CN107734972B

CN107734972B - 用乳酸菌（lab）和芽孢杆菌两者接种的发酵奶

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Publication number: CN107734972B
Application number: CN201680039838.9A
Authority: CN
Inventors: K·彼杰里; 梅泰·戴尼斯·康托; 托马斯·简森; 帕特里克·德克斯
Original assignee: Section Hansen Co ltd
Current assignee: Section Hansen Co ltd
Priority date: 2015-07-09
Filing date: 2016-06-30
Publication date: 2021-11-23
Anticipated expiration: 2036-06-30
Also published as: RU2751166C2; CN107734972A; WO2017005601A1; JP2018518982A; US11684073B2; RU2018102562A3; BR112017027640B1; US20180199582A1; EP3319452A1; RU2018102562A; JP6849649B2; BR112017027640A2

Abstract

一种用于生产乳酸菌发酵奶制品的方法，包括用接种乳酸菌(LAB)和接种芽孢杆菌属细菌两者使奶发酵。

Description

用乳酸菌（LAB）和芽孢杆菌两者接种的发酵奶

技术领域

本发明涉及一种用于生产乳酸菌发酵奶制品的方法，包括用接种的乳酸菌(LAB)和接种的芽孢杆菌属细菌两者使奶发酵。

背景技术

乳酸菌(LAB)被广泛用于乳品行业中以制造不同的发酵奶制品，例如酸奶、奶酪等。

乳酸菌(LAB)已经实现了通常认为安全(Generally Recognized As Safe；GRAS)状态。

通常认为安全(GRAS)是一种美国食品药物监督局(FDA)指定，意思是添加到食品中的化学物或物质被专家视为安全的。

乳酸菌表示一种革兰氏阳性、微需氧或厌氧细菌，其发酵糖，同时产生酸，包括乳酸(作为主要产生的酸)、乙酸和丙酸。工业上最适用的乳酸菌被发现于“乳杆菌目(Lactobacillales)”和“放线菌目 (Actinomycetales)”中，乳杆菌目包括乳球菌属(Lactococcus spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、明串珠菌属(Leuconostoc spp.)、片球菌属(Pediococcus spp.)和肠球菌属(Enterococcus spp.)，放线菌目包括短杆菌属(Brevibacterium spp.) 和丙酸杆菌属(Propionibacterium spp.)。

芽孢杆菌属细菌本身不被视为乳酸菌。

现有技术描述使用芽孢杆菌属细菌本身(即不添加LAB发酵剂培养物，例如乳杆菌或乳球菌)制造发酵奶制品如酸奶，一个实例是例如US2009/0011081A1(参见下文)。

US2009/0011081A1描述使用纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis var.natto)菌株制造酸奶。纳豆枯草芽孢杆菌不被视为人病原体并且被归类为GRAS。纳豆枯草芽孢杆菌菌株能够抑制某些不期望的其它细菌(例如不期望的大肠杆菌)的增殖，并且其可以产生保健化合物纳豆激酶，它被视为在血栓形成治疗中是有潜力的，因而由纳豆枯草芽孢杆菌菌株制造的酸奶可以提供预防心血管疾病的功效。

US5077063描述使用枯草芽孢杆菌菌株制造发酵奶制品。其描述由芽孢杆菌属细菌菌株产生的抗菌物质确保制备具有长保存期并且具有活性治疗和预防特性的产品。

简言之，现有技术描述使用芽孢杆菌属细菌本身，因为例如芽孢杆菌属细菌本身具有正面抗菌和治疗特性。

CN103300147A描述一种使用两步法制造发酵奶的方法。在第一步中，用枯草芽孢杆菌发酵奶以使脱脂奶中的蛋白质被芽孢杆菌产生的蛋白酶降解成氨基酸或多肽。在第二步中，将乳酸菌(植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum))添加到早先用芽孢杆菌发酵的奶中，然后进行乳酸菌发酵(即降低pH-酸化作用)。在摘要中据说这种两步程序为植物乳杆菌的生长提供优势。

在第一步中，用枯草芽孢杆菌发酵奶48小时(参见例如[0018])，随后(步骤二)添加植物乳杆菌。

Rossland等人的论文(受控乳酸发酵对奶中的蜡样芽孢杆菌的生长和孢子形成的影响(Influence of controlled lactic fermentation on growth and sporulation ofBacillus cereus in milk.)International journal of food microbiology,103(1),第69-77页(2005))涉及对乳杆菌或乳球菌抑制蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)生长和孢子形成的能力的研究。蜡样芽孢杆菌被视为不期望的病原体并且容易污染许多类型的食品，因此其显然不具有GRAS状态。为了进行分析，用少量(10²群落形成单位(cfu)/ml)的蜡样芽孢杆菌和乳杆菌或乳球菌菌株接种奶，并共培养/共发酵。只用少量的蜡样芽孢杆菌接种是为了和该篇论文的目的一致，该篇论文涉及对乳杆菌或乳球菌抑制蜡样芽孢杆菌病原体生长的能力的研究，并且因此不涉及生产商业相关的发酵奶制品(例如酸奶或奶酪)本身。显而易见，该篇论文因此不涉及生产商业相关的发酵奶制品(例如酸奶或奶酪)本身，因为所属领域技术人员不会用致病的蜡样芽孢杆菌接种奶来制造例如酸奶。

CN103190478A公开一种用于制备包括果聚糖(levan)的酸奶的方法，包括以下步骤：1)培养产果聚糖蔗糖酶的细菌菌株以获得含有由所述菌株分泌的果聚糖蔗糖酶的发酵液，2)离心步骤1)中获得的发酵液以分离上清液和细菌细胞，3)将硫酸铵添加到上清液中以沉淀酶蛋白，离心以获得蛋白质沉淀，并纯化蛋白质沉淀以获得纯果聚糖蔗糖酶，和4)将蔗糖和步骤3)中获得的纯果聚糖蔗糖酶添加到原料奶中，用乳酸菌接种，并发酵混合物以获得含有果聚糖的酸奶。产果聚糖蔗糖酶的细菌菌株可以是例如地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)ATCC14580和枯草芽孢杆菌ATCC6051。乳酸菌可以是例如保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)CICC6046和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CICC6038或其混合物。

KR20090039941A公开一种使用插田泡(Rubus coreanus Miq) (Bokbunja)和小球藻(chlorella)的混合物，使用乳酸菌和芽孢杆菌的混合物制造功能型发酵物质的方法。

US-A-3 674 508在实施例中公开一种使用嗜热链球菌和嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stereothermophilus)的组合以获得具有奶酪风味的产品，从而制造具有奶酪风味的发酵奶制品的方法。

发明内容

欲通过本发明解决的问题是提供一种用于制造乳酸菌发酵奶制品(例如乳制食品，如酸奶)的方法，其中乳酸发酵更迅速地达到期望的较低pH水平(例如约4.5的pH)。

所属领域中已知芽孢杆菌属细菌在低pH下通常不能最佳地生长。

因此，CN103300147A的现有技术两步法(以上论述)表面上看起来对于所属领域技术人员是优选的，因为在添加LAB发酵剂培养物的第二步骤之前只用芽孢杆菌发酵约48小时的第一步骤看起来将确保芽孢杆菌具有足够时间以在约pH＝6的奶中性pH下适当地作用。

本发明人测试了此类与现有技术相关的两步法。

如本文中的工作实施例1中可见，被测试的现有技术的两步法对于短小芽孢杆菌并不适当地作用。

先用短小芽孢杆菌预孵育和发酵24小时(即现有技术两步法中的第一步)，后用嗜热链球菌发酵(即现有技术两步法中的第二步) 得到了分成两个相(参见图1上面的图片)并且具有不期望的黄色(参见图1下面的图片)的发酵奶。这种相分离和颜色显现会在芽孢杆菌预孵育概念(即现有技术的两步法)的应用期间引起显著问题。

如本文的实施例1中进一步论述的(也参见本文的图2)，对于被测试的现有技术的两步法，与单独的嗜热链球菌菌株相比，酸化活性并没有提高。

本文的实施例2的结果基本上证实了对于枯草芽孢杆菌获得了与实施例1的短小芽孢杆菌一样的结果，因为现有技术的两步法对于枯草芽孢杆菌并不适当地作用。

如本文中所论述的，本发明人测试了不同的一步发酵法(即用芽孢杆菌和乳酸菌两者只进行一个乳酸发酵步骤)。

与被测试的现有技术的两步法相反，本发明的一步发酵法(例如用芽孢杆菌和乳酸菌两者的仅一个乳酸发酵步骤)非常好地作用，即获得了酸化活性的显著提高(参见本文的许多工作实施例)。

此外并且如本文的工作实施例中所论述的，本发明的一步发酵法得到商业相关的优良发酵奶制品(即不具有例如不期望的相分离和颜色显现，参见例如本文的工作实施例6)。

以下表格显示不同的芽孢杆菌和乳酸菌，其在本文的不同工作实施例中被证明在本发明的一步发酵法中适当作用，即其中乳酸发酵更迅速地达到期望的降低的pH水平(例如约4.5的pH)。

因此，本发明的一步发酵法已被证明对许多不同的芽孢杆菌物种和对于来自不同属的3种不同LAB有效。

不受限于理论，因此没有明显的技术原因令人相信它不应该是所谓的类属作用(class effect)，即没有明显的技术原因令人相信本发明不应该对基本上所有的本文相关的芽孢杆菌细胞与LAB细胞的组合生效。

此外，如例如本文的工作实施例6中所示，对于特定的感兴趣的 LAB(例如链球菌)，相对容易设立小规模(例如1ml奶)筛选试验以鉴别合适的良好工作的芽孢杆菌菌株。

因此，本发明的第一方面涉及一种用于生产乳酸菌发酵奶制品的方法，包括以下步骤：

(a)：在合适条件下在22℃到45℃的温度下用10⁴到10¹²cfu/ml 的接种乳酸菌(LAB)和10⁴到10¹²cfu/ml的接种芽孢杆菌属细菌使奶发酵，直到发酵奶达到3.5到5.5的期望pH并且其中所述奶的芽孢杆菌属细菌发酵在所述奶的LAB发酵开始之前5小时到之后4小时的时期范围内开始；和

其中步骤(a)中的接种芽孢杆菌属细菌是选自由以下组成的组的至少一种芽孢杆菌属细菌：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、弯曲芽孢杆菌(Bacillusflexus)、梭形芽孢杆菌(Bacillus fusiformis)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)、暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)、简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)、索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)、枯草芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)和死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)。

所有以上刚刚列出的芽孢杆菌属细菌类型都被视为是健康的并且因此不会致病。

如以上所论述，蜡样芽孢杆菌被视为致病的，并且此种致病芽孢杆菌的使用因此在制造例如食品/饲料产品的本发明背景下没有商业利益。

举例来说，对于欲添加到食品和饲料中的QPS生物试剂的清单的维持的欧盟(EU)欧洲食品安全局(EFSA)生物危害专家组 (BIOHAZ)科学意见(2013年更新)(The EuropeanUnion(EU) European Food Safety Authority(EFSA)Panel on Biological Hazards(BIOHAZ)Scientific Opinion on the maintenance of the list of QPS biologicalagents intentionally added to food and feed(2013update))关于第一方面的方法中列出的芽孢杆菌属细菌类型提到：“不存在产毒素活性(Absence of toxigenicactivity)”。

相同的EFSA 2013报告关于蜡样芽孢杆菌提到：“致病性有增加的迹象(There isincreasing evidence of pathogenicity)”。

以上引述的EFSA 2013报告的引用参考文献是“EFSA Journal 2013；11(11):3449[108pp.].doi:10.2903/j.efsa.2013.3449”，并且在本申请的提交日期，它可以通过以下链接下载到：http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/doc/3449.pdf

如例如本文的工作实施例7中所论述，相信通过在本文所述的第一方面的方法的步骤(a)中使用小于约10⁴cfu/ml(优选地约10⁵cfu/ml) 的芽孢杆菌属细菌，所描述的第一方面的方法在商业上可接受的水平下不生效。

如上所论述——在Rossland等人(2005)的论文中，用少量(10² cfu/ml)的蜡样芽孢杆菌接种奶，这和该篇论文的目的一致，该篇论文涉及研究乳杆菌或乳球菌抑制蜡样芽孢杆菌病原体生长的能力，并且因此不涉及生产商业相关的发酵奶制品(例如酸奶或奶酪)。

因此，通过使用少量(10²cfu/ml)的在Rossland等人(2005)的论文中公开的芽孢杆菌属细菌，在本文实施例中测试的非致病性芽孢杆菌属细菌并没有适当地作用。

如上文所论述，第一方面的步骤(a)的主要目的是在LAB和芽孢杆菌属细菌两者的存在下进行一步同时发酵。

显然，如果LAB和芽孢杆菌属细菌在相同时间点接种到奶中，那么获得一步同时发酵。

然而，如所属领域技术人员在本发明背景下所理解的，人们可以在相对短的时期范围内在不同时间点将LAB和芽孢杆菌属细菌接种到奶中，这个事实在第一方面的步骤(a)中得到反映，其中写到：“并且其中所述奶的芽孢杆菌属细菌发酵在所述奶的LAB发酵开始之前5小时到之后4小时的时期范围内开始”。

对于所属领域技术人员来说，确定“奶的LAB发酵的开始”(例如通过测量奶中增加的乳酸量和/或通过测量pH酸化作用)是常规工作，并且对于所属领域技术人员来说，鉴别奶的芽孢杆菌属细菌发酵开始的适当时间点(例如通过适当选择接种芽孢杆菌属细菌的时间点)以便满足以上时期范围标准当然也是常规工作。

关于步骤(a)，在本发明背景中应了解“芽孢杆菌属细菌发酵的开始”和“奶的LAB发酵的开始”不能在奶具有适合于细菌发酵的温度之前，并且应了解在实践中实际上所有本文中的商业相关的细菌菌株在22℃以下和45℃以上的温度下都不具有显著发酵。

因此，如果例如芽孢杆菌属细菌在第1天接种到奶中，然后在 5℃下储存例如24小时，那么在5℃下的这个储存期期间不存在关于步骤(a)的“芽孢杆菌属细菌发酵的开始”，这基本上是因为芽孢杆菌细胞在5℃下是基本上无活性的并且因此本身不会使奶发酵。

因此，如果在第2天将乳酸菌接种到含有芽孢杆菌的在5℃储存的奶中，然后将温度升高到合适温度(例如37℃)，那么将理解该实施例中的“芽孢杆菌属细菌发酵的开始”和“奶的LAB发酵的开始”将处于相同时间(即当奶的温度达到适合于细菌的温度并且显著的芽孢杆菌/LAB发酵实际上开始时的时间)。

如在本文的工作实施例中所论述的，使用芽孢杆菌细胞本身(单独)的发酵并不显著降低pH。

因此并且不受限于理论，本文公开的实验结果证明当根据本文所述的第一方面的一步发酵法共培养时，芽孢杆菌以某种方式或其它方式增加/提高LAB本身的pH降低能力。

如本文的工作实施例1中所示，关于本文所述的一步法，测试的短小芽孢杆菌菌株在本发明的第一方面的发酵步骤(a)中似乎没有显著生长。事实上，它们在发酵过程期间基本上死亡(可能是因为pH 的降低)。这可被视为优点，因为在最终的乳酸菌发酵奶制品中可能没有芽孢杆菌细胞存在或只有很少的芽孢杆菌细胞存在。

如本文的工作实施例5中所论述的，本发明人进行了实验以验证现有技术理论(参见例如以上论述的CN103300147A)，其涉及芽孢杆菌菌株的蛋白水解系统负责LAB的生长促进作用。

将蛋白酶阴性乳酸乳球菌菌株与正常乳酸乳球菌菌株比较，如果芽孢杆菌菌株的蛋白水解系统是主要因素，那么人们将预期蛋白酶阴性LAB相比正常LAB获得相对更高的pH降低作用。

然而，在实施例5的实验中，与测试的其它正常乳酸乳球菌菌株相比，蛋白酶阴性乳酸乳球菌菌株的生长没有得到很大促进。

因此并且不受限于理论，看起来芽孢杆菌细胞的蛋白水解系统不是负责本文中论述的改善/提高LAB生长的积极协同作用的唯一重要因素。

简言之并且基于本文中公开的实验结果，看起来芽孢杆菌细胞在同时共培养期间对LAB细胞作出积极贡献。

此外，相信芽孢杆菌属细菌的积极影响非常重要，尤其在奶的 LAB乳酸发酵开始时。

如例如在本文中的工作实施例9中所论述的，通过例如使用合适的选定芽孢杆菌细胞，人们可以制造具有其它商业相关特性(例如改进的质地特性和/或增加的维生素K的量)的发酵奶制品。

本发明另外涉及一种用于生产乳酸菌发酵奶制品的组合物，包括发酵剂培养物，所述发酵剂培养物包括至少一种乳酸菌和选自由以下组成的组的至少一种芽孢杆菌属细菌：解淀粉芽孢杆菌、阿耶波多氏芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌、梭形芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、莫海威芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌和死亡谷芽孢杆菌。

本发明另外涉及芽孢杆菌属细菌用于生产乳酸菌发酵奶制品的用途，包括在合适条件下在22℃到45℃的温度下用10⁴到10¹²cfu/ml 的接种乳酸菌(LAB)和10⁴到10¹²cfu/ml的接种芽孢杆菌属细菌使奶发酵，直到发酵奶达到3.5到5.5的期望pH并且其中所述奶的芽孢杆菌属细菌发酵在所述奶的LAB发酵开始之前5小时到之后4小时的时期范围内开始；和

其中所述芽孢杆菌属细菌是选自由以下组成的组的至少一种芽孢杆菌属细菌：解淀粉芽孢杆菌、阿耶波多氏芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌、梭形芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、莫海威芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌和死亡谷芽孢杆菌。

定义

本文中的相关术语的所有定义都和技术人员关于本文中的相关技术背景所理解的内容一致。

本发明背景下的术语“细菌”是复数，因为在这里谈论例如仅包括一单一细菌的本文相关的乳酸菌发酵奶制品毫无意义。

“发酵”意味着涉及通过微生物作用从有机底物释放能量的生化反应。

术语“发酵奶制品”是指旨在用于动物、更具体地人的消耗并且源于细菌发酵奶底物的产品。这些产品可以含有次要成分，例如水果、蔬菜、糖、香味剂等。

如本文中所用，术语“乳酸菌”表示一种革兰氏阳性、微需氧或厌氧细菌，其发酵糖，同时产生酸，包括乳酸(作为主要产生的酸)、乙酸和丙酸。工业上最有用的乳酸菌被发现于“乳杆菌目 (Lactobacillales)”和“放线菌目(Actinomycetales)”中，乳杆菌目包括乳球菌属(Lactococcus spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、明串珠菌属(Leuconostoc spp.)、片球菌属(Pediococcus spp.)和肠球菌属(Enterococcus spp.)，放线菌目包括短杆菌属(Brevibacterium spp.)和丙酸杆菌属 (Propionibacterium spp.)。另外，属于严格厌氧菌双歧杆菌(即双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.))的组的产乳酸细菌一般被包括在乳酸菌的组内。这些通常被单独地或与其它乳酸菌组合用作食品培养物。

术语“乳酸发酵”表示发酵物中的细菌消耗乳糖的厌氧或微需氧过程，其导致形成乳酸，并且可能形成乙酸，同时降低pH。

术语“乳酸菌发酵奶制品”是指旨在用于动物、更具体地人的消耗并且源于乳酸菌对奶底物的酸化乳酸发酵的产品。这些产品可以含有次要成分，例如水果、蔬菜、糖、香味剂等。

在本发明背景下，术语“奶”包括哺乳动物或植物的奶。奶的实例是牛奶(牛乳)、骆驼奶、水牛奶、山羊奶、绵羊奶和豆奶。任选地，奶例如通过添加酸(例如柠檬酸、乙酸或乳酸)被酸化，或例如与水混合。奶可以是未加工的或经过加工的，例如通过过滤、灭菌、巴氏灭菌、均质化等，或者其可以是复原奶粉(reconstituted dried milk)。根据本发明的“牛乳”的一个重要实例是巴氏灭菌牛奶。应了解奶可以在接种细菌之前、期间和/或之后被酸化、混合或加工。

在本发明背景下，发酵奶“发酵剂培养物”是细菌培养物，包括选自由乳酸乳球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌组成的组的乳酸菌的至少一种菌株。根据本文，发酵奶制品可通过用添加的菌株接种奶并发酵奶来获得。典型地，用于酸奶的发酵剂培养物包括嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种，并且在大多数国家，酸奶在法律上被定义成使用包括两种所述菌株的发酵剂培养物制造的发酵奶制品。

以下仅通过实例描述本发明的实施方案。

附图说明

图1：用预孵育的短小芽孢杆菌菌株CHCC5042获得的奶分成两个相(参见图1上面的图片)。利用预孵育的短小芽孢杆菌菌株 CHCC16735的奶仍然是黄色(参见图1下面的图片)。关于其它细节请参见本文中的工作实施例1。

图2：使用短小芽孢杆菌和嗜热链球菌的酸化实验的结果。关于其它细节请参见本文中的工作实施例1。

图3：使用枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和嗜热链球菌的酸化实验的结果。关于其它细节请参见本文中的工作实施例3。

图4：涉及用不同浓度的短小芽孢杆菌CHCC16735对嗜热链球菌CHCC4460进行生长刺激的实验的结果。关于其它细节请参见本文中的工作实施例7。

图5：涉及嗜热链球菌和芽孢杆菌的预先共培养的实验的结果。关于其它细节请参见本文中的工作实施例8。

具体实施方式

如技术人员所了解的，本文中相关的优选实施方案的组合将被理解成甚至更优选的，例如优选乳酸菌(LAB)连同优选芽孢杆菌属细菌的使用被理解成甚至更优选的。

用LAB和芽孢杆菌属细菌两者发酵奶-第一方面的步骤(a)

如以上所论述，第一方面的步骤(a)涉及在合适条件下在22℃到 45℃的温度下用10⁴到10¹²cfu/ml的接种乳酸菌(LAB)和10⁴到10¹² cfu/ml的接种芽孢杆菌属细菌使奶发酵，直到发酵奶达到3.5到5.5 的期望pH并且其中所述奶的芽孢杆菌属细菌发酵在所述奶的LAB 发酵开始之前5小时到之后4小时的时期范围内开始。

如技术人员在本发明背景下所了解的，步骤(a)中的术语“接种”涉及乳酸菌和芽孢杆菌属细菌被主动添加到奶中。

在步骤(a)中可以添加不同类型的芽孢杆菌属细菌的混合物，但所述不同类型应该是处于第一方面或其优选实施方案的列表内的类型。

举例来说，在步骤(a)中可以接种例如10⁵cfu/ml的短小芽孢杆菌和10⁵cfu/ml的枯草芽孢杆菌，这总共导致在步骤(a)中添加/接种 2×10⁵cfu/ml的芽孢杆菌属细菌。

在本发明的一个优选实施方案中，步骤(a)中的接种芽孢杆菌属细菌是选自由以下组成的组的至少一种芽孢杆菌属细菌：解淀粉芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、梭形芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、莫海威芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和死亡谷芽孢杆菌。

优选地，步骤(a)中的接种芽孢杆菌属细菌是选自由以下组成的组的至少一种芽孢杆菌属细菌：解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。

优选地，步骤(a)中的接种芽孢杆菌属细菌是选自由以下组成的组的至少一种芽孢杆菌属细菌：短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。

优选的枯草芽孢杆菌可以是纳豆枯草芽孢杆菌。

优选地，步骤(a)中的接种乳酸菌是选自由以下组成的组的至少一种乳酸菌：乳球菌属、链球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、片球菌属和肠球菌属、短杆菌属和丙酸杆菌属。

类似于芽孢杆菌属细菌，在步骤(a)中可以添加不同类型的乳酸菌的混合物，例如链球菌属与乳杆菌属的混合物。

更优选地，步骤(a)中的接种乳酸菌是选自由以下组成的组的至少一种乳酸菌：乳球菌属、链球菌属和乳杆菌属。

乳酸菌选自由乳球菌属、链球菌属和乳杆菌属组成的组并且芽孢杆菌属细菌选自由短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌组成的组可能是甚至更优选的。

甚至更优选地，步骤(a)中的接种乳酸菌是选自由以下组成的组的乳酸菌：嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和乳酸乳球菌。

在本文中的工作实施例中确认了对于嗜热链球菌的尤其良好的积极作用。

因此，步骤(a)中的接种乳酸菌是嗜热链球菌可能是优选的。

步骤(a)中的接种乳酸菌是嗜热链球菌并且第一方面的步骤(a)中的接种芽孢杆菌属细菌是选自由短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌组成的组的至少一种芽孢杆菌属细菌可能是尤其优选的。

优选地，在步骤(a)中使用10⁵到10¹¹cfu/ml的接种乳酸菌 (LAB)，更优选地在步骤(a)中使用10⁶到10¹⁰cfu/ml的接种乳酸菌 (LAB)。

优选地，在步骤(a)中使用2×10⁴到10¹⁰cfu/ml的接种芽孢杆菌属细菌，更优选地在步骤(a)中使用10⁵到10⁹cfu/ml的接种芽孢杆菌属细菌，并且甚至更优选地在步骤(a)中使用10⁶到10⁸cfu/ml的接种芽孢杆菌属细菌。

对于技术人员来说，鉴别适合的发酵条件以得到期望pH值的是常规工作，这通常取决于具体使用的LAB和芽孢杆菌属细菌。

合适的条件可以包括：

(i)：22℃到45℃，优选地32℃到42℃，例如36℃到38℃的温度；

(ii)：2小时到100小时，例如3小时到48小时或例如10小时到 30小时的发酵时期。

一般来说并且如技术人员已知的，优选/最佳的发酵温度将取决于所用的LAB。举例来说，某种LAB在约25℃下具有最佳生长，而其它LAB在约37℃下具有最佳生长。

取决于目的发酵奶制品，期望pH可以是4到5的pH，例如4.4 到4.6的pH。

优选地，奶的芽孢杆菌属细菌发酵在奶的LAB发酵开始之前3 小时到之后2小时的时期范围内开始，例如奶的芽孢杆菌属细菌发酵在奶的LAB发酵开始之前2小时到之后1小时的时期范围内开始。

更优选地，奶的芽孢杆菌属细菌发酵在奶的LAB发酵开始之前 1小时到之后30分钟的时期范围内开始。

甚至更优选地，奶的芽孢杆菌属细菌发酵在奶的LAB发酵开始之前30分钟到之后15分钟的时期范围内开始。

最优选地，奶的芽孢杆菌属细菌发酵在奶的LAB发酵开始之前 5分钟到之后5分钟的时期范围内开始。

如技术人员在本发明背景下所了解的，如果在步骤(a)中在适合于发酵奶的条件(例如37℃的温度等等)下将芽孢杆菌属细菌接种到奶中，那么奶的芽孢杆菌属细菌发酵的开始实际上与奶的接种同时。

对于乳酸菌来说，情况同样如此，即如果在步骤(a)中在适合于发酵奶的条件(例如37℃的温度等等)下将LAB接种到奶中，那么奶的LAB发酵的开始实际上与奶的接种同时。

显然，如果LAB和芽孢杆菌属细菌在大约相同的时间点接种到奶中，那么获得一步同时发酵。

因此，第一方面的方法和本文中描述的其实施方案的一个优选实施方案是在步骤(a)中将乳酸菌和芽孢杆菌属细菌在小于5小时(优选地小于2小时，更优选地小于1小时，甚至更优选地小于20分钟并且最优选地小于5分钟)的时期范围内接种到奶中。

如技术人员关于上一段所了解的，如果例如芽孢杆菌属细菌首先接种到奶中，那么乳酸菌应在所需的优选时间范围(例如其后5分钟)内接种到奶中。

当然也适用的是：如果乳酸菌首先接种到奶中，那么芽孢杆菌属细菌应在所需的优选时间范围内接种到奶中。

第一方面的方法和本文中描述的其实施方案的一个优选实施方案是步骤(a)中的发酵奶比在与第一方面的方法中相同的条件下进行的对比方法中更快地达到pH＝4.5，相同的条件除了在所述对比方法中没有用步骤(a)中的芽孢杆菌属细菌对奶进行任何接种。

对于技术人员来说，进行此类真实对比分析是常规工作，其例如在本文中的工作实施例1中常规进行。在本发明的一个特定实施方案中，对比方法如下进行：

将芽孢杆菌菌株接种在MRS肉汤中并在37℃下孵育过夜。离心过夜培养物，并将沉淀再悬浮于1倍体积的B-奶(B-milk)(9.5％脱脂奶，在99℃下煮沸30分钟)中。将嗜热链球菌菌株在含有2％乳糖的M17中在37℃下预生长，离心，并再悬浮于1倍体积的B-奶中。

对于酸化实验，将再悬浮的芽孢杆菌和嗜热链球菌菌株各自以 1％接种到200mlB-奶(9.5％脱脂奶，在99℃下煮沸30分钟)中。通过用PC记录器过夜测量pH来跟踪37℃下在水浴中的酸化作用。

如技术人员所了解的，对比方法应当相同(除了没有用芽孢杆菌属细菌对奶进行任何接种)，即其它一切(例如步骤(a)中发酵的奶的量(例如200ml或100L)；温度等)都应当和第一方面的方法相同 (即在步骤(a)中接种LAB)。

在一个优选实施方案中，步骤(a)中的发酵奶比在与第一方面的方法中相同的条件下进行的对比方法中早30分钟(更优选地1小时，并且甚至更优选地2小时)达到pH＝4.5，所述相同的条件除了在所述对比方法中没有用步骤(a)中的芽孢杆菌属细菌对奶进行任何接种。

在本发明的一个具体实施方案中，步骤(a)中获得的发酵奶与在相同条件(但没有接种芽孢杆菌属细菌)下进行的步骤(a)中获得的发酵奶相比具有增加的质地，如通过质地比较方法所测量。所述质地对比方法可以是如下进行的测量剪应力的一种方法：

在孵育后一天，使发酵奶达到13℃并借助于配备有穿孔盘 (perforated disc)的棒子轻轻搅拌，直到样品变得均质。在流变仪(具备自动样品更换器(Automatic SampleChanger；ASC)的Anton Paar Physica流变仪,Anton

GmbH,Austria)上评估样品的流变性质。设定如下：

等待时间(用于重建成稍微原始的结构)

5分钟，不进行振荡或旋转

振荡(用于测量G’和G”，从而计算G^*)

y＝0.3％,频率(f)＝[0.5…8]Hz

历经60秒的6个测量点(每10秒一个)

旋转(用于测量300 1/s下的剪应力)

和

历经210秒的21个测量点(每10秒一个)，达到300 1/s。

和

历经210秒的21个测量点(每10秒一个)，达到0.3 1/s。

为了进一步分析，选择300 1/s下的剪应力。

优选地，第一方面的步骤(a)中的奶是牛奶、骆驼奶、水牛奶、山羊奶或绵羊奶，更优选地，第一方面的步骤(a)中的奶是牛奶。

优选的是，本文所述的第一方面的方法是商业相关的相对大规模的生产方法。

因此，优选的是，第一方面的步骤(a)中的奶量是至少100L的奶量，更优选地至少1000L的奶量，甚至更优选地至少10000L的奶量。

优选的是，制造包括本文所需量的乳酸菌(LAB)和芽孢杆菌属细菌两者的发酵剂培养物组合物，然后在第一方面的步骤(a)中使用这个发酵剂培养物组合物接种奶。

因此，在一个优选实施方案中，通过使用包括所需量的乳酸菌 (LAB)和芽孢杆菌属细菌两者的单一发酵剂培养物组合物在第一方面的步骤(a)中接种奶。

优选的是，已经通过LAB和芽孢杆菌属细菌的先前共培养获得了所述单一发酵剂培养物组合物。

用于生产发酵奶制品的方法的其它步骤

技术人员知道如何制造乳酸菌发酵奶制品(例如酸奶或奶酪产品)，因此，没有必要在本背景中非常详细地描述步骤(a)、即发酵步骤之后的其它步骤。

其它步骤可以包括将发酵奶制品简单包装到合适包装中的步骤。合适包装因此可以是瓶子、纸盒或类似物，并且合适的量可以是例如 10mL到5000mL或50mL到1000mL。

当发酵奶制品是奶酪时，其它步骤可以包括将凝固物切割成奶酪凝乳颗粒以便分离乳清和奶酪凝乳的步骤。

取决于目的发酵奶制品的类型，其它步骤可以包括例如添加其它相关细菌或例如使用相关奶凝固酶(milk-clotting enzyme)，例如凝乳酶和胃蛋白酶。

优选地，乳酸菌发酵奶制品是乳制食品。

优选地，乳酸菌发酵奶制品是选自由以下组成的组的发酵奶制品：开菲尔(kefir)、酸奶(yogurt)、奶酪(cheese)、酸奶油(sour cream)、法式酸奶油(Crèmefraiche)、马奶酒(Kumis)、发酵酪乳(Cultured buttermilk)和酸乳(Acidophilus milk)。

优选地，乳酸菌发酵奶制品选自由酸奶和奶酪组成的组。在一个具体实施方案中，乳酸菌发酵奶制品是酸奶。在一个具体实施方案中，乳酸菌发酵奶制品是奶酪。

实施例

如果没有另外说明的话，以下实施例中使用的奶就是所谓的B- 奶(B-milk)(9.5％复原脱脂奶，在99℃下热处理30分钟)。B-奶是牛奶。

实施例1：对比实验-与本发明的一步发酵法比较的现有技术的两步法-短小芽孢杆菌和嗜热链球菌

如以上所论述的，现有技术-例如CN103300147A描述一种使用两步法制造发酵奶的方法。在第一步骤中用枯草芽孢杆菌发酵奶 (CN103300147A中48小时)，并在第二步骤中将乳酸菌添加到先前用芽孢杆菌发酵的奶中，然后进行乳酸菌发酵(即降低pH-酸化作用)。

如本工作实施例1中所论述的，本发明人比较了现有技术的两步法与本发明的一步同时方法。

单独的短小芽孢杆菌：

将短小芽孢杆菌CHCC5042和CHCC16735从冷冻安瓿各自接种到3×5ml BHI肉汤中，并在37℃和150rpm下ON(过夜)孵育。

将4×200ml B-奶转移到4个摇瓶中并将短小芽孢杆菌菌株5042 和16735以1％各自(从脑心浸液培养基(BHI)中的过夜培养物) 接种到2个瓶子中。它们在37℃和150rpm下孵育24小时。

5042和16735也从冷冻安瓿接种到5ml BHI肉汤中并以相同的方式孵育。

具有16735的24小时瓶子变成黄色。在二者瓶子中(即对于5042 和16735两者)都有一些泡沫形成。

使用短小芽孢杆菌和嗜热链球菌的酸化实验：

将24小时短小芽孢杆菌培养物从摇瓶转移到200ml无菌瓶中。

离心BHI中的短小芽孢杆菌过夜培养物，并将沉淀各自再悬浮于 5ml B-奶中。

将嗜热链球菌(ST)CHCC4895和CHCC4460接种到M17+2％乳糖中并在37℃下孵育过夜。

离心11ml的嗜热链球菌过夜培养物并将其再悬浮于11ml B-奶中。

1.来自摇瓶24小时的5042以1％接种到B-奶中

2.来自摇瓶的24小时5042培养物+1％4895

3.来自摇瓶的24小时5042培养物+1％4460

4.来自摇瓶24小时的16735以1％接种到B-奶中

5.来自摇瓶的24小时16735培养物+1％4895

6.来自摇瓶的24小时16735培养物+1％4460

7.1％4895

8.1％4895+1％5042(在BHI中过夜)

9.1％4895+1％16735(在BHI中过夜)

10.1％4460

11.1％4460++1％5042(在BHI中过夜)

12.1％4460++1％16735(在BHI中过夜)

13.B-奶

在37℃下在水浴中酸化。通过PC记录器过夜测量pH。

使用短小芽孢杆菌和嗜热链球菌的酸化实验的结果：

含有预孵育的短小芽孢杆菌菌株CHCC5042的培养物分成两个相(参见图1上面的图片，其涉及实验#2(参见上文))。

含有预孵育的短小芽孢杆菌菌株CHCC16735的培养物仍然是黄色(参见图1下面的图片，其涉及实验#5(参见上文))。

相分离和颜色显现会在芽孢杆菌预孵育概念的应用期间引起显著问题。

如在本文的图2中可以看到：

具有预孵育的短小芽孢杆菌菌株的瓶子在更高pH下开始。

与单独的嗜热链球菌菌株相比，酸化活性没有提高。最终pH也比单独的嗜热链球菌高得多。

以下表1显示在一些时间点时的图2的一些pH值+达到pH＝5时的时间(从图2直接读取的近似数)：

如以上所论述的：

实验编号7是单独的嗜热链球菌4895(即对照组)；

实验编号8是嗜热链球菌4895+芽孢杆菌1％5042

实验编号9是嗜热链球菌4895+芽孢杆菌1％16735

这些实验8和9根据本发明的一步共培养发酵法进行，并且结果是乳酸发酵显著更快地达到期望较低pH水平，例如显著更快地达到pH＝5和pH＝4.5。

对于嗜热链球菌4460菌株(比较#11和#12与对照组#10)获得类似的阳性结果。

用芽孢杆菌细胞本身(单独)发酵没有显著降低pH(参见#1和 #4)。

发酵期间短小芽孢杆菌的生长分析：

培养物8和9平铺到BHI上：

在这里分析短小芽孢杆菌连同嗜热链球菌的效果是因为芽孢杆菌在奶中的生长还是因为其他原因。培养物8和9因此在接种之后，孵育之前以10^-1到10^-4的稀释度平铺到BHI琼脂上，并在第二天再次平铺以观察它们是否生长。

同时将嗜热链球菌4895划线到BHI琼脂上以观察其在平板上是否可以生长。平板在37°下有氧孵育。

在发酵后，将培养物8和9稀释10倍，并以10^-3-10^-6的稀释度再次平铺在BHI琼脂上。平板在37°下有氧孵育过夜。

CHCC4895平铺在BHI上的结果：菌株不在平板上生长。

培养物8和9平铺到BHI琼脂上的结果：

	时间0	时间18h
			5042	7,4E+06	1,0E+04
16735	1,0E+07	2,0E+04

没有对CHCC4895计数，它在平板上只有非常微弱的生长。

大多数的芽孢杆菌细胞似乎在用嗜热链球菌酸化期间已被清除，这可能是因为低pH。

总而言之，没有短小芽孢杆菌菌株的显著生长。事实上，它们在发酵过程期间基本上死亡(可能是因为pH的降低)。

这可被视为优点，因为在最终的乳酸菌发酵奶制品中没有芽孢杆菌细胞存在或只有很少的芽孢杆菌细胞存在。

结论：

本实施例1的结果证明现有技术的两步法对于短小芽孢杆菌没有适当地作用。

先用短小芽孢杆菌预孵育和发酵24小时(即现有技术两步法中的第一步)，后用嗜热链球菌发酵(即现有技术两步法中的第二步) 得到了分成两个相(参见图1上面的图片)并且具有不期望的黄色(参见图1下面的图片)的发酵奶。

这种相分离和颜色显现会在芽孢杆菌预孵育概念(即现有技术的两步法)的应用期间引起显著问题。

如本文的图2中关于现有技术的两步法可以看到：

具有预孵育的短小芽孢杆菌菌株的瓶子在更高pH下开始。

与单独的嗜热链球菌菌株相比，酸化活性没有提高。

最终pH也比单独的嗜热链球菌高得多。

相反地，本发明的一步法(即使用短小芽孢杆菌和嗜热链球菌二者的仅一个发酵步骤)非常好地作用。

如在本文的图2中可以看到，当使用本发明的一步法时，一个阳性结果是乳酸发酵显著更快地达到期望的较低pH水平。

另外，发酵奶(本文中的第一方面的方法中的步骤(a))比在相同条件下进行的对比方法中显著更快地达到期望pH，所述相同条件除了在所述对比方法中没有用芽孢杆菌属细菌对奶进行任何接种(本文中的第一方面的方法中的步骤(a))。

在图2中，这可以通过例如比较单独嗜热链球菌菌株4460的酸化作用看到，其明显没有嗜热链球菌4460+芽孢杆菌5042和嗜热链球菌4460+芽孢杆菌16735的一步同时酸化曲线那么快速/迅速。对于嗜热链球菌菌株4895获得类似的阳性结果，其中与芽孢杆菌一起同时一步发酵显著更快地达到期望的较低pH水平。

另外，本实施例1的结果证明，在与嗜热链球菌菌株同时发酵期间，没有短小芽孢杆菌菌株的显著生长。事实上，芽孢杆菌细胞在发酵过程期间基本上死亡(可能是因为pH的降低)。

实施例2：对比实验–现有技术的两步法-枯草芽孢杆菌和嗜热链球菌

本实施例可以看作和以上实施例1类似，在本实施例中，用枯草芽孢杆菌菌株CHCC15877和CHCC16871进行类似实验(在实施例1 中使用短小芽孢杆菌)。

将枯草芽孢杆菌菌株CHCC15877和CHCC16871从冷冻安瓿划线到BHI琼脂上并在37℃下有氧孵育过夜。

将来自CHCC15877和CHCC16871的单一菌落接种在6ml BHI 肉汤中并在37℃和150rpm下孵育。

将4×200ml B-奶转移到4个摇瓶中并将枯草芽孢杆菌菌株 15877sc和16687sc以1％各自(从BHI中的过夜培养物)接种到2 个瓶子中。它们在37℃和150rpm下孵育24小时。

将嗜热链球菌CHCC4895和CHCC4460接种到M17+2％乳糖中并在37℃下孵育过夜。

酸化实验：

将24小时枯草芽孢杆菌培养物从摇瓶转移到200ml无菌瓶中。菌株这一次也使奶变成黄色(即和针对短小芽孢杆菌的实施例1中类似)。

离心7ml的嗜热链球菌过夜培养物并将其各自再悬浮于7ml B- 奶中。

1.来自摇瓶中24小时的15877以1％接种到B-奶中

2.来自摇瓶的24小时15877培养物+1％4895

3.来自摇瓶的24小时15877培养物+1％4460

4.来自摇瓶中24小时的16687以1％接种到B-奶中

5.来自摇瓶的24小时16687培养物+1％4895

6.来自摇瓶的24小时16687培养物+1％4460

7.1％4895

8.1％4460

9.B-奶

结果：

所有四个具有枯草芽孢杆菌的预孵育瓶子看起来都类似于来自实施例1中的先前实验的瓶子5(稀薄的黄色培养物)。

具有预孵育的枯草芽孢杆菌菌株的瓶子在更高pH下开始。

与单独的嗜热链球菌菌株相比，酸化活性没有提高。

最终pH也比单独的嗜热链球菌高得多。

结论：

本实施例2的结果基本上证实了对于枯草芽孢杆菌，与实施例1 的短小芽孢杆菌基本上一样，因为现有技术的两步法同样对于枯草芽孢杆菌也不适当地作用。

实施例3：通过与来自枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的菌株共发酵，对嗜热链球菌的生长刺激-本发明的一步发酵法

通过添加来自枯草芽孢杆菌的菌株对嗜热链球菌CHCC4895的生长刺激

将来自枯草芽孢杆菌的以下菌株接种在MRS肉汤中并在37℃下孵育过夜：

CHCC3810

CHCC15877

CHCC16282

CHCC19200

离心过夜培养物，并将沉淀各自再悬浮于1体积的B-奶(9.5％脱脂奶，在99℃下煮沸30分钟)中。

将嗜热链球菌CHCC4895在含有2％乳糖的M17中在37℃下预生长，离心，并再悬浮于1体积的B-奶中。

对于酸化实验，将再悬浮的菌株以1％各自接种到200ml B-奶中。通过用PC记录器过夜测量pH来跟踪37℃下在水浴中的酸化作用。

1.1％CHCC4895

2.1％CHCC4895+1％CHCC15877

3.1％CHCC4895+1％CHCC16282

4.1％CHCC4895+1％CHCC19200

5.1％CHCC4895+1％CHCC3810

6.1％CHCC15877

7.1％CHCC16282

8.1％CHCC19200

9.1％CHCC3810

10.B-奶

结果：

枯草芽孢杆菌菌株CHCC3810、CHCC15877、CHCC16282和 CHCC19200能够增强嗜热链球菌CHCC4895的酸化活性。

通过添加来自短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的菌株对嗜热链球菌CHCC4895的生长刺激

将来自短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的以下菌株接种到BHI肉汤中，并在振荡培养箱中在150rpm下和37℃下孵育过夜。

菌株最初接种到MRS中，没有像先前菌株那样搅拌，但只显示微弱的生长。

短小芽孢杆菌CHCC5042

短小芽孢杆菌CHCC15512

短小芽孢杆菌CHCC15544

短小芽孢杆菌CHCC16735

短小芽孢杆菌CHCC16873

短小芽孢杆菌CHCC17513

枯草芽孢杆菌CHCC16871

将CHCC4895接种到M17+2％乳糖中并在37℃下孵育过夜。

离心过夜培养物，并将沉淀再悬浮于1体积的B-奶中。

1.1％CHCC4895

2.1％CHCC4895+1％CHCC5042(短小)

3.1％CHCC4895+1％CHCC15512(短小)

4.1％CHCC4895+1％CHCC15544(短小)

5.1％CHCC4895+1％CHCC16735(短小)

6.1％CHCC4895+1％CHCC16871(枯草)

7.1％CHCC4895+1％CHCC17513(短小)

8.1％CHCC4895+1％CHCC16873(短小)

9.1％CHCC5042

10.1％CHCC15512

11.1％CHCC15544

12.1％CHCC16735

13.1％CHCC16871

14.1％CHCC17513

15.1％CHCC16873

16.B-奶

结果：

结果显示在本文的图3中。

所有芽孢杆菌菌株都能够显著增强CHCC4895的酸化活性。与单独CHCC4895的孵育相比，早两个小时达到pH 5.0。同时，它们完全不酸化奶，意味着共发酵中的pH降低不是因为枯草芽孢杆菌产酸，而是因为生长刺激作用。

通过添加来自短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的菌株对来自嗜热链球菌的5株菌株的生长刺激

在本实验中，在来自枯草芽孢杆菌的两株菌株和来自短小芽孢杆菌的两株菌株存在下测试来自嗜热链球菌的5株其它菌株的酸化活性。5株嗜热链球菌菌株的特征为在奶中具有不同的酸化活性。

嗜热链球菌菌株：

CHCC3175

CHCC4460

CHCC5389

CHCC6592

CHCC9204

芽孢杆菌属菌株：

CHCC15877(枯草)

CHCC16871(枯草)

CHCC5042(短小)

CHCC16735(短小)

芽孢杆菌属菌株在BHI肉汤中在37℃和150rpm搅拌下孵育过夜。

嗜热链球菌菌株在M17+2％乳糖中在37℃下孵育过夜。

离心过夜培养物，并将沉淀再悬浮于1倍体积的B-奶中。

结果：

结果证明所有的4株芽孢杆菌菌株都能够显著增强5株嗜热链球菌菌株CHCC3175、CHCC4460、CHCC5389、CHCC6592和 CHCC9204的酸化活性。

结论：

本实施例3的结果显示添加来自枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的菌株可以刺激来自嗜热链球菌的不同菌株的酸化。

当与来自枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的各不同菌株共发酵时，测试的所有嗜热链球菌菌株都显示效果。

实施例4：通过与来自短小芽孢杆菌的菌株共发酵，对德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus)的生长刺激-本发明的一步发酵法

通过添加来自短小芽孢杆菌的菌株对来自德氏乳杆菌保加利亚亚种的5株菌株的生长刺激

短小芽孢杆菌5042sc和16735sc(单一菌落分离物，参见上文；来自过夜培养物)接种到3×5ml BHI肉汤中。在150rpm和37℃下孵育。

德氏乳杆菌保加利亚亚种CHCC3984接种到9ml MRS中。

汇集短小芽孢杆菌过夜培养物，离心12ml，并将沉淀各自再悬浮于12ml B-奶中。

离心保加利亚乳杆菌菌株并再悬浮于9ml B-奶中。

酸化实验：

1％接种到200ml B-奶中。在37℃下在水浴中酸化。通过PC记录器过夜测量pH。

1.3984

2.3984+5042

3.3984+16735

4.B-奶

结果：

测试的两株短小芽孢杆菌菌株对于德氏乳杆菌保加利亚亚种 CHCC3984都具有显著的生长促进作用。当芽孢杆菌细胞与德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株共培养时，相比对照实验(即仅使用 CHCC3984)显著更快地达到pH＝5。

实施例5：通过与来自短小芽孢杆菌的菌株共发酵，对乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的生长刺激-本发明的一步发酵法

通过添加来自短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的菌株对来自乳酸乳球菌的5株菌株的生长刺激

短小芽孢杆菌5042和16735(从冷冻安瓿)接种到3×5ml BHI 肉汤中。在150rpm和37℃下孵育。

乳酸乳球菌菌株CHCC2281、CHCC4427、CHCC9867、 CHCC3949和CHCC3950接种到M17中。将1％葡萄糖添加到乳糖阴性的3949和3950中。在30℃下孵育过夜。

汇集短小芽孢杆菌过夜培养物，离心11ml，并将沉淀各自再悬浮于11ml B-奶中。

离心乳酸乳球菌菌株并再悬浮于1体积的B-奶中。

酸化实验：

1％接种到200ml B-奶中。在30℃下在水浴中酸化。通过PC记录器过夜测量pH。

1.2281

2.2281+5042

3.2281+16735

4.4427

5.4427+5042

6.4427+16735

7.9867

8.9867+5042

9.9867+16735

10.3949+1％葡萄糖

11.3949+5042+1％葡萄糖

12.3949+16735+1％葡萄糖

13.3950+1％葡萄糖

14.3950+5042+1％葡萄糖

15.3950+16735+1％葡萄糖

16.B-奶

结果：

结果显示当和短小芽孢杆菌菌株一起生长时，乳酸乳球菌菌株的酸化要快一些。然而，其效果没有我们对于某些嗜热链球菌菌株(参见以上实施例)所看到的那么大。

在本实验中选择乳酸乳球菌CHCC3949和CHCC3950的一个原因是因为以下理论：短小芽孢杆菌菌株的蛋白水解系统负责生长促进作用。蛋白酶阴性的CHCC3949和CHCC3950在理论上应该比其它测试的乳酸乳球菌菌株(即CHCC2281、CHCC4427、CHCC9867) 相对更加受益于与短小芽孢杆菌的共培养。

然而，在本实验中，与测试的其它乳酸乳球菌菌株相比， CHCC3949和CHCC3950的生长没有得到很大促进。

实施例6：合适芽孢杆菌菌株的筛选-本发明的一步发酵法

在本实施例中筛选与使用单独的LAB菌株相比，提高酸化活性的芽孢杆菌细胞。

在96孔板中使用1ml奶的筛选

选择嗜热链球菌(ST)菌株CHCC12339(产胞外多糖(EPS) 菌株)用于筛选。

该筛选在96孔板中用1ml奶进行，并且测试选自以下芽孢杆菌物种的156个不同芽孢杆菌菌株：解淀粉芽孢杆菌、阿耶波多氏芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌、梭形芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、莫海威芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌和死亡谷芽孢杆菌。

测量酸化时间和质地。使用TADM技术测量质地。总的说来，结果证明大部分芽孢杆菌细胞都有效，即相比使用单独的LAB菌株，所述芽孢杆菌细胞提高酸化活性(速度)并改善质地。具体来说，测试的芽孢杆菌菌株中有135株相比单独的嗜热链球菌菌株得到更高的酸化速度，并且测试的菌株中有60株相比单独的嗜热链球菌菌株具有改善的质地。嗜热链球菌自身所导致的酸化很慢，pH 6降到4.5需要长达14小时或更长。添加芽孢杆菌将酸化时间显著缩短，对于最快的菌株，缩短到低至2-4小时。

来自200ml瓶子的结果

在具有奶的200ml瓶子中测试验证过的候选物(来自96孔板筛选)。测量酸化时间和质地。获得样品的糖消耗、小分子酸和挥发物的产生。200ml瓶子在冰箱中储存4周，再次分析脱水收缩作用、气味和挥发物。还追踪芽孢杆菌在奶中生长。

剪应力测量结果显示当在奶中添加芽孢杆菌菌株CHCC15176 时，与单独的乳杆菌菌株相比，乳杆菌菌株CHCC12945的质地高出最多73％。与单独的乳杆菌菌株相比，从大豆产品纳豆分离的芽孢杆菌菌株在与乳杆菌菌株组合时得到高40％的质地。然而，与奶中只有嗜热链球菌菌株相比，3株嗜热链球菌菌株在添加芽孢杆菌时不具有好得多的质地。当向奶中添加芽孢杆菌时，两种不同的发酵剂培养物、即CH-1和Sweety发酵剂培养物已经显示增加23％的质地。

具有LAB菌株和芽孢杆菌的奶中的酸化作用比只使用LAB菌株时具有更短的酸化时间。在1ml规模下，对于最佳组合(乳杆菌 CHCC12945和芽孢杆菌)来说，从pH 6到pH 4.5的酸化时间的降低多达6小时。此外，最快酸化的嗜热链球菌菌株CHCC15915在使用芽孢杆菌时酸化时间从4.35小时降到3小时。在200ml瓶子中，对于最佳组合(乳杆菌CHCC12945和从纳豆分离的芽孢杆菌 CHCC18102)来说，酸化时间降低4小时。

研究芽孢杆菌在奶中的生长。在这个项目中测试的芽孢杆菌菌株不在奶中生长，无论是否添加LAB。芽孢杆菌的生长需要氧。标准酸化程序是将细菌接种到200ml瓶子中的200ml奶中。然后瓶子在水浴或培养箱中不经搅拌地静置。当存在LAB菌株时，芽孢杆菌营养细胞有更快减少的趋势。奶中大多数的芽孢杆菌菌株都产生孢子，但是LAB的存在也抑制孢子形成。

与单独的LAB菌株相比，芽孢杆菌促进乳杆菌(Lb)CHCC12945 和嗜热链球菌(ST)CHCC12561两者的酸化和生长。与奶中单独的 LAB菌株相比，LAB的最终CFU/ml高达两倍。

对于单独LAB菌株，结果是：

乳杆菌；CHCC12945

在向乳杆菌发酵中添加一些芽孢杆菌时，酸化作用快得多。从 pH 6降到pH 4.5的时间从对于单独乳杆菌的8小时减少到对于最快组合的略微超过2小时。

嗜热链球菌2；CHCC12561(慢)

酸化作用；酸化作用从对于嗜热链球菌2自身的6小时改良到对于芽孢杆菌和嗜热链球菌2的最佳组合的4小时。

嗜热链球菌3；CHCC15915(快)

这个嗜热链球菌3进行的酸化作用产生好看且平滑的酸化曲线。与单独的嗜热链球菌3相比，与芽孢杆菌的一些组合似乎加快从pH 6酸化到pH 4.5。

为了评估向奶中的LAB菌株添加芽孢杆菌的效果，测量样品的糖、挥发物和小分子酸。在添加或不添加芽孢杆菌的情况之间没有看到显著差别。

为了评估储存，将具有发酵奶的瓶子在冰箱中储存4周，并测量样品的挥发物。发酵奶闻起来很好，并且挥发物分布与储存1天后相比几乎相同。简言之，在储存期间，具有芽孢杆菌的发酵奶与只添加LAB的发酵奶相比没有不同地发展。

结论：

本实施例的结果证明，在储存期间，具有芽孢杆菌的发酵奶与只添加LAB的发酵奶相比没有不同地发展。

因此，本发明的一步发酵法提供商业上相关的优良发酵奶制品——如上所论述的，现有技术的两步法没有适当地作用。

对于测试的所有LAB菌株(1株乳杆菌(Lb)和3株不同的嗜热链球菌(ST)菌株)，至少从以下不同的芽孢杆菌物种发现了适当作用的候选物：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等。

实施例7：利用不同浓度的短小芽孢杆菌CHCC16735对嗜热链球菌CHCC4460的生长刺激-本发明的一步发酵法

将嗜热链球菌CHCC4460接种到15ml M17+2％乳糖中并在37℃下孵育过夜(ON)。

将短小芽孢杆菌CHCC5042接种到BHI肉汤中并在37℃和200 rpm下孵育过夜。

对于酸化实验，离心15ml CHCC4460过夜培养物并将沉淀再悬浮于15ml B-奶中。

离心6ml CHCC16735过夜培养物并将沉淀再悬浮于6ml B-奶中。

CHCC4460以1％单独接种到B-奶中，并且根据以下方案与不同浓度的CHCC16735共培养。

接种1％的CHCC16735将导致在奶发酵开始时约6×10⁶cfu/ml 的浓度。

1.1％CHCC4460

2.1％CHCC4460+1％CHCC16735

3.1％CHCC4460+0.1％CHCC16735

4.1％CHCC4460+0.01％CHCC16735

5.1％CHCC4460+0.001％CHCC16735

6.1％CHCC4460+0.0001％CHCC16735

7.B-奶对照

通过用PC记录器过夜测量pH来跟踪37℃下在水浴中的酸化作用。

结果：

结果显示在本文的图4中。

添加对应于1％和0.1％的接种百分率的枯草芽孢杆菌 CHCC16735导致CHCC4460的酸化活性增加。

更低接种百分率的CHCC16735没有导致CHCC4460的生长刺激。

结论：

本实施例的结果证明，在本文所述的第一方面的方法的步骤(a) 中对奶接种约6×10⁵cfu/ml的芽孢杆菌属细菌可接受地作用。

它在使用约6×10⁶cfu/ml的芽孢杆菌属细菌时更好地作用。

基于这些结果，相信通过在本文所述的第一方面的方法的步骤 (a)中使用小于约10⁴cfu/ml的芽孢杆菌属细菌，所描述的第一方面的方法不在商业上可接受的水平下作用。

事实上，在第一方面的方法的步骤(a)中使用至少10⁵cfu/ml的芽孢杆菌属细菌似乎是非常优选的。

实施例8：嗜热链球菌和芽孢杆菌的预先共培养

在本实验中，使用与以上实施例1中相同的菌株，即短小芽孢杆菌CHCC5042、CHCC16735和嗜热链球菌CHCC4460。

如实施例1中所论述的，在本实施例中，离心BHI中的过夜(ON) 培养物，并将沉淀各自再悬浮于奶中。

如以下所论述的，在本实施例中，将嗜热链球菌菌株与短小芽孢杆菌菌株预孵育，并在之后在第二步骤中使用过夜培养物来接种奶。过夜培养物是原样使用(即不经过离心)。获得pH的改善的更快降低。

将嗜热链球菌CHCC4460接种到15ml M17+2％乳糖中并在37℃下孵育过夜。

将短小芽孢杆菌CHCC5042和CHCC16735接种到BHI肉汤中并在37℃和200rpm下孵育过夜。

从过夜培养物将0.5％的CHCC4460分别连同0.5％的CHCC5042 和CHCC16735接种到M17+2％乳糖中。

共培养物在37℃下不经振荡地孵育过夜。

再次将CHCC4460从冷冻储备液接种到15ml M17+2％乳糖中并在37℃下孵育过夜，并且再次将CHCC5042和CHCC16735从冷冻储备液接种到10ml BHI中，并在37℃和200rpm下孵育过夜。

酸化实验：

离心15ml CHCC4460过夜培养物并将沉淀再悬浮于15ml B-奶中。

离心6ml CHCC5042和6ml CHCC16735过夜培养物并将沉淀各自再悬浮于6ml B-奶中。

这两个共培养物没有经过离心。它们从预孵育的共培养物以1％直接接种到200mlB-奶中。

作为对照，CHCC4460也从过夜培养物以1％直接接种到200ml B-奶中。

1.来自过夜培养物的1％CHCC4460

2.来自预先共培养物的1％CHCC4460/CHCC5042

3.来自预先共培养物的1％CHCC4460/CHCC16735

4.1％CHCC4460，离心并再悬浮

5.1％CHCC4460+1％CHCC5042，两者都被离心并再悬浮

6.1％CHCC4460+1％CHCC16735，两者都被离心并再悬浮

7.B-奶对照

结果：

结果显示在本文的图5中。

与孵育来自过夜培养物的单独CHCC4460相比，CHCC4460与 CHCC5042/CHCC16735预孵育导致酸化活性改善。

当预孵育的共培养物被离心并再悬浮于B-奶中并且以1％接种到 B-奶中时，与作为单一菌株培养物被离心并再悬浮于奶中的 CHCC4460相比，酸化活性也得到增加。

在过夜生长后的预孵育培养物CHCC4460+CHCC16735中，测量到9×10⁴芽孢杆菌细胞的滴度。在将这个预培养物接种到奶中并孵育过夜后(发酵第二天)，测量到1×10³芽孢杆菌细胞的滴度。

结论：

本实施例的结果进一步证明一起共培养芽孢杆菌和LAB细胞获得了本文所述的积极效果。当在使用培养物接种奶之前将芽孢杆菌细胞与嗜热链球菌一起预孵育时，看到酸化活性的强烈增加，这和共培养物直接用于接种，还是共培养物在接种之前先被离心然后再悬浮于奶中(这将消除第一天的生长培养基的遗留)没有关系。

实施例9：嗜热链球菌与不同的芽孢杆菌菌株的共发酵-本发明的一步发酵法

质地协同作用

分离来自日本产纳豆的两株芽孢杆菌菌株并保藏为CHCC18102 和CHCC18103。在平板上，CHCC18102比CHCC18103更黏滑，表明产生了γ-PGA，一种谷氨酸聚合物。想法是芽孢杆菌菌株可以为奶中的质地作出贡献。将两株芽孢杆菌菌株连同嗜热链球菌菌株(CHCC16404，缓慢酸化并产生葡萄糖)一起接种到奶中。两株菌株都以1％的经过洗涤的过夜培养物接种。在1ml B-奶中酸化24小时后，在Hamilton机器人上用TADM技术测量质地。结果清楚地显示，当两株芽孢杆菌菌株添加到奶中的嗜热链球菌时，质地是不同的，表明在用这两株芽孢杆菌菌株共酸化奶时质地明显增加。

在基本培养基中的生长实验中，CHCC18102和CHCC18103在乳糖或葡萄糖上不生长。当这两株菌株和Sweety ST一起添加到奶中时，分泌的葡萄糖不被这两株芽孢杆菌菌株利用。分析数据(小分子酸、挥发物、糖)显示芽孢杆菌菌株并没有对发酵奶中产生的总体化学组成和代谢物作出显著贡献，因为芽孢杆菌菌株没有显示生长。 CHCC18102对质地的贡献比CHCC18103大。关于芽孢杆菌菌株如何对发酵奶的质地作出贡献仍然是个问题。

我们假设增加的质地是因为芽孢杆菌产生γ-PGA、生物膜的能力，或通过促进嗜热链球菌的酸化作用和生长。

奶中的酸化协同作用

奶的酸化作用是一个重要因素，因为更快的酸化作用可以节省发酵奶制品的生产商的时间，和/或人们可以销售更少的具有相同活性的细菌。将不同的芽孢杆菌菌株(OD0.02)和0.024％发酵剂培养物(含有CHCC16404、ST-16731、ST-15757和LBAbu16159)一起添加到奶中显示对4株菌株的酸化作用的有利影响。酸化作用冷开始，这解释了长酸化时间。

表1.酸化实验中使用的芽孢杆菌菌株

CHCC编号	芽孢杆菌物种
		CHCC15396	索诺拉沙漠芽孢杆菌
CHCC15146	莫海威芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌/特基拉芽孢杆菌
		CHCC18102	来自纳豆的芽孢杆菌
CHCC18103	来自纳豆的芽孢杆菌

重要的时间点是“达到pH 4.55的时间”。这两株芽孢杆菌菌株 CHCC18102和CHCC18103都比单独的发酵剂培养物更快地达到pH 4.55。具有CHCC18102的最快培养物比单纯的发酵剂培养物早45分钟达到pH 4.55。具有CHCC18103和CHCC15146的培养物比单纯的发酵剂培养物早25分钟达到pH 4.55。具有CHCC15396的培养物比单纯的发酵剂培养物早15分钟达到pH 4.55。这显示不同的芽孢杆菌菌株在酸化作用方面可以有益于发酵剂培养物。

在另一个实验中，从生奶分离的芽孢杆菌菌株短小芽孢杆菌 A650-3能够刺激不同嗜热链球菌生产菌株的酸化活性。从过夜培养物接种1％的嗜热链球菌菌株和短小芽孢杆菌菌株。

维生素K

已知“纳豆”枯草芽孢杆菌用于生产维生素K，特别是在发酵日本大豆产品纳豆中。在本实验中，我们在200ml奶中添加了从纳豆分离的两株芽孢杆菌菌株，同时添加和不添加嗜热链球菌菌株 (CHCC16404，与质地实验中是相同的)，在37℃下维持24小时。结果显示这两株芽孢杆菌菌株可以生产维生素K，与嗜热链球菌菌株无关。CHCC18102的水平是6-7μg/100ml发酵奶，并且 CHCC18103的水平是～9μg/100ml发酵奶，参见表2。芽孢杆菌菌株主要生产MK-4和MK-7，也有少量的K1(MK-4、MK-7和K1是不同类型的维生素K)。嗜热链球菌菌株对维生素K水平没有贡献。

表2.具有CHCC18102和CHCC18103且具有和不具有嗜热链球菌菌株的奶中的维生素K产量，μg/100发酵奶。

结论：

两株纳豆芽孢杆菌菌株与嗜热链球菌(ST)的共接种得到几个有趣的结果：

-6-9μg/100ml发酵奶的维生素K产量

-发酵奶的质地性能的增加(-5500Pa对比-12000Pa的 TADM值)

-酸化速度增加了45分钟(达到pH 4.55的时间)

显示短小芽孢杆菌菌株显著促进嗜热链球菌CHCC4895的生长，而单独的短小芽孢杆菌菌株在奶中不酸化。

参考文献

1.US2009/0011081A1.

2.US5077063.

3.CN103300147A.

4.ROSSLAND,E.,LANGSRUD,T.和SORHAUG,T.,2005.受控乳酸发酵对奶中的蜡样芽孢杆菌的生长和孢子形成的影响.(Influence of controlled lactic fermentation ongrowth and sporulation of Bacillus cereus in milk.)International journal offood microbiology,103(1),第69-77页.

5.对于欲添加到食品和饲料中的QPS生物试剂的清单的维持的欧盟(EU) 欧洲食品安全局(EFSA)生物危害专家组(BIOHAZ)科学意见(2013年更新) (The European Union(EU)European Food Safety Authority(EFSA)Panel on Biological Hazards(BIOHAZ)Scientific Opinion on the maintenance of the list of QPS biological agentsintentionally added to food and feed(2013update))引用参考文献是“EFSA Journal2013；11(11):3449[108pp.].doi:10.2903/j.efsa.2013.3449”，并且在本申请的提交日期，其可以通过以下链接下载到：http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/doc/ 3449.pdf

Claims

1.一种用于生产乳酸菌发酵奶制品的方法，包括以下步骤：

(a)：在合适条件下在22℃到45℃的温度下用10⁴到10¹²cfu/ml的接种乳酸菌(LAB)和10⁴到10¹²cfu/ml的接种芽孢杆菌属(Bacillus)细菌使奶发酵，直到发酵奶达到3.5到5.5的期望pH并且其中所述奶的芽孢杆菌属细菌发酵在所述奶的LAB发酵开始之前5小时到之后4小时的时期范围内开始；其中步骤(a)中的接种芽孢杆菌属细菌是选自由以下组成的组的至少一种芽孢杆菌属细菌：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、弯曲芽孢杆菌(Bacillusflexus)、梭形芽孢杆菌(Bacillus fusiformis)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)、暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)、索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)、简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)和死亡谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)，

其中步骤(a)中的接种乳酸菌选自由以下组成的组：嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiissp.bulgaricus)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；

其中步骤(a)中的发酵奶比在相同的条件下进行的对比方法中更快地达到pH＝4.5，所述相同的条件除了在所述对比方法中没有用步骤(a)中的芽孢杆菌属细菌对所述奶进行任何接种；并且

其中所述奶是哺乳动物的奶。

2.根据权利要求1所述的方法，其中权利要求1的步骤(a)中的接种芽孢杆菌属细菌是选自由以下组成的组的至少一种芽孢杆菌属细菌：短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(a)中使用10⁶到10¹⁰cfu/ml的接种乳酸菌(LAB)和其中在步骤(a)中使用10⁵到10⁹cfu/ml的接种芽孢杆菌属细菌。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中权利要求1的步骤(a)的合适条件包括：

(i)：36℃到38℃的温度；和

(ii)：2小时到100小时的发酵时期；

并且其中步骤(a)的期望pH是4.4到4.6的pH。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中权利要求1的步骤(a)中的奶的芽孢杆菌属细菌发酵在所述奶的LAB发酵开始之前5分钟到之后5分钟的时期范围内开始。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中在权利要求1的步骤(a)中，所述乳酸菌和芽孢杆菌属细菌在小于20分钟的时期范围内被接种到所述奶。

7.根据权利要求6所述的方法，其中在权利要求1的步骤(a)中，所述乳酸菌和芽孢杆菌属细菌在小于5分钟的时期范围内被接种到所述奶。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中权利要求1的步骤(a)中的发酵奶比在与权利要求1中相同的条件下进行的对比方法中提早1小时达到pH＝4.5，所述相同的条件除了在所述对比方法中没有用步骤(a)中的芽孢杆菌属细菌对所述奶进行任何接种。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其中权利要求1的步骤(a)中的奶是牛奶。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中权利要求1的乳酸菌发酵奶制品是选自由以下组成的组的至少一种发酵奶制品：开菲尔、酸奶、奶酪、酸奶油、法式酸奶油、马奶酒、发酵酪乳和酸乳。

11.一种用于生产乳酸菌发酵奶制品的组合物，包含发酵剂培养物，所述发酵剂培养物包括至少一种乳酸菌和选自由以下组成的组的至少一种芽孢杆菌属细菌：解淀粉芽孢杆菌、阿耶波多氏芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌、梭形芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、莫海威芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌和死亡谷芽孢杆菌，

其中所述至少一种乳酸菌选自由以下组成的组：嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和乳酸乳球菌；并且

其中所述奶是哺乳动物的奶。

12.芽孢杆菌属细菌用于生产乳酸菌发酵奶制品的用途，包括在合适条件下在22℃到45℃的温度下用10⁴到10¹²cfu/ml的接种乳酸菌(LAB)和10⁴到10¹²cfu/ml的接种芽孢杆菌属细菌使奶发酵，直到发酵奶达到3.5到5.5的期望pH并且其中所述奶的芽孢杆菌属细菌发酵在所述奶的LAB发酵开始之前5小时到之后4小时的时期范围内开始；和

其中所述芽孢杆菌属细菌是选自由以下组成的组的至少一种芽孢杆菌属细菌：解淀粉芽孢杆菌、阿耶波多氏芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌、梭形芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、莫海威芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌和死亡谷芽孢杆菌，

其中所述接种乳酸菌选自由以下组成的组：嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和乳酸乳球菌；

其中所述发酵奶比在相同的条件下进行的对比方法中更快地达到pH＝4.5，所述相同的条件除了在所述对比方法中没有用发酵步骤中的芽孢杆菌属细菌对所述奶进行任何接种；并且

其中所述奶是哺乳动物的奶。