CN107651664B - 一种荧光碳纳米粒子及用作细胞标记材料的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种荧光碳纳米粒子及用作细胞标记材料的用途。荧光碳纳米粒子通过如下方法制备：先将岩藻多糖和草酸溶于蒸馏水中，再进行水热反应，反应温度为180‑220℃，反应时间为14‑18h，最后离心、洗涤、干燥、煅烧、研磨；其中，草酸质量浓度为15‑25g/L。本发明提供的荧光碳纳米粒子采用常规的水热法即可生产，工艺可控性强，设备常见，整个生产成本低，易于工业化大生产；该荧光碳纳米粒子持续发光时间长，可达到72小时，可以满足科研中对细胞长时间观察的需要。

Description

一种荧光碳纳米粒子及用作细胞标记材料的用途
技术领域
本发明属于材料领域，具体涉及一种荧光碳纳米粒子及用作细胞标记材料的用途。
背景技术
以碳为基础的纳米材料，包括碳纳米管、纳米金刚石、富勒烯、纳米碳纤维和碳量子点等，在纳米技术、生物传感、生物标记以及作为药物载体等方面都有着潜在的应用价值。碳纳米粒子作为一种新的碳纳米材料，也引起了人们的极大关注。Sun等人曾用激光消蚀法获得了多种尺寸的碳纳米颗粒，经表面钝化处理，使碳纳米颗粒发出了较强的可见光并用于生物标记(Sun Y P,Zhou B,Lin Y et al.Quantum-sized carbon dots forbright and colourful photoluminescence.J.Am.Chem.Soc.,2006,128:7756-7757)。
但是，Sun等公开的方案有两个不足，决定其难以推广使用：
第一，激光消蚀法成本高，工艺要求高，设备投资高；
第二，经测试，其得到的碳纳米颗粒发光时间短，不超过24小时；但是，细胞标记领域对细胞的观察时间较长，发光时间达到72小时才能更符合科研需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种荧光碳纳米粒子及用作细胞标记材料的用途，以提供一种易于工业化生产、成本低、发光时间持续时间长的荧光碳纳米粒子。
本发明由如下技术方案得以实现：
一种荧光碳纳米粒子，通过如下方法制备：先将岩藻多糖和草酸溶于蒸馏水中，再进行水热反应，反应温度为180-220℃，反应时间为14-18h，最后离心、洗涤、干燥、煅烧、研磨；其中，草酸质量浓度为15-25g/L。
优选地，水热反应体系还含有有效浓度的生物交联剂京尼平。
优选地，岩藻多糖质量浓度为80-150g/L。
优选地，先将草酸溶于蒸馏水中配置成草酸溶液，再加入所述岩藻多糖搅拌溶解。
优选地，所述水热反应的温度为200℃，反应时间为16h。
优选地，洗涤时用乙醇和蒸馏水交替洗涤3-5遍，每次洗涤体积为沉淀重量的5-15倍。
优选地，干燥温度70-90℃，时间为4-8h。
优选地，煅烧温度400-500℃，煅烧时间3-5h；煅烧后自然冷却、研磨成纳米粒子即可。
上述荧光碳纳米粒子用作细胞标记材料的用途。
本发明的优点：
本发明提供的荧光碳纳米粒子采用常规的水热法即可生产，工艺可控性强，设备常见，整个生产成本低，易于工业化大生产；该荧光碳纳米粒子持续发光时间长，可达到72小时，可以满足科研中对细胞长时间观察的需要。
附图说明
图1为使用本发明荧光碳纳米粒子标记Hela细胞的共聚焦成像结果，其中：a、b、c、d分别代表不同放大倍数和不同视野下的成像结果，细胞内可见明显荧光。
具体实施方式
下面结合实施例详细介绍本发明的实质性技术方案。本发明岩藻多糖采用文献方法制备(见参考文献：海带中岩藻多糖提取工艺的研究，河北师范大学学报，2005年7月第29卷第4期)，也可以直接购买市售的岩藻多糖成品。
实施例1荧光碳纳米粒子的制备
先将岩藻多糖和草酸溶于蒸馏水中，再进行水热反应，反应温度为200℃，反应时间为16h，最后离心、洗涤、干燥、煅烧、研磨；其中，草酸质量浓度为20g/L。岩藻多糖质量浓度为120g/L。洗涤时用乙醇和蒸馏水交替洗涤4遍，每次洗涤体积为沉淀重量的10倍。干燥温度80℃，时间为6h。煅烧温度450℃，煅烧时间4h；煅烧后自然冷却、研磨至100-200nm。配制水热反应体系时，先将草酸溶于蒸馏水中配置成草酸溶液，再加入岩藻多糖搅拌溶解。
实施例2荧光碳纳米粒子的制备
先将岩藻多糖和草酸溶于蒸馏水中，再进行水热反应，反应温度为180℃，反应时间为18h，最后离心、洗涤、干燥、煅烧、研磨；其中，草酸质量浓度为15g/L。岩藻多糖质量浓度为80g/L。洗涤时用乙醇和蒸馏水交替洗涤3遍，每次洗涤体积为沉淀重量的15倍。干燥温度70℃，时间为8h。煅烧温度400℃，煅烧时间5h；煅烧后自然冷却、研磨至100-200nm。配制水热反应体系时，先将草酸溶于蒸馏水中配置成草酸溶液，再加入岩藻多糖搅拌溶解。
实施例3荧光碳纳米粒子的制备
先将岩藻多糖和草酸溶于蒸馏水中，再进行水热反应，反应温度为220℃，反应时间为14h，最后离心、洗涤、干燥、煅烧、研磨；其中，草酸质量浓度为25g/L。岩藻多糖质量浓度为150g/L。洗涤时用乙醇和蒸馏水交替洗涤5遍，每次洗涤体积为沉淀重量的5倍。干燥温度90℃，时间为4h。煅烧温度500℃，煅烧时间3h；煅烧后自然冷却、研磨至100-200nm。配制水热反应体系时，先将草酸溶于蒸馏水中配置成草酸溶液，再加入岩藻多糖搅拌溶解。
实施例4荧光碳纳米粒子的制备
该实施例与实施例1的区别在于：水热反应体系还加入生物交联剂京尼平。具体如下：
先将岩藻多糖、京尼平和草酸溶于蒸馏水中，再进行水热反应，反应温度为200℃，反应时间为16h，最后离心、洗涤、干燥、煅烧、研磨；其中，草酸质量浓度为20g/L。岩藻多糖质量浓度为120g/L。京尼平质量浓度为10g/L。洗涤时用乙醇和蒸馏水交替洗涤4遍，每次洗涤体积为沉淀重量的10倍。干燥温度80℃，时间为6h。煅烧温度450℃，煅烧时间4h；煅烧后自然冷却、研磨至100-200nm。配制水热反应体系时，先将草酸溶于蒸馏水中配置成草酸溶液，再加入岩藻多糖、京尼平搅拌溶解。
实施例5效果实施例
选取对数生长期Hela细胞，消化，离心收集细胞，制备成细胞悬浮液。将细胞接种于放有盖玻片的培养皿中，细胞密度以5×104/mL为宜，在37℃、5％CO2培养箱中培养。20h细胞贴壁后，吸去上清液，分别加入浓度为50μg/mL的荧光碳纳米粒子(制备方法见实施例1-4)培养液，在37℃、5％CO2培养箱中培养4h。取出培养皿，吸去培养液，用1mL PBS平衡液洗3次，每次浸泡1min。然后加入500μL 4％多聚甲醛溶液，室温下固定8min，吸去多聚甲醛溶液，再用1mL PBS平衡液浸泡3次，浸泡时间依次为2、2、5min。向载玻片上滴一滴0.9％的甘油，将盖玻片挑出，晾干后放置于甘油上，注意须使盖玻片上长有细胞的一面朝向甘油放置，用指甲油封口，晾干，保存于4℃冰箱中。在激光共聚焦荧光显微镜下观察实施例1-4制备的荧光碳纳米粒子对细胞的标记情况，并统计实施例1-4荧光碳纳米粒子在激光共聚焦荧光显微镜下的持续发光时间。
图1为使用本发明荧光碳纳米粒子标记Hela细胞的共聚焦成像结果，其中：a、b、c、d分别代表不同放大倍数和不同视野下的成像结果，细胞内可见明显荧光。实施例1-4荧光碳纳米粒子在激光共聚焦荧光显微镜下成像结果均如图1所示。但是，实施例4制备的荧光碳纳米粒子在激光共聚焦荧光显微镜下的持续发光时间明显较长，如下表：
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4
持续发光时间(h) 48 48 48 72
综上可见，本发明提供的荧光碳纳米粒子采用常规的水热法即可生产，工艺可控性强，设备常见，整个生产成本低，易于工业化大生产；该荧光碳纳米粒子持续发光时间长，可达到72小时，可以满足科研中对细胞长时间观察的需要。

Claims (4)

1.一种荧光碳纳米粒子，其特征在于，通过如下方法制备：先将岩藻多糖、京尼平和草酸溶于蒸馏水中，再进行水热反应，反应温度为180-220℃，反应时间为14-18h，最后离心、洗涤、干燥、煅烧、研磨；其中，草酸质量浓度为15-25g/L，岩藻多糖质量浓度为80-150g/L，京尼平质量浓度为10g/L。
2.根据权利要求1所述的荧光碳纳米粒子，其特征在于：干燥温度为70-90℃，干燥时间为4-8h。
3.根据权利要求1所述的荧光碳纳米粒子，其特征在于：煅烧温度为400-500℃，煅烧时间为3-5h；煅烧后自然冷却、研磨成纳米粒子即可。
4.权利要求1-3任一所述荧光碳纳米粒子用作细胞标记材料的用途。
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