CN107727841A - 预测孕妇分娩时间的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种预测孕妇分娩时间的方法。本发明涉及一种方法，用于在孕妇中预测分娩时间。所述方法包括，如果确定PAMG‑1在获取自孕妇的阴道液样品中以超出预定检测阈值的水平存在，则预测该孕妇将在预定的时间框以内分娩。也提供确定患者的早产和/或绒毛膜自发破裂风险的方法。

Description

预测孕妇分娩时间的方法
本申请是申请日为2013年12月23日、申请号为201380074274.9、发明名称为“预测孕妇分娩时间的方法”的申请的分案申请。
本申请要求2013年1月2日提交的61/748,310号和2013年11月26日提交的61/909,238号美国临时专利申请的优先权，通过引用将二者全部并入本文。
技术领域
本申请内容涉及预测妊娠患者中分娩时间(time-to-delivery,TTD)和/或确定患者早产(preterm labor)和/或绒毛膜自发破裂的风险的方法。
背景技术
在面临早娩风险的妊娠中，分娩时间(TTD)的预测在临床上是很重要的，特别是对于皮质激素的给药(在给药的24小时至7天内效果最佳)。此外，早生风险高的患者应在三级护理病房中分娩。特别是考虑到类固醇的重复使用尚有争议，产科医师就担负着在面临早娩风险的患者中预测TTD的任务。
美国产科和妇科医师学会(ACOG)在其最近的早产处置规范公报中指出，虽然已提出并评估了很多鉴别面临早生风险的妇女的方法，但只有超声波检查(用以确定宫颈长度)和胚胎纤粘连蛋白(fibronectin)试验显示出有效。超声波检查或胚胎纤粘连蛋白试验或二者的组合在鉴别早娩风险高的妇女时可能有用，但其临床用处可能主要取决限于其鉴别最不倾向分娩的妇女的能力(即，试验的阴性预测值(negative predictive value,NPV))，而不是鉴别最倾向分娩的妇女(即，阳性预测值(positive predictive value,PPV)高的试验)的能力。因而，迫切需要具有高PPV的试验以便准确地预测临近的分娩，并允许有利健康的干预。
发明内容
如上文所讨论的，技术领域中需要的是用于准确诊断有临近分娩(例如14天内、7天内或48小时内)风险的患者的改进的装置和方法，特别是出现了提示早产(pretermlabor,PTL)的迹象、征兆或不适，但是没有胎膜破裂(rupture of fetal membranes,ROM)临床证据的患者的改进的装置和方法。对于医护人员而言，此类改进的装置和方法对决定如何管理其患者有重要价值：例如，决定是否给予安胎药来延长妊娠、给予皮质激素来改善胎儿的呼吸发育、给予抗生素降低感染风险(产时和产后)、建议卧床休息和/或增加观察和胎儿监测等。
因而，在某些方面，本发明内容提供预测分娩时间(TTD)的方法，其包括(例如，包含、本质上由下列构成、由下列构成)：(a)使取自孕妇的阴道液样品与至少两种PAMG-1特异性单克隆抗体接触，其中所述抗体的至少一种与在样品中存在时的PAMG-1结合，从而形成PAMG-1/单克隆抗体复合物；(b)只有当样品中PAMG-1的浓度超过预定的检测阈值时，检测样品中PAMG-1/单克隆抗体复合物的存在；和(c)如果检测到PAMG-1，则预测该孕妇将在预定的时间框架内分娩。在另一方面，预测TTD的方法包括(a)使取自孕妇的阴道液样品与至少两种PAMG-1特异性单克隆抗体接触，其中所述抗体的至少一种与在样品中存在时的PAMG-1结合，从而形成PAMG-1/单克隆抗体复合物；(b)只有当样品中PAMG-1的浓度超过预定的检测阈值时，检测样品中PAMG-1/单克隆抗体复合物的存在；和(c)如果检测到PAMG-1，则预测该孕妇将在预定的时间框架内分娩；或(d)如果没有检测到PAMG-1，则预测该孕妇将不会在预定的时间框架内分娩。在某些实施方案中，步骤(d)包含在从孕妇获得阴道液样品时预测该孕妇将不会在预定的时间框架内分娩。预测分娩时间的预定的时间框架可以是例如约48小时以内；约7小时以内；和/或(iii)约14天以内。在某些方面，预测TTD的方法具有下列阳性预测值(PPVs)的一个或多个：(i)对于预测48小时以内的TTD，至少约39％；(ii)对于预测7天以内的TTD，至少约64％；和(iii)对于预测约14天以内的TTD，至少约77％。在某些方面，预测TTD的方法具有下列PPVs的一个或多个：(i)对于预测约48小时以内的TTD，约45.5％；(ii)对于预测约7天以内的TTD，约81.8％；和(iii)对于预测14天以内的TTD，约90.9％。在某些方面，本方法具有大于约90％的阴性预测值(NPV)。在某些方面，预测TTD的方法具有下列PPVs的一个或多个：(i)对于预测48小时以内的TTD，约45.5％；和/或(ii)对于预测7天以内的TTD，约78.3％(例如约78％)；和/或(iii)对于预测14天以内的TTD，约87％。在某些方面，本方法具有87％以上的阴性预测值(NPV)。还在其它方面，本方法具有下列NPVs的一个或多个：(i)对于预测48小时以内的TTD，约100％；和/或(ii)对于预测7天以内的TTD，约97.4％(例如约87％)；和/或(iii)对于预测14天以内的TTD，约93.6％(例如约84％)。
在其它方面，本发明内容提供确定早娩风险的方法，其中所述方法包括(例如，包含、本质上由下列构成、由下列构成)：(a)使取自孕妇的阴道液样品与至少两种PAMG-1特异性单克隆抗体接触，其中所述抗体的至少一种与在样品中存在时的PAMG-1结合，从而形成PAMG-1/单克隆抗体复合物；(b)只有当样品中PAMG-1的浓度超过预定的检测阈值时，检测样品中PAMG-1/单克隆抗体复合物的存在；和(c)如果检测到PAMG-1，则预测该孕妇面临早娩风险。在其它方面，本发明内容提供确定早娩风险的方法，其中所述方法包括(例如，包含、本质上由下列构成、由下列构成):(a)使取自孕妇的阴道液样品与至少两种PAMG-1特异性单克隆抗体接触，其中所述抗体的至少一种与在样品中存在时的PAMG-1结合，从而形成PAMG-1/单克隆抗体复合物；(b)只有当样品中PAMG-1的浓度超过预定的检测阈值时，检测样品中PAMG-1/单克隆抗体复合物的存在；和(c)如果检测到PAMG-1，则预测该孕妇面临早娩风险；或(d)如果没有检测到PAMG-1，则预测该孕妇没有面临早娩风险。在某些实施方案中，步骤(d)包含在从孕妇获得阴道液样品时预测该孕妇没有面临早娩风险。
还在其它方面，本发明内容提供确定孕妇的绒毛膜自发破裂风险的方法，其中所述方法包括(例如，包含、本质上由下列构成、由下列构成):(a)使取自孕妇的阴道液样品与至少两种PAMG-1特异性单克隆抗体接触，其中所述抗体的至少一种与在样品中存在时的PAMG-1结合，从而形成PAMG-1/单克隆抗体复合物；(b)只有当样品中PAMG-1的浓度超过预定的检测阈值时，检测样品中PAMG-1/单克隆抗体复合物的存在；和(c)如果检测到PAMG-1，则确定该孕妇面临绒毛膜自发破裂的风险。在另一方面，本发明内容提供确定孕妇的绒毛膜自发破裂风险的方法，其中所述方法包括：(a)使取自孕妇的阴道液样品与至少两种PAMG-1特异性单克隆抗体接触，其中所述抗体的至少一种与在样品中存在时的PAMG-1结合，从而形成PAMG-1/单克隆抗体复合物；(b)只有当样品中PAMG-1的浓度超过预定的检测阈值时，检测样品中PAMG-1/单克隆抗体复合物的存在；和(c)如果检测到PAMG-1，则确定该孕妇面临绒毛膜自发破裂的风险；或(d)如果没有检测到PAMG-1，则确定该孕妇没有面临绒毛膜自发破裂的风险。在某些实施方案中，步骤(d)包含在从孕妇获得阴道液样品时预测该孕妇没有面临绒毛膜自发破裂的风险。
在某些方面，本方法用于确定自发的预产期前过早绒毛膜破裂的风险。
另一方面，本文提供的是排除(预测为高度不可能)孕妇在预定的时间框架内自发预产期前过早(preterm premature)ROM或早娩的方法。该方法包括：(a)使取自疑似有早娩风险的孕妇的阴道液样品与至少两种PAMG-1特异性单克隆抗体接触，其中所述抗体的至少一种与在样品中存在时的PAMG-1结合，从而形成PAMG-1/单克隆抗体复合物；(b)只有当样品中PAMG-1的浓度超过预定的检测阈值时，检测样品中任何PAMG-1/单克隆抗体复合物的存在；和(c)如果没有检测到PAMG-1，则排除(预测为高度不可能)在预定的时间框架内的自发预产期前过早ROM或早娩。预定的时间框架可为例如约48小时以内；约7天以内；和/或(iii)约14天以内。在某些方面，排除(预测为高度不可能)自发的预产期前过早ROM或早娩的方法具有大于约90％的阴性预测值(NPV)。在某些方面，排除(预测为高度不可能)自发的预产期前过早ROM或早娩的方法具有87％以上的阴性预测值(NPV)。还在其它方面，该方法具有下列NPVs的一个或多个：(i)对于排除(预测为高度不可能)48小时以内的自发预产期前过早ROM或早娩，约100％；和/或(ii)对于排除(预测为高度不可能)7天以内的自发预产期前过早ROM或早娩，约97.4％(例如约87％)；和/或(iii)对于排除(预测为高度不可能)14天以内的自发预产期前过早ROM或早娩，约93.6％(例如约84％)。
在以上公开的任何方面，该方法可进一步包括确定孕妇的胎膜是完整的。该方法也可包括只有当孕妇出现下列一项以上、两项以上、三项以上或所有四项时，才选择该孕妇进行该方法的分析：(i)提示早产的迹象、征兆或不适；(ii)20周与36周6天之间的妊龄；(iii)25mm以上的宫颈长度；和(iv)3cm以下的宫颈扩张。该方法也可包括用采集器具(例如植绒拭子(flocked swab))从孕妇采集阴道液样品。在某些方面，植绒阴道拭子使存在于阴道液样品中的任何PAMG-1以1:4稀释。在某些方面，植绒拭子使存在于阴道液样品中的任何PAMG-1在1:1至1:10的范围内稀释。该方法也可包括下列步骤的任何一个或多个：使采集器具与溶剂接触而释放采集的阴道液样品；在约30秒的时间框架上采集阴道液样品；采集阴道液样品之后，使采集器具与溶剂接触约30秒；使阴道液样品与至少两种PAMG-1特异性单克隆抗体接触5分钟。
在任何上述方面中，预定的PAMG-1检测阈值水平可为4ng/ml。
在任何上述方面中，在侧流装置(lateral flow device)中可使用至少两种PAMG-1特异性单克隆抗体。所述侧流装置可包括衬垫区和试验区。试验装置的衬垫区可包括所述至少两种PAMG-1特异性单克隆抗体的一种，且试验区可包括所述两种的另一种。在某些方面，衬垫区中的PAMG-1特异性单克隆抗体是可移动的且试验区的PAMG-1特异性单克隆抗体是固定化的。在某些方面，试验装置的试验区进一步包括对照区。在某些方面，所述至少两种PAMG-1-特异性单克隆抗体为各自选自由下列抗体组成的组的抗体：杂交瘤N271产生的M271，由俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM)保藏机构保藏并分配登录号VKPM-93；杂交瘤N52产生的M52，由VKPM保藏并分配登录号VKPM-92；和杂交瘤N42产生的M42，由VKPM保藏并分配登录号VKPM-94。
在任何上述方面中，衬垫区中可移动的抗体可以是杂交瘤N271产生的M271，由俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM)保藏机构保藏并分配登录号VKPM-93，且试验区中固定化的抗体可以是杂交瘤N52产生的M52，由VKPM保藏并分配登录号VKPM-92。
在上述使用装置的某些方法中，装置可以是图1和2中说明的装置。
在某些方面，本发明内容提供试剂盒，其包括(例如，包含、本质上由下列构成、由下列构成)：(a)当阴道液样品中存在超出阈值水平的PAMG-1时检测PAMG-1存在的装置；和阴道拭子。在某些方面，阴道拭子可以是植绒的。在某些方面，试剂盒进一步包括药瓶和/或使用说明书。在某些方面，预定的阈值为4ng/ml。还在其它方面，装置包括对PAMG-1特异的第一和第二单克隆抗体。第一和第二PAMG-1-特异性单克隆抗体可具有不同的对PAMG-1的结合特异性和亲和力。在某些方面，第一和第二PAMG-1-特异性单克隆抗体各自可选自由下列抗体组成的组：杂交瘤N271产生的M271，由俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM)保藏机构保藏并分配登录号VKPM-93；杂交瘤N52产生的M52，由VKPM保藏并分配登录号VKPM-92；和杂交瘤N42产生的M42，由VKPM保藏并分配登录号VKPM-94。还在其它方面，试验装置为侧流装置。试验装置可包括衬垫区和试验区。试验装置的衬垫区可包括所述第一和第二PAMG-1-特异性单克隆抗体之一，且试验区可包括另一所述第一和第二PAMG-1-特异性单克隆抗体。在某些方面，衬垫和试验区之一或二者可含有附加的PAMG-1-特异性单克隆抗体和/或所述前两种PAMG-1-特异性单克隆抗体的混合物。在某些方面，衬垫区中的PAMG-1-特异性单克隆抗体可以是可移动的，且试验区中的PAMG-1-特异性单克隆抗体可以是固定化的。还在另一方面，衬垫区中可移动的抗体为杂交瘤N271产生的M271，由俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM)保藏机构保藏并分配登录号VKPM-93；杂交瘤N52产生的M52，由VKPM保藏并分配登录号VKPM-92。在某些方面，试验装置的试验区进一步包括对照区。在某些方面，试剂盒可用于预测TTD的方法。另一方面，试剂盒可用于预测早娩风险的方法。还在另一方面，试剂盒可用于预测孕妇绒毛膜自发破裂(ROM)(例如预产期前过早ROM)的风险的方法。在某些方面，试剂盒中的装置是图1和2中说明的装置。
定义：
如在本文中使用，“分娩时间(TTD)”是从预定的起始时间点(例如患者出现早产的潜在迹象的时间)开始，直至妊娠的患者分娩其胎儿的时间总长度(例如若干小时、天、周)。TTD可规定为“在预定的时间框架内”，例如从作出预测的时间起约14天以内(或约7天以内，或约48小时以内)。如在本文中使用，“预测TTD”意指确定在预定的时间框架内(例如2、7或14天以内)分娩的可能性。在某些方面,预测TTD包括确定在预定的时间点以内自发的预产期前过早ROM或早娩为高度可能。在某些方面，预测TTD包括排除预定的时间点以内的自发预产期前过早ROM或早娩(即确定在预定的时间框架内自发的预产期前过早ROM或早娩为高度不可能)。
如在本文中使用，“早娩”定义为在37周妊龄之前分娩。
如在本文中使用，确定为“面临早娩风险”的孕妇是出现了提示早产的迹象、征兆或不适的孕妇。
如在本文中使用，对于本文公开的试验，“预定的检测阈值”是以下水平(例如浓度或量)：多肽或其它物质必须以该水平或高于该水平存在于样品(例如未稀释的阴道或宫颈-阴道液样品)中以便被检测到(例如在本文公开的试验(例如TTD试验)中给出阳性结果)。
如在本文中使用，术语“抗体”表示对如本文所述的抗原(例如PAMG-1)有结合亲和力、不依赖于获得多肽所使用的方法的任何多肽。例如，多肽可以是单克隆抗体或其片段、多克隆抗体或其抗原结合片段，或如本文所述的对靶抗原有结合特异性的任何分子。
“抗原”是一种实体(例如蛋白质实体或肽)，结合分子特异性的与其结合。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指与结合分子(例如抗体)特异性结合的抗原位点。
如在本文中使用的，对抗原(例如PAMG-1)“特异”的抗体结合至该抗原。
如在本文中使用的，如果孕妇满足如本文所公开的预定的标准，包括但不限于例如：具有提示分娩的迹象、征兆或不适，但没有临床可检测的破膜(ROM)(例如液体从宫颈口泄漏、液体在阴道后穹窿中淤积)，则该孕妇“适合于”或“需要”根据本文公开的方法预测TTD。
如在本文中使用的术语“约”意指在如本领域技术人员确定的特定值的可接受误差范围之内，其将部分取决于该值是如何测定或确定的，即测定体系制约。例如，按照技术实践“约”可表示1倍标准差以内或多于1倍标准差。可选地，”约”可意指给定值的上至20％、优选上至10％、更优选上至5％、且还更优选上至1％的范围。可选地，特别是关于生物体系或过程，该术语可表示数值的一个数量级以内，优选5倍以内，更优选2倍以内。特定值记载在申请和权利要求书中时，除非另有声明，术语“约”意指应当认为该特定值在可接受的误差范围之内。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明内容所属技术领域普通技术人员通常的理解相同。在冲突的情况下，以本文件，包括定义为准。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用将其全部并入。本文公开的材料、方法和实施例仅为说明性的，且并非旨在限制。
本发明内容一个或多个实施方案的细节在下面的附图和说明书中阐述。优选的方法和材料记述如下，但与本文的记载相似或等同的方法和材料也可用于本发明内容的实践或测试。本文所公开方法的其它特征、目标和优点将从说明书、附图和权利要求中清楚得出。
附图说明
图1为可用于检测阴道液样品中PAMG-1的存在(例如用于诊断分娩时间(TTD))的示例性装置的示意性纵截面图，图2为该装置的俯视图。附图标记表示示例性装置的下列组件：10–M271抗体区；12–衬垫；14–试验区；16–对照区；18–箭头；22–硝化纤维素膜；24–滤纸膜；26–粘性硬塑料基材；28–带箭头的半透明保护膜；和30–不透明保护膜。
具体实施方式
发明内容的各方面记述如下。
概要
本发明内容提供用于预测预定的时间框架内(例如约14天、7天或48小时以内)的TTD的改进方法。还提供用于确定早娩(例如在37周妊龄之前分娩)风险的方法，和用于确定孕妇自发绒毛膜破裂(ROM)风险的方法。通常，本文公开的方法包括当PAMG-1以超出预定的检测阈值的水平存在时检测PAMG-1的存在。本公开方法能以高PPV和高NPV预测TTD和/或排除自发早娩。根据本文公开方法的阳性的试验可指示分娩临近(例如约14天、7天或48小时以内)。阴性的试验(没有检测到PAMG-1)指示分娩不太可能在14天、7天或48小时以内发生。阳性的试验也可指示孕妇面临自发预产期前过早ROM和/或早娩的风险，而阴性的试验指示孕妇没有面临自发预产期前过早ROM或早娩的风险。于是，还提供用于排除(预测为高度不可能)自发预产期前过早ROM或早娩的方法。
PAMG-1是在羊水中发现浓度高但在宫颈-阴道排出物中为低浓度背景水平的蛋白质。近年来，医学界日益接受了将PAMG-1的检测广泛地用于辅助医护人员确认或排除自发胎膜破裂(ROM)。使用的试验为商业销售的ROM试验，由International,LLC,Boston,MA,USA制造。在此前关于PAMG-1对于检测ROM的实用性研究中，注意到在ROM试验为阳性且标准临床评估(例如硝嗪、羊齿样和混合集中)为阴性的23个病例中的20例中，在对患者的临床过程回溯分析时，患者最终被确定为已经破膜(见Lee SE等人，Obstet Gynecol 2007；109:634–640)。稍后报道，对于表现出分娩迹象和征兆组别中所有的预产期前患者，在随后7天内发生分娩(见Lee SM等人，J MaternFetal Neonatal Med 2009；22:305–310)。还研究了在出现早产(PTL)迹象和征兆但是没有ROM的病人中阳性ROM试验的临床值。结果表明ROM试验对48小时、7天和14天以内这些患者的分娩有预测性(见Lee MS等人，J Matern Fetal NeonatalMed.2012Sep；25(9):1690-8)，但PPV不是最优的。
虽然不意图受任何一种特定的作用理论或机制限制，但相信本方法通过提供检测阴道分泌样品中PAGM-1的灵敏度相比于特定的当前可得的诊断方法增加的诊断试验，而至少部分提供优越的性能，例如PPV和NPV，以及灵敏度(SN)和特异性(SP)等性能。例如，虽然当前可得的检测PAMG-1的试验利用5ng/ml的检测阈值，但目前发现将检测阈值调节至4ng/ml提供令人吃惊地改善的诊断试验(例如高PPV和高NPV)。出乎意料的是4ng/ml的检测阈值可用于以高PPV预测TTD的方法，如目前所公开的，由于将检测阈值降至低于5ng/ml预期将升高假阳性结果的频率，由此降低试验的PPV。此外，之前没有意识到检测低于5ng/ml的PAMG-1浓度将对预测TTD有用，因为如此小的浓度被认为几乎没有临床意义。
目前还发现，为了确保诊断方法的高度准确性，适合根据本文公开的方法预测TTD的孕妇的理想妊龄特别地在20周和36周6天之间。同样，在某些实施方案中，对于有3cm以下的宫颈扩张的患者群体，本文公开的TTD试验具有高NPV和高PPV，以及高SN和SP。
在某些实施方案中，如果孕妇具有在20周和36周6天之间的孕龄，则其适合于和/或被选择来预测TTD。在某些实施方案中，如果孕妇具有25mm以上的宫颈长度和/或3cm以下的宫颈扩张，则其适合于和/或被选择来预测TTD。
在诊断试验中，PPV，或者叫准确率，是阳性试验结果为真阳性(例如正确的诊断)的比例。因为其反映了阳性试验反映欲测试的潜在状况的可能性，所以它是诊断方法性能的关键量度。其它重要的量度包括阴性预测值(NPV)、灵敏度(SN)和特异性(SP)。NPV表示具有阴性试验结果又正确地鉴别为没有欲测试的状况的受试者比例。对于给定的试验，高NPV表示当试验获得阴性结果时，其评估很可能是正确的，且很少产生假阴性结果。因而，对于预测临近的分娩(例如在特定的时间框架以内)，高NPV意味着当分娩事实上临近时，试验很少预测分娩不临近。也可将诊断试验(例如在临床研究中)取得的真阳性结果和真阴性结果的数目结合来确定诊断试验的灵敏度(SN)和特异性(SP)。
PPV可根据下式计算：
NPV可根据下式计算：
SN可根据下式计算：
SP可根据下式计算：
在某些方面，本文公开的方法对于预测14天以内的TTD具有至少约77％的PPV。在具体的实施方案中，预测14天以内的TTD的PPV为约90.9％(例如约91％)。在另一具体的实施方案中，预测约14天以内的TTD的PPV为约87％。应理解本方法也涵盖了对于预测约14天以内的TTD，具有至少约例如75％、76％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的PPV的方法。在某些方面,预测约14天以内的TTD的PPV在约70％-100％、约80-％-100％、约85％-100％或约90％-100％的范围。
本文公开的方法对于预测约7天以内的TTD具有至少约64％的PPV。在具体的实施方案中，预测约7天以内的TTD的PPV为81.8％。在另一具体的实施方案中，预测约7天以内的TTD的PPV为约78.3％(例如约78％)。应理解本方法也涵盖了对于预测约7天以内的TTD，具有至少约例如65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的PPV的方法。在某些方面，预测7天以内的TTD的PPV在约60％-100％、约65％-100％、约70％-100％、约75％-100％或约80％-100％的范围内。
另一方面，本文公开的方法具有对于预测约48小时以内的TTD至少约39％的PPV。在具体的实施方案中，预测约48小时以内的TTD的PPV为45.5％。应理解本方法也涵盖了对于预测约48小时以内的TTD，具有至少约例如40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的PPV的方法。在某些方面，对于用本方法预测约48小时以内的TTD，PPV在约39％-100％、约40％-100％或约45-100％的范围内。
在某些方面，根据本文公开的方法预测TTD，对于预测约48小时、7天或14天以内的TTD，NPV为至少约90％(例如约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。
在某些方面，根据本文公开的方法预测TTD，对于预测约48小时、7天或14天以内的TTD而言，SN为至少约70％(例如至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。
在某些方面，根据本文公开的方法预测TTD，对于预测约48小时、7天或14天以内的TTD而言，SP为至少约70％(例如至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。
在某些实施方案中，本方法提供对于预测约14天以内的TTD具有约90.9％的PPV，和/或约93.6％的NPV，和/或约80％的SN，和/或约97.3％的SP的诊断试验。在某些实施方案中，本方法提供对于预测约14天以内的TTD具有约91％的PPV，和/或约94％的NPV，和/或约80％的SN，和/或约97.3％的SP的诊断试验。
在某些实施方案中，本方法提供对于预测约14天以内的TTD具有约87％的PPV、约93.6％的NPV、约80％的SN和约96.1％的SP的诊断试验。在某些实施方案中，本方法提供对于预测约14天以内的TTD具有约87％的PPV、约94％的NPV、约80％的SN和约96％的SP的诊断试验。
在某些实施方案中，本方法提供对于预测约7天以内的TTD具有81.8％的PPV、97.4％的NPV、90％的SN和95％的SP的诊断试验。
在某些实施方案中，本方法提供对于预测约7天以内的TTD具有约78.3％的PPV，和/或约97.4％的NPV，和/或90％的SN，和/或约93.8％的SP的诊断试验。在某些实施方案中，本方法提供对于预测约7天以内的TTD具有约78％的PPV，和/或约97％的NPV，和/或90％的SN，和/或约94％的SP的诊断试验。
在某些实施方案中，本方法提供对于预测约48小时以内的TTD具有约45.5％的PPV、约100％的NPV、约100％的SN和约86.7％的SP的诊断试验。
应理解，可调节上述数值和范围从而包括置信区间(例如95％置信区间)，如在下文的实施例2、表2和4中所示。
本文公开的方法对确定患者(例如孕妇)的早娩风险也有用。早娩在本文中定义为在37周妊龄之前分娩。根据本文公开的方法获得的阳性的试验(即在阴道液样品中检测到PAMG-1处于不低于预定的检测阈值的水平)指明患者面临早娩风险。在某些实施方案中，如果患者出现下列迹象的至少一项，则选择该患者来测试早娩风险：(i)20周和36周6天之间的妊龄；和/或(ii)宫颈长度25mm以上；和/或(iii)宫颈扩张3cm以下。
本文公开的方法对确定孕妇的绒毛膜自发破裂(ROM)，例如预产期前过早ROM的风险也有用。自发ROM通常作为正常分娩过程的一部分而发生。然而预产期前过早的ROM(例如在到达37周妊龄之前)也可发生。如能确定患者的自发ROM包括预产期前过早ROM的风险则会很有利，因此如有必要可进行适当的介入测量(例如给予安胎药来延长妊娠、给予皮质激素来改善胎儿的呼吸发育、给予抗生素来降低感染风险(产时和产后)、建议卧床休息和/或增加观察和胎儿监测)。在某些实施方案中，如果患者出现下列迹象的至少一项，则选择该患者来测试自发ROM风险：(i)20周和36周6天之间的妊龄；和/或(ii)宫颈长度25mm以上；和/或(iii)宫颈扩张3cm以下。
PAMG-1
PAMG-1于1977年由D.Petrunin从羊水中分离，并起初被称作胎盘特异的α-1球蛋白(specific alpha-1 globulin of placenta)(D.Petrunin等人，"ImmunologicalIdentification of Organ Specific alpha-1 Globulin of Human Placenta and ItsContent in the Amniotic Fluid,"in Akusherstvo i Ginekologiya,1977,N 1,pp.64-65,Moscow,USSR)。
从孕妇羊水中分离PAMG-1的示例性步骤概述于表1中并在下文讨论。然而应理解，PAMG-1可根据现有技术中已知的任何合适的方法，从任何合适的来源分离。
表1：分离PAMG-1的示例性步骤
分离步骤 纯度(％) 收率(％)
羊水，16-25周妊娠 4 100
用0.5％氯化镧沉淀 25 90
用50％饱和的硫酸铵沉淀 35 70
用60％饱和的硫酸锂沉淀 60 60
反相色谱分离 90 30
PAMG-1从16至25周妊娠的妇女的羊水中分离。液体取自由于医学考虑而终止妊娠的妇女。将氯化镧的10％溶液按20:1的体积比添加至羊水(使得氯化镧的终浓度为0.5％)并在4℃保持18小时。通过8,000rpm下离心30分钟来进一步分离沉淀。沉淀溶解在Na2HPO4饱和溶液中，然后分离不溶镧盐沉淀(在8,000rpm离心30分钟的过程中产生)。用50％饱和硫酸铵在4℃温育18小时将所得溶液分级，并将所得的沉淀溶解在蒸馏水中，使得溶解的沉淀组分体积恢复至羊水初始体积。然后用60％饱和硫酸锂沉淀溶液，并将沉淀溶解在少量蒸馏水中。透析之后，通过向蛋白质溶液添加等体积吸湿剂而用焦磷酸钙吸附掺和物，混合并温育10-15分钟，并通过离心将吸收剂分离。
PAMG-1的分子量首先报道为32kDa(Boltovskaya,M.N.等人，"Histochemical andClinico-Diagnostic Study of the Placental Alpha-Microglobulin[PAMG-1]UsingMonoclonal Antibodies,"in Bulletin of Experimental.Biology and Medicine,1991,No.10,pp.397-400)；然而现在通常接受的是，PAMG-1具有34kDa的分子量(见，例如Pollet-Villard等人(Amer J Perinatol 2011Jun；28(6):489-94))。PAMG-1是出现在孕妇的血清、羊水和阴道分泌物中的蛋白质。PAMG-1在羊水中存在的浓度至少是孕妇血清中的浓度的100倍，且至少是没有胎膜破裂的孕妇的阴道分泌物中的浓度的3000倍。结果，甚至当少量羊水(按每1ml阴道分泌物约一滴的1/100)溶解在阴道分泌物样品中时，足量的PAMG-1就存在于该阴道分泌物样品中而指示胎膜破裂已经发生。此外，由于血清中PAMG-1浓度低，血清向阴道液样品不显著的掺和(10-15％)并不影响本发明内容的装置和方法所产生的结果。已表明对于ROM的诊断，检测PAMG-1要优于检测其它羊膜蛋白质，例如28kDa的蛋白质IGFBP-1(见Pollet-Villard等人(上文)和European Guidelines on preterm labor(TheJournal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine,2011；Early Online,1–9))。
由于阴道分泌物中羊水的出现可对胎膜破裂有指示性，在阴道分泌物中检测羊膜蛋白质PAMG-1可用于检测胎膜破裂。然而现在发现可使用本文公开的方法，在甚至没有可检测的ROM时检测阴道分泌物中的PAMG-1，通过将PAMG-1的检测阈值调节至约4ng/ml而准确地预测TTD。虽然不意图受理论限制或限于任何一种特定的作用机制，但相信在分娩临近(即分娩将在例如14天、7天或48小时以内发生)时发生的宫缩期间，PAMG-1通过胎膜中的绒毛膜羊膜孔漏出。由于分娩的炎性过程或感染而发生的细胞外基质降解也可导致在宫颈-阴道分泌物中发现PAMG-1水平升高。
PAMG-1抗体
本文公开的方法涵盖在取自孕妇的阴道分泌物样品中检测PAMG-1蛋白质的存在。PAMG-1蛋白可根据现有技术中已知的任何合适的方法来检测。
检测阴道液样品中的PAMG-1的示例性方法包括但不限于使用例如本文记载的PAMG-1特异性抗体(例如单克隆抗体或其抗原结合片段)的免疫测定(例如ELISA)。
如本文所公开的PAMG-1抗体可检测极低浓度的PAMG-1。例如，可检测浓度为0.05ng/ml的PAMG-1。由于与羊水中约1680ng/ml的PAMG-1最小浓度相比，血清中PAMG-1的最大浓度仅约为25ng/ml，又由于阴道分泌物中PAMG-1的背景浓度很低，约0.2ng/ml，故较低的PAMG-1阈值水平可用在本发明用于检测阴道中羊水的出现的方法中。目前发现对于PAMG-1的约4ng/ml的预定义阈值可用于本文公开的方法。
结果，本发明内容的装置和方法不受阴道炎或其它变异因素出现的影响，这些因素对检测胎膜破裂的现有方法的准确性有负面影响。炎症渗出物中PAMG-1的最大浓度为3ng/ml(见，例如Fuks等人的美国专利7,709,272号)。如果血清向阴道分泌物的掺和不超过10-15％，可产生相同的PAMG-1浓度。此外，血清PAMG-1与羊水PAMG-1的浓度之比大使得本发明的装置和方法即使PAMG-1检测阈值低也显著地很少倾向于产生由出现在阴道分泌物中的血清所致的假阳性结果。
本发明内容提供以4ng/ml的PAMG-1检测阈值预测TTD的方法和装置。检测阈值可通过选择具有对PAMG-1的特异性结合亲和力的PAMG-1抗体(例如一对PAMG-1结合抗体)，例如提供所期望的检测阈值的PAMG-1结合抗体的组合而调节。也可调节检测阈值，例如通过在试验区(例如图1和2中的试验区)使用至少一种附加的对PAMG-1的抗体来调节预定的检测阈值(见Fuks等人的美国专利7,709,272号)，或通过调节试验过程，如下文详细讨论的。
从体液分离的重组或通过化学合成产生的PAMG-1多肽及其片段或其它衍生物或类似物包括融合蛋白，可用作免疫原来产生识别PAMG-1多肽的抗体。本文公开的抗体可包括免疫球蛋白的任何同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白重链。PAMG-1抗体可兼具重链和轻链。
抗体(包括全长抗体)、单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人类、人源化或嵌合抗体和抗体片段，例如Fab片段、F(ab')片段、Fab表达文库产生的片段、上述任何的表位结合片段，以及工程化形式的抗体，例如scFv分子，只要它们展现出期望的活性，例如结合至PAMG-1，都可用于实施本文公开的方法。抗PAMG-1抗体，例如本文所公开的，可识别来自一种或多种不同哺乳动物物种的PAMG-1。可选地，本文公开的抗体可对单独一种形式的PAMG-1特异。在某些实施方案中，抗PAMG-1抗体对人类PAMG-1特异。
表位可由邻接的氨基酸形成，或由通过蛋白质三级折叠而并置的非邻接氨基酸形成。由邻接氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时通常可保持，然而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常包括独特空间构象中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括，例如X-射线晶体学和二维核磁共振。见，例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66,G.E.Morris,Ed.(1996)。
识别相同或重叠表位的抗体可在显示某一抗体阻断另一抗体向靶抗原结合的能力的简单免疫测定，例如竞争性结合测定中鉴别。竞争性结合在试验结合分子抑制参比结合分子与共同抗原例如PAMG-1的特定结合的测定中确定。已知多种类型的竞争性结合测定，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)；固相直接或间接酶免疫测定(EIA)夹心竞争测定(见Stahli等人，Methods in Enzymology 9:242(1983))；固相直接生物素-亲和素EIA(见Kirkland等人，J.Immunol.137:3614(1986))；固相直接标记测定，固相直接标记夹心测定(见Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1988))；用I-125标记的固相直接标记RIA(见Morel等人，Mol.Immunol.25(1):7(1988))；固相直接生物素-亲和素EIA(Cheung等人，Virology176:546(1990))；和直接标记RIA(Moldenhauer等人，Scand.J.Immunol.32:77(1990))。
通常，此类测定包括使用纯化的抗原，该抗原结合至固体表面或带有未标记试验结合分子和标记的参比结合分子之一的细胞。竞争性抑制通过确定在试验结合分子存在下结合至固体表面或细胞的标记的量来测定。通常试验结合分子过量存在。通常，当竞争性结合分子过量存在时，其将会以至少50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或更高的水平抑制参比结合分子与共同抗原的特异性结合。
现有技术中已知的多种方法可用于生产对PAMG-1多肽或其衍生物或类似物的多克隆抗体。对于抗体的生产，可通过注射PAMG-1多肽或其衍生物(例如片段或融合蛋白)来免疫多种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等。在某一实施方案中，PAMG-1多肽或其片段可缀合至致免疫载体，例如牛血清白蛋白(BSA)或匙孔血蓝蛋白(keyholelimpet hemocyanin,KLH)。取决于宿主物种，可使用各种佐剂来增加免疫应答，包括但不限于弗氏佐剂(完全和不完全)，矿物凝胶例如氢氧化铝，表面活性物质例如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子，肽，油乳剂，匙孔血蓝蛋白，二硝基酚以及潜在有用的人类佐剂例如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。
关于指向PAMG-1多肽或其片段、类似物或衍生物的单克隆抗体的制备，可使用任何通过培养中的传代细胞系而提供抗体分子产生的任何技术。这包括但不限于最初由Kohler和Milstein(Nature 1975,256:495-497)发展的杂交瘤技术，以及三体瘤(trioma)技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，Immunology Today 1983,4:72；Cote等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1983,80:2026-2030)，和EBV-杂交瘤技术来生产人单克隆抗体(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,77-96页,1985)。在本发明内容的附加的实施方案中，单克隆抗体可在无菌动物中生产(国际专利公布号WO 89/12690，1989年12月28日公布)。事实上，根据本发明内容，可使用通过将来自对PAMG-1多肽特异的小鼠抗体分子的基因和来自有适当生物活性的人类抗体分子的基因共同剪接而发展的用于产生“嵌合抗体”(Morrison等人，J.Bacteriol.1984,159:870；Neuberger等人，Nature 1984,312:604-608；Takeda等人，1985,Nature 314:452-454)的技术；此类抗体在本发明内容的范围之内。优选此类人或人源化嵌合抗体用于人类疾病或病症(下文记载)的治疗，鉴于人或人源化抗体比异种抗体更不可能诱导免疫应答，特别是变态反应应答自身。
根据本发明内容，记载用于生产单链抗体的技术(Huston的美国专利5,476,786和5,132,405号；美国专利4,946,778)可修改来生产PAMG-1多肽特异性单链抗体。实际上也可传递这些基因供体内表达。本发明内容的附加实施方案利用记载用于Fab表达文库构建的技术(Huse等人，Science 1989,246:1275-1281)来实现迅速并容易地鉴别具有对期望的PAMG-1多肽或其衍生物或类似物的特异性的单克隆Fab片段。
包含抗体分子独特型的抗体片段可通过已知技术产生。例如，此类片段包括但不限于：可通过抗体分子的胃蛋白酶消化而产生的F(ab)2片段；可通过还原F(ab)2片段的二硫键而产生的Fab片段，和可通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子而产生的Fab片段。
在抗体的生产中，对期望的抗体的筛选可通过现有技术中已知的技术来完成，例如放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、"夹心"免疫测定、免疫放射分析、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散分析、原位免疫测定(例如使用胶态金、酶或放射性同位素标记)、免疫印迹法、沉淀反应、凝集测定(例如凝胶凝集测定、血细胞凝集测定)、补体固定测定(complement fixation assays)、免疫荧光测定、蛋白A测定和免疫电泳测定等。在某一实施方案中，抗体的结合通过检测一抗上的标记来检测。在另一实施方案中，一抗通过检测二抗或对一抗的试剂来检测。在进一步的实施方案中，二抗是标记的。用于在免疫测定中检测结合的很多手段在现有技术中是已知的，并且在本发明内容的范围之内。例如，为了选择识别PAMG-1多肽特定表位的抗体，对产生的杂交瘤可测定其结合至含有该表位的PAMG-1多肽片段的产物。关于对来自特定动物物种的PAMG-1多肽有特异性的抗体的选择，可根据与该动物物种细胞表达或分离的PAMG-1多肽的阳性结合来进行选择。
在本文公开的某些方面，本文公开的PAMG-1-特异性单克隆抗体可为例如杂交瘤N271产生的M271，由俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM)保藏机构保藏并分配登录号VKPM-93；杂交瘤N52产生的M52，由VKPM保藏并分配登录号VKPM-92；和杂交瘤N42产生的M42，由VKPM保藏并分配登录号VKPM-94。所述PAMG-1特异性单克隆抗体的结合性质和其它特征在Fuks等人的美国专利7,709,272号中详细公开。产生例如PAMG-1特异性抗体的杂交瘤细胞系，例如上文所公开的，可通过下列过程产生。首先，用PAMG-1免疫具有脾和淋巴结B细胞的小鼠。然后产生杂交瘤来使B细胞永生化。B细胞可以是脾和/或淋巴结B细胞。然后，产生对PAMG-1有结合亲和力的单克隆抗体的杂交瘤在ELISA中鉴别：第一层：PAMG-1；第二层：杂交瘤上清液；和第三层：辣根过氧化物酶缀合的兔抗小鼠抗体的缀合物。然后在体外或腹水中培养这些鉴别出的杂交瘤，并分离它们产生的单克隆抗体。
如本文所公开的，可组合使用两种或更多种PAMG-1特异性抗体(例如单克隆抗体)来检测阴道液样品中的PAMG-1。在某些实施方案中，本文公开的方法中使用的至少一种抗体被可检测地标记。可使用各种可检测标志，包括但不限于染色颗粒、酶、荧光染料和放射性同位素。可检测标志的一个特定实例为平均尺寸在20至30nm范围内的金染色颗粒。可检测标志的另一实例为辣根过氧化物酶。将可检测标志附着至抗体的方法记载于例如Harlow,E.和Lane,D.的Methods In Enzymology,1981,Vol.73,3-46页；“Antibodies aLaboratory Manual,”Cold Spring Harbor Laboratory,1988,322,323和343页；和Pierce产品目录，T9-T17页(1996)。合适的酶包括但不限于碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。根据本发明内容使用的其它标志或标记包括胶态金、有色胶乳珠、磁珠、荧光标记(对荧光团仅举几例，如异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红(TR)、罗丹明、游离或螯合的镧系盐特别是Eu3+)或磁共振成像标记。其它标志包括例如用于均相和固相测定的荧光猝灭和荧光转移标记。此外，根据本发明内容，标志可为供与另一分子例如生物素-链霉亲和素、谷胱甘肽-GST、六聚组氨酸(hexahistidine)-镍等相互作用的表位、结合配偶体(bindingpartner)或“把手(handle)”。本发明内容也考虑使用自身被可检测地标记的二抗作为标志(例如，在成对的抗PAMG-1抗体使用具有来自两种不同动物物种的Fc部分的抗体的情况中)。
本文公开的抗体可以是可移动的(例如，能够在引进液体样品时移动(例如在流动装置中))和/或固定化的(例如在条形装置的试验区中)。使样品固定化的方法在现有技术中是公知的。
PAMG-1的检测
免疫测定，特别是免疫色谱测定，包括根据本发明内容的优选的技术，且免疫测定在下文详细阐述。这些测定具有特异性、准确性、速度和经济的优点。但也可使用其它检测和定量PAMG-1的方法。此类技术的一种是质谱法，例如，使用利用飞行时间室中的延迟引出(delayed extraction)和反射器(reflectron)的基质辅助激光解吸电离(MALDI)飞行时间(TOF)质谱(MS)。优选地，MALDI测定在硅阵列上进行。MALDI用的阵列的实例为氧化硅上350μm中心的200μm圆形胶垫。胶垫之间的疏水表面(防水表面)为MALDI进一步提供更集中的基质/蛋白质点，因而改善定量的信号。例如，用Packard Bioscience系统产生的点，其直径可小于200μm。Piezo系统可将约300pL MALDI基质(例如DHB、芥子酸)传递至亲和捕捉剂-肽点的确切位置，从而创造均相的肽/基质晶体。MALDI-MS(例如Perseptive Voyager)中从该晶体的脱附/电离(Karas等人，Ion Processes,1987,v.78,53-68页，或Zenobi等人，MassSpectrom.Rev.1998,v.17,337-366页)产生肽峰高度与含有该肽的蛋白质的量相关的质谱。
用于本文公开的方法的可选的技术为毛细管电泳色谱，其可允许定量存在于少量样品中的分析物。
此外，可单独或组合使用定量生物化学技术，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱等，来检测和定量样品中PAMG-1的量。
本文公开的方法所涵盖的此类使用示例性PAMG-1特异性抗体的免疫测定详细记载于Fuks等人的美国专利7,709,272号。
检测PAMG-1的免疫免疫方法和装置
现有技术中已知的多种用于检测抗体对抗原免疫特异性结合的方法可用于依照本发明内容检测结合。涉及复合物分析的检测抗原和抗体之间相互作用的早期方法是通过凝胶中的沉淀。检测分析物-检测抗体结合对的进一步的方法包括使用放射性碘标记的检测抗体，或者放射性碘标记的、可与IgG反应的蛋白质，例如蛋白A。这些早期方法是本领域技术人员公知的，如在Methods in Enzymology,1980,v.70,166-198页中综述的。通过选择获得高于本文公开的PROM阈值的阳性结果的抗体和条件，可在本文公开方法的实践中使用此技术。
仅用一种抗体确定样品中分析物的存在的后期方法包括竞争性结合测定。在此技术中，通常固定化于固体载体上的抗体将与已知量的标记的分析物一起，暴露于怀疑含有分析物的样品。然后，这两类分析物，即标记的分析物和样品中的分析物，将竞争抗体上的结合位点。确定游离的标记的分析物或结合的标记的分析物，并从该测定中得出样品中竞争性分析物的量。此方法更完整的记述在"Basic Principles of Antigen-AntibodyReaction",Elvin A.Labat,(Methods in Enzymology,70,3-70,1980)中公开。在此实例中，标记的分析物可用放射性同位素或酶标来标记。
更近期的免疫测定利用双抗体法来检测分析物的存在。这些技术也在上文引用的Methods in Enzymology卷中综述。因此，根据本发明内容的一个实施方案，利用对各个欲检测标志的成对抗体来确定个别标志的存在。所述成对抗体的抗体之一在本文中称为“检测抗体”，而所述成对抗体中的另一抗体在本文中称为“捕捉抗体”。本发明内容的某一实施方案于是使用双抗体夹心法来检测阴道液样品中的PAMG-1。在此方法中，分析物夹在检测抗体和捕捉抗体之间，捕捉抗体不可逆地固定化于固体载体上。检测抗体会含有可检测的标记，用来鉴别抗体-分析物夹层的存在，并由此鉴别分析物的存在。
一般早期的固体载体形式包括聚苯乙烯板、管或珠，它们在放射免疫测定和酶免疫测定领域中均是已知的。最近以来，若干多孔材料例如尼龙、硝化纤维素、醋酸纤维素、玻璃纤维和其它多孔聚合物已用作固体载体。
因而，在具体的实施方案中，本发明的装置包含用于进行免疫色谱测定的部件(“免疫色谱测定装置”)。此类装置包含用于引导液体的固相部件。如在本文中使用，术语“用于引导液体的固相部件”是指允许液体从中迁移(例如通过毛细作用)的固体载体。具有该性质的代表性产品是硝化纤维素膜，其可通过本领域技术人员公知的方法来制备。
很多免疫色谱测定方法和形式是现有技术中已知的，并可用于本文所公开方法的实践中。用膜作为浸渍片或流通(flow-through)装置中的固体载体的免疫色谱测定已良好建立，供临床实验室使用，以及可选地供例如非实验室现场试验。免疫色谱测定装置的通常外观为包在塑料保持件中的膜(纤维素或非纤维素)。塑料保持件使膜保持适当的构造，从而确保整个装置的正确运行。测定装置的基本结构有很多变化形式。例如，Litman等人(美国专利号5,156,952和5,030,558)记述了用于确定样品中最小量分析物存在的测定方法和装置。Ullman等人(美国专利号5,137,808和4,857,453)记述了一种安置测定膜的装置，其包括用来辅助样品流动的自包含液体试剂。Dafforn等人(美国专利号4,981,768)记述了一种具有供施加样品和额外液体用的接口的装置。Corti等人(欧洲专利申请号89118378.2)、Greenquist等人(美国专利号4,806,312)和Berger等人(美国专利号5,114,673)也记述了测定装置。
优选地，免疫色谱测定部件包括对照，来指示测定已正确地进行。对照可以是在固相载体上处于比检测区更远离样品施加点的位置的特异结合反应物，其将在分析物存在或不存在时向标记试剂结合，于是指示可移动的受体已随同液体样品迁移了足够的距离，从而给出有意义的结果。
供免疫色谱测定中使用的合适的标记包括酶、荧光团、生色团、放射性同位素、染料、胶态金、胶态炭、胶乳颗粒和化学发光剂。当使用对照标志时，对于受体和对照标志可使用相同或不同的标记。
本发明内容的某一实施方案使用流通型免疫测定装置。Valkirs等人(美国专利号4,632,901)公开了一种装置，其包括对抗原分析物特异、结合至添加液体样品的多孔膜或滤器的抗体。液体流过膜时，靶分析物结合至抗体。添加样品之后，接着添加标记的抗体。对标记抗体的目视检测提供样品中靶分析物存在的指示。
流通装置的另一实例由Kromer等人(EP-A 0 229 359)公开，其记述了一种试剂运送系统，包含由分散在水溶性聚合物中的试剂或其组分饱和的基质，用于控制供运送至处于基质之下的反应基质的试剂的溶解速率。
在迁移型测定中，固相载体例如膜由进行测定所需的试剂浸渗。提供结合标记的分析物并读出测定结果的分析物检测区。例如，见Tom等人(美国专利号4,366,241)和Zuk(EP-A 0 143 574)。迁移测定装置当中通常掺入已附着至例如胶态金或炭等有色标记的试剂，从而实现无需添加另外的物质就可视检测测定结果。见例如Bernstein(美国专利号4,770,853)、May等人(WO 88/08534)和Ching等人(EP-A 0 299 428)。所有这些已知类型的流通装置可根据本文公开的方法来使用。
直接标记是可用于根据本发明内容的免疫色谱测定的标记的一个实例。直接标记已定义为在天然状态下对裸眼轻易可见，或借助于滤光片和/或施加例如U.V.光等激发来促进荧光从而可见的实体。可根据本发明内容使用的有色标记的实例包括金属溶胶颗粒，举例来说，金溶胶颗粒，例如Leuvering(美国专利号4,313,734)所记述的；染料溶胶颗粒，例如Gribnau等人(美国专利号4,373,932)和May等人(WO 88/08534)所描述的；染色的胶乳，例如May(见上文),Snyder(EP-A 0 280 559和0 281 327)所记述的；或如Campbell等人(美国专利号4,703,017)记述的包封在脂质体中的染料。其它直接标记包括放射性核素、荧光部分或发光部分。除这些直接标记装置以外，包含酶的间接标记也可根据本发明内容使用。各种类型的酶联免疫测定在现有技术中是公知的，例如碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶、溶菌酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、脲酶这些以及其它已由Eva Engvall在EnzymeImmunoassay ELISA and EMIT,Methods in Enzymology,70.419-439,1980和美国专利号4,857,453中详细讨论。
在具体的实施方案中，本发明内容的诊断装置包含具有接近于样品引入点的检测部和该位置下游的捕捉部的膜组件。检测部含有将与样品中存在的本发明内容的任何分析物反应的抗体(检测抗体)(例如单克隆抗体)。检测抗体可逆地固定在膜上，并且在使用时会随样品一起迁移。虽然并非不可或缺，但优选检测抗体以例如放射性核素、酶、荧光部分、发光部分或如现有技术中所记述及上文所讨论的有色标记等来标记。具体地，可利用反应性标记，使得例如抗体会在抗原捕捉之前呈现金色，并且会在捕捉时变为紫色。
如上所述的捕捉部在检测部的下游，包括不可逆地固定于固体载体上的捕捉抗体(例如单克隆抗体)，各抗体固定在捕捉部的不同位置。抗体和必要的试剂用标准现有技术固定在固体载体上，如此前讨论的流通型免疫测定装置中所讨论的。通常，抗体吸收在固体载体上是非极性蛋白质结构和非极性载体基质材料之间疏水相互作用的结果。
本发明内容的免疫色谱测定技术的特别优点在于其克服了这些测定不能提供定量数据的问题。于是，捕捉部可包含对PAMG-1特异的固定化抗体的混合物，使得信号仅在样品中PAMG-1的量超过期望的检测阈值时产生。
此外，本发明内容考虑使用均相免疫测定形式。此类竞争性均相法的一个实例见于Rubenstein和Ullman的美国专利号3,817,837，其记述了配体和酶结合配体对抗体结合位点进行竞争的技术。由于抗体对酶结合配体的结合改变其酶活性，配体存在的浓度可通过测定此混合物将底物转化为产物的速率来估计。因而，在均相法中，标记的可检测性质取决于是否结合而固有地不同。标记在其结合状态下会具有较大或较小的信号强度。通常，抗体对标记配体的结合造成信号强度降低，例如当标记为酶时。此类别中代表性的产品包括来自Syva Company的酶免疫测定EMIT线和来自Abbott Diagnostics的荧光极化免疫测定TDX线。特定的均相测定可通过所有分析物在珠上的分布而制备，在此过程中将引入样品，并且此后将珠旋转下来并检测。
可根据本发明内容使用的生物诊断装置的其它实例包括G.Grenner,P.B.Diagnostics Systems,Inc.在美国专利4,906,439和4,918,025号中记述的装置。Grenner'439装置包括诊断试验元件，和以具备有多条用于将样品运送至试验元件的沟槽的层为特征的样品施加单元。Grenner'025涉及一种装置，其包括样品引入部件，例如附近安装了包含固定试剂的毛细管和储废液器的膜。样品沉积之后，固定试剂从毛细管的释放使反应终止，过量的液体由储废液器保留，因而该装置是自包含的。
虽然优选使用膜的测定，但应理解，其它技术和相应的传感装置可同样地按照与上文相似的方式使用。目前有若干类型的自动测定设备可用，其可同时在多个样品上承担测定。自动测定设备包括连续/随机获取测定设备。此类系统的实例包括PB DiagnosticSystem,Inc.的OPUSTM和Abbott Laboratories of North Chicago,Ill.于1988年引入的IMXTMAnalyzer。一般来说，试验液体的样品通常提供于样品杯中，并且所有处理步骤，包括将样品吸移至测定试验元件中、温育和读取所获的信号，都自动进行。自动测定系统通常包括一系列的工作站，各自进行试验过程的某一步骤。可通过各种部件，例如旋转传动带或可移动架来将测定元件从一个工作站运送到下一个工作站，从而使试验步骤次序地完成。测定元件也可包括供存储试剂、混合液体、稀释样品等的储蓄器。测定元件也包括开口来实现将预定量的样品液及必要时的其它需要的试剂加至多孔构件。样品元件也可包括窗口，使得信号作为处理步骤的结果而获取，典型地为出现在多孔构件上的试剂的荧光或比色变化，其通过包括在测定系统中的光谱测定或荧光计部件来读取。PB Diagnostic Systems,Inc.的自动测定仪器记述于美国专利5,051,237；5,138,868；5,141,871和5,147,609号。
可用于实践本文所公开方法的进一步的免疫化学分析系统类别为生物传感器或光学免疫传感系统。一般而言，光学生物传感器是用光学原理定量地将所关注的化学或生物化学浓度或活性转化为电信号的装置。这些系统可分组为四个主要类别：反射技术；表面等离子体共振；光纤技术和集成光学装置。反射技术包括椭圆光度法、多重积分反射光谱和荧光毛细管填充装置。光纤技术包括倏逝场荧光(evanescent field fluorescence)、光纤毛细管和光纤荧光传感器。集成光学装置包括刨床倏逝场荧光(planer evanescent fieldfluorescence)、输入分级耦合免疫传感器(input grading coupler immunosensor)、Mach-Zehnder干涉仪、Hartman干涉仪和差分干涉传感器(difference interferometersensor)。结合反应的全息检测通过检测全息图像的存在而完成，该图像是在结合对的反应物之一结合至结合对的固定化的第二反应物时以预定的图像位置形成的(见1994年10月4日授予Lichtenwalter等人的美国专利5,352,582号)。光学免疫传感器的实例大体上记述于G.A.Robins的综述文章(Advances in Biosensors),Vol.1,229-256页,1991。这些装置更具体的记述见于例如美国专利4,810,658；4,978,503和5,186,897号；R.A.Brady等人(Phil.Trans.R.Soc.Land.B 316,143-160,1987)和G.A.Robinson等人(于Sensors andActuators,Elsevier,1992)。
本发明内容的方法和相应的试剂盒能够并入且用于多种光学测定系统中。具体地，虽然本发明内容的试剂盒和材料可在免疫测定形式中使用，此类形式本身也能够在多种光电检测系统中实施。更具体地，已知多种光学免疫传感器在本文公开的方法的实践中可受促进和实现。于是，例如反射技术、表面等离子体共振、光纤波导技术和集成光学装置等装置和技术均可被采用，并根据本方法特别地配置来检测和显示患者生物样品检查结果。存在特别的反射技术，例如反射测定和椭圆光度法，以及光纤、光波导、荧光毛细管填充装置和集成光学生物传感器的具体使用，也可应用一些变体技术和设备。这些装置的大体综述可见于Robinson,G.A.,Optical Immunosensors:An Overview,Advances inBiosensors,Vol.1,229-256页(1991)。
更具体地，椭圆光度法依靠偏振光束的方向，首先对着参比表面(标准)，此后对着样品表面，接下来可进行结果反射的性质和程度的比较。特别地，分析物向受体分子的结合将测定为表面厚度相对于参比表面的连锁。
以多重内反射光谱(multiple internal reflection spectroscopy)为例，例如，配体及其受体可共价地固定在平面融合石英波导的光学表面上，此后光束可在波导中内部反射，并会穿透入临近波导的溶液，因而折射差可测定为标准和样品之间的差。在该特定的形式中，可联合荧光标记，并由此进行荧光测定来确定当前结合的程度。
另外的技术使用称为荧光毛细管填充装置的技术。在此特定技术中，使用由毛细管尺度的缝隙隔开的两块玻璃板。受体分子可固定化于也充当光波导的基板上。可进行利用FITC标记的竞争性或夹心测定，且诱导的荧光耦合入具有来自与结合源相反的结合的信号的波导。此类信号通过其激发波导时的角度发散来区分。也制备了表面等离子体共振(SPR)装置，其响应薄金属膜上的入射光与金属膜中与集体电子震荡相关的表面模式的耦合而运行。共振条件取决于金属膜的光学特征、厚度、任何一面的介电折射率和光入射角。受体分子结合至金属膜的顶面，且光在膜的底面引导，例如通过棱镜衬底。靶分析物在结合至这些受体时，由于其产生的局部折射率的变化，将会引起共振条件的偏移。共振通过监控金属膜表面上的光束入射角变化时的反射光强度来观察。共振角度的变化将与分析物结合量直接相关。
涉及光纤系统的技术包括倏逝场荧光。在此实例中，覆层从光纤末端除去，于是产生与周围介质倏逝地相互作用的传感器元件。受体分子结合至暴露的纤维表面，并且可利用受体与缀合蛋白质的天然荧光来进行直接测定。竞争性或夹心测定可使用FITC标记来进行，以便获得更大的灵敏度。运行中，光波耦合入纤维，且一部分倏逝地产生的荧光耦合返入纤维并扩散返回至检测器。
进一步的技术使用涉及光纤毛细管的光纤技术，其中裸露的光纤包围在圆柱形填充腔中，产生与紧接围绕纤维的填充体积部分倏逝地相互作用的传感器元件。受体分子可结合至暴露的纤维表面，并且可进行夹心或竞争性取代测定。光波可耦合入纤维，且一部分倏逝地诱导的荧光将耦合返入纤维并扩散返回至检测器。来自靶分析物的信号相对背景源通过其激发纤维时的角度发散来区分。可使其它光纤技术例如光纤荧光适合于本文公开的利用某些上文阐述的相同原理的方法。
进一步的光子技术例如干涉分析法包括设置具有例如双路径的薄膜波导，第一路径上可固定受体分子，而第二路径被掩蔽，从而提供参比通道。举例来说，激光可耦合入波导并分开两条路径，因而覆盖物的折射率和厚度可通过光束相移的结果来检测，其将相应地与分析物结合量相关。该方法的变型在制备了单路径多模式薄膜水平波导的Hartman干涉分析中鉴别。受体分子可固定在该路径上，且来自激光的光可耦合入波导，因而两种模式向下扩散至路径。多模式几何的光学是这样的：高阶模式具有大的倏逝场，提供信号机制，而低阶模式实质上不具有倏逝场，提供参比机制。与靶分析物的结合会导致将由高阶模式倏逝场检测的路径上的覆盖层的厚度和折射率的相关变化，造成该模式中的相移。鉴于低阶或参比模式无视此类变化，将不会感受到相移，且信号和参比束之间的测定差将能够关联确定分析物结合量。
虽然上文的讨论提供了一般术语和一些细节，多种光学传感器技术中可用的技术可适应本发明内容的实践。应理解，上面的陈述绝不是详尽无遗或限制性的，鉴于可采用多种现有的技术，将成功地测定结合中的差异，并因此测定此处各自的目标标志或分析物的存在和量。当然，如上文所强调的，无论使用何种技术，本文公开的方法的实践包括至少三种分析物的同时检测和测定。
检测PAMG-1的免疫色谱方法
根据本发明内容的PAMG-1检测方法的实施方案记述如下。
在本方法的一个实施方案中，PAMG-1在样品中通过下列方法检测：含PAMG-1的样品与根据本文公开的方法的免疫测定系统接触而形成抗体-PAMG-1复合物。然后检测抗体-PAMG-1复合物。在本实施方案的一种变型中，抗体包括可检测标志，检测抗体-PAMG-1复合物的步骤包括可检测标志。
在本方法的另一实施方案中，PAMG-1在样品中通过下列方法检测：使样品与对PAMG-1有高度特异结合亲和力的抗体(如M271，作为下文的范例)接触，因而形成抗体M271–PAMG-1复合物。然后复合物与固定化的二抗(例如M52)接触。二抗免疫地与一抗相区别(例如，结合至不同的表位)，因此这些抗体可同时结合至PAMG-1分子。固定化的抗体结合至移动的抗体-PAMG-1复合物，从而形成固定化的抗体-PAMG-1-抗体复合物。通过检测此异源三聚体复合物(heterotrimer complex)而检测PAMG-1。如上所述，对PAMG-1特异性高的抗体优选用于PAMG-1的最初识别。
当上述方法包括所选的以可检测标志标记的抗体对的抗体之一的使用时，该方法的变型包括，在样品与固定化的二抗接触之前，使样品与标记的一抗接触。在此变型中，标记的抗体的作用是结合至样品中的PAMG-1。而本方法的另一实施方案包括下列步骤：将含有PAMG-1的液体样品添加至多孔材料的可移动标记抗体区，该区域允许抗体和蛋白质穿过其而迁移，该抗体区包括对PAMG-1有高特异性的可移动的抗体，导致抗体向PAMG-1的附着，从而形成抗体-PAMG-1复合物；复合物向其中含有固定化的二抗的试验区迁移，二抗具有对PAMG-1的结合亲和力，导致二抗结合至标记抗体-PAMG-1复合物，从而形成固定化的复合物；并检测试验区中固定化的复合物。
而本方法的另一实施方案为标准夹心测定，其中未标记的抗体固定于任何表面上。含PAMG-1的液体样品的添加导致PAMG-1被固定化的抗体结合，从而形成抗体-PAMG-1复合物。标记的抗体的添加导致包含固定化抗体和PAMG-1-标记抗体的复合物的形成，以及该复合物的检测。
根据上述方法，抗体可包括可检测标志或标记，检测抗体-PAMG-1或PAMG-1-抗体复合物的步骤包括所述可检测标志或标记的检测。可用的可检测标志的实例包括染色颗粒、酶、染料和放射性同位素。在具体的实施方案中，可检测标记为金的染色颗粒，例如具有在约20nm和30nm之间的平均尺寸。还在另一实施方案中，可检测标志为辣根过氧化物酶。
检测PAMG-1的示例性装置
预想多种装置供检测样品中的PAMG-1蛋白。根据本发明内容的装置和/或方法优选可检测PAMG-1浓度在约1ng/ml和50μg/ml、约2ng/ml和50μg/ml、约3ng/ml和50μg/ml或约4ng/ml和50μg/ml之间的样品中的PAMG-1。可用于本文所公开方法的装置的非限制性实例记述于Fuks等人的美国专利7,709,272号。供本方法使用的装置也包括，例如，一种盒，其包含试验条(例如，具有放置样品的衬垫区和读取结果的试验区)，以及任选地包括内置计时器和/或指示患者身份的部位。衬垫和试验区在下文更详细地讨论。在本方法的某些实施方案中，优选的PAMG-1检测阈值调节为至少约4ng/ml。应理解本发明内容的方法和装置也涵盖约至少1ng/ml、约至少2ng/ml和约至少3ng/ml的PAMG-1检测阈值。
可使本文记述的装置和方法适合易于以快速方便的方式使用，从而使得装置和方法可用于门诊患者情况。例如，该方法可并入可由对装置几乎或完全没有在先经验的患者操作的易用装置中。这使得方法和装置高度可靠，并且不太受操作错误影响。也可设计该方法，使之能够以简单的“是”或“否”(或者“+”或“-“)确定样品(例如阴道液样品)中PAMG-1的存在。
检测PAMG-1的示例性非限制装置在图1和2中示出。为举例的目的，该记述涉及下文举例的单克隆抗体。然而，这些特异性单克隆抗体的使用并非必需。例如选择如上文所记述的成对PAMG-1特异性抗体的步骤可由本领域普通技术人员重现。
如图1和2所示，可用于实施本文所公开方法的示例性装置具有包含数个依次互相连接的元件的条状主体。更具体地，装置的部件12包括衬垫，该衬垫包含M271抗体区10，该区域中的M271抗体是由例如染色颗粒SP(图中未示出)标记的。衬垫12可由玻璃纤维薄纸(fiberglass tissue)或任何其它材料制成，这些材料是多空的，并允许样品的各种颗粒和物质迁移。染色颗粒可包括平均尺寸在20至30nm范围内的金颗粒。M271抗体区也含有由相同染色颗粒标记的小鼠IgG免疫球蛋白。通过用标记的M271抗体和标记的小鼠IgG溶液浸渍衬垫12，将标记的M271抗体和小鼠IgG免疫球蛋白引入衬垫12的条带部分10。可用画笔或微滴形成装置将M271抗体和小鼠IgG免疫球蛋白溶液引入硝化纤维素膜22。纵向连接至衬垫12一端的是[a]硝化纤维素膜22，其包哈试验区14和对照区16。试验区14和对照区16都横向地设置在装置的整个宽度上。试验区14为硝化纤维素膜22的条带部分。试验区14含有附着至硝化纤维素膜22的M52抗体。对照区16含有附着至硝化纤维素膜22的抗小鼠抗免疫球蛋白抗体。对照区16跨越条22的整个宽度。滤纸膜24连接至硝化纤维素膜22的末端，该末端与硝化纤维素膜22连接至衬垫12的末端相对。滤纸膜24与硝化纤维素条22末端纵向连接。装置的表面覆以特别的保护膜28和30，例如为条形装置特别设计的薄粘合带。箭头18画在膜28表面，用以显示衬垫12的样品施加末端。衬垫12、硝化纤维素膜22和滤纸条24附着至粘性硬塑料基材26。
在本部分记述的实施方案中，装置包括由允许抗体和蛋白质从中迁移的多孔样品施加基质形成的M271抗体衬垫区10。M271抗体区10包括能够高度特异结合至PAMG-1的M271抗体。将含有PAMG-1的液体样品引入M271抗体区导致M271抗体附着至PAMG-1，从而形成抗体M271–PAMG-1复合物。装置也包括试验区14，其与由允许抗体和蛋白质从中迁移的多孔材料所形成的M271抗体区10在液体中相连。试验区14包括固定化于试验区14中、也能够结合至PAMG-1的M52抗体。M52抗体免疫地区别于M271抗体，使得M271和M52抗体可同时结合至PAMG-1。液体样品引至M271抗体区10，导致抗体M271–PAMG-1复合物迁移入试验区14，在此处抗体M271–PAMG-1复合物通过M52抗体而结合至固定化于试验区中的M52抗体。该装置基于固定在试验区14中的M52抗体的存在而检测样品中的PAMG-1。结果，仅PAMG-1形成固定于试验区14中的抗体M271–PAMG-1–M52抗体复合物。于是，固定于试验区14中的M52的存在能指示样品中PAMG-1的存在。
在检测阴道分泌物中PAMG-1的装置的实施方案中，M271抗体附着有可检测标志，其用于检测固定于试验区14的PAMG-1。可用的可检测标志的实例包括但不限于，染色颗粒、酶、染料、荧光染料和放射性同位素。在某一实施方案中，可检测标志为平均尺寸在约20-30nm之间的金颗粒。在某一实施方案中，M271抗体为冻干状态的标记的抗体。
在M271抗体衬垫区中的M271抗体由可检测标志标记的多个实施方案中，装置进一步包括含有M52抗体的试验区。衬垫区和试验区在液体中相连。
还在装置的另一实施方案中，也表现为图1和2说明的装置范围内，装置具有具备近端和远端的条状主体。条状主体的M271抗体区10由允许抗体和蛋白质从中迁移的材料制成。条状主体的M271抗体区10包括对PAMG-1有高度特异结合亲和力的M271抗体，包含PAMG-1的液体样品向M271抗体衬垫区的引入导致M271抗体向PAMG-1附着，从而形成抗体M271–PAMG-1复合物。
条状主体也包括试验区14，其接近于M271抗体区10，并与M271抗体区10在液体中相连。试验区14由允许抗体和蛋白质从中迁移的材料形成。试验区14包括固定于试验区14中的、具有对PAMG-1的结合亲和力的M52抗体，液体样品向M271抗体区10的引入导致抗体M271–PAMG-1复合物向试验区14迁移，在试验区14中抗体M271–PAMG-1复合物结合至M52抗体，并通过M52抗体而固定于试验区14。试验区也可包括固定于试验区14的M42抗体和M52抗体。基于标记的抗体M271–PAMG-1复合物在试验区14中的固定，装置检测样品中的PAMG-1。使用固定于试验区中的PAMG-1特异性抗体(例如M42和M52)的各种组合，示例了一种调节条形装置的灵敏度阈值(检测阈值)的途径(见Fuks等人的美国专利7,709,272号)。然而，本领域普通技术人员将领会到，其它调节检测阈值的方法也是可能的(例如，改变一对PAMG-1特异性抗体的固定化和不可移动抗体的结合亲和力，和/或调节过程，例如试验过程步骤的程序计时，如本文所公开的)。
对照区。本装置可包括标准对照区16(图1和2)。该对照区用于确认装置的正确运行。然而，任何可选的对照区设计也可用于本文公开方法所用的装置。
例如，具有一对照区的装置可包括由允许抗体和蛋白质从中迁移的材料形成的M271抗体区10，M271抗体区10包括标记的M271抗体，该M271抗体并未固定于M271抗体区10中，并且具有对PAMG-1的高特异性；含有PAMG-1的液体样品向M271抗体衬垫区10的引入导致M271抗体结合至PAMG-1，从而形成抗体M271–PAMG-1复合物。该装置也可包括试验区14，试验区14与由允许抗体和蛋白质从中迁移的材料形成的M271抗体区10在液体中相连。试验区14也包括固定在试验区14中、具有对PAMG-1的结合亲和力的M52抗体。M52抗体免疫地区别于M271抗体，使得M271和M52抗体可同时结合至PAMG-1。液体样品向M271抗体区10的引入导致抗体M271–PAMG-1复合物迁移进入试验区14，在试验区14处抗体M271–PAMG-1复合物结合至M52抗体，并通过M52抗体而固定于试验区14中。基于标记的M271抗体在试验区14中的固定，装置检测样品中的PAMG-1。当低浓度的PAMG-1出现在样品中时，至少一部分标记的M271抗体经试验区14从M271抗体区10迁移至对照区16。抗小鼠抗免疫球蛋白抗体固定在对照区16中。抗免疫球蛋白抗体与染色对照区的标记的M271结合。如果高浓度的PAMG-1出现在样品中，则仅有少量的标记的M271抗体可接近对照区16，且对照区的着色可能过于微弱，以致于对人的裸眼不可见。为了防止此类可能性，将标记的小鼠IgG免疫球蛋白加入M271抗体区10。此免疫球蛋白不结合PAMG-1，并自由地经M52抗体试验区14迁移至对照区16，在对照区16处被抗小鼠抗球蛋白抗体结合，并将对照区16染色。无论样品中PAMG-1浓度如何，对照区都确认装置的正常运行。
装置的另一组件可以是与试验区材料紧密有孔连接的多孔材料。装置的这一部分充当帮助液体、蛋白质和抗体从中移动的泵。可用于标记小鼠抗体和IgG免疫球蛋白的可检测标志的实例包括但不限于染色颗粒、酶、染料和放射性同位素。在某一实施方案中，可检测标志为荧光染料。在另一实施方案中，可检测标志为染色的颗粒。在某一实施方案中，M271抗体(其为标记的抗体)和标记的小鼠免疫球蛋白IgG处于冻干状态。
用于上述装置不同区域的材料可以是允许抗体和蛋白质从中迁移的材料的任何组合。合适材料的实例包括但不限于玻璃纤维、多孔塑料、硝化纤维素和滤纸。
本文公开的方法所使用的装置的部件可安置在任何功能性组合体中(例如，在侧流装置、盒等当中)，只要当PAMG-1在样品中以至少预定的检测阈值(例如4ng/ml)存在时可检测到即可。
供本方法使用的装置可任选地包括至少覆盖装置的一部分的保护膜。该膜可以是透明或不透明的，并且其表面上可具有必要的商标、信息记号/符号或箭头。
样品采集
在本文公开的方法中，有必要从患者采集阴道液样品。用于采集样品和将样品转移至溶液(用于试验)的装置或工具或其他部件可根据本发明内容而变化，只要可采集样品即可。采集阴道液样品(例如含PAMG-1的阴道液样品)用的装置的非限制实例包括，例如阴道拭子(例如植绒阴道拭子)。
采集阴道液样品的其他方法的非限制实例包括，例如灌注法或阴道冲洗。同样，注射器可用于采集阴道液样品。
样品采集的具体装置和/或方法可变化，且可使用现有技术中已知的任何合适的装置或方法，只要成功地采集阴道液样品。优选地，样品采集的装置或方法收获样品中靶分析物(例如PAMG-1)的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％以上。例如，用于本实施例的植绒的阴道拭子在采集和转移至溶液后收获PAMG-1的约80-90％。
在某些实施方案中，采集阴道液样品的装置或方法使阴道液样品以1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10稀释。在某些实施方案中，采集阴道液样品的装置或方法使阴道液样品在1:1至1:10、1:2至1:9、1:2至1:8、1:2至1:7、1:2至1:6、1:2至1:5、1:2至1:4、1:2至1:3、1:3至1:10、1:3至1:9、1:3至1:8、1:3至1:7、1:3至1:6、1:4至1:7、或1:5至1:6范围内稀释。
在具体的实施方案中，阴道拭子使阴道液样品以约1:4稀释。在另一实施方案中，植绒的阴道拭子使阴道液样品以约1:4稀释。
试剂盒
本发明内容也提供试剂盒。在一方面，本文公开的试剂盒包括装置，例如，如本文所公开的，当PAMG-1以超出预定的检测阈值(例如，0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml或4ng/ml)的水平在阴道液样品中存在时，用于检测PAMG-1存在的装置(例如侧流装置)。在另一方面，本文公开的试剂盒包括装置(例如但不限于侧流装置，例如与美国专利7,709,272号所记述的相似的装置)，当PAMG-1以超出预定阈值(例如，0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml或4ng/ml)的水平在阴道液样品中存在时其用于检测PAMG-1的存在；以及用于采集阴道液样品的部件(例如阴道拭子，例如但不限于本文记述的阴道拭子(例如植绒的阴道拭子)、注射器、灌注套装或其它供采集样品的合适装置)。在某些方面，供采集阴道液样品的部件可任选地用于稀释阴道液样品(例如，1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10，或例如在1:1至1:10、1:2至1:9、1:2至1:8、1:2至1:7、1:2至1:6、1:2至1:5、1:2至1:4、1:2至1:3、1:3至1:10、1:3至1:9、1:3至1:8、1:3至1:7、1:3至1:6、1:4至1:7、或1:5至1:6等的范围)。试剂盒也可包括用于转移阴道液样品的溶剂(例如，含有分析物(例如PAMG-1)，例如含0.9％NaCl、0.01％Triton X100、0.05％NaN3的溶液)。溶剂可容纳在药瓶中，该药瓶同样可用作可直接施加在侧流装置上的溶剂加阴道液样品的涂布器。试剂盒也可包括含有试验条(例如，具有放置样品的衬垫区，以及读取结果的试验区)的盒，并且任选地，具有内置计时器和/或指示患者身份的部位。本文公开的试剂盒可进一步包括一个或多个药瓶(例如，塑料药瓶)和/或使用说明书。例如，使用说明书可包括根据试验结果诊断TTD的说明。试剂盒也可包括干燥剂。试剂盒也可包括计时器，例如内置于试验装置，或作为单独的单元。除此之外或可选地，使用说明书可包括用于诊断胎膜自发破裂(ROM)(例如预产期前过早ROM)和/或早娩风险的说明。试剂盒可包括示于图1和2的装置。
样品采集和试验过程
通常，本文公开的方法和试剂盒可用于从出现提示早产的迹象、征兆或不适的患者采集试样(阴道液样品)。优选地，在指诊或润滑剂之前，并且在任何消毒剂溶液或药物使用之前或除去6小时之后，进行试样采集。试样可在没有明显血液掺和物的存在下采集。本文公开的方法甚至可在采集器具(例如拭子)上具有痕量血液时进行。若存在尿液、精液或阴道感染也可采集试样，并且试样可从20至36周6天妊龄的患者采集。此外，不要求窥镜检查。
可使用根据本发明的的下列方法，从孕妇采集阴道液样品并测定样品中PAMG-1的存在(例如，用于预测TTD和/或确定患者的早产和/或自发ROM风险)。然而本领域技术人员将领会到，如本文所公开的，可使用不同的方法和/或试验装置来获得相同结果，并且它们也由本发明内容所涵盖。
样品采集
在根据本方法的试验的一个实施例中，根据下文，将阴道拭子采集的宫颈-阴道排出物样品提取入溶剂：
通过其盖子取溶剂(例如，含有0.9％NaCl、0.01％Triton X100、0.05％NaN3)药瓶，并充分震摇来确保药瓶中所有液体已落至底部。打开溶剂药瓶并将之置于竖直位置。如上所述，为了从阴道表面采集样品，可使用阴道拭子(例如无菌植绒拭子)或其它合适的采集器具或部件来采集阴道液样品。对于阴道拭子，在插入阴道之前，拭子顶端不应接触任何物体。在棒的中部握持拭子，当患者仰卧时，小心地将拭子的拭子顶端插入阴道，直至手指接触皮肤，不多于约2-3英寸(5-7cm)深。约30秒之后(其它时长，例如约10、20、40、50、60、90、120秒、3分钟、4分钟、5分钟等)，从阴道中收回拭子。将拭子顶端放入药瓶，并通过旋转约30秒(其它时长，例如约10、20、40、50、60、90、120秒、3分钟、4分钟、5分钟等)而在溶剂(例如0.55ml溶剂)中漂洗拭子。除去并丢弃拭子。本领域技术人员将领会到，如果使用其它装置和/或部件来采集阴道液样品，则上述过程以及样品采集和样品转移至溶剂的时间可变化。其它此类装置和过程和过程时机也由本方法涵盖。
试验过程(PAMG-1检测)
将从患者获得的阴道液样品转移至溶液(例如，通过在溶剂中漂洗拭子)，接下来将如本文所公开的PAMG-1试验装置，如侧流装置，与溶剂接触。在某一实施方案中，样品从吸收衬垫流至硝化纤维素膜，经过含有缀合至金颗粒的单克隆抗PAMG-1抗体的反应区域。抗原-抗体复合物流至试验区，在此处通过第二抗-PAMG-1抗体而固定。该事件导致试验线的出现。未结合的抗原-抗体复合物继续沿着试验条流动，并由二抗固定。这导致内部对照线的出现。在某一实施方案中，试验条浸入具有溶剂的药瓶约5分钟(此处也考虑其它时长，例如约1、2、3、4、6、7、8、9、10分钟，取决于试验的特定条件和用于试验样品的特定方法或装置)。一旦两条条带在药瓶中清晰可见(约5分钟)，即可除去试验条。然后可读取结果(例如，通过将试验置于洁净、干燥、平坦的平面)。在某一实施方案中，两条线的出现指示阳性试验结果(检测到PAMG-1)，且一条线的出现指示阴性结果。本领域技术人员将领会到，上述过程步骤和时机仅是示例性的，并且不是限制性的。
如上文所讨论的，应理解，该过程的变型也由本发明内容涵盖，只要它们导致检测到以预定的检测阈值(例如，约至少4ng/ml、约至少3ng/ml、约至少2ng/ml或约至少1ng/ml)存在于阴道液样品中的PAMG-1即可。因而，例如，溶剂的类型和体积、样品采集的装置或方法以及PAMG-1检测装置可以变化，或与本文作为实例所公开的完全不同。上述培育时间，例如用拭子采集样品30秒、在溶剂中漂洗拭子30秒，可根据所用的特定过程和试验装置而变化。阴道液样品采集的部位可变化，并且可由本领域普通技术人员确定。通过非限制性实例的方式，采集阴道液样品的示例性部位包括，从例如宫颈口、宫颈管、阴道后穹窿、阴道腔/管采集。样品的采集可以是盲的(例如，不用窥镜而从阴道采集)。
根据本发明内容，可利用传统的分子生物学、微生物学、重组DNA、免疫学、细胞生物学和其它本领域已知的相关技术。参见，例如，Sambrook等人，(2001)MolecularCloning:A Laboratory Manual.3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press:ColdSpring Harbor,N.Y.；Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryManual.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,N.Y.；Ausubel等人编辑(2005)Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley andSons,Inc.:Hoboken,N.J.；Bonifacino等人，eds.(2005)Current Protocols in CellBiology.John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,N.J.；Coligan等人编辑(2005)CurrentProtocols in Immunology,John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,N.J.；Coico等人编辑(2005)Current Protocols in Microbiology,John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,N.J.；Coligan等人编辑(2005)Current Protocols in Protein Science,John Wiley andSons,Inc.:Hoboken,N.J.；Enna等人编辑(2005)Current Protocols in PharmacologyJohn Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,N.J.；Hames等人编辑(1999)Protein Expression:APractical Approach.Oxford University Press:Oxford；Freshney(2000)Culture ofAnimal Cells:A Manual of Basic Technique.4th ed.Wiley-Liss；在其它中。上文列出的现有实验方案每年更新数次。
下列实施例意图说明而不限制本发明内容。
实施例
实施例1：PAMG-1检测试剂盒(TTD试验)
制备以4ng/ml的检测阈值检测PAMG-1的试剂盒。该试剂盒包括如Fuks等人的美国专利7,709,272号详细记述的，利用检测存在于宫颈-阴道中的PAMG-1的单克隆抗体的诊断装置。诊断装置在图1和2中说明。诊断装置自身可检测在样品中以至少1ng/ml的浓度存在的PAMG-1。试剂盒还包括植绒的阴道拭子，其具有如下规格：塑料柄长度：170.0mm±1mm；塑料末端直径：4.6mm±0.1mm；手柄部分棒直径：4.4mm±0.2mm；纤维末端长度：22mm±3mm；植绒末端直径：7.00mm±1.5mm；总长度：171mm±2mm。该试剂盒进一步包括样品采集和试验过程的使用说明。样品采集和试验过程包括拭子在阴道中的30秒饱和(不要求无菌的窥镜检查)、30秒的有效的清洗步骤，由此使刚从阴道中取出的拭子在溶剂填充的药瓶中有效地旋转，并且从除去拭子的时间起有5分钟等待时期，并且如果试验线没有及早出现则插入试验条。在试验过程中，样品中存在的PAMG-1顺次地与标记颗粒缀合的单克隆抗体、然后与不溶性载体上固定的单克隆抗体结合。用下文记述的特定样品采集和TTD试验过程将PAMG-1的体内检测灵敏度阈值调节至4ng/ml：
样品采集和TTD试验过程：
1.通过盖子取溶剂(含有0.9％NaCl、0.01％Triton X100、0.05％NaN3)药瓶，并充分震摇来确保瓶中所有液体已落在底部。打开溶剂药瓶并将之置于竖直位置。
2.为了从阴道采集样品，使用TTD试剂盒提供的无菌植绒拭子。依照包装上的说明，从包装中取出植绒拭子。在插入阴道之前，拭子末端不应接触任何物体。在棒的中部握持拭子，并且在患者仰卧时小心地将拭子的拭子末端插入阴道，直至手指接触皮肤，不超过2-3英寸(5-7cm)深。30秒之后，从阴道取出拭子。
3.将拭子放入药瓶，并通过旋转在溶剂中漂洗拭子30秒。除去并丢弃拭子。
4.在撕开缺口处撕开箔纸袋，并除去PAMG-1试验条。
5.将试验条的白色末端(用箭头标注)浸入具有溶剂的药瓶中不超过5分钟。
6.如果在瓶中有两条条带清晰可见，除去试验条(准时地不晚于5分钟)。通过将试验放置在洁净、干燥、平坦的表面，读取结果。
7.从试验条浸入药瓶起，经过10分钟之后，不再读取或解释结果。
8.两条线的出现指示阳性试验结果(PAMG-1阳性)，并且一条线的出现指示阴性试验结果(PAMG-1阴性)。
实施例2：预测分娩时间(TTD)的临床试验
运行使用上文实施例1中记述的PAMG-1检测试剂盒(下文称为TTD试验试剂盒)的预期观察临床试验，用来根据在妊龄为200/7和366/7周之间、出现PTL的迹象和征兆、并具有临床上完好的膜的孕妇的宫颈-阴道分泌物中检测到的PAMG-1，评估TTD试验试剂盒的效能。
研究设计：
使用下列研究设计：
1.由下列妊龄范围分级评估：
a.<22周
b.22-346/7周
c.35-366/7周
检测PAMG-1的TTD试剂盒与在相同患者人群中评估分娩时间的其它可用方法相比较，包括：
a.横贯阴道超声测定通过宫颈长度(<30mm)
b.宫颈扩张>1cm
c.收缩频率每小时≥8次
2.数据分析
确定TTD试验、宫颈长度和下列结果之间的联系：
a.<37周妊娠的分娩
b.进入新生儿深切监护病房(NICU)
c.组织绒膜羊膜炎
d.脐带炎
e.呼吸窘迫综合征
f.动脉导管未闭
g.新生儿败血症
h.出生体重
i.围产期死亡
3.受试者的选择和撤回
使用下列包括和排除标准：
包括标准：妊娠200/7和366/7周之间、具有≤3cm的宫颈扩张，出现自报告的提示早产的迹象、征兆或不适(概述如下)的妇女，被邀请参加试验：
a.宫缩，具有或不具有疼痛
b.间歇性下腹部疼痛
c.背部钝痛
d.骨盆压力
e.第二或第三期期间的出血
f.月经样或肠痉挛，具有或不具有腹泻
g.通过无菌窥镜检查，从宫颈口未观察到破裂
排除标准：在招募时的临床检查期间，发现具有下列之一的受试者被认为是不合格的，并且不包括在分析中：
a.具有不适征兆，提出周期计划产科护理(例如，在患者的评价中征兆强度不足以保证其状况的计划外紧急评价，例如由医院生产和分娩病房或急诊室所提供的)
b.在采集宫颈阴道试样或宫颈长度测定之前接受安胎药物，用于处理早娩威胁
c.宫颈扩张>3厘米
d.怀疑胎盘前置
e.妊娠<200/7周或妊娠≥37周
f.胎膜明显破裂(ROM)，如可见的宫颈口液体流出所指示
g.宫颈在位置处环扎
h.与特发威胁早娩无关的征兆(例如创伤)
i.试样采集之前的指检
j.招募入安胎研究
k.重度阴道出血
l.<18岁，并且未受同意脱离父母独立生活
所有在诊断出活跃分娩(定义为每10分钟以下的正常收缩，持续大于40秒，具有大于80％的宫颈消失和2cm(或3cm)的扩张)之前经历分娩增强来促进生产进程、或有剖腹产切开分娩的患者没有包括在分析中。
4.终点
确定TTD试验的灵敏度(SN)、特异性(SP)、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)，以及确定在下列出现至分娩(presentation-to-delivery)的时间间隔中由横贯阴道超声测定的宫颈长度(<30mm)、>1cm的宫颈扩张和≥每小时8次的收缩频率：
a.≤48小时
b.≤7天
c.≤14天
5.研究过程
遵循下列研究过程：
a.过去的24小时内没有报告交媾、且在妊娠的200/7和366/7周之间、出现PTL的迹象和征兆的患者签署知情同意书。
b.根据生产商的推荐，在无菌窥镜检查插入之前采集TTD试验的试样(如上文实施例1所记述)。
c.根据生产商的推荐，样品适当地标记并存储于特别指定的位置，稍后由对医师的常规临床评估结果不知情的单独的研究者进行检查。
d.采集上述样品之后，医师完成患者的身体检查，基于上文阐述的包括和排除标准来确定是否将患者包括进或排除出临床试验。
e.医师记录发现。
f.通过贯穿阴道超声(TVU)进行宫颈长度测定，并记录结果。
g.记录患者分娩数据(例如时间、条件等)。
h.用实施例1中记述的TTD试验，对采集的样品进行试验。
6.统计分析
Mann-Whitney U试验、Kaplan-Meier存活分析和Cox回归用于初步成果的评估。对TTD试验，计算PPV、NPV、SN和SP(对所有试验的时间点)。用Clopper-Pearson过程计算95％置信区间(CI)。
7.确认的早产患者的现场诊断和处置
根据ACOG早产处置规范公报(2003)，诊断有PTL的患者可用下列一项或多项来治疗：
a.安胎治疗
b.抗生素
c.卧床休息
d.皮质激素
在上文列举的可能的诊断和治疗选择的可能组合中，没有支持证据指明其中任何组合对本研究的主要结果(出现至分娩时间间隔)测定有影响。
结果：
进行中的临床试验的预期结果(基于现在的数据)总结在下面的表3中：
表2：临床试验的预期结果
表格注释：“TTD”：分娩时间；“SN”：灵敏度；“SP”：特异性；“NPV”：阴性预测值；“PPV”：阳性预测值；*95％置信区间(CI)通过Clopper-Pearson过程计算。
完成的临床试验的最终结果
在临床试验中，对单胎妊娠、在妊娠的200/7和366/7周之间、出现自报告的提示早产的迹象、征兆或不适(包括具有或不具有疼痛的宫缩、间歇性下腹部疼痛和骨盆压力)的妇女，在研究过程中进行评估。招募的患者具有如窥镜检查所确定的临床上完整的羊膜和极小的宫颈扩张(≤3cm)。完整的临床检查由参加的医师来进行，包括如上文实施例1所记述的采集TTD试验样品。出现时记录的参数为宫颈长度、宫颈扩张、收缩频率、膜状态、宫颈消失、病史和TTD试验试剂盒试验结果。具有明显胎膜破裂、在无菌窥镜检查期间诊断为宫颈口可见液体漏出的患者没有招入研究。中位年龄为28岁(范围：18–43岁)，且出现时的中位妊龄为31.4周(范围：22.4–36.5周)。多胎妊娠没有包括在试验中。
采集TTD试验样品，且TTD试验过程如上文实施例1所记述的进行。一旦两条线可见，或从试验条插入样品药瓶起经过5分钟后，解释结果。通过两条线(PAMG-1阳性)或一条线(PAMG-1阴性)的出现报告结果。参与的医师在决定患者护理时对TTD试验结果不知情。TTD试验试剂盒在预测距自发早娩时间(7和14天以内)上的灵敏度(SN)、特异性(SP)、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)在试验总结时进行计算。95％置信区间(CI)用Clopper-Pearson过程计算。
20名患者在出现的7天以内分娩，且另外的5名患者在出现的14天以内分娩。TTD试验在23％的患者(23/101)中为阳性，且在此人群中试验至分娩间隔的中位数为3.86天，与TTD试验阴性组的32.12天对比。下文的表3分别总结了对于7天和14天内分娩的TTD试验结果。
表3：TTD试验结果
确认在出现的7天和14天内自发早娩的TTD试验的NPV、PPV、SN和SP总结在下列表4中：
表4：TTD试验的NPV、PPV、SN和SP
表格注释：“TTD”：分娩时间；“SN”：灵敏度；“SP”：特异性；“NPV”：阴性预测值；“PPV”：阳性预测值；*95％置信区间(CI)通过Clopper-Pearson过程计算。
48小时内(≤2天)分娩的TTD试验的最终NPV、PPV、SN和SP结果与上文表2中说明的预期结果相同。
阳性TTD试验的发生率也通过不同的妊龄周范围划分。结果总结在下文表5中：
表5：根据妊龄的阳性TTD试验发生率和性能妊龄
表格注释：“TTD”：分娩时间；“SN”：灵敏度；“SP”：特异性；“NPV”：阴性预测值；“PPV”：阳性预测值
该实施例，包括示于表2-5的数据，证明TTD试验提供以高SN、SP、NPV和PPV诊断2、7或14天以内的TTD的方法。已证明TTD试验可用于在具有受威胁的早产的患者中排除2、7和14天以内自发早娩。在表现早产征兆、完整膜和极小宫颈扩张(≤3cm)的患者中，阳性TTD试验以高度的准确性指示自发早娩将会在7天内发生。此外，阴性结果指示14天以内的自发早娩高度不可能。实施例也证明TTD试验具有高PPV、NPV、SN和SP。
**********************
已描述了本发明内容的多个实施方案。尽管如此，应理解，在不偏离本文公开方法的精神和范围的前提下，可进行各种修改。此外应理解所有数值是大致的，并且是为记述而提供的。因此，其它实施方案也在下列权利要求的范围内。

Claims (10)

1.一种试剂盒，其包括：
(a)用于检测当以高于预定的阈值水平4ng/ml存在时阴道液样品中的PAMG-1的存在的装置，其中所述装置为包括衬垫区和试验区的侧流装置，和其中所述衬垫区包括第一和第二PAMG-1-特异性单克隆抗体之一，且所述试验区包括所述第一和第二PAMG-1-特异性单克隆抗体的另一种，和其中所述衬垫区中所述PAMG-1-特异性单克隆抗体是可移动的，且所述试验区中所述PAMG-1-特异性单克隆抗体是固定化的；以及
(b)植绒阴道拭子，所述植绒阴道拭子具有柄部分和在所述柄部分一端的纤维末端部分，所述末端部分长度为22mm±3mm和直径为7.00mm±1.5mm。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其进一步包括药瓶。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其进一步包括使用说明书。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述第一和第二PAMG-1-特异性单克隆抗体对PAMG-1的结合特异性和亲和力不同。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述第一和第二PAMG-1-特异性单克隆抗体各自为选自由下列抗体组成的组的抗体：杂交瘤N271产生的M271，其由俄罗斯国家工业微生物保藏中心VKPM保藏机构保藏并分配登录号VKPM-93；杂交瘤N52产生的M52，其由VKPM保藏并分配登录号VKPM-92；和杂交瘤N42产生的M42，其由VKPM保藏并分配登录号VKPM-94。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述衬垫区中的所述可移动的抗体为杂交瘤N271产生的M271，其由俄罗斯国家工业微生物保藏中心VKPM保藏机构保藏并分配登录号VKPM-93；且所述试验区中的所述固定化的抗体为杂交瘤N52产生的M52，其由VKPM保藏并分配登录号VKPM-92。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其中所述试验装置的所述试验区进一步包括对照区。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其用于预测TTD的方法中。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其用于预测早娩风险的方法中。
10.根据权利要求1所述的试剂盒，其用于确定孕妇绒毛膜自发破裂风险的方法中。
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