CN107674141A - 一种烟草制品体外毒理学评价用三维细胞支架的制备及利用其进行细胞培养的方法 - Google Patents

一种烟草制品体外毒理学评价用三维细胞支架的制备及利用其进行细胞培养的方法 Download PDF

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Abstract

一种烟草制品体外毒理学评价用三维细胞支架的制备方法，特征是：在细胞培养皿中通过高内相乳液聚合，得到一种具有聚合物互通多孔材料，材料具有烟草制品体外毒理学评价用细胞（人肺癌细胞、人支气管上皮细胞）尺寸的大孔，且孔与孔之间是互通的，利于细胞生长所需氧气、养料的输入和细胞代谢废物的输出，对材料表面进行改性使其具有良好的细胞亲和性，与现有毒理学评价普遍采用平板单层细胞培养方法相比，细胞可在本发明的支架上三维生长，与原体内时的立体形态及生化和功能性更加接近，因此，采用本发明的三维细胞支架培养的细胞进行烟草制品体外毒理学评价时，评价结果将更加客观、真实。且该细胞支架在培养皿中制备，对后续实验更加便捷。

Description

一种烟草制品体外毒理学评价用三维细胞支架的制备及利用 其进行细胞培养的方法
技术领域
本发明属于三维细胞支架制备技术领域，具体是一种烟草制品体外毒理学评价用三维细胞支架的制备及利用其进行细胞培养的方法。
背景技术
目前烟草制品体外毒性评价普遍采用单层细胞培养方法，它具有培养简单、易操作、费用低、可大量应用的优点，被广泛用作烟草制品体外毒理研究的实验模型。但在单层细胞培养中，细胞是在附着底物平面上生长，因缺少立体支架，只能向二维发展，不能生成细胞外基质，且由于缺乏体内特异性生长因子及分化因子作用，细胞不能分化，从而失去原体内时的立体形态。因此，单层细胞培养所反映的生物学性状，与体内组织细胞相差甚远。通常的后果是细胞发生分化现象，培养的细胞不仅失去了正常的形态，而且失去了其生化与功能性质，如软骨细胞在单层培养过程中，呈现出类似成纤维细胞的去分化形态，并且由正常条件下的分泌Ⅱ型胶原转变到分泌I型胶原。因此，为细胞提供与体内相似的支架系统，创建与原体内类似的生长环境，促使细胞增殖、分化及呈现出类似体内组织结构和功能性状，是体外细胞培养的发展趋势。
目前三维细胞支架材料主要包括两大类，一类天然生物材料，如壳聚糖，纤维蛋白、胶原蛋白等，一类是人工合成材料，如聚乙二醇、聚羟基乙酸、聚乳酸聚羟基乙酸共聚物等。但这些三维细胞支架材料主要是用于组织工程，并不完全适用于烟气体外毒理学评价中的三维细胞培养，其原因在于，烟气体外毒理学评价所使用的细胞与以往研究中使用的细胞不同，细胞性质和大小发生变化；上述支架材料一般都为颗粒状材料，在培养皿中进行细胞培养时，在支架材料上生长的细胞数量较少，后续烟气毒理学评价时操作也较复杂。此外，目前烟气体外毒理学评价中还通过商品化的transwell膜实现细胞的多层培养，并未真正实现细胞的三维培养，且操作较复杂。因此，用于烟气体外毒理学评价的三维细胞支架的开发仍是一项具有重要意义和挑战性的工作。
聚合物互通多孔材料(PolyHIPE)是将高内相乳液（high internal phaseemulsion, HIPE，又称超浓乳液，其分散相体积分数在74%以上，液滴间由于相互挤压而成为被含有表面活性剂的连续相薄膜隔离的多面体形状液泡，将连续相的单体聚合后获得的一种互通多孔材料。聚合物互通多孔材料中通常含有三种孔：(1)通过分散相模板形成的孔称之为“泡孔”(void)，孔径在微米级；(2)两个相邻的泡孔之间形成的孔称为“窗孔”(window)，孔径在微米级，起到互通泡孔的作用；(3)通过在连续相单体中添加致孔剂而在泡孔壁上形成的孔称为“毛孔”(pore)，孔径在纳米级，毛孔的存在使聚合物互通多孔材料的表面积大幅度增加。
因此，聚合物互通多孔材料具有成为烟气体外毒理学评价用三维细胞支架的良好潜质，具体表现在：（1）材料具有细胞维度的大孔，且可根据目标细胞的尺寸进行调控；（2）孔与孔之间是互通的，利于细胞生长所需氧气、养料的输入和细胞代谢废物的输出；（3）可使用具有一定亲水性的单体聚合或对材料表面进行改性使其具有良好的细胞亲和性；（4）可在细胞培养皿原位聚合，材料完全贴合培养皿生成，对于后续烟草制品体外毒理学评价更加方便。
但目前还没有通过高内相乳液在细胞培养皿内制备烟草制品体外毒理学评价用三维细胞支架的报道。
发明内容
本发明的目的正是基于上述现有技术状况而研制的一种烟草制品体外毒理学评价用三维细胞支架制备方法，本发明在细胞培养皿中通过高内相乳液聚合，得到一种聚合物互通多孔材料，材料具有烟草制品体外毒理学评价用细胞（人肺癌细胞或人支气管上皮细胞）尺寸的大孔，且孔与孔之间是互通的，利于细胞生长所需氧气、养料的输入和细胞代谢废物的输出，对材料表面进行改性使其具有良好的细胞亲和性，与烟草制品体外毒理学评价普遍采用的平板单层细胞培养方法相比，细胞可在本发明的三维细胞支架上三维生长，与原体内时的立体形态及生化和功能性更加接近，因此，采用本发明的三维细胞支架培养的细胞进行烟草制品体外毒理学评价时，评价结果将更加客观、真实，且本发明的三维细胞支架在细胞培养皿内制备，对于后续烟气体外毒理学评价更加便捷。
本发明为了增加细胞在三维细胞支架上的粘附和生长，通过采用两种方式对支架材料进行改性，一种为在聚合单体中添加丙烯酸2-乙基己基酯和丙烯酸，这两种单体中含有酯基和羧基基团，可改善支架表面的亲水性，有利于细胞的粘附和生长，另一种为在三维支架材料聚合完成后，在材料表面采用聚赖氨酸进行包覆，聚赖氨酸溶液带正电，细胞整体带负电，因此其可作为细胞粘合剂来增强细胞的粘附和生长。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种烟草制品体外毒理学评价用三维细胞支架制备方法，由苯乙烯或甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸缩水甘油酯中的任意、丙烯酸2-乙基己基酯、亲水性单体丙烯酸、交联剂、乳化剂配置油相；水、无机盐、引发剂配置水相；将水相缓慢加入油相中形成高内相乳液，将其转移至细胞培养皿中，通氮气密封；采用热引发或辐射引发聚合；引发聚合固体产物，分别用水和乙醇分别抽提，在真空烘箱中干燥；干燥后的固体产物，加入改性剂处理得到三维细胞支架，用于烟草制品体外毒理学评价用。
具体步骤如下：
(1）先配置油相，组成为单体、交联剂、乳化剂；油相具体配比：苯乙烯或甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸缩水甘油酯中的任意一种2~8ml，丙烯酸2-乙基己基酯0~3ml，亲水性单体丙烯酸0~3ml，交联剂0.5~5ml，乳化剂0.5~4g;
(2）然后配置水相，组成为水，无机盐；其具体配比：水相具体配比：水40~90ml，无机盐0.1~1.5g，引发剂0.1~0.5g；
(3）在500~700rpm下，将水相缓慢加入油相中形成高内相乳液，将其转移至直径为15~40mm的细胞培养皿中，乳液高度为2~5mm，通氮气10~20min后密封；
(4）引发聚合，可采取以下任一方式：
当采用热引发聚合时，将上述装有高内相乳液的培养皿放入50~60℃的烘箱中，加热聚合24~48 h；
当采用辐射引发聚合时，将上述装有高内相乳液的培养皿放入1.3×1015 Bq 60 Co源中，剂量率为20~80Gy/min，照射时间为24~48h；
(5）将步骤（4）所得的引发聚合固体产物，分别用水和乙醇分别抽提24小时，在真空烘箱中干燥；
(6）将步骤（5）所得的固体产物，加入0.1~1mg/ml的改性剂进行处理，对材料表面进行改性的目的是使其具有良好的细胞亲和性。处理时间为12~48h，即得到本发明的体外毒理学评价用三维细胞支架。
所用的交联剂为二乙烯基苯、双甲基丙烯酸乙二醇酯、三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯或丙三醇三（α-甲基丙烯酸）酯。
所用乳化剂为脱水山梨醇单硬脂酸酯聚氧乙烯醚(TWEEN 60)、辛癸酸甘油酯、三聚甘油硬脂酸酯、失水山梨醇单油酸酯(SPAN 80)、三聚甘油油酸酯或琥珀酸单甘油酯。
所述无机盐为氯化钙、氯化钠或硫酸镁。
所述引发剂为过硫酸钾或过硫酸铵。
所用改性剂为分子量在30000~70000，70000~150000，300000~400000的L型或D型聚赖氨酸。
所述丙烯酸2~乙基己基酯的加入量优选1~3ml，亲水性单体丙烯酸的加入量优选1~3ml。
将本发明制备的三维细胞支架用于毒理学评价的细胞培养方法，具体步骤如下：将得到的三维细胞支架用高压蒸汽锅灭菌后，在支架上进行细胞培养；灭菌后的样品一式三份放在6孔板中，每孔加入2ml含有10%胎牛血清和1%双抗的1640培养基，预培养12h；预培养后每孔加入0.2ml含有5×105个人肺癌细胞或人支气管上皮细胞细胞的培养基，2h后再向每孔加入2ml培养基，混匀后放入气氛为5%CO2，37℃的培养箱中进行培养。
Cell Counting Kit-8（CCK-8）溶液可以直接加到细胞样品中，生成的甲臜量与活细胞数量成正比，从而测定细胞的增值情况。从加入细胞为0天算起，1-7天每天检测前吸出培养基，用PBS清洗三遍后，加入含有10%CCK-8的培养基2ml，混匀后，放入培养箱中。在不同时间段从六孔板中每孔取出0.1ml培养基加入96孔板中，用酶标仪测得其在450nm处的吸光度，获得细胞的生长曲线。
本发明提供的三维细胞支架材料具有如下优点：
1. 本发明的三维细胞支架，可为烟草制品体外毒理学评价用人肺癌细胞或人支气管上皮细胞生长提供三维生长环境，使细胞与原体内时的立体形态及生化和功能性更加接近，因此，采用本发明的三维细胞支架进行烟草制品体外毒理学评价时，评价结果将更加客观、真实。
2. 本发明的三维细胞支架，具有互通多孔的结构，利于细胞生长时氧气、养料的输入和细胞代谢废物的输出，大大利于细胞的生长。
3. 本发明的三维细胞支架，采用亲水性单体丙烯酸2-乙基己基酯、丙烯酸及聚赖氨酸对其表面进行了改性，提高了细胞的粘附能力及增殖能力。
4. 本发明的三维细胞支架，可在细胞培养皿内原位聚合，可直接用于后续烟草制品体外毒理学评价，使后续的毒理学评价实验更加便捷。
附图说明
图1为实施例1制备的三维细胞支架性状图，
(a)三维细胞支架照片; (b) 三维细胞支架扫描电镜照片; (c) 人肺癌细胞在三维细胞支架上的生长曲线; (d) 人肺癌细胞在三维细胞支架上生长7天后的扫描电镜照片。
具体实施方式
下面以实例进一步说明本发明的实质内容，但本发明的内容并不限于此。
实施例1
先配置油相，组成为4ml苯乙烯，0.5ml二乙烯基苯，2.4g SPAN 80，然后配置水相，组成为64ml水、0.5g氯化钙及0.65g过硫酸钾。在500rpm高速搅拌下，将水相缓慢加入油相中形成高内相乳液，将其倒入直径为36mm的细胞培养皿中，高度为2mm，通氮气10min后密封。随后将其放入60℃的烘箱中聚合24小时。样品通过索氏提取法分别用乙醇和水作为溶剂提取24h后真空干燥。向真空干燥后的材料中分别加入分子量为70000~150000、浓度为0.1mg/ml的L型聚赖氨酸，浸泡24h。随后用高压蒸汽锅灭菌，灭菌后的样品放在6孔板中，每孔加入2ml含有10%胎牛血清和1%双抗的1640培养基，预培养12h。预培养后每孔加入0.2ml含有5×105个人肺癌细胞的培养基，2h后再向每孔加入2ml培养基，混匀后放入气氛为5%CO2，37℃的培养箱中进行培养后可得烟草制品体外毒理学评价用三维细胞支架。图1（a）为三维细胞支架照片，图1（b）为三维细胞支架扫描电镜照片，图1（c）为人肺癌细胞在三维细胞支架上的生长曲线，图1（d）为人肺癌细胞在三维细胞支架上生长7天后的扫描电镜照片。图1（a）表明，三维细胞支架为直径在32mm，厚度为2mm的圆形物体；图1（b）表明，三维细胞支架为互通多孔结构，孔径在3微米至13微米，平均孔径在8微米；图1（c）和图1（d）表明，人肺癌细胞可在三维细胞支架上内部贴壁生长，并进一步增殖分化形成一定的形态，同时在材料表面形成一层细胞膜。因此，其可以作为烟草制品体外毒理学评价用的细胞支架。
实施例2
先配置油相，组成为4ml苯乙烯，0.5ml二乙烯基苯，2.4g SPAN 80，然后配置水相，组成为64ml水、0.5g氯化钙及0.65g过硫酸钾。在500rpm高速搅拌下，将水相缓慢加入油相中形成高内相乳液，将其倒入直径为36mm的细胞培养皿中，高度为2mm，通氮气10min后密封。随后将其放入60℃的烘箱中聚合24小时。样品通过索氏提取法分别用乙醇和水作为溶剂提取24h后真空干燥。向真空干燥后的材料中分别加入分子量为30000~70000、浓度为0.1mg/ml的L型聚赖氨酸，浸泡24h。随后用高压蒸汽锅灭菌，灭菌后的样品放在6孔板中，每孔加入2ml含有10%胎牛血清和1%双抗的1640培养基，预培养12h。预培养后每孔加入0.2ml含有5×105个人肺癌细胞的培养基，2h后再向每孔加入2ml培养基，混匀后放入气氛为5%CO2，37℃的培养箱中进行培养后可得烟草制品体外毒理学评价用三维细胞支架。
实施例3
先配置油相，组成为4ml苯乙烯，0.5ml二乙烯基苯，2.4g SPAN 80，然后配置水相，组成为64ml水、0.5g氯化钙及0.65g过硫酸钾。在500rpm高速搅拌下，将水相缓慢加入油相中形成高内相乳液，将其倒入直径为36mm的细胞培养皿中，高度为2mm，通氮气10min后密封。随后将其放入60℃的烘箱中聚合24小时。样品通过索氏提取法分别用乙醇和水作为溶剂提取24h后真空干燥。向真空干燥后的材料中分别加入分子量为30000~70000、浓度为0.1mg/ml的D型聚赖氨酸，浸泡24h。随后用高压蒸汽锅灭菌，灭菌后的样品放在6孔板中，每孔加入2ml含有10%胎牛血清和1%双抗的1640培养基，预培养12h。预培养后每孔加入0.2ml含有5×105个人肺癌细胞的培养基，2h后再向每孔加入2ml培养基，混匀后放入气氛为5%CO2，37℃的培养箱中进行培养后可得烟草制品体外毒理学评价用三维细胞支架。
实施例4
先配置油相，组成为3ml苯乙烯，丙烯酸2-乙基己基酯1.5ml，丙烯酸1ml，0.5ml双甲基丙烯酸乙二醇酯，2.4g SPAN 80，然后配置水相，组成为64ml水、0.5g氯化钙及0.65g过硫酸钾。在500rpm高速搅拌下，将水相缓慢加入油相中形成高内相乳液，将其倒入直径为36mm的细胞培养皿中，高度为2mm，通氮气10min后密封。随后将其放入60℃的烘箱中聚合24小时。样品通过索氏提取法分别用乙醇和水作为溶剂提取24h后真空干燥。向真空干燥后的材料中分别加入分子量为70000~150000浓度为0.1mg/ml的D型聚赖氨酸，浸泡24h。随后用高压蒸汽锅灭菌，灭菌后的样品放在6孔板中，每孔加入2ml含有10%胎牛血清和1%双抗的1640培养基，预培养12h。预培养后每孔加入0.2ml含有5×105个人肺癌细胞的培养基，2h后再向每孔加入2ml培养基，混匀后放入气氛为5%CO2，37℃的培养箱中进行培养后可得烟草制品体外毒理学评价用三维细胞支架。
实施例5
先配置油相，组成为3ml甲基丙烯酸甲酯，2ml丙三醇三（α-甲基丙烯酸）酯，2g辛癸酸甘油酯，然后配置水相，组成为70ml水、0.5g氯化钠及0.65g过硫酸铵。在500rpm高速搅拌下，将水相缓慢加入油相中形成高内相乳液，将其倒入直径为22mm的细胞培养皿中，高度为3mm，通氮气10min后密封。随后将其放入60℃的烘箱中聚合24小时。样品通过索氏提取法分别用乙醇和水作为溶剂提取24h后真空干燥。向真空干燥后的材料中分别加入分子量为300000~400000、浓度为0.2mg/ml的L型聚赖氨酸，浸泡24h。随后用高压蒸汽锅灭菌，灭菌后的样品放在6孔板中，每孔加入2ml含有10%胎牛血清和1%双抗的1640培养基，预培养12h。预培养后每孔加入0.2ml含有5×105个人肺癌细胞的培养基，2h后再向每孔加入2ml培养基，混匀后放入气氛5%CO2，37℃的培养箱中进行培养后可得烟草制品体外毒理学评价用三维细胞支架。
实施例6
先配置油相，组成为4ml苯乙烯，1ml二乙烯基苯，2g三聚甘油硬脂酸酯，然后配置水相，组成为75ml水、0.5g硫酸镁及0.65g过硫酸铵。在500rpm高速搅拌下，将水相缓慢加入油相中形成高内相乳液，将其倒入直径为16mm的细胞培养皿中，高度为5mm，通氮气10min后密封。随后将其放入60℃的烘箱中聚合24小时。样品通过索氏提取法分别用乙醇和水作为溶剂提取24h后真空干燥。向真空干燥后的材料中分别加入分子量为30000~70000、浓度为0.8mg/ml的D型聚赖氨酸，浸泡24h。随后用高压蒸汽锅灭菌，灭菌后的样品放在6孔板中，每孔加入2ml含有10%胎牛血清和1%双抗的1640培养基，预培养12h。预培养后每孔加入0.2ml含有5×105个人肺癌细胞的培养基，2h后再向每孔加入2ml培养基，混匀后放入气氛为5%CO，37℃的培养箱中进行培养后可得烟草制品体外毒理学评价用三维细胞支架。
实施例7
先配置油相，组成为3ml苯乙烯，丙烯酸2-乙基己基酯1.5ml，丙烯酸1ml，0.5ml双甲基丙烯酸乙二醇酯，2.4g 三聚甘油油酸酯，然后配置水相，组成为64ml水、0.5g氯化钙及0.65g过硫酸钾。在500rpm高速搅拌下，将水相缓慢加入油相中形成高内相乳液，将其倒入直径为36mm的细胞培养皿中，高度为2mm，通氮气10min后密封。随后将其放入60℃的烘箱中聚合24小时。样品通过索氏提取法分别用乙醇和水作为溶剂提取24h后真空干燥。用高压蒸汽锅灭菌，灭菌后的样品放在6孔板中，每孔加入2ml含有10%胎牛血清和1%双抗的1640培养基，预培养12h。预培养后每孔加入0.2ml含有5×105个人肺上皮细胞的培养基，2h后再向每孔加入2ml培养基，混匀后放入气氛为5%CO2，37℃的培养箱中进行培养后可得烟草制品体外毒理学评价用三维细胞支架。
实施例8
先配置油相，组成为3ml甲基丙烯酸缩水甘油酯，丙烯酸2-乙基己基酯1ml，丙烯酸1ml，0.5ml三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯，2g 脱水山梨醇单硬脂酸酯聚氧乙烯醚，然后配置水相，组成为60ml水、0.5g氯化钙。在500rpm高速搅拌下，将水相缓慢加入油相中形成高内相乳液，将其倒入直径为36mm的细胞培养皿中，高度为2mm，通氮气10min后密封。随后将其放入1.3×1015 Bq 60 Co源中，剂量率为40Gy/min, 照射时间为24小时。将所得产物通过索氏提取法分别用乙醇和水作为溶剂提取24h后真空干燥。向真空干燥后的材料中分别加入分子量为70000~150000、浓度为0.1mg/ml的L型聚赖氨酸，浸泡24h。随后用高压蒸汽锅灭菌，灭菌后的样品放在6孔板中，每孔加入2ml含有10%胎牛血清和1%双抗的1640培养基，预培养12h。预培养后每孔加入0.2ml含有5×105个人肺癌细胞的培养基，2h后再向每孔加入2ml培养基，混匀后放入气氛为5%CO，37℃的培养箱中进行培养后可得烟草制品体外毒理学评价用细胞支架。

Claims (10)

1.一种烟草制品体外毒理学评价用三维细胞支架的制备方法，其特征在于：步骤为：由苯乙烯或甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸缩水甘油酯中的任意、丙烯酸2-乙基己基酯、亲水性单体丙烯酸、交联剂、乳化剂配置油相；水、无机盐、引发剂配置水相；将水相缓慢加入油相中形成高内相乳液，将其转移至细胞培养皿中，通氮气密封；采用热引发或辐射引发聚合；引发聚合固体产物，分别用水和乙醇分别抽提，在真空烘箱中干燥；干燥后的固体产物，加入改性剂处理得到三维细胞支架，用于烟草制品体外毒理学评价用。
2.根据权利要求1所述的烟草制品体外毒理学评价用三维细胞支架制备方法，其特征在于：具体操作步骤如下：
（1）先配置油相，油相具体配比：苯乙烯或甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸缩水甘油酯中的任意一种2~8ml，丙烯酸2-乙基己基酯0~3ml，亲水性单体丙烯酸0~3ml，交联剂0.5~5ml，乳化剂0.5~4g;
（2）再配置水相，水相具体配比：水40~90ml，无机盐0.1~1.5g，引发剂0.1~0.5g；
（3）在500~700rpm下，将水相缓慢加入油相中形成高内相乳液，将其转移至直径为15~40mm的细胞培养皿中，乳液高度为2~5mm，通氮气10~20min后密封；
（4）引发聚合，可采取以下任一方式：
a．当采用热引发聚合时，将上述装有高内相乳液的培养皿放入50~60℃的烘箱中，加热聚合24~48 h；
b．当采用辐射引发聚合时，将上述装有高内相乳液的培养皿放入1.3×1015 Bq 60 Co源中，剂量率为20~80Gy/min，照射时间为24~48h；
（5）将步骤（4）所得的引发聚合固体产物，分别用水和乙醇分别抽提24小时，在真空烘箱中干燥；
（6）将步骤（5）所得的固体产物，加入0.1~1mg/ml的改性剂进行处理，处理时间为12~48h，即得到本发明的烟草制品体外毒理学评价用三维细胞支架。
3.根据权利要求1或2所述的烟草制品体外毒理学评价用三维细胞支架制备方法，其特征在于：所用的交联剂为二乙烯基苯、双甲基丙烯酸乙二醇酯、三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯或丙三醇三（α~甲基丙烯酸）酯。
4.根据权利要求1或2所述的烟草制品体外毒理学评价用三维细胞支架制备方法，其特征在于：所用乳化剂为脱水山梨醇单硬脂酸酯聚氧乙烯醚(TWEEN 60)、辛癸酸甘油酯、三聚甘油硬脂酸酯、失水山梨醇单油酸酯(SPAN 80)、三聚甘油油酸酯或琥珀酸单甘油酯。
5.根据权利要求1或2所述的烟草制品体外毒理学评价用三维细胞支架制备方法，其特征在于：无机盐为氯化钙、氯化钠或硫酸镁。
6.根据权利要求1或2所述的烟草制品体外毒理学评价用三维细胞支架制备方法，其特征在于：所述引发剂为过硫酸钾或过硫酸铵。
7.根据权利要求1或2所述的烟草制品体外毒理学评价用三维细胞支架制备方法，其特征在于：所用改性剂为分子量在30000~70000，70000~150000，300000~400000的L型或D型聚赖氨酸。
8.根据权利要求1或2所述的烟草制品体外毒理学评价用三维细胞支架制备方法，其特征在于：所述丙烯酸2-乙基己基酯的加入量为1~3ml，亲水性单体丙烯酸的加入量为1~3ml。
9.一种按照权利要求1或2所述方法制备的三维细胞支架用于毒理学评价的细胞培养方法，其具体步骤如下：将得到的三维细胞支架灭菌后，在支架上进行细胞培养；灭菌后的样品一式三份放在6孔板中，每孔加入2ml含有10%胎牛血清和1%双抗的1640培养基，预培养12h；预培养后每孔加入0.2ml含有5×105个人肺癌细胞或人支气管上皮细胞细胞的培养基，2h后再向每孔加入2ml培养基，混匀后放入气氛为5%CO2，37℃的培养箱中进行培养。
10.根据权利要求9所述的细胞培养方法，其特征在于：将三维细胞支架采用高压蒸汽锅进行灭菌。
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