CN107746897A - 辣椒分子标记在鉴定辣椒植株有无茸毛中的应用 - Google Patents

辣椒分子标记在鉴定辣椒植株有无茸毛中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了辣椒分子标记在鉴定辣椒植株有无茸毛中的应用。本发明公开的辣椒分子标记为以辣椒基因组DNA为模板，采用引物对PW10‑207进行PCR扩增得到的DNA分子；引物对PW10‑207由名称分别为PW10‑207F和PW10‑207R的单链DNA组成，PW10‑207F为辣椒基因组DNA中与序列表中序列3的第82位的上游特异结合的单链DNA，PW10‑207R为辣椒基因组DNA中与序列表中序列3的第86位的下游特异结合的单链DNA。实验证明，本发明的辣椒分子标记与辣椒有无茸毛相关，在育种实际应用中可以利用该标记对辣椒有无茸毛进行鉴定，鉴定准确性可达99％。

Description

辣椒分子标记在鉴定辣椒植株有无茸毛中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，辣椒分子标记在鉴定辣椒植株有无茸毛中的应用。
背景技术
辣椒(Capsicum annuum L.)原产于中南美洲的热带地区，为茄科辣椒属一年或多年生植物，是一种重要的蔬菜作物和调味品。植物体表的茸毛对于植株的生长具有重要意义，这些茸毛能够通过分泌许多特殊的代谢产物来提高植物本身的防御与保护能力，如抗虫、耐旱、耐盐、抗病及防御紫外线照射等作用，因此茸毛性状可作为反映植株的某些抗病或抗性的指示性状，在植物的抗病，抗逆育种中具有非常重要的利用价值。
辣椒茸毛性状在植株整个生命周期均可观察到，由表皮层的一部分表皮细胞分化而来。茸毛一般由多个细胞排列构成，每个构成茸毛的细胞大小不一，靠近表皮组织的细胞要比远离表皮组织的细胞要大，每个细胞都有完整的细胞器。辣椒茸毛一般为直立生长，由于重力作用尖端向下弯曲，茸毛生长过密导致茸毛相互交织生长，形成茸毛层，茸毛层一方面可以防止害虫取食，另一方面可以降低植株的蒸腾作用。
分子标记辅助育种作为当前育种工作的重要辅助手段，其应用越来越广泛。利用分子标记技术缩短育种周期的关键是开发出高效的分子标记。与目标性状紧密连锁并且稳定、检测方便快捷的分子标记，能够极大的提高育种中选择的准确性和效率，显著缩短育种周期。因此，开发高效的分子标记对于品种改良及新品种选育具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何鉴定辣椒是否有茸毛，尤其是辣椒茎叶部是否有茸毛。
本发明首先提供了辣椒分子标记或其多态性在鉴定或辅助鉴定辣椒有无茸毛中的应用；
所述辣椒分子标记为以辣椒基因组DNA为模板，采用引物对PW10-207进行PCR扩增得到的DNA分子；
所述引物对PW10-207由名称分别为PW10-207F和PW10-207R的单链DNA组成，所述PW10-207F为辣椒基因组DNA中与序列表中序列3的第82位的上游特异结合的单链DNA，所述PW10-207R为辣椒基因组DNA中与序列表中序列3的第86位的下游特异结合的单链DNA。
所述PW10-207F具体可为序列表中序列1所示的单链DNA，所述PW10-207R具体可为序列表中序列2所示的单链DNA。
本发明还提供了鉴定辣椒基因型的方法，所述基因型为AA基因型、AB基因型和BB基因型；所述方法为下述O或P：
O、包括：检测待测辣椒基因组中对应于序列表中序列3的第82-86位的序列，如所述待测辣椒基因组中两条染色体均为下述g1)的染色体，所述待测辣椒为AA基因型辣椒；如所述待测辣椒基因组中两条染色体均为下述g2)的染色体，所述待测辣椒为BB基因型辣椒；如所述待测辣椒基因组中两条染色体一条为下述g1)的染色体、另一条为下述g2)的染色体，所述待测辣椒为AB基因型辣椒；
g1)对应于序列3的第82-86位为序列3的第82-86位；
g2)对应于序列3的第82-86位不为序列4的第82-86位；
P、包括如下P1)和P2)：
P1)以待测辣椒基因组DNA为模板，利用所述引物对PW10-207进行PCR扩增得到PCR产物；
P2)P2a)或P2b)：
P2a)检测步骤P1)得到的PCR产物的序列，如果所述PCR产物的序列为序列4，所述待测辣椒为BB基因型辣椒；如果所述PCR产物的序列为序列3和序列4，所述待测辣椒为AB基因型辣椒；如果所述PCR产物的序列为序列3，所述待测辣椒为AA基因型辣椒；
P2b)检测步骤P1)得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物含有158bp的DNA片段且不含有163bp的DNA片段，所述待测辣椒为BB基因型辣椒；如果所述PCR产物含有158bp和163bp的DNA片段，所述待测辣椒为AB基因型辣椒；如果所述PCR产物含有163bp的DNA片段且不含有158bp的DNA片段，所述待测辣椒为AA基因型辣椒。
上述方法中，利用所述引物对PW10-207进行PCR扩增的反应体系中所述PW10-207F和所述PW10-207R的浓度均可为0.1μM。所述反应体系具体可含有待测辣椒基因组DNA、含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP的dNTPs混合物、PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、所述PW10-207F、所述PW10-207R和水。所述DNA聚合酶和所述PCR反应缓冲液(10×Buffer缓冲液)均可为宝生物工程(大连)有限公司产品。
所述PCR扩增的退火温度可为52℃。所述PCR扩增的反应条件具体可为94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸7min。
本发明还提供了鉴定辣椒有无茸毛的方法，所述方法包括：利用所述鉴定辣椒基因型的方法鉴定待测辣椒的基因型，AA基因型待测辣椒有茸毛或候选有茸毛，AB基因型待测辣椒有茸毛或候选有茸毛，BB基因型待测辣椒五茸毛或候选无茸毛。
本发明还提供了所述辣椒分子标记。
本发明还提供了所述引物对PW10-207。
本发明还提供了鉴定或辅助鉴定辣椒有无茸毛的系统，所述系统含有所述引物对PW10-207。
所述系统可仅由所述引物对PW10-207组成，也可由所述引物对PW10-207与进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器组成。
上述系统中，所述进行PCR扩增所需的试剂可为含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP的dNTPs混合物、DNA聚合酶和/或PCR反应缓冲液；所述进行PCR扩增所需的仪器可为PCR仪。所述DNA聚合酶和所述PCR反应缓冲液(10×Buffer缓冲液)均可为宝生物工程(大连)有限公司产品。
上述系统中的各试剂均可独立包装。
上述系统也可为仅含有试剂的试剂盒。
本发明还提供了所述引物对PW10-207的下述任一应用：
X1、在鉴定或辅助鉴定辣椒有无茸毛中的应用；
X2、在制备鉴定或辅助鉴定辣椒有无茸毛产品中的应用。
本发明还提供了所述鉴定辣椒基因型的方法在鉴定或辅助鉴定辣椒有无茸毛中的应用。
本发明还提供了辣椒育种方法，所述方法包括：按照所述鉴定辣椒基因型的方法检测辣椒的基因型，选择AA或AB基因型的辣椒作为亲本进行育种。
本发明中，所述引物对PW10-207中的两条单链DNA的摩尔比可为1:1。
本发明中，在检测PCR产物的大小时，可通过电泳与DNA分子量标准进行检测，也可通过测序进行检测。
本发明中，所述辣椒有无茸毛均可为辣椒植株的茎叶部有无茸毛。
实验证明，本发明中的辣椒分子标记与辣椒有无茸毛相关：含有序列3不含有序列4的DNA片段的AA基因型辣椒有茸毛，含有序列3和序列4的DNA片段的AB基因型辣椒有茸毛，含有序列4不含有序列3的DNA片段的BB基因型辣椒无茸毛。表明，本发明的辣椒分子标记适用性较强，在育种实际应用中可以利用该标记对辣椒有无茸毛进行快速鉴定，鉴定准确性可达99％。
附图说明
图1为引物对PW10-207对有茸毛自交系20079C/658与无茸毛自交系22045A/666的F1植株PCR扩增产物的电泳结果。
图2为引物对PW10-207对已知茸毛表型辣椒PCR扩增产物的电泳结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
下述实施例中的茸毛自交系20079C/658、无茸毛自交系22045A/666记载在文献“辣椒恢复基因连锁标记的适用性评价与应用_2015，米志波等”中，CM334记载在文献“Finemapping of Restorer-of-fertility in pepper(Capsicum annuum L.)identifed acandidate gene encoding a pentatricopeptide repeat(PPR)-containing protein_2016,Yeong Deuk Jo等”中，17C-109、17C-214、16Q-901、16Q-438和16Q-512为发明人实验室自交系材料，公众可从申请人处获得这些生物材料，这些生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、利用辣椒分子标记鉴定辣椒茸毛
1、辣椒分子标记
本实施例提供的辣椒分子标记为以辣椒的基因组DNA为模板、采用引物对PW10-207进行扩增得到的DNA分子。本发明的申请人发现该辣椒分子标记有两种序列：序列表中序列3和序列4。
其中，PW10-207由名称为PW10-207F和PW10-207R的单链DNA组成，PW10-207F为序列表中序列1所示的单链DNA，PW10-207R为序列表中序列2所示的单链DNA。
将引物对PW10-207的PCR产物含有序列4所示的DNA片段且不含有序列3所示的DNA片段的辣椒的基因型记为BB基因型，将PCR产物含有序列3所示的DNA片段且不含有序列4所示的DNA片段的辣椒的基因型记为AA基因型，将PCR产物含有序列3和序列4所示的DNA片段的辣椒的基因型记为AB基因型。
2、辣椒分子标记与辣椒茸毛的关系
利用以有茸毛自交系20079C/658(表现为茎叶部有茸毛)和无茸毛自交系22045A/666(表现为茎叶部光滑无茸毛)为试验材料，进行杂交，得到F1，F1自交获得包含600个单株的F2群体。鉴定各个F2单株、亲本有茸毛自交系20079C/658和无茸毛自交系22045A/666以及F1的基因型，并单株统计茎叶部有无茸毛。基因型鉴定方法如下：
提取各单株的基因组DNA，利用引物对PW10-207进行PCR扩增。
PCR扩增反应体系(20μl)为：基因组DNA 2μl、10×Buffer缓冲液2μl、dNTPs0.8μl、DNA聚合酶0.4μl、PW10-207F和PW10-207R(10μM)各0.2μl，用14.4μl ddH2O将总体积补齐至20μl。其中，10×Buffer缓冲液和DNA聚合酶均为宝生物工程(大连)有限公司产品。
PCR扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸7min。
PCR扩增产物用7％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色后观察照相。并对PCR扩增产物进行测序。部分植株电泳结果如图1所示，图1中，F1：20079C/658和22045A/666的F1代杂种；A：20079C/658；B：22045A/666。结果显示，所有植株的PCR产物在140-160bp间共有三种类型，第一种类型为含有序列4所示的DNA片段且不含有序列3所示的DNA片段(即含有158bp的DNA片段不含有163bp的DNA片段)，第二种类型为含有序列3和序列4的所示的DNA片段(即含有158bp和163bp的DNA片段)，第三种类型为含有序列3所示的DNA片段且不含有序列4所示的DNA片段(即含有163bp的DNA片段不含有158bp的DNA片段)。PCR产物为第一种类型的植株即为步骤1的BB基因型植株，PCR产物为第二种类型的植株即为步骤1的AB基因型植株，PCR产物为第三种类型的植株即为步骤1的AA基因型植株。
分析辣椒茎叶部有无茸毛与基因型的关系，结果发现，有茸毛自交系20079C/658为AA基因型；无茸毛自交系22045A/666为BB基因型；AB基因型的F1茎叶部表现为有茸毛；F2群体中，有172株为AA基因型，这些植株均表现为有茸毛；有267株为AB基因型，这些植株中264株有茸毛3株无茸毛；有149株为BB基因型，这些植株中145株无茸毛4株有茸毛。表明，本发明的辣椒分子标记及根据该分子标记确定的基因型与辣椒茎叶部有无茸毛相关，具体的，根据本发明的辣椒分子标记鉴定辣椒茎叶部是否有茸毛的方法如下：
利用PW10-207对待测辣椒基因组DNA进行扩增，检测PCR产物序列，如待测辣椒的PCR产物含有序列3不含有序列4的DNA片段(即为AA基因型辣椒)，该待测辣椒有茸毛；如待测辣椒的PCR产物含有序列3和序列4的DNA片段(即为AB基因型辣椒)，该待测辣椒有茸毛；如待测辣椒的PCR产物含有序列4不含有序列3的DNA片段(即为BB基因型辣椒)，该待测辣椒无茸毛。
根据上述结果，。利用本发明的辣椒分子标记鉴定辣椒茎叶部是否有茸毛的准确率为(172+264+145)/(172+267+149)×100％＝99％。
实施例2、实施例1的辣椒分子标记的应用
本实施例利用5份茎叶部无茸毛的辣椒自交系(17C-109；17C-214；16Q-901；16Q-438；16Q-512)以及5份茎叶部有茸毛的辣椒自交系或品种(CM334；17C-444；16Q-381；16C-1007；16Q-561)，对实施例1的辣椒分子标记进行验证。
利用实施例1中的引物对PW10-207按照实施例1中的PCR扩增反应体系与PCR扩增反应程序鉴定上述各辣椒的基因型。
结果如图2所示，图2中，泳道1：17C-109；泳道2：17C-214；泳道3：16Q-901；泳道4：16Q-438；泳道5：16Q-512；泳道6：CM334；泳道7：17C-444；泳道8：16Q-381；泳道9：16C-1007；泳道10：16Q-561。结果显示，茎叶部有茸毛自交系或品种(CM334；17C-444；16Q-381；16C-1007；16Q-561)的PCR扩增产物均含有大小为163bp的DNA片段且不含有158bp的DNA片段，这五个自交系或品种均为AA基因型植株；茎叶部无茸毛自交系(17C-109；17C-214；16Q-901；16Q-438；16Q-512)的PCR扩增产物均含有大小为158bp的DNA片段且不含有大小为163bp的DNA片段，这五个自交系或品种均为BB基因型植株。说明本发明的辣椒分子标记特异性高，可用于辣椒有无茸毛表型的鉴定和筛选。
<110> 中国农业大学
<120> 辣椒分子标记在鉴定辣椒植株有无茸毛中的应用
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
tagggctgtt gctggtgc 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
ctttgaggga ccggtttcct 20
<210> 3
<211> 163
<212> DNA
<213> 辣椒
<400> 3
tagggctgtt gctggtgccc gcaaacttgc ccacttcgtt cagtaatttg gacggtcttt 60
ccatctccca gccctgccct gccctgctct cccaacactc accaatcttt gtctcaaggg 120
ttggtatata tacgaaagag gttaggaaac cggtccctca aag 163
<210> 4
<211> 158
<212> DNA
<213> 辣椒
<400> 4
tagggctgtt gctggtgccc gcaaacttgc ccacttcgtt cagtaatttg gacggtcttt 60
ccatctccca gccctgccct gctctcccaa cactcaccaa tctttgtctc aagggttggt 120
atatatacga aagaggttag gaaaccggtc cctcaaag 158

Claims (10)

1.辣椒分子标记或其多态性在鉴定或辅助鉴定辣椒有无茸毛中的应用；
所述辣椒分子标记为以辣椒基因组DNA为模板，采用引物对PW10-207进行PCR扩增得到的DNA分子；
所述引物对PW10-207由名称分别为PW10-207F和PW10-207R的单链DNA组成，所述PW10-207F为辣椒基因组DNA中与序列表中序列3的第82位的上游特异结合的单链DNA，所述PW10-207R为辣椒基因组DNA中与序列表中序列3的第86位的下游特异结合的单链DNA。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述PW10-207F为序列表中序列1所示的单链DNA，所述PW10-207R为序列表中序列2所示的单链DNA。
3.鉴定辣椒基因型的方法，所述基因型为AA基因型、AB基因型和BB基因型；所述方法为下述O或P：
O、包括：检测待测辣椒基因组中对应于序列表中序列3的第82-86位的序列，如所述待测辣椒基因组中两条染色体均为下述g1)的染色体，所述待测辣椒为AA基因型辣椒；如所述待测辣椒基因组中两条染色体均为下述g2)的染色体，所述待测辣椒为BB基因型辣椒；如所述待测辣椒基因组中两条染色体一条为下述g1)的染色体、另一条为下述g2)的染色体，所述待测辣椒为AB基因型辣椒；
g1)对应于序列3的第82-86位为序列3的第82-86位；
g2)对应于序列3的第82-86位不为序列3的第82-86位；
P、包括如下P1)和P2)：
P1)以待测辣椒基因组DNA为模板，利用权利要求2中所述引物对PW10-207进行PCR扩增得到PCR产物；
P2)P2a)或P2b)：
P2a)检测步骤P1)得到的PCR产物的序列，如果所述PCR产物的序列为序列4，所述待测辣椒为BB基因型辣椒；如果所述PCR产物的序列为序列3和序列4，所述待测辣椒为AB基因型辣椒；如果所述PCR产物的序列为序列3，所述待测辣椒为AA基因型辣椒；
P2b)检测步骤P1)得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物含有158bp的DNA片段且不含有163bp的DNA片段，所述待测辣椒为BB基因型辣椒；如果所述PCR产物含有158bp和163bp的DNA片段，所述待测辣椒为AB基因型辣椒；如果所述PCR产物含有163bp的DNA片段且不含有158bp的DNA片段，所述待测辣椒为AA基因型辣椒。
4.鉴定辣椒有无茸毛的方法，包括：利用权利要求3所述方法鉴定待测辣椒的基因型，AA基因型待测辣椒有茸毛或候选有茸毛，AB基因型待测辣椒有茸毛或候选有茸毛，BB基因型待测辣椒无茸毛或候选无茸毛。
5.权利要求1或2中所述辣椒分子标记。
6.权利要求1或2中所述引物对PW10-207。
7.鉴定或辅助鉴定辣椒有无茸毛的系统，含有权利要求1或2中所述引物对PW10-207。
8.权利要求1或2中所述引物对PW10-207的下述任一应用：
X1、在鉴定或辅助鉴定辣椒有无茸毛中的应用；
X2、在制备鉴定或辅助鉴定辣椒有无茸毛产品中的应用。
9.权利要求3所述的方法在鉴定或辅助鉴定辣椒有无茸毛中的应用。
10.辣椒育种方法，包括：按照权利要求3所述的方法检测辣椒的基因型，选择AA或AB基因型的辣椒作为亲本进行育种。
CN201711212143.9A 2017-11-28 2017-11-28 辣椒分子标记在鉴定辣椒植株有无茸毛中的应用 Active CN107746897B (zh)

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