疗的抗性呈现正相关性，包含化学治疗及放射治疗等抗肿瘤治疗皆被证实会引发细胞自噬并活化能提升细胞存活力的分子机转。与OV-2008相比，我们发现ES-2 这株对顺铂有高抵抗性的细胞株有较高的Atg5、Atg7和LC3BII表达量(图1C)。进一步利用细胞荧光染色也发现Atg-5与LC3BII 会共同大量表达于高度恶性ES-2卵巢癌细胞中。推测，LC3BII会经过磷脂化后位于细胞自噬体膜上的结构，故Atg-5与LC3BII表达量高也就代表细胞自噬表达旺盛(图1D)。
3、式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B通过抑制细胞自噬体的延长以抑制细胞自噬的发展
即使ES-2这细胞株本身就有较高的细胞自噬表达量，在顺铂处理后细胞自噬现象却更加显著，推测是因为顺铂处理引发了增强存活力的细胞自噬反应。结果显示式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B显著抑制细胞自噬。在式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B处理后以免疫组织染色及西方墨点法检测LC3BII，显示式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B确实能抑制细胞自噬体的LC3BII表达(图2A)。细胞自噬能保护癌细胞避免因化学治疗而引发的细胞凋亡，羟氯喹是一种广为使用的抗寄生虫药物，近期的第二期临床研究也证实羟氯喹能成功的抑制细胞自噬。羟氯喹会提高溶小体内的pH值让溶小体难以跟成熟的细胞自噬体融合，引此对细胞自噬的抑制效果也能解决癌细胞因化学治疗产生细胞自噬阻抗性的问题。在本实施例中ES-2细胞株以5μM的顺铂预处理，再分别辅以式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B治疗，结果显示式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B处理细胞后对细胞自噬体成熟的抑制能力更胜过于羟氯喹(图2B)，相同浓度下的式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B处理的细胞存活率也显著比羟氯喹处理低。综合以上结果，式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B通过抑制细胞自噬体延长阶段降低细胞自噬的能力足以和已广泛使用的细胞自噬抑制剂相提并论。更重要的是，从西方墨点的结果发现式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B的机转和羟氯喹有所不同。羟氯喹主要是通过提高溶小体内的pH值，进而减少细胞自噬体和溶小体的融合而达到抑制细胞自噬的效果，而式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B则是减少Atg-7的表达量进而使得下游的Atg-5表达量也受到抑制(图 2C)。Atg-5在细胞自噬体延长阶段扮演重要的角色，所以Atg-5表达量降低也让成熟的细胞自噬体数量变少。结果说明式I化合物-4- 乙酰基-安卓奎诺-B能通过抑制细胞自噬体的成熟而达到抑制细胞自噬的作用。此外，因为降低了细胞自噬的表达也同时降低了细胞存活力，所以在式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B处理后也降低了细胞群落的生成效率(图2D)。
4、式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B通过阻断 AKT/mTOR/p70S6K信号通路分子表达对ES2细胞增殖和自噬抑制
观察式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B卵巢癌细胞株ES2细胞增殖和自噬的影响，并利用西方墨点法检测自噬相关蛋白LC3BII表达的变化和AKT/mTOR/p70S6K信号通路分子表达的变化。实验结果显示20uM的I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B可明显抑制ES2细胞的生长，并且具有时间依赖性效应(P＜0.05)。用不同时间(0、3、6 及12小时)的式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B作用ES2细胞后可以显著降低降低AKT/mTOR/p70S6K信号通路关键分子的表达量(图 3)。
5、式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B和顺铂的合并使用呈现更明显的抗癌效应
本实施例进一步以combinational index(CI)探讨式I化合物-4- 乙酰基-安卓奎诺-B及顺铂的药物协同效应(图4A)。结果显示，不同浓度的式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B(5、10、及20μM) 与顺铂(5μM)具有协同效应(图4B)。由此可知式I化合物-4- 乙酰基-安卓奎诺-B通过下调AKT/mTOR/p70S6K信号通路抑制 ES-2细胞增殖，并且诱导ES-2发生自噬，联合使用式I化合物-4- 乙酰基-安卓奎诺-B和顺铂可能会更有效发挥式I化合物-4-乙酰基- 安卓奎诺-B抗肿瘤增殖的作用(图4B)。
6、探讨式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B在腹腔暨口服卵巢癌动物模型的抗癌功效
本研究利用恶性卵巢癌细胞株ES-2诱导NOD-SCID小鼠产生肿瘤，建立恶性卵巢癌动物模式，评估式口服及腹腔I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B对于卵巢癌治疗的功效。在卵巢癌动物模式中，以皮下注射方式植入恶性卵巢癌ES-2，模拟临床上恶性卵巢癌的症状，并同时开始每天喂食不同浓度I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B，持续六周，并分别在一到六周牺牲动物。研究结果显示，口服或腹腔注射卵巢癌动物模式(图5B)，喂食式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺 -B的实验组其肿瘤严重程度都较控制组来的低。此外，口服投予不同剂量的式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B(5mg/kg及10mg/kg)，于肿瘤大小约70-250立方公厘时，每周静脉注射cisplatin(CIS)1 剂，剂量为3mg/kg，共投与三剂，结果显示式I化合物-4-乙酰基- 安卓奎诺-B单独投予对肿瘤的生长具有抑制作用，不但具有剂量相关性地抑制肿瘤生长(图5C)，式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺更有加乘化疗药物Cisplatin及FOFOX对卵巢癌的抑制能力。与CIS合并也有增强式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺的抗癌效果。重要的是，在式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺的安全性上，每周监测各组小鼠的体重变化。单独投予cisplatin的小鼠体重呈现持续下降，由原本接近26克下降到约21克，但当同时投予式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B及cisplatin，其小鼠体重与对照组间并无显著差异。对照其肿瘤生长状况，同时投予式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B及cisplatin 皆可有效的抑制恶性卵巢癌细胞株-ES-2细胞的生长，但投予 cisplatin时，辅以式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B却可防止小鼠体重过度下降，降低cisplatin对个体造成的伤害(图5D)，代表在活体内的安全性极高。因此，在卵巢癌治疗过程中，式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B具有相当潜力可以应用为一辅助治疗剂。
7、Atg-5与卵巢癌预后相关
本实施例以60位卵巢癌病人的组织样本研究Atg-5表达量和临床指标的关系。不同临床分类的卵巢癌免疫组织染色(IHC)结果整合在图6，将IHC染色结果依前面实验方法叙述分类为：无染色(n ＝9)、弱或焦点染色(n＝30)、中等或强染色(n＝21)三组。结果显示Atg-5在恶性肿瘤细胞中表达较高，且表达量和病程进展有正相关性。末期病人组织的Atg-5染色浓度也比早期病人组织高，另外， Atg-5染色结果呈中等或强染色组别的病人存活率显著低于无染色及弱或是焦点染色的病人(OR:5.133；p＝0.027)，因此Atg-5或许也能成为卵巢癌预后指标的病理标的。
实施例四、动物试验方法
实验动物
免疫缺陷小鼠由乐斯科生物科技股份公司购得(约4-6周大之 NOD/SCID小鼠)，经驯养一周后，开始进行试验。
细胞培养
选用的肿瘤细胞为ES2恶性卵巢癌细胞(ES-2细胞株是源自于对包含顺铂治疗在内等化疗药物有高抵抗性且预后较差的卵巢癌细胞株)，为一贴附型的细胞株，且具很强的转移能力。以培养液DMEM 内含10％胎牛血清(FBS)，1％非必需氨基酸(NEAA)和1％抗生素(antibiotics)培养于37℃、5％二氧化碳的培养箱中，约3～4天继代一次。
将细胞以0.05％胰蛋白酶(trypsin)-EDTA作用3～5分钟，使呈悬浮状态，加入含血清的培养基中和胰蛋白酶(trypsin)的作用， 1000rpm、20℃、离心5分钟。去除上清液，轻轻打散细胞沈淀，将细胞回溶于适当体积的培养液，混合均匀后，取少许细胞液，以血球计数器进行细胞计数。将细胞稀释成每毫升含107个细胞的浓度，取约0.15毫升分装于1.5毫升小离心管中。
药物配制
以DMSO为溶剂，将式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B配置成每毫升250毫克的溶液，待完全溶解后，进行分装，为stock，保存于4℃，取stock加入无菌的生理实验水做500倍稀释，混合均匀，即可进行腹腔注射。目前临床标准化学疗法用药顺柏则为针剂，其浓度分别为每毫升50毫克及每毫升5毫克，两药物皆取原液进行静脉注射。
肿瘤细胞注射
注射肿瘤细胞的前一天，将小鼠以10倍稀释的舒泰50(zoletil 50)及若朋(rompun)2％经1：1混合后，每只小鼠腹腔注射0.25 毫升进行麻醉，待其完全睡着后，进行放射线照射，以抑制其免疫力，照射剂量为0.75Gy。
小鼠以2.5％的异氟烷(isoflurane)进行麻醉，并将欲注射部位的毛发剔除，注射前用75％酒精及优碘消毒注射部位，选用29G胰岛素针进行ES2肿瘤细胞注射，注射时，先用镊子将小鼠表皮拉起，再将ES2肿瘤细胞注射到皮下，注射细胞数为106个，体积为0.1 毫升，注射完毕后，确认细胞液无漏出，即可将小鼠移回笼中，待其苏醒，注意其保温。持续观察肿瘤生长状况。
口服大肠癌及腹腔暨口服卵巢癌动物模型的建立
取对数生长期的ES-2卵巢癌混合于血清悬浮液0.1ml(2x106 个细胞数)接种于NOD-SCID免疫缺陷鼠后腿下形成肿瘤皮丘，48 小时之后随机分成控制组、Cisplatin正对照组(3mg/kg body weight)、高剂量(10mg/kg body weight)及低剂量(3mg/kg bodyweigh)。 ES2卵巢癌口服暨腹腔注射动物实验部分，每组6只老鼠，每天以式I化合物-4-乙酰基-安卓奎诺-B悬腹腔注射，对照组以等量生理食盐水灌食，共持续6周。6周后牺牲老鼠，并测量老鼠最长径为a、最短径为b；肿瘤大小＝(a*b2)/2，并计算肿瘤生长曲线。
实施例五、动物试验测定的结果
肿瘤大小测定
每周测量一次肿瘤大小，利用光标量尺测量肿瘤的最长径和最短径，为确保量测的准确度，实验期间由同一人进行肿瘤大小的量测。肿瘤体积计算公式：最长径为a、最短径为b；肿瘤大小＝(a*b2) /2，最后，将小鼠牺牲，取其肿瘤组织，拍照存盘，再以福尔马林固定。肿瘤大小的变化以倍数计算制成图表显示。肿瘤大小改变倍数(fold change in tumorvolume)＝肿瘤大小(N)/肿瘤大小(N-1)。N为周数。

Claims (9)

1.一种组合物用于制备抑制卵巢癌生长的药物的用途，其特征在于，该组合物包含一有效量的式I化合物–4-乙酰基-安卓奎诺-B(4-acetyl-antroquinonol B)
或其医药上可接受盐、一抗癌药物及一医药上可接受载体。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物还包含抗癌药物；其中，所述抗癌药物包含：5-氟尿嘧啶、奥沙利铂或5-氟尿嘧啶与奥沙利铂的组合。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物用于制备可治疗或预防癌症的药物。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述式I化合物–4-乙酰基-安卓奎诺-B是以有机溶剂萃取牛樟芝菌丝体，并经硅胶管柱纯化制备而得。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述式I化合物–4-乙酰基-安卓奎诺-B的有效量为0.01μM至1000μM。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述式I化合物–4-乙酰基-安卓奎诺-B的有效量为0.5μM至50μM。
7.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述5-氟尿嘧啶的浓度为每毫升5毫克至每毫升300毫克。
8.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述奥沙利铂的浓度为每毫升0.5毫克至每毫升50毫克。
9.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述组合物用于制备可防止个体因服用抗癌药物造成的体重降低的药物。
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