CN107655867A - 一种检测和提取牛粪中酪氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种检测和提取牛粪中酪氨酸的方法；应用牲畜粪肥成分确定的应用上较为罕见，依据本方法从源上认识到牛粪的有效可溶性有机成分，牛粪的无害化处理提供科学依据。另外我们已经验证的实际实验数据显示牛粪中确定的酪氨酸的含量在5.6±0.25‑9.8±0.45g/kg范围内，鉴于酪氨酸的较高的含量以及以上提及的酪氨酸的诸多应用价值，可以从牛粪中提取酪氨酸的角度，对牛粪的资源化利用提供另一种有效的处理方法。

Description

一种检测和提取牛粪中酪氨酸的方法

技术领域

本发明属于畜牧垃圾的资源化利用，提出一种检测和提取牛粪中酪氨酸的方法是对酪氨酸的生产来源的一个创新。

背景技术

酪氨酸(C₉H₁₁NO₃结构式如下)是一种非必需氨基酸，它有调节情绪，刺激神经

系统的作用。此外还帮助加快身体新陈代谢，治疗慢性疲劳等疾病。人体需要足够的酪氨酸生产许多重要的大脑化学物质，以便于帮助调节食欲，疼痛敏感性，和人体对压力的反应。正常的甲状腺，垂体和肾上腺功能也需要它。酪氨酸水平低可能导致甲状腺功能衰退，低血压，慢性疲劳，以及新陈代谢缓慢等问题。酪氨酸作为一种非必需氨基酸，但是对于某些先天性缺陷的(苯丙酮尿症患者)人群，酪氨酸就成了必须的药品。

酪氨酸是酪氨酸酶单酚酶功能的催化底物，是最终形成优黑素和褐黑素的主要原料。在美白化妆品研发中，可以通过研究合成与酪氨酸竞争的酪氨酸酶结构类似物也可有效地抑制黑素的生成。另外在医学上白癜风患者吃含有酪氨酸的食物可以促进黑色素的形成，减轻白癜风症状，在医药生产上有使用过从蚕蛹黄中提取酪氨酸用于生产治疗甲状腺疾病的甲状腺素和氯霉素。

工业上用于生产酪氨酸的方法也很有限，2016年协和发酵公司表示该公司已开发出世界上首个利用发酵技术商业化生产L-酪氨酸的工艺，并将在2007年实现大规模生产。但是需要在工业环境下实现量产。现在工业生产酪氨酸使用较多的是微生物发酵法，但是微生物的复杂性以及对环境的敏感性导致了酪氨酸生产的技术难度，而且微生物发酵也只是产生含有酪氨酸的产物，还需要进一步的提纯，无疑是需要较高成本的。而本发明基于牛粪中含有酪氨酸的发现提出将牛粪作为生产酪氨酸原材料从而减少了工业生产中的微生物发酵过程降低了成本，本发明也是对农业生产中牛粪资源化处理的创新。

发明内容

根据现有技术的问题,本发明提出应用牲畜粪肥成分确定的应用上较为罕见，依据本方法从源上认识到牛粪的有效可溶性有机成分，牛粪的无害化处理提供科学依据。另外我们已经验证的实际实验数据显示牛粪中确定的酪氨酸的含量在5.6±0.25-9.8±0.45g/kg范围内，鉴于酪氨酸的较高的含量以及以上提及的酪氨酸的诸多应用价值，可以从牛粪中提取酪氨酸的角度，对牛粪的资源化利用提供另一种有效的处理方法。

本发明的技术方案如下：

一种检测牛粪中酪氨酸的方法；其步骤如下：

1)溶解：取鲜牛粪，加入超纯水溶解，摇匀4500～500r/min的速率下离心；

2)过滤：牛粪溶解液用0.45微米孔径的玻璃纤维滤纸过滤，取滤液；

3)测荧光平行因子分析：滤液用应光谱仪测定荧光光谱数据，并通过平行因子分析法；

4)确定成分：根据平行因子最终数据与标准物质比对确定结果。

本发明荧光平行因子分析是采用三维荧光光谱-平行因子分析法是荧光谱仪与MATLAB数据处理软件的结合方法。

检测数据显示牛粪中确定的酪氨酸的含量在5.6±0.25-9.8±0.45g/kg。

根据发明的技术和检测的结果，对牛粪中酪氨酸进行提取，具体方法如下：

1)水解:取鲜牛粪，加入2～5倍量的20％的盐酸105～110℃条件下油浴水解20～24小时；

2)去酸：将水解后的溶液使用离心机在4500～500r/min的速率下离心，然后过滤去残渣，利用减压蒸馏设备去除水解液中的盐酸；

3)调节pH：使用氨水将滤液pH调节至5.8～6.5；

4)去色浓缩：温度在60～80℃使用活性炭吸附；脱色后滤除活性炭温度保持在60～80℃条件下产生结晶石，分离出滤液；

5)结晶：将滤液在低温下进行结晶，得到酪氨酸的粗制结晶体。

三维荧光光谱-平行因子分析法(EEM-PARAFAC)是荧光谱仪与MATLAB数据处理软件的结合，EEM-PARAFAC是主要用于分析水体中溶解性有机质的判定并且有了较为成熟的发展，然而在有机粪肥的研究分析中较为罕见。本次发现是基于EEM-PARAFAC的分析判定牛粪中含有较多酪氨酸，并提出将牛粪这种常见的农业养殖中产生的垃圾加以利用作为生产酪氨酸的原材料。

本发明利用三维荧光技术确定了牛粪中的主要成分(如图.1所示)，并从原料上考虑降低成本将牛粪应用于酪氨酸的生产原材料关于三维荧光法确定牛粪中主要成分的步骤操作如图.2所示。

本发明涉及一种方法用于分析鉴别牛粪中可溶性有机质的，并致力于将牛粪作为生产酪氨酸的原材料，其方法叙述如下操作流程如图.3所示。

(一)水解:取一定量的牛粪鲜牛粪最好,加入2～5倍量的20％的盐酸105～110℃条件下油浴水解20～24小时(视水解程度调节时间)。

(二)去酸：将水解后的溶液使用离心机在4500～500r/min的速率下离心10分钟，然后过滤去残渣，利用减压蒸馏设备去除水解液中的盐酸蒸馏出的盐酸还可以回收重复利用。

(三)调节pH：蒸馏方法并不能完全去除滤液中的酪氨酸，为了是酪氨酸的溶解效果最好，我们使用氨水将滤液pH调节至5.8～6.5之间介于酪氨酸的最佳等电点范围。

(四)去色浓缩：简单的取色可用活性炭吸附来完成，不过要注意的是在外温度较低的情况下可能会产生活性炭对酪氨酸的吸附，所以我们将温度设定在60～80℃范围内，脱色后滤除活性炭温度保持在60～80℃条件下结晶，此条条件下产生的结晶大部分为NH₄Cl晶体过滤去除NH₄Cl杂质完成浓缩。

(五)结晶：将浓缩后的滤液在低温下进行结晶(酪氨酸在热水中易于溶解，温度低时便会结晶析出)，当有大量晶体产生时在抽滤漏斗中过滤并用冷水冲洗(NH₄Cl在冷水中溶解性较好这样可以更进一步去除残余NH₄Cl)过滤之后便得到酪酸的粗制结晶体。对于酪氨酸粗制晶体成分的鉴定，可以取部分晶体作紫外可见吸光度分析最大吸收波长在275±2nm处，或者同酪氨酸标准样品作比对进行荧光光谱分析。

本方法提取的酪氨酸为酪氨酸的粗制晶体，对于更高的工业化要求可以采取措施进一步纯化。

附图说明

图1：牛粪三维荧光光谱分析结果

图2：酪氨酸标准样品分析的结果

图3：牛粪中的成分确定方法设计执行步骤。

图4：牛粪中酪氨酸的提取。

以下为本方法设计的具体实施案例，所述实例是为进一步描述本本设计的可行性，但本发明要求保护的范围并不局限于下列材料应用方式。

实施例1：

我们采取了天津蓟县农村的奶牛养殖农户养殖的奶牛的牛粪，取2.5g的牛粪溶解于250ml，用0.45微米孔径的玻璃纤维滤膜过滤获取牛粪中溶解性有机质溶液，获得的溶液可直接进行荧光测定。荧光数据用平行因子分析法确定最终物质的荧光峰值为Peak T＝275/311，Peak T_uv＝220/311根据荧光峰的特征，并且增加了酪氨酸的标准物质的测定比对，确定了天津采的牛粪样品中主要可溶性成分为酪氨酸。这一步是以下将牛粪作为酪氨酸生产原材料的理论依据也是创新之一并确定样品牛粪中酪氨酸的含量范围5.6±0.25-9.8±0.45g/kg。

取200g鲜牛粪,加入3倍的20％的盐酸在105℃条件下油浴水解我们这里采用水解时间为24小时。将水解后的溶液使用离心机在4500r/min的速率下离心10分钟离心更有利于分离牛粪溶液与残渣，然后过滤去残渣，利用减压蒸馏设备去除水解液中的盐酸蒸馏出的盐酸还可以回收重复利用。蒸馏方法并不能完全去除滤液中的酪氨酸，为了是酪氨酸的溶解效果最好，用0.1mol/L的氨水将滤液pH调节至6.4以利于酪氨酸的溶解，接下来加入活性炭吸附来去除溶液中的颜色并用水浴锅维持温度在70℃，脱色后滤除活性炭温度保持在75℃条件下结晶，此条条件下(NH₄Cl的溶解度降低并有晶体析出)产生的结晶大部分为NH₄Cl晶体过滤去除NH₄Cl杂质完成浓缩。将浓缩后的滤液用凉水冲洗容器是温度下降进而产生结晶当有大量晶体产生时在抽滤漏斗中过滤并用冷水冲洗。

试验最终我们从200g牛粪原样中分离到了酪氨酸粗制晶体0.51g粗制的提取率46％。

实施例2：

我们采取了天津蓟县农村的奶牛养殖农户养殖的奶牛的牛粪，取2.5g的牛粪溶解于250ml，用0.45微米孔径的玻璃纤维滤膜过滤获取牛粪中溶解性有机质溶液，获得的溶液可直接进行荧光测定。荧光数据用平行因子分析法确定最终物质的荧光峰值为Peak T＝275/311，Peak T_uv＝220/311根据荧光峰的特征，并且增加了酪氨酸的标准物质的测定比对，确定了天津采的牛粪样品中主要可溶性成分为酪氨酸。这一步是以下将牛粪作为酪氨酸生产原材料的理论依据也是本发明创新之一并确定样品牛粪中酪氨酸的含量范围5.6±0.25g/kg。

取200g鲜牛粪,加入3倍的20％的盐酸107.5℃条件下油浴水解我们这里采用水解时间为24小时。将水解后的溶液滤使用离心机在500r/min的速率下离心10分钟离心更有利于分离牛粪溶液与残渣，然后过滤去残渣，利用减压蒸馏设备去除水解液中的盐酸蒸馏出的盐酸还可以回收重复利用。蒸馏方法并不能完全去除滤液中的酪氨酸，为了是酪氨酸的溶解效果最好，用0.1mol/L的氨水将滤液pH调节至6.4以利于酪氨酸的溶解，接下来加入活性炭吸附来去除溶液中的颜色并用水浴锅维持温度在70℃度左右，脱色后滤除活性炭温度保持在75℃条件下结晶，此条条件下产生的结晶大部分为NH₄Cl晶体过滤去除NH₄Cl杂质完成浓缩。将浓缩后的滤液用凉水冲洗容器是温度下降进而产生结晶当有大量晶体产生时在抽滤漏斗中过滤并用冷水冲洗。

试验最终我们从200g牛粪原样中分离到了酪氨酸粗制晶体0.53g粗制的提取率在47％。

实施例3：

我们采取了天津蓟县农村的奶牛养殖农户养殖的奶牛的牛粪，取2.5g的牛粪溶解于250ml，用0.45微米孔径的玻璃纤维滤膜过滤获取牛粪中溶解性有机质溶液，获得的溶液可直接进行荧光测定。荧光数据用平行因子分析法确定最终物质的荧光峰值为Peak T＝275/311，Peak T_uv＝220/311根据荧光峰的特征，并且增加了酪氨酸的标准物质的测定比对，确定了天津采的牛粪样品中主要可溶性成分为酪氨酸。这一步是以下将牛粪作为酪氨酸生产原材料的理论依据也是创新之一并确定样品牛粪中酪氨酸的含量范围5.6±0.25g/kg。

取200g鲜牛粪,加入3倍的20％的盐酸在110℃条件下油浴水解我们这里采用水解时间为24小时。将水解后的溶液使用离心机在4500-500r/min的速率下离心10分钟离心更有利于分离牛粪溶液与残渣，然后过滤去残渣，利用减压蒸馏设备去除水解液中的盐酸蒸馏出的盐酸还可以回收重复利用。蒸馏方法并不能完全去除滤液中的酪氨酸，为了是酪氨酸的溶解效果最好，用0.1mol/L的氨水将滤液pH调节至6.4以利于酪氨酸的溶解，接下来加入活性炭吸附来去除溶液中的颜色并用水浴锅维持温度在70℃，脱色后滤除活性炭温度保持在75℃条件下结晶，此条条件下产生的结晶大部分为NH₄Cl晶体过滤去除NH₄Cl杂质完成浓缩。将浓缩后的滤液用凉水冲洗容器是温度下降进而产生结晶当有大量晶体产生时在抽滤漏斗中过滤并用冷水冲洗。

试验最终我们从200g牛粪原样中分离到了酪氨酸粗制晶体0.55g粗制的提取率为49％。

本发明公开和提出的一种检测和提取牛粪中酪氨酸的方法，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

Claims (4)

1.一种检测牛粪中酪氨酸的方法；其特征是步骤如下：

1)溶解：取鲜牛粪，加入超纯水溶解，摇匀4500～500r/min的速率下离心；

2)过滤：牛粪溶解液用0.45微米孔径的玻璃纤维滤纸过滤，取滤液；

3)测荧光平行因子分析：滤液用应光谱仪测定荧光光谱数据，并通过平行因子分析法；

4)确定成分：根据平行因子最终数据与标准物质比对确定结果。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是荧光平行因子分析是采用三维荧光光谱-平行因子分析法是荧光谱仪与MATLAB数据处理软件的结合方法。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征是检测数据显示牛粪中确定的酪氨酸的含量在5.6±0.25-9.8±0.45g/kg。

4.一种提取牛粪中酪氨酸的方法；其特征是步骤如下：

1)水解:取鲜牛粪，加入2～5倍量的20％的盐酸105～110℃条件下油浴水解20～24小时；

2)去酸：将水解后的溶液使用离心机在4500～500r/min的速率下离心，然后过滤去残渣，利用减压蒸馏设备去除水解液中的盐酸；

3)调节pH：使用氨水将滤液pH调节至5.8～6.5；

4)去色浓缩：温度在60～80℃使用活性炭吸附；脱色后滤除活性炭温度保持在60～80℃条件下产生结晶石，分离出滤液；

5)结晶：将滤液在低温下进行结晶，得到酪氨酸的粗制结晶体。