CN107712066B - 一种具有免疫调节功能的儿童配方肽奶粉及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有免疫调节功能的儿童配方肽奶粉，属于营养工程和食品科学领域。本发明的配方奶粉含有以下重量份的原料：乳粉50‑80份，生物活性肽粉5‑30份、益生元2.5‑15份。实验表明本发明奶粉能显著促进巨噬细胞NO释放和正常淋巴细胞增殖，具有增强机体免疫力的功效，且本发明奶粉中小分子蛋白含量高，易于吸收儿童生长发育所需蛋白质，是一种营养丰富，配方优良且具有调节免疫功能的儿童配方肽奶粉。

Description

一种具有免疫调节功能的儿童配方肽奶粉及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种配方奶粉，特别是涉及一种具有免疫调节功能的儿童配方肽奶粉及其制备方法。

背景技术

学龄儿童可分为小学学龄儿童和中学学龄儿童，处于生长发育的突增高峰期，必须供给足够的蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质和维生素等营养素，其中奶类是蛋白质和矿物质的重要来源。学龄儿童奶粉主要包括牛乳、乳清蛋白、聚葡萄糖、低聚半乳糖、牛磺酸、维生素和矿物质等，保证学龄儿童能够及时补充生长所需的各类营养物质。乳清蛋白易于消化吸收，在提供优质蛋白的同时具有清除体内自由基、抑菌防癌，其含有较高谷氨酸，能够保证免疫细胞的功能；聚葡萄糖作为一种膳食纤维，在保证产品稳定性的同时具有多种益生功效，低聚半乳糖作为母乳中的重要的双歧因子，可以促进胃肠道的消化，肠道菌群的平衡；牛磺酸作为体内必须的一种氨基酸，与神经系统的发育密切相关，调节机体正常的生理活动，并发挥多种益生功效；微量元素的补充主要来自饮食，是体内多种酶的关键组成部分，与机体的免疫功能及体格智力发育等关系密切。

蛋白质组成人体结构，参与到所有生命活动的过程中，是细胞的核心营养素。随着现代营养学研究的不断深入，越来越多的既成理论被重新修订，氨基酸曾经被认为是人体对蛋白质类食物吸收的最小单位，然而近年的研究发现，蛋白质消化分解后只有1/3是以氨基酸的形式吸收的，其余2/3以含2-3个氨基酸的低聚肽被吸收，且其吸收效率较单个氨基酸更高，所以肽是一种比蛋白质更小，比氨基酸更有效的营养补充方式。

免疫系统与机体健康密切相关，人体的防御系统主要包括物理屏障、先天性免疫和获得性免疫。在先天性免疫和获得性免疫反应中巨噬细胞起着关键性的作用，受LPS、病原体等刺激时可迅速被激活，产生大量细胞因子，吞噬体内异物和衰老、凋亡的细胞，在有效清除病原体方面最为关键。在获得性免疫反应中，脾脏具有重要的作用，脾脏是人体最大的淋巴器官，可以产生大量的免疫细胞活性因子和记忆性T-/B-淋巴细胞，自动抵抗病原体的再次入侵。学龄期儿童的免疫系统发育尚未成熟，极易受到病原体的侵袭，补充足够的营养物质对其生长发育具有重要的促进和保障作用。学龄儿童奶粉中所含的营养素在保障儿童生长发育所需营养物质同时，兼具提高机体免疫的作用。近年来，随着易吸收食源性生物活性肽的研究与发展，其免疫调节等功能越来越引起关注，有大量研究表明大豆肽、小麦肽、乌鸡肽、酪蛋白肽等均具有刺激机体淋巴细胞的增殖、NK细胞的活性、释放免疫因子等增强机体免疫功能的功效。

由于学龄儿童处于生长发育的快速时期，需要大量的营养物质支持，儿童所需的营养物质的消化吸收都依赖于健康的肠道功能，通过改善儿童的肠道吸收情况及免疫力、减少蛋白致敏性，从而增强其身体的舒适性，只有身体舒适才能更好地吸收利用能量和营养物质。

目前市场上存在营养强化型奶粉、大分子整蛋白型蛋白粉，属于大分子物质，吸收利用率根据人群健康状态不同，可能只有20-80％的吸收率，人体不仅无法获得足够易吸收的蛋白质，还可能造成额外的身体负担。儿童配方肽奶粉主要通过强化维生素、矿物质来提升品质，如高钙学生奶粉，但都未能在营养吸收方面起到比较大的促进作用，甚至因未能有效吸收造成肠胃负担。市场上也存在一些肽产品，但只能补充后短暂产生吸收峰值，无法长时间稳定提供营养。对于营养吸收不良或相对较弱的人群，比如身体发育阶段的儿童，需要从本质上改善和促进营养吸收能力，从而真正补充身体所需要的营养成份。学龄儿童奶粉在保证儿童生长发育所需营养素之外，还需要添加易于人体胃肠道吸收的食源性生物活性肽，配合其他营养素，以期能够增强学龄儿童的免疫调节能力。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种具有免疫调节功能、易吸收的儿童配方肽奶粉。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明经过精心调配，提供了一种具有免疫调节功能的儿童配方肽奶粉，含有以下重量份的原料：乳粉50-80份，生物活性肽粉5-30份、益生元2.5-15份。

所述生物活性肽粉为小麦低聚肽、酶解酪蛋白和/或水解小麦蛋白肽粉。其中，上述生物活性肽粉组合应用，肽段分布量5000-10000D占所有肽段的5-25％；1000-5000D占所有肽段的10-30％；1000D以下的肽段占30-80％。本发明涉及的生物活性肽其分子量分布情况见表1-表3以及图7-图9。

表1水解小麦蛋白肽粉GPC分子量分布计算结果

表2小麦低聚肽GPC分子量分布计算结果

表3酶解酪蛋白GPC分子量分布计算结果

本发明所用的小麦低聚肽、酶解酪蛋白、水解小麦蛋白肽是活性肽成分，具有生理活性功能。酶解酪蛋白含有阿片肽，能调节神经系统、促进心血管健康；水解小麦蛋白肽含有谷氨酰胺，促进免疫细胞生长、缓解体力疲劳、保护胃肠粘膜。它们能明显促进小肠绒毛生长、增加肠道褶皱，改善肠道在配方促进肠道菌粘附能力等方面起主要作用。

本发明的儿童配方肽奶粉中，所述益生元为低聚果糖、多聚果糖、菊粉、低聚木糖、水苏糖、低聚半乳糖、大豆低聚肽、膳食纤维中的一种或多种。

本发明的儿童配方肽奶粉还包括植物油粉、糖、水果粉、蛋黄粉、牛磺酸、叶黄素酯的一种或多种。

本发明提供一种儿童配方肽奶粉，含有以下重量份的原料：全脂乳粉50-80份，生物活性肽粉5-30份，益生元2.5-15份，植物油粉0.3-0.8份，牛磺酸0.08-0.26份，叶黄素酯0.01-0.05份。

进一步地，本发明的儿童配方肽奶粉含有以下重量份的原料：全脂乳粉55-75份，生物活性肽粉8-30份，益生元3-12份，糖10-20份，水果粉0.5-2.5份，蛋黄粉0.1-0.5份，植物油粉0.3-0.8份，牛磺酸0.08-0.26份，叶黄素酯0.01-0.05份。

其中，上述生物活性肽粉中小麦低聚肽2-10份、酶解酪蛋白1-10份，水解小麦蛋白肽粉1-10份。

优选地，本发明的儿童配方肽奶粉含有以下重量份的原料：全脂乳粉60-75份，小麦低聚肽2-8份，糖10-20份，酶解酪蛋白2-8份，菊粉3.5-4.5份，水苏糖2.8-3.8份，水解小麦蛋白肽粉1.5-8.5份，水果粉0.8-1.8份，蛋黄粉0.1-0.3份，植物油粉0.4-0.6份，牛磺酸0.09-0.16份，叶黄素酯0.01-0.03份。

进一步地，含有以下重量份的原料：全脂乳粉60-70份，小麦低聚肽3.8-6.8份，糖12-18份，酶解酪蛋白2-6份，菊粉3.8-4.2份，水苏糖2.9-3.5份，水解小麦蛋白肽粉1.8-6.5份，水果粉0.9-1.5份，蛋黄粉0.12-0.22份，植物油粉0.4-0.55份，牛磺酸0.10-0.15份，叶黄素酯0.015-0.025份。

更优选地，含有以下重量份的原料：全脂乳粉60-70份，小麦低聚肽4-6份，糖12-18份，酶解酪蛋白2-5份，菊粉3.8-4.2份，水苏糖3-3.5份，水解小麦蛋白肽粉1.8-5份，水果粉1-1.5份，蛋黄粉0.12-0.2份，植物油粉0.4-0.5份，牛磺酸0.12-0.15份，叶黄素酯0.015-0.02份，甜菊糖苷0.01-0.04份。

最优选地，含有以下重量份的原料：全脂乳粉60-70份，小麦低聚肽4-6份，糖12-18份，酶解酪蛋白2-5份，菊粉3.8-4.2份，水苏糖3-3.5份，水解小麦蛋白肽粉1.8-5份，水果粉1-1.5份，蛋黄粉0.12-0.2份，植物油粉0.4-0.5份，牛磺酸0.12-0.15份，叶黄素酯0.015-0.02份，甜菊糖苷0.01-0.03份，水果粉末香精0.03-0.09份。

所述植物油粉为亚麻籽油粉、椰子油粉、大豆油粉、菜籽油粉、葵花籽油粉、棕榈油粉、芝麻油粉、橄榄油粉。

本发明的实施例采用的植物油粉为亚麻籽油微囊粉。

本发明所述水果粉为香蕉粉、苹果粉、蜜桃粉、菠萝粉、草莓粉、橙子粉、橘子粉、蓝莓粉、葡萄粉中的一种或多种。

所述水果粉末香精选自香蕉粉末香精、苹果粉末香精、蜜桃粉末香精、菠萝粉末香精、草莓粉末香精、橙子粉末香精、橘子粉末香精、蓝莓粉末香精、葡萄粉末香精中的一种或多种。

本发明还提供了上述儿童配方肽奶粉在改善儿童营养吸收能力中的用途。

本发明提供了上述儿童配方肽奶粉在增强儿童免疫力中的用途。

本发明提供了上述儿童配方肽奶粉在制备儿童保健品中的用途。

本发明提供了制备上述儿童配方肽奶粉的方法，包括以下步骤：

(1)按照上述配方的儿童配方肽奶粉中的原料分别称量，过筛；

(2)投料、预混；

(3)批量混合，真空充氮包装。

本发明提供了上述儿童配方肽奶粉在改善儿童营养吸收能力和增强儿童免疫力中的用途。

本发明的儿童配方肽奶粉具有以下有益效果：

1、本发明配方肽奶粉成分主要来自天然动植物，不添加防腐剂，也不添加人工色素，安全无风险，适合学龄儿童食用；

2、本发明配方肽奶粉以基础营养+活性调节，共同作用，不仅在特别功能方面表现价值，还能通过合理营养搭配调节细胞营养，长期促进人体细胞的自我修复能力。肽从内部改善肠道结构，益生元从外部改善肠道环境，双向调节，发挥协同作用。

3、利用整蛋白、多肽、低聚肽的梯度吸收原理，构建合理蛋白吸收方案。小麦低聚肽，酶解酪蛋白和水解小麦蛋白肽作为小分子的生物活性肽，其分子比蛋白质更小，易于消化吸收，不增加胃肠负担，帮助机体建立营养的梯度吸收平衡；并且能够激活机体营养吸收系统，有利于学龄儿童保持健康状态；

4、菊粉、水苏糖、水果粉、蛋黄粉、亚麻籽油粉、牛磺酸、叶黄素酯作为动植物精华，具有改善风味，提高适口性，调节营养平衡，调节机体免疫力的作用；

5、本发明以肽成分激活人体功能，快速满足营养需求，改善身体状态；再进一步促进身体消化吸收奶粉中的蛋白质和其他营养素，实现奶粉营养和肽营养两类成分的营养梯度，产生良性吸收循环，提高身体的自主吸收营养能力。实验证实，本发明儿童配方肽奶粉能显著促进巨噬细胞NO释放和正常淋巴细胞增殖，具有增强机体免疫力的功效，是一种营养丰富，配方优良且具有调节免疫功能的儿童配方肽奶粉。

附图说明

图1为本发明实施例3制得的奶粉对小鼠正常腹腔巨噬细胞增殖的影响，**P＜0.01，与对照组比较。

图2为本发明实施例3制得的奶粉对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响，PI表示吞噬指数；*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较。

图3为本发明实施例3制得的奶粉对LPS诱导的腹腔巨噬细胞NO释放量的影响，*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较。

图4为本发明实施例3制得的奶粉对脾淋巴细胞增殖的影响，*P<0.05，与对照组比较。

图5为本发明实施例3制得的奶粉对LPS诱导的B淋巴细胞增殖的影响，SI表示刺激指数；*P<0.05，与模型组比较。

图6为本发明实施例3制得的奶粉对ConA诱导的T淋巴细胞增殖的影响，SI表示刺激指数；*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较。

图7为本发明使用的水解小麦蛋白肽粉的PDA检测色谱图(220nm)。

图8为本发明使用的小麦低聚肽的PDA检测色谱图(220nm)。

图9为本发明使用的酶解酪蛋白的PDA检测色谱图(220nm)。

图10为本发明实施例3制得的奶粉与市售四种儿童配方奶粉对中性红的吞噬能力比较，图中A-D分别为品牌一—品牌四，E为本发明实施例3制得的肽奶粉，1-3分别是浓度为200、400、800μg/mL的各品牌/配方奶粉。

图11为本发明实施例3制得的奶粉与市售四种儿童配方奶粉对小鼠腹腔巨噬细胞NO生成量的比较，图中A-D分别为品牌一—品牌四，E为本发明实施例3制得的肽奶粉，1-3分别是浓度为200、400、800μg/mL的各品牌/配方奶粉。

图12为本发明实施例3制得的奶粉与市售四种儿童配方奶粉对刀豆蛋白诱导的T淋巴细胞增殖的影响，图中A-D分别为品牌一—品牌四，E为本发明实施例3制得的肽奶粉，1-3分别是浓度为200、400、800μg/mL的各品牌/配方奶粉。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中所用的原料均为市售。

本发明实施例所用的小鼠(Balb/c，6～8周龄)：北京维通利华实验动物技术有限公司；刀豆蛋白A、脂多糖、MTT：Sigma公司；RPMI-1640培养基：Hyclone公司；胎牛血清(FBS)：四季青公司；胰蛋白酶、红细胞裂解液、CCK-8、Griess试剂、缓冲液PBS：碧云天生物技术研究所；DMSO：西陇化工股份有限公司；中性红：Amresco公司。Spectra MR多功能酶标仪：美国Dynex公司；ESCO AC2-6S1生物安全柜：新加坡艺思高科技有限公司；240i直热式二氧化碳培养箱：美国Thermofisher公司；BD C6流式细胞仪。

本发明实施例中，奶粉中蛋白质含量的测定，采用凯氏定氮法。奶粉中水分含量的测定，采用常压干燥法测定。

本发明采用SPSS16.0统计软件对数据进行处理，试验结果以均值±标准偏差(Mean±SD)表示。采用组间t检验，P<0.05具有显著性差异，P<0.01具有极显著性差异。

实施例1儿童配方肽奶粉的制备(1)

本发明的具有免疫调节功能的儿童配方肽奶粉配料为：全脂乳粉70g，小麦低聚肽5.5g，白砂糖6.5g，酶解酪蛋白4.5g，菊粉3.5g，水苏糖2.8g，水解小麦蛋白肽粉3.0g，苹果粉1.8g，蛋黄粉0.3g，亚麻籽油微囊粉0.4g，牛磺酸0.16g，叶黄素酯0.01g。

实施例2儿童配方肽奶粉的制备(2)

本发明的具有免疫调节功能的儿童配方肽奶粉配料为：全脂乳粉75g，小麦低聚肽6.5g，白砂糖5.5g，酶解酪蛋白3.5g，菊粉4.5g，水苏糖3.8g，水解小麦蛋白肽粉1.8g，橘子粉0.8g，蛋黄粉0.1g，亚麻籽油微囊粉0.6g，牛磺酸0.09g，叶黄素酯0.03g，甜菊糖苷0.02g。

实施例3儿童配方肽奶粉的制备(3)

本发明的具有免疫调节功能的儿童配方肽奶粉配料为：全脂乳粉68.02g，小麦低聚肽6.00g，白砂糖12.00g，菊粉4.00g，水苏糖3.12g，水解小麦蛋白肽粉3.00g，酶解酪蛋白2.00g，水果粉1.02g，蛋黄粉0.20g，亚麻籽油微囊粉0.50g，牛磺酸0.12g，叶黄素酯0.02g。

实施例4本发明儿童配方肽奶粉基础理化指标结果

由实验得出的本发明实施例1-3制得的儿童配方肽奶粉基础理化指标结果见表4，结果均为质量分数。儿童奶粉中总蛋白含量占27.96±0.08％，其中酸溶蛋白即包括肽及氨基酸等较低分子量的蛋白水解物占6.916±0.721％，说明奶粉中含有较高含量的小分子蛋白，更易于学龄儿童补充生长发育所需的蛋白质。

表4实施例1-3制得的儿童配方肽奶粉基础理化成分含量

实施例5本发明的儿童配方肽奶粉对小鼠腹腔巨噬细胞的影响

1、小鼠腹腔巨噬细胞悬液的制备

Balb/c小鼠2只，于试验前3d腹腔注射1.5mL 4％肉汤淀粉溶液。拉颈处死，75％酒精浸泡5分钟，于无菌工作台上将其腹部皮肤剥离，无菌收集腹腔液，1200r/min离心8min收集细胞，PBS缓冲液洗涤2次。流式细胞仪计数，用RPMI-1640完全培养液(含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和10mmol/L Hepes)调整细胞密度达1×10⁶个/mL，按100μL/孔加入96孔细胞培养板中，置于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中培养2.5h，弃上清，用预温RPMI-1640培养基洗去未贴壁细胞，加入完全RPMI-1640培养液制备96孔板巨噬细胞单层。

2、本发明儿童配方肽奶粉对小鼠腹腔巨噬细胞增殖的影响

采用MTT法检测实施例1-3制得的奶粉对腹腔巨噬细胞增殖的影响。将细胞分为空白对照组和实验组，实验组加入奶粉样品10μL(终质量浓度分别为200、400、800μg/mL)，于37℃，5％CO₂培养箱内培养24h，弃上清，PBS洗2次，加入MTT溶液100μL，继续培养4h，弃上清，加入DMSO 100μL，震荡使溶解，用酶标仪测定OD_490nm值。增殖率计算公式：

吞噬细胞属于机体固有免疫细胞，当机体受到病原体侵袭，巨噬细胞可迅速被激活，吞噬病原体释放抗原，呈递给免疫细胞，产生大量细胞因子。巨噬细胞具有可塑性，受到不同抗原刺激会分化为不同类型的巨噬细胞，起到促进或抑制炎症反应的发生。经典的巨噬细胞的激活方式是受LPS、干扰素-γ(IFN-γ)及肿瘤坏死因子(TNF)的激活，巨噬细胞会增加细胞毒性物质NO和活性氧中间体的释放，清除细胞内的病原体、抑制肿瘤细胞的增殖。本发明通过LPS诱导腹腔巨噬细胞，通过细胞对中性红的吞噬能力和NO释放量的检测结果，来评价本发明实施例1-3制得的肽奶粉和竞品奶粉的免疫调节能力。

本发明实施例3制得的肽奶粉对正常腹腔巨噬细胞增殖的影响结果见图1，实施例1和实施例2制得的奶粉对正常腹腔巨噬细胞增殖的影响与实施例3奶粉的结果相似。在3个样品浓度的本发明奶粉均能极显著的促进正常腹腔巨噬细胞的增殖(P<0.01)，说明本发明实施例1-3制得的儿童配方肽奶粉均有很好的增强免疫的能力。

3、本发明儿童配方肽奶粉对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性的测定

通过细胞对中性红的吞噬能力的检测结果来评价本发明实施例1-3制得的儿童配方肽奶粉对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性的测定。将细胞分为空白对照组、模型组和实验组，模型组每孔加入10μL LPS(终浓度30μg/mL)，试验组每孔加入10μL样品(终质量浓度分别为200、400、800μg/mL)，试验组分为2种，即LPS与奶粉共同作用组和奶粉单独添加组。每组各设6个复孔，于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱内培养24h。之后，用预温不完全1640培养基洗涤细胞2次，每孔加入100μL 0.1％中性红溶液，于37℃，5％CO₂培养箱内继续培养1h，每孔再加入100μL细胞溶解液[含体积分数1％乙酸的50％(体积分数)乙醇溶液]，室温下放置2h，待细胞溶解后，用酶标仪测定OD_550nm值。吞噬指数(Pinocytosis index，PI)计算公式如下：

本发明实施例3制得的奶粉对LPS诱导的腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响结果见图2，实施例1-2制得的儿童配方肽奶粉对LPS诱导的腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响结果与实施例3奶粉的结果相似。在3种作用浓度下本发明奶粉均表现出很好的增强免疫的功效，与模型组相比均能极显著提高LPS诱导的腹腔巨噬细胞的吞噬能力(P<0.01)。由图可看出，LPS诱导的腹腔巨噬细胞的吞噬能力PI值与样品浓度呈现“U”型关系，在高浓度800μg/mL时的吞噬能力最高，是模型组的2.9倍；在中浓度400μg/mL时的吞噬能力最低，是模型组的1.6倍。

另外本实施例还进行了平行对比试验，以市场上商品化的4种品牌的学龄儿童奶粉(品牌一：合生元金装学龄前儿童配方奶粉；品牌二：惠氏S-26金装学儿乐；品牌三：三元爱益儿童成长配方奶粉；品牌四：圣元荷兰乳牛学生配方奶粉)与本发明实施例3制得的肽奶粉进行比较，观察它们影响细胞对中性红的吞噬能力。结果见图10，说明本发明实施例3制得的肽奶粉较另外4种商品化奶粉具有较好的促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力。

4、本发明儿童配方肽奶粉对小鼠腹腔巨噬细胞NO生成量的测定

小鼠腹腔巨噬细胞经样品干预24h后，收集上清液，依据NO试剂盒说明书测定NO生成量。实施例3制得的奶粉对LPS诱导的腹腔巨噬细胞NO释放量的影响结果见图3，实施例1-2制得的儿童配方肽奶粉对LPS诱导的腹腔巨噬细胞NO释放量的影响结果与实施例3奶粉的结果相似。在3个浓度下本发明奶粉均能极显著的促进LPS诱导的腹腔巨噬细胞NO的释放(P<0.01)，且促进NO释放的能力与样品浓度正相关。说明本发明实施例1-3制得的肽奶粉具有较好的增强机体固有免疫的功能。

再以市场上商品化的4种品牌的学龄儿童奶粉与本发明实施例3制得的肽奶粉进行比较，观察各个奶粉对小鼠腹腔巨噬细胞NO生成量的影响，结果见图11，结果说明本发明实施例3制得的儿童肽奶粉较其他四个配方奶粉能够显著促进小鼠腹腔巨噬细胞NO的生成，随着作用浓度的增加，促进NO生成作用增强，量效关系明显。

实施例6本发明的儿童配方肽奶粉对T-淋巴细胞和B-淋巴细胞增殖的影响

1、小鼠脾细胞悬液的制备

将小鼠(Balb/c)拉颈处死，无菌取脾脏，用PBS冲去浮血，剥除结缔组织及脂肪成分。剩余脾组织剪成大小1mm³小块，研磨后用PBS缓冲液洗涤，1200r/min，5min，弃掉上清，加入2mL红细胞裂解液，静置4min，加入PBS稀释裂解液终止裂解，离心弃上清，用RPMI-1640不完全培养基洗1次，再用适量RPMI-1640完全培养基重悬。流式细胞仪调整细胞浓度至2×10⁶个细胞/mL。

2、本发明奶粉对脾淋巴细胞增殖的影响

将调整好细胞浓度的脾细胞悬液按100μL/孔加入到96孔板中，再添加10μL ConA/LPS(LPS终浓度5μg/mL，ConA终浓度10μg/mL)设置模型组，10μL ConA/LPS、10μL不同浓度的样品溶液(终质量浓度分别为200、400、800μg/mL)设置样品组，不添加任何物质为空白对照组，每组做6个复孔，将培养板置于37℃、5％CO2的培养箱中培养72h。之后，选用CCK-8试剂盒测定T/B淋巴细胞增殖的影响，结果用刺激指数(Stimulation index，SI)表示，计算如下：

脾脏内有大量的巨噬细胞、淋巴细胞和树突状细胞，既可以通过吞噬作用完成非特异性免疫反应，又可以通过T/B淋巴细胞介导特异性免疫反应，其中B淋巴细胞的转化能力是反映机体体液免疫的重要方法，T淋巴细胞的转化能力是反映机体细胞免疫的重要方法。成熟B淋巴细胞的分化需要两种信号，抗原与B淋巴细胞抗原受体的结合以及T辅助细胞及其产生的细胞因子，有研究表明，革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖(LPS)可以在没有辅助细胞的情况下，通过Toll样受体4(TLR4)和另一种Toll样受体蛋白RP105的表达直接促进B淋巴细胞的分化成熟；Con A是四聚体球蛋白，是T细胞的多克隆激活剂，可以通过促进T淋巴细胞活化过程中重要信号转导膜分子CD3ε以及相关趋化因子的表达来促进T淋巴细胞的活化。本发明采用LPS和ConA对提取的脾淋巴细胞进行诱导，通过MTT增殖实验来判断奶粉对T-/B-淋巴细胞增殖的影响，评价本发明奶粉对淋巴细胞的影响。

实施例3制得的儿童配方肽奶粉对未经诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响结果见图4。由图可看出，3个浓度下奶粉均能极显著的促进正常脾淋巴细胞的增殖(P<0.01)，且促进增殖的能力与样品浓度正相关。本发明实施例1-2制得的奶粉做相同的试验，结果显示上述3个浓度下奶粉均能极显著的促进正常脾淋巴细胞的增殖(P<0.01)，且促进增殖的能力与样品浓度正相关。

本发明实施例3制得的儿童奶粉对LPS诱导的小鼠B淋巴增殖的影响结果见图5。由图可看出，3个浓度下本发明奶粉均能促进LPS诱导的B淋巴细胞的增殖，在低浓度200μg/mL和高浓度800μg/mL时可以显著促进B淋巴细胞的增殖(P<0.05)，但在中浓度400μg/mL时作用结果相比于模型组而言并没有显著性差异。本发明实施例1-2制得的奶粉做相同的试验，结果显示与实施例3结果相似。

本发明实施例3制得的儿童奶粉对ConA诱导的小鼠T淋巴增殖的影响结果见图6。由图6可看出，本发明实施例3制得的奶粉在3个浓度下促进ConA诱导的T淋巴细胞增殖的能力与样品浓度正相关，这与奶粉对脾淋巴细胞增殖的实验结果相一致，说明这几种奶粉具有很好的促进T淋巴细胞增殖的能力。在低浓度200μg/mL的促增殖能力相比于模型组而言不显著，在中浓度400μg/mL时可以显著促进T淋巴细胞的增殖(P<0.05)，在高浓度800μg/mL时可极显著促进T淋巴细胞增殖。本发明实施例1-2制得的奶粉做相同的试验，结果显示与实施例3结果相似。

对本发明制得的儿童配方肽奶粉的免疫调节能力进行了研究，结果表明：对经LPS诱导和正常的小鼠腹腔巨噬细胞，本发明实施例1-3制得的奶粉均能提高其中性红吞噬能力，促进LPS诱导的腹腔巨噬细胞NO的释放，并对对ConA和LPS诱导的小鼠T和B淋巴细胞增殖均有促进增殖作用，说明本发明儿童奶粉具有较好的增强免疫的功效。后期可通过调整配方，通过生物活性肽、功能性物质(黄酮类、多酚类)等的加入与调配，进一步提高产品的功效。

做平行对比试验。以市场上商品化的4种品牌的学龄儿童奶粉与本发明实施例3制得的肽奶粉进行比较，观察它们对刀豆蛋白诱导的T淋巴细胞增殖的影响，结果见图12，随着作用浓度的增加，SI值显著增加。本发明的肽奶粉量效关系明显，在800μg/ml时，促进增殖效果最好。因此，本发明实施例3制得的肽奶粉具有较好的增强细胞免疫的作用，实施例1-2制得的肽奶粉具有与实施例3的肽奶粉类似的效果。

实施例7本发明的儿童配方肽奶粉的用户反馈评价

100名志愿者参与本发明实施例1-3制得的儿童配方肽奶粉的评价试验。有87％的志愿者表示产品饮用一个月后，对身体有显著的改善作用。其中有40％志愿者表示，学龄儿童在早上饮用本发明实施例1-3的肽奶粉后，上课精力更加集中，精神状态很好。有两名家长反馈自己孩子体质弱，经常容易生病，使用后当月未出现身体不适的情况，食用期间体重稳定增长。90％志愿者接受产品的口感和溶解性，反馈类似奶粉的味道和口感，评价优于市面常见蛋白粉和肽营养粉。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种具有改善儿童营养吸收能力和增强儿童免疫力功能的儿童配方肽奶粉，其特征在于，由以下重量份的原料组成：全脂乳粉55-75份，益生元3-12份，植物油粉0.3-0.8份，糖10-20份，水果粉0.5-2.5份，蛋黄粉0.1-0.5份，牛磺酸0.08-0.26份，叶黄素酯0.01-0.05份，小麦低聚肽2-10份，酶解酪蛋白1-10份，水解小麦蛋白肽粉1-10份；

所述小麦低聚肽、酶解酪蛋白、水解小麦蛋白肽粉中：肽段分布量5000-10000D占所有肽段的5-25％；1000-5000D占所有肽段的10-30％；1000D以下的肽段占30-80％；

所述益生元为低聚果糖、多聚果糖、菊粉、低聚木糖、水苏糖、低聚半乳糖的一种或多种。

2.如权利要求1所述的儿童配方肽奶粉，其特征在于，由以下重量份的原料组成：全脂乳粉60-75份，小麦低聚肽2-8份，糖10-20份，酶解酪蛋白2-8份，菊粉3.5-4.5份，水苏糖2.8-3.8份，水解小麦蛋白肽粉1.5-8.5份，水果粉0.8-1.8份，蛋黄粉0.1-0.3份，植物油粉0.4-0.6份，牛磺酸0.09-0.16份，叶黄素酯0.01-0.03份。

3.一种具有改善儿童营养吸收能力和增强儿童免疫力功能的儿童配方肽奶粉，其特征在于，由以下重量份的原料组成：全脂乳粉60-70份，小麦低聚肽3.8-6.8份，糖 12-18份，酶解酪蛋白2-6份，菊粉3.8-4.2份，水苏糖2.9-3.5份，水解小麦蛋白肽粉1.8-6.5份，水果粉0.9-1.5份，蛋黄粉0.12-0.22份，植物油粉0.4-0.55份，牛磺酸0.10-0.15份，叶黄素酯0.015-0.025份，甜菊糖苷0.01-0.04份；

所述小麦低聚肽、酶解酪蛋白、水解小麦蛋白肽粉中：肽段分布量5000-10000D占所有肽段的5-25％；1000-5000D占所有肽段的10-30％；1000D以下的肽段占30-80％。

4.根据权利要求1-3任一所述的儿童配方肽奶粉，其特征在于，所述水果粉为香蕉粉、苹果粉、蜜桃粉、菠萝粉、草莓粉、橙子粉、橘子粉、蓝莓粉、葡萄粉中的一种或多种。

5.权利要求1-4任一所述的儿童配方肽奶粉在改善儿童营养吸收能力和增强儿童免疫力中的用途。

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