CN107653314A - circRNAs作为活动性肺结核病特异性标志物的应用 - Google Patents

circRNAs作为活动性肺结核病特异性标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了circRNAs作为活动性肺结核病特异性标志物的应用。circRNAs有组织特异性与时空特异性，不同组织之间的circRNAs表达量不同，同一组织或器官在不同生长阶段，其中的circRNAs表达量也会变化，本发明首次公开了两个circRNAs作为活动性肺结核病特异性标志物，利用临床上比较容易直接获得的全血标本，结合设计的引物对进行RT‑qPCR验证circRNAs的差异表达，具有快速、简单、省时、检测灵敏度高，样品消耗少的优点，是非常适合的利用差异表达的circRNAs诊断活动性肺结核病的方法，对研究控制肺结核病的传播，降低其发生率具有重要的意义。

Description

circRNAs作为活动性肺结核病特异性标志物的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种制备活动性肺结核病特异性circRNAs的方法。
背景技术
结核病是一个重大的全球性公共卫生问题，严重威胁着人类健康。肺结核是结核病中最常见的临床类型。肺结核是一种由结核杆菌感染引起的慢性传染病。根据世界卫生组织（WHO）报道，2015年，全世界新发结核病数量约为1040万例，新发48万例耐多药结核病，有140万人死于结核病。中国发病人数居世界第二位。据估计，近5.5亿的结核感染人群，每年新发生肺结核患者100万例。死亡率2.32/10万。由于肺结核病主要通过空气传播，具有高发病率和高死亡率，因此对社会产生了相当大的负担。早发现、早诊断、早治疗，可控制肺结核病传播，是遏制肺结核病流行的最重要措施；但是活动性肺结核病的研究难点是缺乏特异的标志物。
环状RNA（circular RNAs，circRNAs）是一类新型非编码RNA，不具有 5' 末端帽子和 3' 末端 poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码 RNA 分子，与传统非编码不同，环状RNA分子为封闭环状结构，由于对核酸酶不敏感，因此比线性RNA更为稳定。circRNAs有组织特异性与时空特异性，不同组织之间的circRNAs表达量不同，同一组织或器官在不同生长阶段，其中的circRNAs表达量也会变化，circRNAs可从染色质重塑、转录调控及转录后加工等多种层面实现对基因表达的调控，其作用机制非常复杂，至今尚未完全清楚，比如已有许多研究证实了miRNAs参与调节TGFβ表达量和EMT过程，但参与此过程的circRNAs并不清楚。另外，一些在线网站比如starBase 2.0网站预测准确率低，比如现在已经比较明确的GAS5和miRNA21都预测不到，而且人血清中存在多达1000个circRNAs，还有一定的变化，导致circRNAs无法有效利用，同时circRNAs的检测和分析已成为其应用的关键问题，现有测序法操作复杂，费用贵，测序深度有限，效率较低，导致circRNAs 的检测变数较大；目前已有一些关于circRNAs作为癌症分子标志物的研究，但是仅是存在可能性，比如科学家发现结直肠癌患者大部分新的circRNAs表达上调，在胃癌中有的circRNAs表达下调；有研究者在EMT中发现，上百种circRNA的表达受TGF-β的影响，比如，DOCK1是一种鸟苷酸交换因子（GEF），可激活Rac以提高细胞活性，使用TGF-β诱导EMT过程后，上皮细胞中含量最为丰富的DOCK1 circRNA水平下降了30倍，而DOCK1 mRNA水平则上升了2倍，提示这一circRNA的功能之一可能是引起上皮细胞中mRNA的下调，然而，鉴于上皮细胞中含有大量的DOCK1 circRNA，其很可能还有其他方面的功能，总而言之，circRNA在EMT中的确切作用及相关机制仍有待进一步明确。虽然circRNA具有保守性和稳定性，但目前检测和定性circRNA的方法仍有局限性，不同的生物信息学方法或测序数据造成circRNA的识别出现偏倚；因此针对活动性肺结核病，研发合适的特异性circRNAs作为标志物在调控基因转录、作为疾病诊断标志物等方面具有重要的研究和临床意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种作为针对活动性肺结核病特异性标志物的circRNAs及其应用。本发明首次公开了两个circRNAs作为活动性肺结核病特异性标志物，表达谱的变化具有组织和细胞特异性，同时具有很高的稳定性；利用临床上比较容易直接获得的全血标本，结合设计的引物对进行RT-qPCR验证circRNAs的差异表达，具有快速、简单、省时、检测灵敏度高，样品消耗少的优点，是非常适合的利用差异表达的circRNAs诊断活动性肺结核病的方法。
本发明的技术方案如下：
circRNAs作为活动性肺结核病特异性标志物的应用；所述circRNAs为circRNA-00074或者circRNA-14623。
circRNAs在制备活动性肺结核病特异性标志物中的应用；所述circRNAs为circRNA-00074或者circRNA-14623。
circRNAs在制备活动性肺结核病特异性诊断试剂中的应用；所述circRNAs为circRNA-00074或者circRNA-14623。
本发明中，通过检测人体全血样本中的circRNA-00074或者circRNA-14623的表达情况即可诊断活动性肺结核病，与现有临床检测手段结果吻合。
本发明公开了活动性肺结核病诊断试剂盒，该试剂盒含有能够对circRNAs的表达量进行定量的试剂，所述circRNAs为circRNA-00074或者circRNA-14623；优选的，所述能够对circRNAs的表达量进行定量的试剂包括RT-qPCR引物对；所述RT-qPCR引物对的序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或者SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4。
本发明还公开了活动性肺结核病诊断试剂盒在制备活动性肺结核病诊断试剂中的应用，该试剂盒含有能够对circRNAs的表达量进行定量的试剂，所述circRNAs为circRNA-00074或者circRNA-14623；优选的，所述能够对circRNAs的表达量进行定量的试剂包括RT-qPCR引物对；所述RT-qPCR引物对的序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或者SEQID NO：3、SEQ ID NO：4。
本发明公开了能够对circRNAs的表达量进行定量的试剂在制备活动性肺结核病诊断试剂盒中的应用或者能够对circRNAs的表达量进行定量的试剂在制备活动性肺结核病诊断试剂中的应用，所述circRNAs为circRNA-00074或者circRNA-14623；优选的，所述能够对circRNAs的表达量进行定量的试剂包括RT-qPCR引物对；所述RT-qPCR引物对的序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或者SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4。
本发明通过提取活动性肺结核病患者和健康对照者全血样本的总RNA，设计RT-qPCR特异性引物，并RT-qPCR验证活动性肺结核病特异性circRNAs的表达情况，发现在活动性肺结核病人和正常健康人中检测circRNA-00074和circRNA-14623的表达量，结果显示在肺结核病人中两个circRNAs都发生了显著性的上调表达；由此说明，通过检测circRNA-00074或者circRNA-14623的表达水平，可以有效区分活动性肺结核病人和正常健康人。
本发明中，circRNA-00074序列为SEQ ID NO：5，具体如下：
gtgggagatgagggagcaggccacttcgtgaagatggtgcacaacgggatagagtatggggacatgcagctgatctgtgaggcataccacctgatgaaagacgtgctgggcatggcgcaggacgagatggcccaggcctttgaggattggaataagacagagctagactcattcctgattgaaatcacagccaatattctcaagttccaagacaccgatggcaaacacctgctgccaaagatcagggacagcgcggggcagaagggcacagggaagtggaccgccatctccgccctggaatacggcgtacccgtcaccctcattg
所述circRNA-14623序列为SEQ ID NO：6，具体如下：
aaaaagaagacacgactgataacatctgagaggaaggaaactgcattgtgctggggatctgcatgtcacattataaaaagcaatttttttttttaatagaaccagcctttcaaacagtttccagagatggattatcctactttacttttggctcttcttcatgtatacagagctctatgtgaagaggtgctttggcatacatcagttccctttgccgagaacatgtctctagaatgtgtgtatccatcaatgggcatcttaacacaggtggagtggttcaagatcgggacccagcaggattccatagccattttcagccctactcatggcatggtcataaggaagccctatgctgagagggtttactttttgaattcaacgatggcttccaataacatgactcttttctttcggaatgcctctgaagatgatgttggctactattcctgctctctttacacttacccacagggaacttggcagaaggtgatacaggtggttcagtcaggtaagggcaagttttttttttttttaaatccctttttatccacttacaacatttatttctataaagcccaagtagaagctatagaatgtcttctcgtatttctgtggcattctccaattccatttctagatgctttgatgttactgctttgaaggagcaatcttgggagtctgtttcatttttctgactgtgctgttgtgtccgagtagaagtgcctttcaaatttgaatgtagtagaagaaagcacaggttttttgttgtcttaatgataacctgagccttgattaaactgatgttggcaacacatgggttcaggatcctttcagggttttatcacagtgacatagcaccattcccttctgctggacactccagcacccacatcaacccctgtgtgttcaaggttcttcctacagtaccaaatctaagtttgttttctttctttctttttctctttctttctttctctctctctctttctttcttttctttcctttctttcctgtctttctttcttcttccttcttttttttttttttttttttttttttttgatggagtcttgctctgtcaccaggctggagtacagtagcatgatcttggctcactgcaacctccagctcctgggctcaagcgattctcctacctcagccccgcaagtagctgggactacaggtgtgcaccgccacgtgatatggtttgaattcccatgtgttgtgggagggacctggtgggaggtaattgaatcgtgcgggcaagtctttcccatgctgtcctcatgatagtgcataagtctcatgagatctgatggtttaaaaaagaggagttcccctgcactagctctctctgtttgcctgctgccatccatgtaagacgtgacttctccttgccttccaccttgattgtgaggcttccccagacatgtggtgctgtaagtccaattaaacctctttcttttgtaaattgcccagtcttgggaatatcttcatcagcagggtgaaaacggactaatacaccatgccaggctgattgttgtattttttgtagagatgaggtttcaacatgttgcccaggctggtcttggactcctgagttcaagtgatccaactgcctcggcctcccagagtgccaggattactggcatgaaccaccaagcttggccctggctctatctttcacctcatccaggtttagctagagaggacactttcttcataaattgtgagctgtggtgtcagaaagaacccaatgatcccttggagtgttttttgctttatctaccagagattgtggttttgtctttctagtgatgactacatgaactggttgtagtatattggaaacacttgggtttatagtcatcactttccatcaacctggtgttagttgctcgatccctctgaatctcaggttcctgaagaggaaatggggttggtagtgccattctacttgttgaatggctgagggacgatatatttaaagaacttggtccatggtagtcagagaatgatacatcttattatttcctatgcttgtgatccaaaaggactaataatgaaattttcagatattagtgacaatctaaagcagggaatatttttggaactgtgtgtttcttgtgtggtgtctctcaaattatactcatggctgtacagagaagaacattttatgacatctgacataatagtgctttatttttaagggatctgtgctctaaaagaacaagtacagaattatatgaggaatatcaaatggtcaggagataagaaacatcttcatatatttagttttccctttctctttaggtgtagctagggtgaagactaattttgtgtatatagctgaggcttatagagtgtcaatttacaatgtttctttagttaaatgtttatttattaaagactctgtttcaccatacaagtcctcatttgctgttgtatgtagacacctgttaaatcctgcttggaagtttttactgtgtagtttgctataaatcagtcaggcaggcgaagtagaagattggcaaagcttttaacatagactgagccattggaaacaaggcctgagccaccaaagctagaacaggatgcactccccactgctgccttgtgtggtatgcctttaaagtttgggttccaaattagctgttttggtttctgtcacaggacaaccaattgaaaacagctcaacctttcaggatagaggatggagctaacctgtagagaactaaatgatggttgttatgcaaaggtaggatttttaacatcacatatgaatagtcttcggaatatttcctgttgttttcatccagatttgtcattactgctagtttttgaggttaggaaaagagagctgtcaccttcatggggcttaaaaaaatacaatgtggagattttcagtcagttttcagtcagaggaaggaataccggctgtccgtctagtttgaattcttcatgatggtatccttagccatgatccattgctcttgttttgattatttgtattttaaagagcagattgatgcaatgggctagtgagggcattctaccctattttgagagtttgagagcttcacttttttaaactaagaatgatagtgagtttaaaaaatattagttgtatttcaaaattaaccttaggtgtgcttgaaattttcttatgtacttcagtaacaacatactgggattgcaaatattgtacttttgtatactgtaaagggggagttgaaaatacattaaatagtaaaaaaaaaaaaaaaaagacttggaatctagaaatcctagtttgtataatggattgtaagaacttcagaaggatgaaggagttgggccctatgctctgtaaatatgttgattttttgctatttattgatagcttattatgtgcggaattttacatagtctggatcttcatagacttcctccttgaatctcctgtgtgcacttgaacgtttgtattgcctgattttacagatgatgacattgaagtgcagtgaggtctagtagtctttccaaggccctaagtttcacgtatgtcccagcagataaagttgcaaattgatgtaactgtcagcctgggggacatgggaacccaccagggcccttgaagaaggagaccttggcctttgtacctcctatcaatgctacccctctccagctttcagcctagagtttaagagcaaacaggacatcttattctgaataaatggtactactaatacaaagttatttgaaaatatgtgttctttccagaacaggcatttcttcattagcaattgatttagagactctgatggtaagaataaatgcatttgtttttacctagtttgtgagaaaatatgcagagatgacttgggggaccacattttccagatagccctttctagcagagtttgtgaggtcatggagaaaactactgtcacctacgtgtctctggctttattagtcagttaaagcaaatatagttgcatttacagaaatacccccaaaatgagtgacccactcagaatgctctgccacctagtgtttactgggtgcctgctctgtaggatgcaactgcgtgtcatttcatttaatccttatgaagcactatggggaggtaatatgttcccgtaatacaacagaagacactgaggttcagggtggtagactcacttgtccaaggttatcaagctgccaagtggcagcaccagaatgaccccagttgatttttctgaagagccagagatcttaactccagtggaatgaaccagggagggccatggtagagaaaagtcgtgctggaccttgaagaattggaaggaatattttaattagagaggccggggtctggggaagagagaagacagagagggaagggtgtcctgggggtactgatggcttaaagaagggcacagtggaggtgtaaagttcatgtaagaggcagagcctggccttctctgactagggcactggatttggataagatgtggttctcaccctgggctctgaggccccctacacccacagaggtggcctgagaggcagcctcccaggaaaggaagacactgtgagagtgagactctctccctgcatgcaccagcaaaggggctcagcttatgatactttagagtttcaggaaaagctttagtacagtagattctgtgcttgaaaaaggagttgcagctcactagggcagcagaatgtcagaaataaacccgaaaagttattgatgtgcctaatggaattttgacttctgtctgtaatgcagaccaggggacatctctgactagtttttagagagacacacaaaataaaaccagatttttctttcaccacctaaaagattacactagctgcagtcttttaggagagtaagagtttgcaggcaaggtaagcaaataggcatctgtagattggaacctttacacactgctagcaggaggattaattggtatctctattattttagtcaggcttctccagagaaagagaaccaatgtgtatatacatgg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本发明中，circRNAs相对表达量分析采用GraphPad Prism 5软件，采用软件中单样本T检验和独立样本T检验，P < 0.05时，认为结果在统计学上具有显著性差异，P < 0.01时，结果在统计学上具有极显著性差异。研究发现，相对健康人样本，活动性肺结核病人circRNA-00074和circRNA-14623的表达量都发生了显著性的上调表达，在统计学上具有极显著性差异，可以说明circRNA-00074或者circRNA-14623可以作为活动性肺结核病特异性标志物用于诊断。
附图说明
图1为circRNA-00074在肺结核病人和正常健康人之间的差异表达图；
图2为circRNA-14623在肺结核病人和正常健康人之间的差异表达图。
具体实施方式
总RNA提取试剂盒购自Ambion公司；RT-qPCR反转录试剂盒购自Fermentas公司；SYBR system Mix购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司；96孔板及膜购自Axygen公司。
实施例一 活动性肺结核病人circRNA-00074和circRNA-14623的表达量都发生了显著性的上调表达
A1：收集20例临床确诊的活动性肺结核患者和20例健康对照者。所有参加者血样为晨起空腹抽取，采用一次性真空EDTA抗凝采血管，采集外周血3.0 mL，颠倒混匀；加入 3 倍体积红细胞裂解液（300μL血液加入 900 μL红细胞裂解液），颠倒混匀，室温放10 min，期间颠倒几次； 3000 rpm 离心10 min，弃上清。用1 mL的红细胞裂解液，轻轻悬浮；3000 rpm 离心 5 min，弃上清；用1 mL的TRIzol Reagent，轻轻悬浮，-80℃冰箱保存。
A2：将活动性肺结核病患者和健康对照者含有白细胞的TRIzol Reagent样本于-80 ℃中取出，待4 ℃自然溶解；加入等体积酚氯仿，最大转速室温离心 10 min。取上清；加1.25倍体积 100%乙醇；将混合液加入柱子中，室温，13000 rpm，1 min，弃流过液；加 350 μL miRNA Wash Solution 1 (mirVana™ miRNA ISOlation Kit，Ambion-1561) 到离心柱中，13000 rpm，1 min。弃流过液，将离心柱重新放置到收集管中；混合10 μL DNase I 和70 μL Buffer RDD QIAGEN (#79254) 总体积：80 μL，加到离心柱中的膜上，室温放置10min；加350 μL miRNA Wash Solution 1 到离心柱中，13000 rpm，1 min。弃流过液，将离心柱重新放置到收集管中；500 μL Wash Solution 2/3 过柱两次，13000 rpm，1 min。弃流过液，将离心柱重新放置到收集管中；空柱离心 1 min，将离心柱放置到新的收集管中，柱中心加 100 μL 95℃预热的Elution Solution，放置 3 min，室温最高转速离心 30 s，收集管中的液体即为提取的总 RNA，可放置在-70℃保存。
取活动性肺结核病患者和健康对照者总RNA样本1.0 μL，经安捷伦生物分析仪器nanodrop-2000检测OD值，在紫外分光光度计上测定A260/A280数值，测定结果总RNA浓度在5～10 ng/μL之间，A260/A280数值在1.2～1.9之间，表示总RNA的纯度较好，无蛋白或者时其他有机物的污染亦无总RNA降解。
A3：设计circRNAs RT-qPCR引物对
RT-qPCR引物长度21bp左右，退火温度Tm值在60 ℃左右，GC含量约40%-60%；引物对的序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或者SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4，参见表1。
以内参β-actin在活动性肺结核病患者全血样本中扩增为例，观察扩增情况，扩增曲线平滑且随着循环数的增加，荧光信号具有明显的对数期，而空白对照无连续曲线生成，说明扩增情况良好。对扩增的circRNAs产物做溶解曲线，有且只有一个明显的单峰，而无模板对照无明显波峰出现，说明经扩增后产物是特异的circRNAs，即此定量无污染，准确，可靠。
表1 RT-qPCR引物
Primers Sequence (5'to3') nt
circRNA-00074-上游 ATACTCTATCCCGTTGTGCAC 21 SEQ ID NO：1
circRNA-00074-下游 AGAAGGGCACAGGGAAGTG 19 SEQ ID NO：2
circRNA-14623-上游 CAATGCAGTTTCCTTCCTCTC 21 SEQ ID NO：3
circRNA-14623-下游 GGCTGAATTGATAGAGAATGG 21 SEQ ID NO：4
β-actin-上游 TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGT 26
β-actin-下游 CCTAGAAGCATTTGCGGTGCACGATG 26
A4：活动性肺结核病诊断试剂盒RT-qPCR活动性肺结核病相关的特异性circRNAs
用Fermentas反转录试剂盒进行反转录，反转录反应体系：总RNA 2.5 μL，RNase 抑制剂RRI 0.25 μL，dNTP（10mM each）0.5 μL，5×M-MuLV buffer 1.0 μL，随机引物（2 µM）0.5μL，M-MuLV反转录酶0.25 μL，总体积5 μL。分两步方法进行，第一步：65℃，5 min；冰上，15min；第二步：42℃，60 min；70℃，10 min；反应完毕后，保存于-80℃冰箱。
RT-qPCR体系：ddH2O 7 μL，SYBR system Mix 10 μL，50*ROX refenence dye 0.4μL，上游引物（10 µM）/ 下游引物（10µM）0.8 μL，模板cDNA1 μL，总体积20 μL；混匀后稍离心，在CFX96 荧光定量PCR 仪中进行荧光定量PCR反应，反应参数设置为：95 ℃ 60 s，然后95 ℃5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。
circRNAs荧光定量数据分析以β-actin为内参基因，对目标基因进行归一化处理，已确保相等数量的样品中比较目标基因的量。circRNAs表达倍数的变化公式为RQ = 2-△△CT，其中△△CT =（CTlncRNA-CTβ-actin）OC-（CTlncRNA-CTβ-actin）Mean ON。RQ代表相对表达变化量，CTlncRNA 和CTβ-actin分别代表同个样本中目标lncRNA和内参基因β-actin的Ct值，OC代表活动性肺结核病患者，ON代表健康对照者，Mean ON代表所有正常对照组中的平均值。实验设立阴性对照和重复实验，阴性对照为反应体系中不加cDNA模板，以ddH2O代替，所有荧光定量PCR均做3次重复。circRNAs相对表达量分析采用GraphPad Prism 5软件，采用软件中单样本T检验和独立样本T检验。P < 0.05时，认为结果在统计学上具有显著性差异，P <0.01时，结果在统计学上具有极显著性差异，差异表达的circRNAs数据处理结果以平均值±标准误表示，绘制含误差线的散点图。
分别在20例肺结核病人和20例正常健康人中检测circRNA-00074和circRNA-14623的表达量，结果显示在肺结核病人中两个circRNAs都发生了显著性的上调表达，circRNA-00074和circRNA-14623的表达量差异分别见附图1、附图2，表达差异在2倍以上；P< 0.01。
实施例二 验证circRNA-00074和circRNA-14623的表达上调特异性
A1：收集20例临床确诊的肺炎非肺结核患者和20例临床确诊的肺癌非肺结核患者。所有参加者血样为晨起空腹抽取，采用一次性真空EDTA抗凝采血管，采集外周血3.0 mL，颠倒混匀；加入 3 倍体积红细胞裂解液（300 μL血液加入 900 μL红细胞裂解液），颠倒混匀，室温放10 min，期间颠倒几次； 3000 rpm 离心10 min，弃上清。用1 mL的红细胞裂解液，轻轻悬浮；3000 rpm 离心 5 min，弃上清；用1 mL的TRIzol Reagent，轻轻悬浮，-80℃冰箱保存。
A2：将患者含有白细胞的TRIzol Reagent样本于-80 ℃中取出，待4 ℃自然溶解；加入等体积酚氯仿，最大转速室温离心 10 min。取上清；加1.25倍体积 100%乙醇；将混合液加入柱子中，室温，13000 rpm，1 min，弃流过液；加 350 μL miRNA Wash Solution 1(mirVana™ miRNA ISOlation Kit，Ambion-1561) 到离心柱中，13000 rpm，1 min。弃流过液，将离心柱重新放置到收集管中；混合10 μL DNase I 和 70 μL Buffer RDD QIAGEN (#79254) 总体积：80 μL，加到离心柱中的膜上，室温放置10 min；加350 μL miRNA WashSolution 1 到离心柱中，13000 rpm，1 min。弃流过液，将离心柱重新放置到收集管中；500μL Wash Solution 2/3 过柱两次，13000 rpm，1 min。弃流过液，将离心柱重新放置到收集管中；空柱离心 1 min，将离心柱放置到新的收集管中，柱中心加 100 μL 95℃预热的Elution Solution，放置 3 min，室温最高转速离心 30 s，收集管中的液体即为提取的总RNA，可放置在-70℃保存。取患者总RNA样本1.0 μL，经安捷伦生物分析仪器nanodrop-2000检测OD值，在紫外分光光度计上测定A260/A280数值，测定结果总RNA浓度在5～10ng/μL之间，A260/A280数值在1.2～1.9之间，表示总RNA的纯度较好，无蛋白或者时其他有机物的污染亦无总RNA降解。
A3：设计circRNAs RT-qPCR引物对
如实施例一。
A4：用Fermentas反转录试剂盒进行反转录，反转录反应体系：总RNA 2.5 μL，RNase 抑制剂RRI 0.25 μL，dNTP（10mM each）0.5 μL，5×M-MuLV buffer 1.0 μL，随机引物（2 µM）0.5 μL，M-MuLV反转录酶0.25 μL，总体积5 μL。分两步方法进行，第一步：65℃，5min；冰上，15 min；第二步：42℃，60 min；70℃，10 min；反应完毕后，保存于-80℃冰箱。
RT-qPCR体系：ddH2O 7 μL，SYBR system Mix 10 μL，50*ROX refenence dye 0.4μL，上游引物（10 µM）/ 下游引物（10µM）0.8 μL，模板cDNA1 μL，总体积20 μL；混匀后稍离心，在CFX96 荧光定量PCR 仪中进行荧光定量PCR反应，反应参数设置为：95 ℃ 60 s，然后95 ℃5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。
分别在肺炎病人和肺癌病人中检测circRNA-00074和circRNA-14623的表达量，结果显示在肺炎病人和肺癌病人中两个都没有发生上调表达，与健康人相比。
本发明公开的活动性肺结核病特异性circRNAs，利用设计的引物对进行RT-qPCR方法验证得到差异表达量，获得活动性肺结核病特异性circRNAs标志物，对研究控制肺结核病传播，降低肺结核病的发生率具有重要的意义。
序列表
<110> 苏州大学附属第一医院
<120> circRNAs作为活动性肺结核病特异性标志物的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
atactctatc ccgttgtgca c 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
agaagggcac agggaagtg 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
caatgcagtt tccttcctct c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
ggctgaattg atagagaatg g 21
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
tcatgaagtg tgacgttgac atccgt 26
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 6
cctagaagca tttgcggtgc acgatg 26
<210> 7
<211> 325
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 7
gtgggagatg agggagcagg ccacttcgtg aagatggtgc acaacgggat agagtatggg 60
gacatgcagc tgatctgtga ggcataccac ctgatgaaag acgtgctggg catggcgcag 120
gacgagatgg cccaggcctt tgaggattgg aataagacag agctagactc attcctgatt 180
gaaatcacag ccaatattct caagttccaa gacaccgatg gcaaacacct gctgccaaag 240
atcagggaca gcgcggggca gaagggcaca gggaagtgga ccgccatctc cgccctggaa 300
tacggcgtac ccgtcaccct cattg 325
<210> 8
<211> 11510
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 8
aaaaagaaga cacgactgat aacatctgag aggaaggaaa ctgcattgtg ctggggatct 60
gcatgtcaca ttataaaaag caattttttt ttttaataga accagccttt caaacagttt 120
ccagagatgg attatcctac tttacttttg gctcttcttc atgtatacag agctctatgt 180
gaagaggtgc tttggcatac atcagttccc tttgccgaga acatgtctct agaatgtgtg 240
tatccatcaa tgggcatctt aacacaggtg gagtggttca agatcgggac ccagcaggat 300
tccatagcca ttttcagccc tactcatggc atggtcataa ggaagcccta tgctgagagg 360
gtttactttt tgaattcaac gatggcttcc aataacatga ctcttttctt tcggaatgcc 420
tctgaagatg atgttggcta ctattcctgc tctctttaca cttacccaca gggaacttgg 480
cagaaggtga tacaggtggt tcagtcaggt aagggcaagt tttttttttt tttaaatccc 540
tttttatcca cttacaacat ttatttctat aaagcccaag tagaagctat agaatgtctt 600
ctcgtatttc tgtggcattc tccaattcca tttctagatg ctttgatgtt actgctttga 660
aggagcaatc ttgggagtct gtttcatttt tctgactgtg ctgttgtgtc cgagtagaag 720
tgcctttcaa atttgaatgt agtagaagaa agcacaggtt ttttgttgtc ttaatgataa 780
cctgagcctt gattaaactg atgttggcaa cacatgggtt caggatcctt tcagggtttt 840
atcacagtga catagcacca ttcccttctg ctggacactc cagcacccac atcaacccct 900
gtgtgttcaa ggttcttcct acagtaccaa atctaagttt gttttctttc tttctttttc 960
tctttctttc tttctctctc tctctttctt tcttttcttt cctttctttc ctgtctttct 1020
ttcttcttcc ttcttttttt tttttttttt tttttttttt tgatggagtc ttgctctgtc 1080
accaggctgg agtacagtag catgatcttg gctcactgca acctccagct cctgggctca 1140
agcgattctc ctacctcagc cccgcaagta gctgggacta caggtgtgca ccgccacgtg 1200
atatggtttg aattcccatg tgttgtggga gggacctggt gggaggtaat tgaatcgtgc 1260
gggcaagtct ttcccatgct gtcctcatga tagtgcataa gtctcatgag atctgatggt 1320
ttaaaaaaga ggagttcccc tgcactagct ctctctgttt gcctgctgcc atccatgtaa 1380
gacgtgactt ctccttgcct tccaccttga ttgtgaggct tccccagaca tgtggtgctg 1440
taagtccaat taaacctctt tcttttgtaa attgcccagt cttgggaata tcttcatcag 1500
cagggtgaaa acggactaat acaccatgcc aggctgattg ttgtattttt tgtagagatg 1560
aggtttcaac atgttgccca ggctggtctt ggactcctga gttcaagtga tccaactgcc 1620
tcggcctccc agagtgccag gattactggc atgaaccacc aagcttggcc ctggctctat 1680
ctttcacctc atccaggttt agctagagag gacactttct tcataaattg tgagctgtgg 1740
tgtcagaaag aacccaatga tcccttggag tgttttttgc tttatctacc agagattgtg 1800
gttttgtctt tctagtgatg actacatgaa ctggttgtag tatattggaa acacttgggt 1860
ttatagtcat cactttccat caacctggtg ttagttgctc gatccctctg aatctcaggt 1920
tcctgaagag gaaatggggt tggtagtgcc attctacttg ttgaatggct gagggacgat 1980
atatttaaag aacttggtcc atggtagtca gagaatgata catcttatta tttcctatgc 2040
ttgtgatcca aaaggactaa taatgaaatt ttcagatatt agtgacaatc taaagcaggg 2100
aatatttttg gaactgtgtg tttcttgtgt ggtgtctctc aaattatact catggctgta 2160
cagagaagaa cattttatga catctgacat aatagtgctt tatttttaag ggatctgtgc 2220
tctaaaagaa caagtacaga attatatgag gaatatcaaa tggtcaggag ataagaaaca 2280
tcttcatata tttagttttc cctttctctt taggtgtagc tagggtgaag actaattttg 2340
tgtatatagc tgaggcttat agagtgtcaa tttacaatgt ttctttagtt aaatgtttat 2400
ttattaaaga ctctgtttca ccatacaagt cctcatttgc tgttgtatgt agacacctgt 2460
taaatcctgc ttggaagttt ttactgtgta gtttgctata aatcagtcag gcaggcgaag 2520
tagaagattg gcaaagcttt taacatagac tgagccattg gaaacaaggc ctgagccacc 2580
aaagctagaa caggatgcac tccccactgc tgccttgtgt ggtatgcctt taaagtttgg 2640
gttccaaatt agctgttttg gtttctgtca caggacaacc aattgaaaac agctcaacct 2700
ttcaggatag aggatggagc taacctgtag agaactaaat gatggttgtt atgcaaaggt 2760
aggattttta acatcacata tgaatagtct tcggaatatt tcctgttgtt ttcatccaga 2820
tttgtcatta ctgctagttt ttgaggttag gaaaagagag ctgtcacctt catggggctt 2880
aaaaaaatac aatgtggaga ttttcagtca gttttcagtc agaggaagga ataccggctg 2940
tccgtctagt ttgaattctt catgatggta tccttagcca tgatccattg ctcttgtttt 3000
gattatttgt attttaaaga gcagattgat gcaatgggct agtgagggca ttctacccta 3060
ttttgagagt ttgagagctt cactttttta aactaagaat gatagtgagt ttaaaaaata 3120
ttagttgtat ttcaaaatta accttaggtg tgcttgaaat tttcttatgt acttcagtaa 3180
caacatactg ggattgcaaa tattgtactt ttgtatactg taaaggggga gttgaaaata 3240
cattaaatag taaaaaaaaa aaaaaaaaga cttggaatct agaaatccta gtttgtataa 3300
tggattgtaa gaacttcaga aggatgaagg agttgggccc tatgctctgt aaatatgttg 3360
attttttgct atttattgat agcttattat gtgcggaatt ttacatagtc tggatcttca 3420
tagacttcct ccttgaatct cctgtgtgca cttgaacgtt tgtattgcct gattttacag 3480
atgatgacat tgaagtgcag tgaggtctag tagtctttcc aaggccctaa gtttcacgta 3540
tgtcccagca gataaagttg caaattgatg taactgtcag cctgggggac atgggaaccc 3600
accagggccc ttgaagaagg agaccttggc ctttgtacct cctatcaatg ctacccctct 3660
ccagctttca gcctagagtt taagagcaaa caggacatct tattctgaat aaatggtact 3720
actaatacaa agttatttga aaatatgtgt tctttccaga acaggcattt cttcattagc 3780
aattgattta gagactctga tggtaagaat aaatgcattt gtttttacct agtttgtgag 3840
aaaatatgca gagatgactt gggggaccac attttccaga tagccctttc tagcagagtt 3900
tgtgaggtca tggagaaaac tactgtcacc tacgtgtctc tggctttatt agtcagttaa 3960
agcaaatata gttgcattta cagaaatacc cccaaaatga gtgacccact cagaatgctc 4020
tgccacctag tgtttactgg gtgcctgctc tgtaggatgc aactgcgtgt catttcattt 4080
aatccttatg aagcactatg gggaggtaat atgttcccgt aatacaacag aagacactga 4140
ggttcagggt ggtagactca cttgtccaag gttatcaagc tgccaagtgg cagcaccaga 4200
atgaccccag ttgatttttc tgaagagcca gagatcttaa ctccagtgga atgaaccagg 4260
gagggccatg gtagagaaaa gtcgtgctgg accttgaaga attggaagga atattttaat 4320
tagagaggcc ggggtctggg gaagagagaa gacagagagg gaagggtgtc ctgggggtac 4380
tgatggctta aagaagggca cagtggaggt gtaaagttca tgtaagaggc agagcctggc 4440
cttctctgac tagggcactg gatttggata agatgtggtt ctcaccctgg gctctgaggc 4500
cccctacacc cacagaggtg gcctgagagg cagcctccca ggaaaggaag acactgtgag 4560
agtgagactc tctccctgca tgcaccagca aaggggctca gcttatgata ctttagagtt 4620
tcaggaaaag ctttagtaca gtagattctg tgcttgaaaa aggagttgca gctcactagg 4680
gcagcagaat gtcagaaata aacccgaaaa gttattgatg tgcctaatgg aattttgact 4740
tctgtctgta atgcagacca ggggacatct ctgactagtt tttagagaga cacacaaaat 4800
aaaaccagat ttttctttca ccacctaaaa gattacacta gctgcagtct tttaggagag 4860
taagagtttg caggcaaggt aagcaaatag gcatctgtag attggaacct ttacacactg 4920
ctagcaggag gattaattgg tatctctatt attttagtca ggcttctcca gagaaagaga 4980
accaatgtgt atatacatgg agatttatta taagaaattg gctcacatga tgtattagtc 5040
tattctcaca ctgctgtgaa gaaatactta agactgggta atttataagg gaaagaggtt 5100
taattgactc acagttcagt atggctgggg aggcctcagg aaacgtacaa tcatggtgaa 5160
aaggggagca aacatgtcct tcttcacatg gcagcaggaa ggagaagtgc agagtgaggt 5220
gggggaaaag ccccttataa aaccatcaga ttttgtgaga attcactcac tgtcaccaga 5280
acagcatgaa ggtgactggc cccatgattc agctacctcc caccgggtcc ttcccacaat 5340
acatggggat tatgggaact acaagatgag atttgggtgg ggaaacagcc aaattatatc 5400
attttgcccc tggcccctct gaaatctcat gccctcacat ttcaaaatac aaccataccc 5460
tcccaacagt cccccaaagt cttaactctt tccagcatta actgaaagtc cacagcccaa 5520
agtctcatct gagacaaggc aagtaccttc cgcctatgag cctgtaaaat caaaagcaag 5580
ttagttactt cctagataaa agaggggtac aggcattgga taaatacacc aattctaaat 5640
gagagaaatt ggccaaaaca aaggggctac tagctccatg caagtctgaa atcctgtagg 5700
gcagtcatta aaacttcaag ttccaaaaat gatctccttt gactccatgt cccacatcct 5760
gggcatgctg atgcaagagg tgggcaccca tggtcttggg cagctccacc cctctggcta 5820
tgcagggtac agcctcccct cttggctgct ttcacaggct ggtgttgagt gtctgtggct 5880
tctccagttg catggtgcaa gccgtctgtg gatcagattc agattgtggg gtctgaagga 5940
tggtggccct cttctcacag ctctactaga cagtgcccca gtggggattc tgtgtggggg 6000
ctccaacccc acatttccct gctgcagtgc cctagcagag gtcttccatg agggctctgc 6060
ccttgcagca acttctgaat ggacacccag gtgtttctgt acattttctg aagtctaggc 6120
agaggttctc aaaccacagt tcttgacttc tgtgcacccg caggcccaac accacgtgta 6180
agctgtcaag gcttggggct tgcaccctct gaagcaacag cctgagctgt atgttggccc 6240
cttttagccg tggctgggac atagggcacc atatgcagtc ccgaggctgc atagagcagg 6300
gggtcttagg cttggcccag gaaatcactt ttccctccta ggcttatgat ggaaggggct 6360
gccatgaagg tctctgacat gccttggaga cattttcccc attgtcttgg tgatttacat 6420
ttggctcctc attacttatg caaatttctg cagctggctg gaatttcttc ccagaaaatg 6480
tttttctttt ctgtcgcatc atcaggctgc aaattttcca aattttttat gctctgcttc 6540
ctcttgaatg ctttgcccct tagaagtttc ttctgccaga taccctaaat tatctctctc 6600
aagttcaaag ttccacagat ctctggggca ggggcaaaat gccaccaaac tctttgcata 6660
gcaagagtga cctttactcc atttcccaaa aagttcctca tctccatctg agaccacctc 6720
agcctggact tcattgttta tatcactgtc agcattttgg tcaatgtcat tcaacaaatt 6780
tctaggaagt tcccaaattt cccacatttt cctgtcttct tctgagccct caaaactgtt 6840
ccaacctcta cctgttaccc agttccaaag ttgctttcac acttgtggat atctttacag 6900
caaccctcca ctctctgctg tactcattta ctgtattact cagttttcat gctgctaata 6960
aagacatacc tgagacaggg taatttataa aggaaagagg tttaattgat tctcagttca 7020
gtatgggtgg ggaggcctca ggaaacttac aatcatggtg gaaggggaag caaatatgtc 7080
cttcacatgg tagcagggag aagaagagtg agtgcccaga gcaggggaag ccccttataa 7140
aaccatcaga tctcatgaga actaactcac tatcatgaga acaggatggg ggaaaccacc 7200
cccatgattc agttatctcc acctggtctc tcccacgaca cgtgagggtt atgggaacta 7260
caactcaaga tgagatttgg gtgggcacac ggccaaatta tatcatatga tcatggagac 7320
tgataagccc aaatttgcag tgtgggcttg caggctgcag acccaggaga gccgatggta 7380
caggtgaagc ccaggtcatc tgctgcagaa tccctcttgc ttggggaggc tggtcttttt 7440
gttgaattag gctcacctac attatggagg caaactgctt attcaaaatt caccaattta 7500
aatgttaatc tcatcccaaa acacccttca aattgacacg taaaattaac catcatacct 7560
gttttggaaa atgatatggc attagctagt taaaaacccc aaatcctatg atccaataat 7620
tctactctgt ttggtatcca agagttctct cattataggg aaaattcctg acaatattta 7680
tagcaacagt gattgcaata gcaaaaaatt ggtaacaacc caaataccca tcaacagtag 7740
aaccgaaaag cacactgagg tctattcaca cattaggata ctctacatca ctaaaatgag 7800
tgaattatca cttgctcacc gacatggatg aagctcatga actttgtgtt gaaagaaaag 7860
agcaagttac caaaaaaaat aggtaaacta gggttccttt tctttaaagg ttttagaaat 7920
atgcataatt aaacaatacg ttatttatag atacaaacgt ggtaaaacta taaagaaaag 7980
caaagttcag aaacatggta ggtgggggat agaatagaat caggaagggc tgaaagggtc 8040
tttaaggctc atagtcaggg tgttttcctt atacaggtgt tttattttgc atttgtctca 8100
aaatgtttta gaagatttct ttcaaatcta ctgatttctt tttcttttcc ttttttgaga 8160
cagagtctca ctctgttgcc caggctggag tgcagtggca tgatctcagc tcattgcaac 8220
ctctgcctcc tgggttcaag tggttctcct gcctcagcct cctgagtagc tgggattaca 8280
ggcctgcatc atcacaccca gctaattttt gtatttttgt agagatgggg gttttgccat 8340
gttggccagg ctgatctcaa actcctgacc tcaggtgatc caccccacct tggcctccca 8400
aagtgctgga attacaggca taggccacct tgcctggcca aatctactga tttctaatgg 8460
tgaaaagaga tgtgattgca atttttgagc agttgaaagc tctaaggtaa ggatgaaatc 8520
ttcattctga tatggcctgg gggccaggta gaggtaagtt tcagcaatgg tttcaaattt 8580
ttatgatcca aggactaaaa aatgatgatt ttagtgaaaa agatgtgaaa ttaagagacc 8640
aacttggcta gcaagagtgg aattaagtct gtttcaggtg tattaaattg taaagtagcc 8700
tttgaccagc tgacaattga aattatggaa caacaaacca ggattgaaaa tatccaattt 8760
gaagtcatct gaatgatcat ccagcacatg tggatggatg gggttaacta agaaagtacc 8820
aatggatggg ggcagaagtc taaggtcata gcttgtggct tggaggatgg tcacattgta 8880
gtgtgttaaa gaaggtgttc atgttaaaga atgtagaggg catagagaaa agagggggag 8940
agttgggagg gagaggaaag tgaacaggtg aattattgat gtgagagcag aagacacata 9000
gaactcatat ttatagtaga gggttagatt ttcttgctcc acacatgcag gtactttgtg 9060
ttggctgtat tgtatgtttg ctgactctgt gatctcccat attccagtcc atttatctca 9120
aactgggcac agagatgttc ctcactgttt ccctttaaga gtctcattct ctcccaggtg 9180
ggatgaggct ccttatatgc catccatgct cattcttaga aggctcttat ctctacaccc 9240
ttcagggaca agtgttctct gtccaggttc ccagcagctg acatagcagc caaagttttc 9300
tttcattctt gtatatatct gctggttagt ggcactaaag agattccttt aatattaagg 9360
gctccagaat tgatggcagt tctgaggaat cctatgatga aagggattct aaagatcatg 9420
ctggcctata tattagttga gggcagcatg gccaacattt ttctaatgct ggggtataat 9480
ctcagccttt aaatttgatt taaagctggg gagagggaag tgtctcaaat ctggctttta 9540
taaatgggtg tgctgatttg caggagctga acccacttat ccattaattc actcatcaag 9600
tctttcctga gaatctacaa tgtacaatgt aatgttcagt ggtttggaag atagaaagac 9660
atagatctta gctctaaata ggatgtagaa tattgggaga gagaaaagtt tatatcacaa 9720
attattattt gaggcaaaaa aataagtcgc attgtagtct agaggatata attttatttt 9780
acctaggaaa ttcagggcag agtccctgaa aaagtggaat ttgaactgcc aacccagaaa 9840
atttggatgt tgagattaat aggcactatt ccaggagaat tgctttagaa aattatctag 9900
aaaatagaca gctattttct agatagtagg ctccagtgta acctactttg gaagataatt 9960
ttcattgttc aaaaggaccc caacaacaaa acaccaaaaa cctctaaaat tgaaccaaca 10020
catagaattg atcaacaaat taaagcaatt tattccggtt tacaattcat ggcttggttg 10080
acatgttgaa ttgctgcttc aaaaggcaag ggaagccaga tgcactatgc aattgtattt 10140
tacaacctat cttacggtat ttgcacactt tcatttcggc ttttgttttg cctatcccaa 10200
attcagaagg aaggaagaaa acatacgaaa atgacactat catatctatt aatgacaggt 10260
gaaagtgatg gaggaggaga tttggtctga aaggctattg cctgtcaaag gaaatttcaa 10320
acaaggttaa gaaggccaca gagaaagagt ctttcttatt ctcctgttat aagggtcacc 10380
aattcctgct agcttcctta gtccttgtgt agaccttttt cagttttgtc tatcatatgt 10440
atctctatca cttttaattt tcttaagtca gatggagaaa taagaaaaaa agtcattcca 10500
agtcaactga ttagagaatg aagccataag ctctctcttc aggcccattc tggtgagatt 10560
agaaataagt cataaaggtt ttatatatcc atgtgtgtgt gtatgcatgc acacacacaa 10620
gactaaaaaa tgttacattt tagcagtttt tcatttaaag aaaaaaatac taaatggtac 10680
ctataaggaa tccacaaggg atgaagcaga aacattttaa aggcttaaaa atctcactcc 10740
gtaatgaaat aaaatagtat ataaagaagg cagacgataa aaaacatttt aagactcaca 10800
gaaagcaagg ttatggtcac tgcacttctc aagggtgaag taaatgggaa actgaaagtg 10860
gatggttacc agaacgtgtg ccaaggttgt ttttatccac gtgctttccc tgtgctaagc 10920
ccaggaagga acaggcacaa gaacacatgt cactgtggga atcaaccctc aggctttcag 10980
gcaaagctct gtaatcaaaa atcaaaaaaa aagagaaagt ttaaaaactc tctaaagcca 11040
gataatacta aatttatata cacaattgaa ttcaataatc gaatggctga tacagtggaa 11100
ttcacgtaca ggcacgggta caggcttgga tttttgggga ttgagattgt ccgtctgtct 11160
cgatgcctgg gtttctctct acctccttca cctcctttat gccccgtgag acaccccagt 11220
ctttgacact tctgagctgt agcaaaatcc agaggaaact tttactttgg gcttgttgtc 11280
aaatgcagtc aggcgagcca gagcagggag tggaattggc tgccatcttt gtgtgcagcc 11340
attttgttta tttatactac ctatgtaaac ttgaaactgt acccttctta ttgtaggtat 11400
ttatattttc aagatgattg tagagtaggg gtatgcttgg ctgaattgat agagaatggg 11460
ctacagctga agcttcggac actgattctc ctgtgacctc agaacattct 11510

Claims (10)

1.circRNAs作为活动性肺结核病特异性标志物的应用；所述circRNAs为circRNA-00074或者circRNA-14623。
2. circRNAs在制备活动性肺结核病特异性标志物中的应用；所述circRNAs为circRNA-00074或者circRNA-14623。
3. circRNAs在制备活动性肺结核病特异性诊断试剂中的应用；所述circRNAs为circRNA-00074或者circRNA-14623。
4.活动性肺结核病诊断试剂盒，所述试剂盒含有能够对circRNAs的表达量进行定量的试剂，所述circRNAs为circRNA-00074或者circRNA-14623。
5. 根据权利要求4所述活动性肺结核病诊断试剂盒，其特征在于，所述能够对circRNAs的表达量进行定量的试剂包括RT-qPCR引物对；所述RT-qPCR引物对的序列为SEQID NO：1、SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4。
6. 根据权利要求4所述活动性肺结核病诊断试剂盒，其特征在于，所述circRNA-00074的序列为SEQ ID NO：5；所述circRNA-14623的序列为SEQ ID NO：6。
7.权利要求4所述活动性肺结核病诊断试剂盒在制备活动性肺结核病诊断试剂中的应用。
8.能够对circRNAs的表达量进行定量的试剂在制备活动性肺结核病诊断试剂盒中的应用或者能够对circRNAs的表达量进行定量的试剂在制备活动性肺结核病诊断试剂中的应用，所述circRNAs为circRNA-00074或者circRNA-14623。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述能够对circRNAs的表达量进行定量的试剂包括RT-qPCR引物对；所述RT-qPCR引物对的序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4。
10. 根据权利要求1、2、3、7或者8所述的应用，其特征在于，所述circRNA-00074的序列为SEQ ID NO：5；所述circRNA-14623的序列为SEQ ID NO：6。
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WO2017046203A1 (en) * 2015-09-15 2017-03-23 Luxembourg Institute Of Health (Lih) Biomarkers for heart failure
CN107022605A (zh) * 2017-02-27 2017-08-08 广东医科大学 一种活动性肺结核的生物标志物

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Title
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