CN107674912A

CN107674912A - 血清16SrDNA作为糖尿病肾病的生物标志的应用

Info

Publication number: CN107674912A
Application number: CN201710891899.4A
Authority: CN
Inventors: 董晨; 仇静; 郭志荣; 景阳
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2017-09-27
Filing date: 2017-09-27
Publication date: 2018-02-09
Anticipated expiration: 2037-09-27
Also published as: CN107674912B

Abstract

本发明涉及血清16S rDNA作为糖尿病肾病的生物标志的应用；本发明还提供了一种检测糖尿病肾病的试剂盒，包括血清16S rDNA的特异性引物和/或探针，其中上述血清16SrDNA均来自普氏菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和链球菌中的一种或几种。本发明进一步公开了一种采用上述试剂盒检测血清中16S rDNA水平的方法：利用试剂盒中的血清16S rDNA的特异性引物和/或探针对血清样本进行实时荧光定量PCR检测测得普氏菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和链球菌的丰度E_普氏菌、E_柔嫩梭菌、E_球形梭菌和E_链球菌；将E_普氏菌、E_柔嫩梭菌、E_球形梭菌和E_链球菌参数代入数学模型Y＝1.001+0.772×E_普氏菌+1.286×E_柔嫩梭菌+1.529×E_球形梭菌+0.473×E_链球菌，计算Y值。

Description

血清16S rDNA作为糖尿病肾病的生物标志的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种血清16S rDNA作为糖尿病肾病的生物标志的应用。

背景技术

糖尿病是以血糖水平升高为特征的代谢性疾病，可致全身多个重要器官的损伤，严重影响患者寿命与生活质量。随着社会经济的发展和人们生活方式的改变，尤其是人们膳食结构的巨大变化，糖尿病患者在世界范围日益增多。调查显示，我国成人糖尿病患病率高达11.6％，可见糖尿病已经成为威胁我国人民健康的重要疾病。

糖尿病肾病是糖尿病微血管病变导致的肾小球变化，是糖尿病常见的并发症之一。其临床症状主要为蛋白尿、渐进性肾功能损害、高血压和水肿，晚期出现严重肾功能衰竭，是糖尿病患者的重要死亡原因之一。糖尿病肾病作为糖尿病最严重的慢性并发症之一，不仅是公认的导致终末期肾脏疾病的病因之一，同时也是心血管疾病的独立危险因素。根据全国透析移植登记报告，糖尿病肾病为我国终末期肾脏病的第2位病因，不仅给患者本人及其家属带来极大的痛苦，而且也给患者家庭、医疗系统以及整个社会带来沉重的经济负担。

目前糖尿病肾病诊断的主要指标为微量白蛋白尿。微量白蛋白尿是评估肾脏受损程度的主要依据。然而，临床上检测到微量白蛋白尿时，肾脏的实质性损伤已经发生，因此对于糖尿病肾病的预测预防所发挥的作用十分有限。所以，开发能够用于早期预测糖尿病肾病的特异性的新型血清学生物标志物，对于预防和控制糖尿病肾病的发生和发展非常必要。

血液系统是一个闭合的系统，健康组织中的血清一般被视为无菌的环境。但多项研究已经证明，健康人或罹患疾病的患者血液系统中均存在微生物菌群。血液循环中微生物的状态主要分为三种：正常状态下可存活、不可存活以及处于休眠状态的。当机体免疫力下降或遭受外力刺激时，休眠状态的微生物可进入增殖状态。与肠道、口腔的微生物菌群相比，血液微生物的组成和含量受饮食等因素影响较小，更能反映个体的身体健康状况。

血液微生态学与糖尿病密切相关。糖尿病患者由于肠粘膜屏障的受损，肠道中的微生物可进入血液循环，这些进入血液循环的微生物将引起机体产生相应的免疫应答，形成多种抗原-抗体复合物。而这些复合物不能顺利排出时，将沉积于肾小球小血管时引起肾功能的损害。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种血清16S rDNA作为糖尿病肾病的生物标志的应用，本发明公开了血清16S rDNA的新用途，本发明的检测血清中的16S rDNA水平的方法具有高度的灵敏性和特异性，进而可提早预防和控制糖尿病肾病的发生。

在一方面，本发明公开了血清16S rDNA在制备糖尿病肾病检测试剂或检测试剂盒中的应用，其中血清16S rDNA来自普氏菌(Prevotella)、柔嫩梭菌(Clostridium leptum)、球形梭菌(Clostridium cocoides)和链球菌(Streptococcus)中的一种或几种。

在另一方面，本发明还公开了一种检测糖尿病肾病的试剂盒：包括血清16S rDNA的特异性引物和/或探针，其中血清16S rDNA来自普氏菌(Prevotella)、柔嫩梭菌(Clostridium leptum)、球形梭菌(Clostridium cocoides)和链球菌(Streptococcus)中的一种或几种。

进一步地，特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

进一步地，特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。

进一步地，特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。

进一步地，特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示。

在又一方面，本发明还提供了一种采用上述试剂盒检测血清中16S rDNA水平的方法，包括以下步骤：

(1)利用试剂盒中的血清16S rDNA的特异性引物和/或探针对血清样本16SrDNAV3-V4可变区进行实时荧光定量PCR检测，测得普氏菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和链球菌的丰度E_普氏菌、E_柔嫩梭菌、E_球形梭菌和E_链球菌；

(2)将上述E_普氏菌、E_柔嫩梭菌、E_球形梭菌和E_链球菌参数代入数学模型Y＝1.001+0.772×E_普氏菌+1.286×E_柔嫩梭菌+1.529×E_球形梭菌+0.473×E_链球菌，计算参数Y值。得到的Y代表上述四种菌16SrDNA的相对丰度。

进一步地，在步骤(1)中，PCR扩增的条件为第一循环95℃，5min；而后95℃，10s，60℃，35s，共40个循环。

进一步地，当Y值高于3.103时，糖尿病肾病的患病几率较大。

进一步地，Y值可联合空腹血糖值预测糖尿病肾病患病几率。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明首次公开了普氏菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和链球菌的16S rDNA对糖尿病肾病具有重要预测价值、可作为其血清学生物标记的应用。在此基础上，血清16SrDNA标志物和诊断试剂盒的公开，为早期预测糖尿病肾病提供了新思路，具有准确，快速，简便，高效等优点。

本发明通过对血液微生态进行筛选和分析，采用生物统计分析方法建立血清中16S rDNA水平的检测方法，相比于微量白蛋白尿等其他传统生物标志，血清微生物菌群变化能更早的反应糖尿病患者肾脏功能的受损情况，因此可作为糖尿病肾病早期预测的生物标志物；此外，16S rDNA是细菌分类系统研究中最常用的分子，其种类少，含量大，分子大小适中，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列；且外周血清样本在临床上是必不可少的常规检测项目，样本获取容易；此外本发明具有高度的灵敏性和特异性，简单方便、科学可靠，从而预防和控制糖尿病肾病的发生。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是本发明实施例4中，各菌群血清16S rDNA单独或联合作为糖尿病肾病预测标志的ROC曲线分析结果；

图2是本发明实施例5中，四种菌群血清16S rDNA联合作为糖尿病肾病预测标志的ROC曲线分析结果；

图3是本发明实施例6中，四种菌群血清16S rDNA结合空腹血糖的糖尿病肾病预测模型的ROC曲线分析结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1普氏菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和链球菌血清16S rDNA的提取

采用细菌基因组DNA提取试剂盒(Qiagen)提取血清样本中的普氏菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和链球菌中的16S rDNA，具体步骤如下：

a.取出-80℃冻存样本置冰上融化，吸取200μL血清于1.5mL EP管中，加入200μL裂解液和20μL蛋白酶K裂解细菌，振荡混匀后瞬离。

b.将混合液置于56℃恒温水槽中水浴15分钟，擦干并瞬离。

c.向裂解液中加入250μL无水乙醇，充分混匀后室温静置5分钟，瞬离。

d.将裂解液转移至吸附管中，盖上管盖于室温静置5分钟。

e.将吸附管置于离心机中，12000rpm离心1分钟，弃滤液，吸附管放回收集管中。

f.用移液器吸取500μL洗涤液(75％无水乙醇)加入到吸附管中，12000rpm离心1分钟，弃滤液，吸附管放回收集管中。

g.用移液器吸取600μL洗涤液(75％无水乙醇)加入到吸附管中，室温下静置3分钟，12000rpm离心1分钟，弃滤液，吸附管放回收集管中。

h.重复步骤g。

i.用移液器吸取500μL无水乙醇加入到吸附管中，12000rpm离心1分钟，弃滤液。

j.吸附管放回收集管中，12000rpm离心3分钟，弃滤液。

k.拿出新的1.5mL无菌EP管，将吸附柱放于其中，打开盖子，静置5分钟。

l.待吸附膜完全变干后，向膜的中央处悬空滴加35μL无核酸水，静置5分钟后12000rpm离心1分钟。

m.将离下液重新加到膜中央，静置5分钟，12000rpm离心1分钟。离下液即所提取的细菌核酸，转移至新的1.5ml无菌EP管中-80℃保存备用。

实施例2普氏菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和链球菌血清16S rDNA的检测

分别对实施例1中提取的血清样本中的4种菌的16S rDNA进行检测，具体方法如下：

(1)对样本血清普氏菌16S rDNA进行定量

对血清普氏菌16S rDNA区域RT-PCR扩增，使用以下引物和探针，按照表1在PCR管中配置反应体系：

正向引物：CCTWCGATGGATAGGGGTT(SEQ ID No.1)；其中的W代表A/T。

反向引物：CACGCTACTTGGCTGGTTCAG(SEQ ID No.2)；

探针：VIC-AAGGTCCCCCACATTG(SEQ ID No.9)。

表1反应体系

将加好样的PCR管瞬时低速离心后放入实时荧光定量PCR仪进行扩增。反应条件如表2所示：

表2 RT-PCR反应条件

(2)对样本血清柔嫩梭菌16S rDNA进行定量

对血清柔嫩梭菌16S rDNA区域RT-PCR扩增，使用以下引物和探针，按照表1在PCR管中配置反应体系：

正向引物：CCTTCCGTGCCGSAGTTA(SEQ ID No.3)；其中的S代表G/C。

反向引物：GAATTAAACCACATACTCCACTGCTT(SEQ ID No.4)；

探针：6FAM-CACAATAAGTAATCCACC(SEQ ID No.10)。

按照表2中的反应条件进行扩增。

(3)对样本血清球形梭菌16S rDNA进行定量

对血清球形梭菌16S rDNA区域RT-PCR扩增，使用以下引物和探针，按照表1在PCR管中配置反应体系：

正向引物：GACGCCGCGTGAAGGA(SEQ ID No.5)；

反向引物：AGCCCCAGCCTTTCACATC(SEQ ID No.6)；

探针：VIC-CGGTACCTGACTAAGAAG(SEQ ID No.11)。

按照表2中的反应条件进行扩增。

(4)利用SYBR green技术，对样本血清链球菌16S rDNA进行定量

对血清链球菌16S rDNA区域RT-PCR扩增，使用以下引物，按照表3在PCR管中配置反应体系：

正向引物：GAAGAATTGCTTGAATTGGTGAA(SEQ ID No.7)；

反向引物：GGACGGTAGTTGTTGAAGAATGG(SEQ ID No.8)；

表3反应体系

反应体系组分	体积
		2 x Premix Ex Taq	12.5uL
DNA模板	5.5μL
		正向引物(10μM)	0.5μL
反向引物(10μM)	0.5μL
		重蒸水	6.0μL

按照表2中的反应条件进行扩增。

实施例3糖尿病和糖尿病肾病患者普氏菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和链球菌血清16SrDNA的检测

按照实施例1-2的方法，对100例单纯性糖尿病患者和100例糖尿病肾病患者血清中的普氏菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和链球菌的16S rDNA进行分析发现，糖尿病肾病患者血清中四种菌相对丰度(2^-ΔΔCt)显著高于单纯性糖尿病组，差异均有统计学意义(P<0.05)(表4)。

表4单纯性糖尿病和糖尿病肾病患者血清16S rDNA水平分析

以上结果表明，可基于普氏菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和链球菌制作用于人糖尿病肾病的检测试剂或检测试剂盒。试剂盒中包括普氏菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和链球菌血清16SrDNA的特异性引物和/或探针(序列如SEQ ID No.1-SEQ ID No.11所示)。

实施例4糖尿病和糖尿病肾病患者的巢式病例对照研究及基于普氏菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和链球菌血清16S rDNA水平的预测模型的建立

采用巢式病例对照研究方法，研究普氏菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和链球菌血清16SrDNA的预测价值。发明人于2016年选取100例糖尿病肾病患者为病例，200名单纯性糖尿病患者为对照，观察2013年基线时300名患者(基线时均为单纯性糖尿病患者)的血清普氏菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和链球菌的16S rDNA水平。通过构建ROC曲线来分析4种血清菌群16SrDNA对于糖尿病肾病患者的预测能力。

结果如图1所示，其中，图1A代表普氏菌，图1B代表柔嫩梭菌，图1C代表球形梭菌，图1D代表链球菌。结果表明，4种菌属ROC曲线下面积(AUC)分别如下：普氏菌为0.820(95％置信区间：0.663-1.000)，灵敏度和特异度分别为82％和77％；柔嫩梭菌为0.750(95％置信区间：0.593-1.000)，灵敏度和特异度分别为78％和80％；球形梭菌为0.720(95％置信区间：0.633-1.000)，灵敏度和特异度分别为73％和76％；链球菌为0.800(95％置信区间：0.595-1.000)，灵敏度和特异度分别为85％和79％。

进一步采用统计学方法，建立血清16S rDNA水平的预测模型：

Y＝1.001+0.772×E_普氏菌+1.286×E_柔嫩梭菌+1.529×E_球形梭菌+0.473×E_链球菌。其中E表示各种菌的丰度，Y表示上述四种菌16S rDNA的相对丰度。

图1E为四菌联合的结果，ROC曲线分析结果显示，该模型对于糖尿病肾病的具有很好的预测能力。其AUC为0.860(95％置信区间：0.612-1.000)，灵敏度和特异度分别为83％和81％(Cut-off值＝3.103)。

实施例5基于普氏菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和链球菌血清16S rDNA的糖尿病肾病预测模型的验证

采用前瞻性队列研究对上述实施例4中的预测模型进行验证。选取1000名单纯性糖尿病患者，检测基线时血清普氏菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和链球菌额16S rDNA水平，随访3年，记录糖尿病肾病的发病情况。验证上述的预测模型对糖尿病肾病的预测能力。ROC分析结果再次证明本发明所提供的模型具有很好的预测能力。4种菌联合的预测模型AUC可达到0.880(95％置信区间：0.754-1.000)，灵敏度和特异度分别为88％和82％(见图2)。

实施例6联合空腹血糖和普氏菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和链球菌血清16S rDNA的糖尿病肾病预测模型

在上述研究基础上，进一步分析4种菌联合空腹血糖值对于糖尿病肾病的预测价值，ROC结果分析提示该模型的AUC为0.950(95％置信区间：0.816-1.000)，灵敏度和特异度分别为93％和85％(见图3)。

上述实施例表明，普氏菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和链球菌血清16S rDNA联合空腹血糖对糖尿病肾病预测具有非常高的价值。因而可以采用本发明的预测模型，检测四种菌16SrDNA的相对丰度，进而根据检测结果对糖尿病肾病进行早期预测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.血清16S rDNA作为糖尿病肾病的生物标志的应用，其中所述血清16S rDNA来自普氏菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和链球菌中的一种或几种。

2.一种检测糖尿病肾病的试剂盒，其特征在于：包括血清16S rDNA的特异性引物和/或探针，其中所述血清16S rDNA来自普氏菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和链球菌中的一种或几种。

3.根据权利要求2所述的检测糖尿病肾病的试剂盒，其特征在于：所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

4.根据权利要求2所述的检测糖尿病肾病的试剂盒，其特征在于：所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。

5.根据权利要求2所述的检测糖尿病肾病的试剂盒，其特征在于：所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。

6.根据权利要求2所述的检测糖尿病肾病的试剂盒，其特征在于：所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示。

7.一种采用权利要求2-6中任一项所述的试剂盒检测血清中16S rDNA水平的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用所述试剂盒中的血清16S rDNA的特异性引物和/或探针对血清样本进行实时荧光定量PCR检测，测得普氏菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和链球菌的丰度E_普氏菌、E_柔嫩梭菌、E_球形梭菌和E_链球菌；

(2)将上述E_普氏菌、E_柔嫩梭菌、E_球形梭菌和E_链球菌参数代入数学模型Y＝1.001+0.772×E_普氏菌+1.286×E_柔嫩梭菌+1.529×E_球形梭菌+0.473×E_链球菌，计算参数Y值。

8.根据权利要求7所述的检测血清中16S rDNA水平的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述PCR扩增的条件为第一循环95℃，5min；而后95℃，10s，60℃，35s，共40个循环。