CN107646039A - 具有有效抗hiv活性的双特异性cxcr4‑cd4多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及针对细胞受体CD4以及HIV的细胞共同受体的双特异性多肽。所述多肽可以用于阻止HIV进入人类细胞。

Description

具有有效抗HIV活性的双特异性CXCR4-CD4多肽
发明领域
本发明涉及针对细胞受体CD4以及HIV的细胞共同受体的双特异性多肽。所述多肽可以用于阻止HIV进入人类细胞。
背景
在整个说明书中对现有技术的任何讨论绝不应被认为是承认所述现有技术是广为人知的，或者形成本领域公知常识的一部分。
感染人免疫缺陷病毒(HIV)，如果未治疗，几乎总是导致感染的人死亡。HIV感染CD4+T细胞并且导致感染的人中CD4+T细胞数量的下降。当CD4+T细胞数量下降到低于临界水平时，细胞介导的免疫实际上丢失，并且出现多种机会性微生物感染，导致获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。因为感染HIV的人不再能够抵御这些机会性感染，所以患者将最终死于这些感染中的一种。
HIV感染是由包膜糖蛋白(Env)介导的。Env形成由受体结合亚单位gp120和HIV膜锚定融合蛋白亚单元gp41组成的异源三聚体(参见图1)。进入宿主细胞是由gp120与CD4的相互作用介导的，其引发构象变化，从而允许随后与细胞共同受体(主要是CCR5或CXCR4)的相互作用(Dalgleish等人(1984)Nature 312:763–767；Klatzmann等人(1984)Nature 312:767–768；Moore等人(1997)Curr Opin Immunol 9:551–562；Clapham&McKnight(2002)JGen Virol 83:1809–1829)。CCR5是使用的主要共同受体，但是在进行性HIV感染期间选择CCR5的改变使用。gp120与共同受体的结合诱导了gp41中另外的构象变化，这又促进了膜脂质的混合，最终促进了病毒和细胞膜的融合(Weissenhorn等人(1997)Nature387:426–430；Chan等人(1997)Cell 89:263–273；Weissenhorn等人(2007)FEBS Lett 581:2150–2155)。一旦病毒已经进入T细胞，病毒即绑架了T细胞复制机器以产生另外的HIV拷贝，由此进一步感染。
目前没有可用的用于HIV/AIDS的疗法。然而，感染HIV的人可以通过多种抗病毒治疗选择抑制病毒复制。目前对于HIV感染的治疗由抗逆转录病毒疗法，或ART组成。ART由多种抗病毒化合物的混合物的施用组成。然而，因为HIV容易突变，所以病毒常常对ART混合物中的一种或多种化合物具有抗性。此外，ART与多种副作用相关。尽管抗逆转录病毒依从性(adherence)是进展为AIDS和死亡的第二强的预测因子，但是在CD4计数之后，在所有治疗的个体中对ART的不完全依从性是常见的。尽管事实是长期的病毒抑制需要近乎完美的依从性，但是ART依从性的平均比率为大约70％。由此产生的病毒学治疗失败减少了长期临床成功的可能性并增加了耐药性的风险。
因此，需要治疗HIV感染的新的疗法。
在小分子抗-HIV化合物之后，已经改造和测试了中和抗体。然而，抗体必须针对病毒的外部。实际上，Env是进入抑制剂的主要靶标(Matthews等人(2004)Nat Rev DrugDiscov 3:215–225)和大多数中和抗体针对gp120或gp41(Sattentau Q(2008)Curr OpinHIV AIDS 3:368–374)。同样在这种情况下，HIV疫苗研究中的一个关键问题是交叉亚型中和抗体的产生，这归因于这样的事实：HIV采用了许多策略来逃避免疫应答。这包括高度可变的gp120区域，碳水化合物屏蔽(Wyatt等人(1998)Nature 393:705–711)和受体结合位点的构象掩蔽(Kwong等(2002)Nature 420:678–682)。
已经描述了针对各种HIV-1蛋白质的纳米抗体(Hinz等人2010PLoS ONE 5:e10482；McCoy等人2014Retrovirology 11:83；Vercruysse等人2010JBC 285:21768-21780；Bouchet等人,2011Blood 117:3559-3568)。然而，各种纳米抗体针对细胞内HIV蛋白质，需要纳米抗体的细胞内表达。此外，在所有情况下，都没有解决HIV对纳米抗体的抗性的发展。
有趣的是，旨在阻断细胞进入的HIV“在周围突变(mutate around)”疗法的选择似乎更受限制。事实上，在一项使用艾巴利珠单抗(ibalizumab)(一种抗-CD4单克隆抗体)的研究中，发展了抗性，但是抗性分离株的病毒进入仍然依赖于CD4，这表明抗性不能通过使用替代受体而发展(参见Bruno&Jacobson 2010J Antimicrob Chemother 65:1839-1841)。然而，在这种情况下，最终也发展了对艾巴利珠单抗的抗性(参见Fessel等人,2011Antiviral Res 92:484-487)。
PRO140是针对共同受体CCR5的完全人源化的IgG4单克隆抗体。PRO140通过掩蔽所需的共同受体CCR5来阻断HIV R5亚型进入T细胞。在短期研究中，还没有观察到对PRO140的抗性。然而，长期研究中抗性的潜在发展尚未得到解决。PRO140不阻止CXCR4共同受体的使用。例如，在高达40至50％的感染B-HIV的个体中，进展为晚期感染与共同受体特异性的转变有关，伴随着X4(CXCR4)或R5X4(CCR5/CXCR4)病毒变体的出现(Bjorndal等人J Virol1997,71(10):7478-7487；Connor等人J Exp Med 1997,185(4):621-628)。使用CXCR4的HIV病毒的出现与快速的CD4+T细胞下降和HIV感染从慢性期进展至晚期有关。
发明概述
本发明的目的是克服或改善现有技术的至少一个缺点，或者提供有用的替代方案。
发明人证明了通过针对共同受体(CR)和受体CD4的双特异性多肽的结合导致了两种结合部分针对HIV感染的协同作用(参见实施例4)。令人惊奇地，双特异性多肽比两个单独部分的组合更加有效(参见实施例8)。
双特异性多肽中具有非重叠效应的部分的组合(即第一部分针对CD4而第二部分针对共同受体)，允许施用更有效的结合物(binder)，而不增加对宿主超出不可接受限度的总体负面毒性作用。
发明人进一步证明了即使在强制性实验室环境中，完成HIV对双特异性多肽的抗性也是极其困难的(参见实施例8)。另一方面，令人惊讶地发现即使在对一种受体具有抗性的HIV株中(例如抗-CD4部分)，双特异性多肽仍然是有效的。因此，这种性质将双特异性多肽的使用扩展到这样的可能的效力：其针对对一种部分药剂不具有固有抗性的异源株以及对另一种部分不具有固有抗性的另一种HIV株。
因此，本发明涉及包含第一和第二免疫球蛋白单可变结构域(ISV)的多肽，其中所述第一ISV结合存在于细胞表面上的CD4和多态(polymorphic)变体；所述第二ISV结合存在于所述细胞表面上的共同受体(CR)，优选其中所述CR选自由以下组成的组：CXCR4、CCR5、CCR1、CCR2、CCR3、CCR8、CX3CR1、CXCR6、FPRL1、GPR1、GPR15、APJ和D6以及相关的多态变体，优选CXCR4，优选人CR，优选人CXCR4；并且其中所述CR不是CD4，优选所述多肽抑制人免疫缺陷病毒(HIV)或猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的感染，更优选所述HIV选自由HIV-1和HIV-2组成的组(优选HIV-1，优选C亚型)，并且优选所述细胞是人类细胞，优选人CD4+细胞，甚至更优选人CD4+T细胞。
因此，本发明涉及如上文所述的多肽，其中HIV抑制的平均EC50值是在10nM至0.1pM之间，诸如10nM以下的平均EC50值，甚至更优选9nM以下的平均EC50值，诸如小于8、7、6、5、4、3、2、1、0.5nM或甚至更小，诸如小于400、300、200、100、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5pM或甚至更小，诸如小于0.4pM；和/或其中HIV抑制的IC50是低于50nM，低于10nM，低于1nM以下，诸如小于0.5nM或甚至更小，诸如小于400、300、200、100、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5pM或甚至更小，诸如小于0.4pM；和/或其中所述多肽抑制HIV感染达约10％、20％、30％、40％、50％、60％、80％、90％和优选95％以上(诸如100％)(如HIV感染测定所测量的)；和/或其中所述多肽抑制HIV与CD4+CXCR4+细胞的融合；和/或其中所述多肽对所述CD4具有选自由以下组成的组的结合速率常数(Kon)：至少约102M-1s-1、至少约103M-1s-1、至少约104M-1s-1、至少约105M-1s-1、至少约106M-1s-1、107M-1s-1、至少约108M-1s-1、至少约109M-1s-1和至少约1010M-1s-1，优选如通过表面等离子共振所测量的；和/或其中所述多肽对所述CD4具有选自由以下组成的组的解离速率常数(Koff)：至多约10-3s-1、至多约10-4s-1、至多约10-5s-1、至多约10-6s-1、至多约10-7s-1、至多约10-8s-1、至多约10-9s-1和至多约10-10s-1，优选如通过表面等离子共振所测量的；和/或其中所述多肽对所述CD4具有选自由以下组成的组的解离常数(KD)：至多约10-7M、至多约10-8M、至多约10-9M、至多约10-10M、至多约10-11M和至多约10-12M，优选如通过表面等离子共振所测量的。
本发明还涉及如上文所述的多肽，其中所述第一ISV以这样的平均KD值与CD4结合：在10nM至0.1pM之间的平均KD值，诸如10nM以下的平均KD值，甚至更优选9nM以下的平均KD值，诸如小于8、7、6、5、4、3、2、1、0.5nM或甚至更小，诸如小于400、300、200、100、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5pM或甚至更小，诸如小于0.4pM，优选如通过SPR所测量的，例如通过KinExA确定的；和/或所述多肽抑制通过CD4的多聚化达小于约50％，诸如40％、30％或20％或甚至小于10％(诸如小于5％)；和/或所述多肽抑制通过CD4募集Lck达小于约50％，诸如40％、30％或20％或甚至小于10％(诸如小于5％)。
本发明还涉及如上文所述的多肽，其中所述多肽对所述CR具有选自由以下组成的组的结合速率常数(Kon)：至少约102M-1s-1、至少约103M-1s-1、至少约104M-1s-1、至少约105M- 1s-1、至少约106M-1s-1、107M-1s-1、至少约108M-1s-1、至少约109M-1s-1和至少约1010M-1s-1，优选如通过表面等离子共振所测量的，所述CR优选是CXCR4；和/或其中所述多肽对所述CR具有选自由以下组成的组的解离速率常数(Koff)：至多约10-3s-1、至多约10-4s-1、至多约10-5s-1、至多约10-6s-1、至多约10-7s-1、至多约10-8s-1、至多约10-9s-1和至多约10-10s-1，优选如通过表面等离子共振所测量的，所述CR优选是CXCR4；和/或所述多肽对所述CR具有选自由以下组成的组的解离常数(KD)：至多约10-7M、至多约10-8M、至多约10-9M、至多约10-10M、至多约10-11M和至多约10-12M，优选如通过表面等离子共振所测量的，所述CR优选是CXCR4；和/或所述第二ISV以这样的平均KD值与所述CR结合：在10nM至0.1pM之间的平均KD值，诸如10nM以下的平均KD值，甚至更优选9nM以下的平均KD值，诸如小于8、7、6、5、4、3、2、1、0.5nM或甚至更小，诸如小于400、300、200、100、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5pM或甚至更小，诸如小于0.4pM，优选如通过SPR所测量的，例如通过KinExA确定的，所述CR优选是CXCR4；和/或所述多肽抑制天然配体与所述CR的结合达小于约50％，诸如40％、30％或20％或甚至小于10％(诸如小于5％)。
本发明还涉及如本文所述的多肽，其中所述CR优选是CXCR4，并且优选所述天然配体是基质细胞-衍生因子-1β(Stromal Cell-Derived Factor-1beta,SDF-1β)或基质细胞-衍生因子-1α(Stromal Cell-Derived Factor-1alpha,SDF-1α)；并且优选地，在多肽的存在下从CXCR4置换SDF-1α或SDF-1β的IC50是10nM以上、250nM以上或1μM以上；甚至更优选地，在多肽的存在下从CXCR4置换SDF-1α或SDF-1β的IC50大于HIV抑制的IC50。
本发明还涉及如本文所述的多肽，其进一步包含血清蛋白结合部分、优选结合血清白蛋白，基于非抗体的多肽或PEG。优选地，所述血清蛋白结合部分是结合血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域。更优选地，结合血清白蛋白的所述ISV基本上由4个构架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中CDR1是SEQ ID NO:124，CDR2是SEQ ID NO:125，CDR3是SEQ ID NO:126，诸如选自由Alb8、Alb23、Alb129、Alb132、Alb11、Alb11(S112K)-A、Alb82、Alb82-A、Alb82-AA、Alb82-AAA、Alb82-G、Alb82-GG、Alb82-GGG组成的组。
本发明还涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISV和所述第二ISV以及可能的结合血清白蛋白的所述ISV彼此直接连接或通过接头连接；优选选自由5GS、7GS、9GS、10GS、15GS、18GS、20GS、25GS、30GS和35GS的接头组成的组。
本发明还涉及如本文所述的多肽，其中所述ISV是VHH、人源化的VHH或骆驼源化的VH。
本发明还涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISV基本上由4个构架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中(i)CDR1选自由以下组成的组：SEQ ID NOs:82-85；以及与SEQ ID NOs:82-85具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；(ii)CDR2选自由以下组成的组：SEQ ID NOs:88-91；以及与SEQ ID NOs:88-91具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；(iii)CDR3选自由以下组成的组：SEQ ID NO：96-99以及与SEQID NOs:96-99具有1、2、3或4个氨基酸差异的氨基酸序列；优选地，CDR1是SEQ ID NO:85，CDR2是SEQ ID NO:91，且CDR3是SEQ ID NO:99。此外，本发明还涉及如上文所述的多肽，其中所述第一ISV选自由以下组成的组：01B6(SEQ ID NO:17)、01E2(SEQ ID NO:18)、01H12(SEQ ID NO:19)和03F11(SEQ ID NO:20)，优选所述第一ISV是克隆03F11(SEQ ID NO:20)。
本发明还涉及如本文所述的多肽，其中所述第二ISV基本上由4个构架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中(i)CDR1选自由以下组成的组：SEQ ID NOs:34-40以及与SEQ ID NOs:34-40具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；(ii)CDR2选自由以下组成的组：SEQ ID NOs:48-56组成的组；以及与SEQ ID NOs:48-56具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；(iii)CDR3选自由以下组成的组：SEQ ID NO：67-75以及与SEQ ID NOs:67-75具有1、2、3或4个氨基酸差异的氨基酸序列；优选地，CDR1是SEQ ID NO:35，CDR2是SEQ ID NO:50，且CDR3是SEQ ID NO:69。此外，本发明还涉及如上文所述的多肽，其中所述第二ISV选自由以下组成的组：238D4(SEQ ID NO:4)、281A5(SEQ ID NO:5)、281E10(SEQ ID NO:6)、281D4(SEQ ID NO:7)、281A6(SEQ ID NO:8)、281F12(SEQ ID NO:9)、283B6(SEQ ID NO:10)、283E2(SEQ ID NO:11)、283F1(SEQ ID NO:12)、15F5(SEQ IDNO:13)、15G11(SEQ ID NO:14)、15A1(SEQ ID NO:15)和10C3(SEQ ID NO:16)，优选地其中所述第二ISV是281F12(SEQ ID NO:9)。
此外，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISV选自由以下组成的组：01B6(SEQ ID NO:17)、01E2(SEQ ID NO:18)、01H12(SEQ ID NO:19)和03F11(SEQ ID NO:20)，并且其中所述第二ISV选自由以下组成的组：238D4(SEQ ID NO:4)、281A5(SEQ ID NO:5)、281E10(SEQ ID NO:6)、281D4(SEQ ID NO:7)、281A6(SEQ ID NO:8)、281F12(SEQ IDNO:9)、283B6(SEQ ID NO:10)、283E2(SEQ ID NO:11)、283F1(SEQ ID NO:12)、15F5(SEQ IDNO:13)、15G11(SEQ ID NO:14)、15A1(SEQ ID NO:15)和10C3(SEQ ID NO:16)，优选地所述多肽选自由以下组成的组：03F11-9GS-281F12(SEQ ID NO:101)、03F11-25GS-281F12(SEQID NO:102)、03F11-35GS-281F12(SEQ ID NO:103)、281F12-9GS-03F11(SEQ ID NO:104)、281F12-25GS-03F11(SEQ ID NO:105)、281F12-35GS-03F11(SEQ ID NO:106)、15G11(Q108L)-15GS-ALB11-15GS-03F11(Q108L)(SEQ ID NO:107)、15F05(Q108L)-15GS-ALB11-15GS-03F11(Q108L)(SEQ ID NO:108)和281F12(Q108L)-15GS-ALB11-15GS-03F11(Q108L)(SEQ ID NO:109)。
此外，本发明还涉及用于治疗有需要的受试者(感染HIV、HIV-1、C亚型)的如上文所述的多肽。此外，本发明还涉及包含如上文所述的多肽的(药物)组合物。
本发明还涉及将预防性或治疗性多肽递送至体内特定位置、组织或细胞类型的方法，所述方法包括将如上文所述的多肽施用于受试者的步骤。
本发明还涉及治疗有需要的受试者的方法，其包括施用如本文所述的多肽，优选其中所述受试者感染HIV R5、HIV X4和/或HIV X4R5。
本发明还涉及治疗感染HIV的受试者的方法，其包括施用如本文所述的多肽，其中优选在与PR、RTI和/或NRTI的组合治疗中，所述感染HIV的受试者至少6个月等不发展对所述多肽的抗性。
本发明还涉及治疗感染HIV的受试者的方法，其包括施用如本文所述的多肽，其中所述受试者对至少一种其它抗HIV剂具有抗性，所述至少一种其它抗HIV剂诸如一种或多种蛋白酶抑制剂(PR)，例如安普那韦(amprenavir,AMP)、阿扎那韦(atazanavir,ATV)、茚地那韦(indinavir,IDV)、洛匹那韦(lopinavir,LPV)、奈非那韦(NFV)、利托那韦(ritonavir,RTV)或沙奎那韦(saquinavir,SQV)；和/或逆转录酶抑制剂(RTIs)，例如非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)[阿巴卡韦(abacavir,ABC)、地拉韦啶(delavirdine,DLV)、依法韦仑(efavirenz,EFV)、奈韦拉平(NVP)和替诺福韦(tenofovir,TFV)]；或核苷类似物逆转录酶抑制剂(NRTI)[去羟肌苷(didanosine,ddl)、司他夫定(stavudine,d4T)、拉米夫定(lamivudine,3TC)和齐多夫定(zidovudine,ZDV)]。
本发明还涉及降低受试者中的HIV滴度的方法，所述方法包括将治疗有效量的如本文所述的多肽施用至受试者以降低受试者中的HIV滴度。
本发明还涉及治疗对非抗体CD4和/或CR拮抗剂具有抗性或已经变得具有抗性的感染HIV的人类受试者中获得性免疫缺陷综合征的症状的方法，所述方法包括以这样的量将如本文所述的多肽施用至所述人类受试者：所述量对治疗人类受试者中获得性免疫缺陷综合征的症状有效。
本发明还涉及预防受试者中HIV感染的方法，所述方法包括将治疗有效量的如本文所述的多肽施用至受试者以预防受试者的HIV感染。
本发明还涉及抑制受试者中易感细胞被HIV病毒的HIV感染的方法，所述HIV病毒对CD4拮抗剂具有抗性或已经变得具有抗性，所述方法包括使易感细胞经受有效HIV感染抑制剂量的如本文所述的多肽(其抑制HIV与CD4+CXCR4+细胞的融合)，优选其中有效HIV感染抑制剂量包含每千克受试者体重0.1mg至25mg，以致由此抑制易感细胞被HIV1感染，所述HIV1对CD4拮抗剂具有抗性或已经变得具有抗性。
本发明还涉及包含第一和第二免疫球蛋白单可变结构域(ISV)的多肽，其中所述第一ISV结合存在于细胞表面上的CD4；所述第二ISV结合存在于所述细胞表面上的CXCR4；并且
其中所述第一ISV基本上由4个构架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1选自由以下组成的组：SEQ ID NOs:85、84、83和82；以及与SEQ ID NOs:85、84、83和82具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
(ii)CDR2选自由以下组成的组：SEQ ID NOs:91、90、89和88；以及与SEQ ID NOs:91、90、89和88具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
(iii)CDR3选自由以下组成的组：SEQ ID NO:99、98、97和96；以及与SEQ ID NO:99、98、97和96具有1、2、3或4个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且，其中所述第二ISV基本上由4个构架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1选自由以下组成的组：SEQ ID NOs:35、34、36-40；以及与SEQ ID NOs:35、34、36-40具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
(ii)CDR2选自由以下组成的组：SEQ ID NOs:50、48-49和51-56；以及与SEQ IDNOs:50、48-49和51-56具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
(iii)CDR3选自由以下组成的组：SEQ ID NO:69、67-68、70-75以及与SEQ ID NOs:69、67-68、70-75具有1、2、3或4个氨基酸差异的氨基酸序列。
本发明还涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISV选自由以下组成的组：03F11(SEQ ID NO:20)、01B6(SEQ ID NO:17)、01E2(SEQ ID NO:18)和01H12(SEQ ID NO:19)，并且其中所述第二ISV选自由以下组成的组：281F12(SEQ ID NO:9)、238D4(SEQ ID NO:4)、281A5(SEQ ID NO:5)、281E10(SEQ ID NO:6)、281D4(SEQ ID NO:7)、281A6(SEQ ID NO:8)、283B6(SEQ ID NO:10)、283E2(SEQ ID NO:11)、283F1(SEQ ID NO:12)、15F5(SEQ ID NO:13)、15G11(SEQ ID NO:14)、15A1(SEQ ID NO:15)和10C3(SEQ ID NO:16)。
本发明还涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽预防所述HIV的感染至少3个月，诸如至少6个月或甚至更长，诸如例如9个月、11个月、1年、1.5年、2年或甚至更长。
本发明还涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽以小于约50％诸如40％、30％或20％或甚至小于10％(诸如小于5％)抑制天然配体与所述CXCR4的结合，其中所述天然配体是基质细胞-衍生因子-1β(SDF-1β)或基质细胞-衍生因子-1α(SDF-1α)。
本发明还涉及用于治疗和/或预防受试者中HIV感染的如本文所述的多肽。优选地，所述多肽预防HIV感染至少3个月，诸如至少6个月或甚至更长，诸如例如9个月、11个月、1年、1.5年、2年或甚至更长。本发明还涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽抑制HIV感染达约10％、20％、30％、40％、50％、60％、80％、90％和优选95％以上(诸如100％)，例如如HIV感染测定所测量的。本发明还涉及用于治疗和/或预防受试者中HIV感染的如本文所述的多肽，其中所述多肽抑制HIV与CD4+CXCR4+细胞的融合。本发明还涉及用于治疗和/或预防受试者中HIV感染的如本文所述的多肽，其中所述多肽抑制天然配体与所述CXCR4的结合达小于约50％，诸如40％、30％或20％或甚至小于10％(诸如小于5％)，其中所述天然配体是基质细胞-衍生因子-1β(SDF-1β)或基质细胞-衍生因子-1α(SDF-1α)。
附图简述
图1：模型系统的示例性表示。
图2A-2D：针对gp120结合位点的人CD4特异性纳米抗体的鉴别。图2A：ELISA中噬菌体结合重组人CD4。图2B：使用myc-标签的检测，通过流式细胞术对在Jurkat和THP-1细胞(而不是Ba/F3细胞)上的细胞表达的CD4的结合。图2C：选择的CD4纳米抗体在竞争ELISA中对CD4-gp120相互作用的阻断。在图2B和2C中，抗-hCD4单克隆mAb A-1(Diaclone)用作阳性对照。图2D：纳米抗体3F11对人T细胞的结合。
图2.1：对CXCR4纳米抗体结合人CXCR4的放射-配体置换分析。将转染以CXCR4的Hek293细胞的膜提取物与纯化的纳米抗体的系列稀释物和75pM的[125I]-CXCL12温育。在100nM冷的SDF-1的存在下确定非特异性结合。显示三次实验的平均值。
图2.2：ELISA中单价和双特异性CD4-CXCR4纳米抗体对病毒脂质颗粒(CXCR4-脂质)上的CXCR4相对空对照颗粒(空-脂质)的结合。经由小鼠抗-c-myc抗体和兔抗-小鼠-HRP抗体检测结合的纳米抗体。
图2.3：单价和双特异性CXCR4-CD4多肽对表达CXCR4和CD4二者的细胞系(JurkatE6.1、THP-1和MOLM-13细胞)的结合亲和力分析。开始显示在这些细胞系中CD4和CXCR4的相对表达水平，如用抗-CD4mAb A-1(Diaclone)和抗-CXCR4mAb 12G5(R&D系统)对照抗体所确定的。使用具有35GS接头的双特异性多肽。经由抗-标签抗体进行检测。
图2.4：对于Jurkat E6.1和Molm-13细胞抑制单价和CXCR4-CD4双特异性多肽的SDF-1介导的趋化作用。显示具有35GS接头的双特异性多肽。
图3：对于Jurkat E6.1细胞和THP-1细胞，单价和CXCR4-CD4双特异性多肽对抗-CXCR4mAb 12G5结合的抑制。经由山羊抗-小鼠-PE(Jackson ImmunoResearch)检测结合的12G5抗体。
图4：与单价纳米抗体的混合物相比，双特异性CXCR4-CD4多肽对MT-4细胞中HIV-1NL4.3感染性的剂量依赖性抑制。通过MTS生存力染色法进行检测。
图5：在MT-4细胞中具有不同接头长度的CXCR4-CD4纳米抗体对野生型NL4.3和AMD3100-抗性的HIV-1变体的HIV1感染性的抑制。AMD-3100用作对照化合物。显示三次实验的平均IC50。
图6：通过MT-4细胞中NL4.1感染评估的一大组CXCR4纳米抗体对HIV-1中和能力的排序。包括AMD-3100作为对照化合物。显示两次实验的平均IC50值。
图7：针对CXCR4上的gp120结合位点但不与配体竞争的CXCR4纳米抗体的鉴定。图片A：CXCR4纳米抗体的选择的配体竞争和HIV-1中和亲和力的比较。包括CXCR4纳米抗体281F12和AMD-3100作为参考。图片B：对于在Hek-293细胞上表达的CXCR4，选择的CXCR4纳米抗体的配体置换分析。将生物素化的SDF-1(30nM，EC30浓度)用于检测。包括AMD-3100和抗-CXCR4mAb 12G5作为参考化合物。
图8：通过流式细胞术在Jurkat E6.1细胞中单价CXCR4纳米抗体对抗-CXCR4mAb12G5和AMD-3100结合CXCR4的抑制。经由山羊抗-小鼠-PE(Jackson ImmunoResearch)检测结合的12G5抗体。在AMD-3100竞争的情况下，纳米抗体以EC30浓度使用并与增加浓度的AMD-3100竞争。经由抗-myc检测对结合的纳米抗体进行检测。
图9：对于Jurkat E6.1细胞(图片A)和Molm-13细胞(图片B)，半衰期延长的CXCR4-CD4双特异性多肽的SDF-1介导的趋化作用的抑制。在3小时内将趋化作用评估为750pMSDF-1(Jurkat)或1nM SDF-1(MOLM-13)。
图10：通过流式细胞术对单价抗-CD4纳米抗体3F11与CD4+猕猴(cynomolgus)HSC-F T细胞的结合分析。经由小鼠抗-Flag抗体和山羊抗-小鼠-PE抗体(JacksonImmunoResearch)检测结合的纳米抗体。
发明描述
本发明涉及特定多肽，也称为“本发明的多肽”，其包含或基本上由以下各项组成：(i)第一结构单元，其基本上由第一免疫球蛋白单可变结构域组成，其中所述第一免疫球蛋白单可变结构域结合细胞表面上的第一靶标、优选HIV受体、诸如CD4；和(ii)第二结构单元，其基本上由第二免疫球蛋白单可变结构域组成，其中所述第二免疫球蛋白单可变结构域结合细胞表面上的第二靶标、优选HIV共同受体(CR)，且其中所述CR不是CD4。
a)除非另有说明或定义，使用的所有术语具有其在本领域中通常的含义，其对于本领域技术人员来说是清楚的。例如参考WO 08/020079第46页段a)中提及的标准手册。
b)除非另有说明，术语“免疫球蛋白单可变结构域”或“ISV”用作一般术语包括但不限于分别地抗原结合结构域或片段，例如VHH结构域或VH或VL结构域。术语抗原结合分子或抗原结合蛋白可以交换使用，并且还包括术语纳米抗体。免疫球蛋白单可变结构域可以是轻链可变结构域序列(例如VL-序列)，或重链可变结构域序列(例如VH-序列)；更特别地，它们可以是衍生自常规四链抗体的重链可变结构域序列或衍生自重链抗体的重链可变结构域序列。相应地，免疫球蛋白单可变结构域可以是结构域抗体，或者适合用作结构域抗体的免疫球蛋白序列，单结构域抗体，或者适合用作单结构域抗体的免疫球蛋白序列，“dAbs”或者适合用作dAbs的免疫球蛋白序列，或者纳米抗体，包括但不限于VHH序列，以及人源化的VHH序列和骆驼源化的VH序列。本发明包括不同来源的免疫球蛋白序列，包括小鼠、大鼠、兔、驴、人和骆驼科动物的免疫球蛋白序列。免疫球蛋白单可变结构域包括完全是人的、人源化的，其它序列优化的或嵌合的免疫球蛋白序列。免疫球蛋白单可变结构域和免疫球蛋白单可变结构域的结构可视为-但不限于-由四个构架区或“FR’s”组成，其在本领域中以及在本文中分别称为“构架区1”或“FR1”；“构架区2”或“FR2”；“构架区3”或“FR3”；“构架区4”或“FR4”；构架区被三个互补决定区或“CDR’s”间隔开，所述三个互补决定区或“CDR’s”在本领域中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”；“互补决定区3”或“CDR3”。应当注意术语纳米抗体(Nanobody或Nanobodies)是Ablynx N.V.的注册商标，因此也分别被称为(或)。
c)除非另有说明，术语“免疫球蛋白序列”、“序列”、“核苷酸序列”和“核酸”如WO08/020079第46页段b)中所述。
d)除非另有说明，所有没有特别详细描述的方法、步骤、技术和操作可以以本身已知的方式进行或已经这样进行，这对于本领域技术人员来说是清楚的。例如再次参考本文提及的标准手册和一般背景技术以及其中所引用的其它参考文献；以及例如下述综述Presta,Adv.Drug Deliv.Rev.2006,58(5-6):640-56；Levin和Weiss,Mol.Biosyst.2006,2(1):49-57；Irving等,J.Immunol.Methods,2001,248(1-2),31-45；Schmitz等,Placenta,2000,21增刊A,S106-12,Gonzales等,Tumour Biol.,2005,26(1),31-43，其中描述了蛋白质工程技术，例如亲和力成熟及其它提高蛋白质如免疫球蛋白的特异性及其它所需性质的技术。
e)氨基酸残基用标准的三字母或单字母氨基酸代码表示。参考发明名称为“Immunoglobulin single variable domains directed against IL-6R andpolypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disordersassociated with IL-6mediated signalling”的Ablynx N.V.的国际申请WO 08/020079第48页表A-2。
f)为比较两个以上核苷酸序列的目的，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之间的“序列同一性”的百分比可以如WO 08/020079(通过引用的方式将其合并入本文中)第49页段e)所述进行计算或确定，例如用[第一核苷酸序列中与第二核苷酸序列中相应位置的核苷酸相同的核苷酸的数目]除以[第一核苷酸序列中核苷酸的总数目]并乘以[100％]，其中第二核苷酸序列中每个核苷酸的缺失、插入、取代或添加-与第一核苷酸序列相比-视为是单核苷酸(位置)的差异；或者使用适合的计算机算法或技术，也如WO 08/020079(通过引用的方式合并入本文中)第49页段e)所述。
g)为了比较两个以上免疫球蛋白单可变结构域或其它氨基酸序列例如本发明的多肽等的目的，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间的“序列同一性”(本文中也称为“氨基酸同一性”)的百分比可以如WO 08/020079(通过引用的方式合并入本文中)第49和50页的段f)所述进行计算或确定，例如用[第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置的氨基酸残基相同的氨基酸残基的数目]除以[第一氨基酸序列中氨基酸残基的总数目]并乘以[100％]，其中第二氨基酸序列中每个氨基酸残基的缺失、插入、取代或添加-与第一氨基酸序列相比-视为是单个氨基酸残基(位置)的差异，即本文所定义的“氨基酸差异”；或者使用适合的计算机算法或技术，也如WO 08/020079(通过引用的方式将其合并入本文中)第49和50页段f)所述。
而且，在确定两个免疫球蛋白单可变结构域之间的序列同一性程度时，本领域技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，如WO 08/020079第50页所述。
还可以基于由Schulz等,Principles of Protein Structure,Springer-Verlag,1978提出的不同物种的同源蛋白之间的氨基酸变异频度分析，由Chou和Fasman,Biochemistry 13:211,1974和Adv.Enzymol.,47:45-149,1978提出的结构形成潜能分析，由Eisenberg等,Proc.Natl.Acad Sci.USA 81:140-144,1984；Kyte&Doolittle；JMolec.Biol.157:105-132,198 1,和Goldman等,Ann.Rev.Biophys.Chem.15:321-353,1986提出的蛋白质疏水模式分析对本文所述的多肽应用任何氨基酸取代，通过引用的方式将它们的全文合并入本文。本文说明书和上述引用的一般背景技术中给出纳米抗体的一级、二级和三级结构的信息。而且，为此目的，例如在Desmyter等,Nature Structural Biology,Vol.3,9,803(1996)；Spinelli等,Natural Structural Biology(1996)；3,752-757；和Decanniere等,Structure,Vol.7,4,361(1999)中给出了美洲驼(llama)的VHH结构域的晶体结构。可以在上述引用的现有技术中找到关于在常规VH结构域中在这些位置上形成VH/VL界面和可能的骆驼源化取代的一些氨基酸残基的进一步的信息。
h)如果免疫球蛋白单可变结构域和核酸序列在其全长上具有100％的序列同一性(如文本所定义的)，那么将它们称为“完全相同”。
i)当比较两个免疫球蛋白单可变结构域时，术语“氨基酸差异”指与第二序列相比，第一序列的某个位置上单个氨基酸残基的插入、缺失或取代；应当理解两个免疫球蛋白单可变结构域可以包含一个、两个或更多个这种氨基酸差异。
j)当核苷酸序列或氨基酸序列被称为分别“包含”另一个核苷酸序列或氨基酸序列，或者被称为“基本上由”另一个核苷酸或氨基酸序列“组成”时，其具有WO 08/020079第51-52页段i)所给出的含义。除非上下文清楚地要求，否则在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”等被解释为包含性的意义，而不是排他的或穷举的意义；也就是说，被解释为“包括但不限于”的意义。
k)术语“以基本上分离的形式”具有WO 08/020079第52和53页段j)所给出的含义。
l)术语“域”和“结合结构域”具有WO 08/020079第53页段k)所给出的含义。
m)术语“抗原决定簇”和“表位”在本文中可互换使用，具有WO 08/020079第53页段l)所给出的含义。
n)如WO 08/020079第53页段m)中进一步描述的，能与特定的抗原决定簇、表位、抗原或蛋白(或者它的至少一部分、片段或表位)(特异性)结合，与其具有亲和力和/或对其具有特异性的氨基酸序列(例如本发明的抗体、多肽，或通常的抗原结合蛋白或多肽或其片段)被称为“拮抗剂”或“针对”所述的抗原决定簇、表位、抗原或蛋白。
o)术语“特异性”指特定的抗原结合分子或抗原结合蛋白(例如本发明的ISV(诸如例如纳米抗体)或多肽)分子能结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。可以基于亲和力和/或抗体亲抗原性确定抗原结合蛋白的特异性。
亲和力(由抗原与抗原-结合蛋白解离的平衡常数(KD或KD)表示)，是抗原决定簇(即靶标)，和抗原-结合蛋白(即ISV或纳米抗体)上的抗原-结合位点之间的结合强度的测量值：KD值越小，抗原决定簇和抗原-结合分子之间的结合强度越强(备选地，亲和力还可以表达为亲和力常数(KA)，其是1/KD)。如对于技术人员明确的(例如基于本文中进一步公开的)，亲和力可以以本身已知的方式确定，取决于研究的特定抗原。
亲合力是多肽的亲和力，即配体能够经由两个(以上)药效团(ISV)结合，其中多个相互作用协同增强“表观”亲和力。亲合力是本发明的多肽和相关抗原之间的结合强度的测量值。本发明的多肽能够经由其两个(以上)结构单元，如ISV或纳米抗体，结合于至少两个靶标，其中多个相互作用，例如第一结构单元，ISV或纳米抗体结合第一靶标并且第二结构单元，ISV，或纳米抗体结合第二靶标，协同增强“表观”亲和力。亲合力与抗原决定簇和抗原-结合分子上的其抗原结合位点之间的亲和力以及抗原-结合分子上存在的相关结合位点的数量相关。例如，并且不受限制，含有两个以上结构单元，如针对细胞上不同靶标并且尤其是针对人CXCR4和人CD4的ISV或纳米抗体的多肽可以(并且通常将)以比包含在本发明中的多肽中的单个单体或单个结构单元，如，例如，单价ISV或纳米抗体高的亲合力结合。
在本发明中，当解离常数(KD)是10-9至10-12摩尔/升以下，并且优选为10-10至10-12摩尔/升以下并且更优选为10-11至10-12摩尔/升(即结合常数(KA)为109至1012升/摩尔以上，并且优选为1010至1012升/摩尔以上或更优选为1011至1012升/摩尔)时，表明单价抗原-结合蛋白(如本发明的结构单元、ISV、氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽)以高亲和力结合其抗原。
在本发明中，当解离常数(KD)是10-6至10-9摩尔/升以上，并且优选为10-6至10-8摩尔/升以上并且更优选为10-6至10-7摩尔/升(即结合常数(KA)为106至109升/摩尔以上，并且优选为106至108升/摩尔以上并且更优选为106至107升/摩尔)时，表明单价抗原-结合蛋白(如本发明的结构单元、ISV、氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽)以低亲和力结合其抗原。
中等亲和力可以定义为范围在高-低，例如10-10至10-8摩尔/升之间的值。
任何大于10-4摩尔/升的KD值(或任何低于104升/摩尔的KA值)通常认为是非特异结合。
本发明的多肽包含第一和第二结构单元，例如第一和第二ISV，或第一和第二纳米抗体。优选为分别确定各个结构单元，例如ISV或纳米抗体的亲和力。换句话说，对于单价结构单元，ISV或纳米抗体，独立于由于其他结构单元，ISV或纳米抗体(其可能存在或可能不存在)导致的亲合力效应来确定亲和力。对于单价结构单元，ISV或纳米抗体的亲和力可以对单价结构单元，ISV或纳米抗体本身确定，即当所述单价结构单元，ISV或纳米抗体不包含在本发明的多肽中时。在备选方案中或此外，在不存在其他靶标时，单价结构单元，ISV或纳米抗体的亲和力可以对一个靶标确定。
抗原-结合蛋白对抗原或抗原决定簇的结合可以以本身已知的任何合适方法确定，包括例如，Scatchard分析和/或竞争结合测定，如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心竞争测定，和本领域中的本身已知的其不同变化形式；以及本文中提及的其他技术。
解离常数可以是实际或表面解离常数，如对于技术人员将是明显的。用于确定解离常数的方法对于技术人员将是明显的，并且例如包括本文中提及的技术。在此方面，还将明显的是，其可能不能测量大于10-4摩尔/升或10-3摩尔/升(例如，10-2摩尔/升)的解离常数。任选地，如还将对于技术人员明显的，(实际或表观)解离常数可以基于(实际或表观)结合常数(KA)，通过关系[KD＝1/KA]的方式计算。
亲和力表示分子相互作用的强度或稳定性。亲和力通常由KD或解离常数给出，其具有摩尔/升(或M)的单位。亲和力还可以表达为结合常数，KA，其等于1/KD并且具有(摩尔/升)-1(或M-1)的单位。在本说明书中，两个分子(如本发明的氨基酸序列、ISV(诸如例如纳米抗体)或多肽和其预期靶标)之间的相互作用的稳定性将主要根据它们的相互作用的KD值表达；技术人员将明确，鉴于关系KA＝1/KD，通过其KD值指定分子相互作用的强度还可以用于计算相应KA值。KD-值也在热力学意义上表征分子相互作用的强度，因为通过公知关系DG＝RT.ln(KD)(等价地DG＝-RT.ln(KA))它与结合的自由能(DG)相关，其中R等于气体常数，T等于绝对温度并且ln表示自然对数。
被认为有意义的(例如特异的)的对于生物学相互作用的KD通常在10-10M(0.1nM)至10-5M(10000nM)的范围内。相互作用越强，其KD越低。
KD也可以表达为复合体的解离速率常数(表示为koff)与其结合速率(表示为kon)的比率(所以KD＝koff/kon和KA＝kon/koff)。解离速率koff具有单位s-1(其中s是秒的SI单位记号)。结合速率kon具有单位M-1s-1。结合速率可以在102M-1s-1至约107M-1s-1之间变化，接近对于生物分子相互作用的扩散限制的结合速率常数。通过关系t1/2＝ln(2)/koff，解离速率与给定分子相互作用的半衰期有关。解离速率可以在10-6s-1(接近具有多日的t1/2的不可逆复合体)至1s-1(t1/2＝0.69s)之间变化。
两个分子之间的分子相互作用的亲和力可以经由本身已知的不同技术测量，如公知的表面等离子共振(SPR)生物传感器技术(参见例如Ober等人，Intern.Immunology，13，1551-1559，2001)。如本文使用的术语“表面等离子共振”，是指允许通过检测生物传感器矩阵内的蛋白浓度的改变分析实时生物特异相互作用的光学现象，在传感器矩阵中，一种分子被固定在生物传感器芯片上，并且另一种分子在流动条件下经过固定的分子，得到kon，koff测量值和由此得到KD(或KA)值。这可以例如使用公知的系统(BIAcoreInternational AB，GE Healthcare公司，Uppsala，Sweden和Piscataway，NJ)进行。对于进一步描述，参见Jonsson，U.，等人(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26；Jonsson，U.，等人(1991)Biotechniques 11:620-627；Johnsson，B.，等人(1995)J Mol.Recognit.8：125-131；和Johnnson，B.，等人(1991)Anal.Biochem.198:268-277。
如果测量过程例如由与一种分子的生物传感器上包被层相关的假象某种程度上影响隐含的分子的固有结合亲和力，技术人员还将明确的是，测量的KD可以对应于表观KD。此外，如果一种分子含有多于一个用于其他分子的识别位点，可以测量表观KD。在此情况下，测量的亲和力不受两个分子的相互作用的亲合力影响。
可以用于评价亲和力的另一方法是Friguet等人的2-步骤ELISA(酶联免疫吸附测定)步骤(J.Immunol.Methods，77，305-19，1985)。该方法建立溶液相结合平衡测量并且避免与在支持物如塑料上的分子中的一种的吸附相关的假象。
然而，KD的精确测量可能是极为劳力密集的并且因此，经常确定表观KD值以评价两种分子的结合强度。应该注意，只要以连续的方式进行所有测量(例如保持测定条件不变)，表观KD测量可以用作真正KD的近似值，并且因此在本文件中，KD和表观KD应该被以相等的重要性或相关性处理。
最后，应该注意，在很多情况下，有经验的科学家可以判断其方便用于确定相对于一些参考分子的结合亲和力。例如，为了评价分子A和B之间的结合强度，可以例如使用参考分子C，其已知结合B并且适当地用荧光团或发色团基团或其他化学部分，如用于容易在ELISA或FACS(荧光激活的细胞分选)或其他形式(用于荧光检测的荧光团，用于光吸收检测的发色团，用于链霉亲和素介导的ELISA检测的生物素)中检测的生物素标记。通常，将参考分子C保持固定的浓度并且对于给定浓度或量的B改变A的浓度。作为结果，获得对应于A的浓度的IC50值，在该值，在不存在A的情况下对于C测量的信号减半。假如KD ref(参考分子的KD)以及参考分子的总浓度cref是已知的，则对于相互作用A-B的表观KD可以从下式获得：KD＝IC50/(1+cref/KD ref)。注意如果cref<<KD ref，则KD≈IC50。假如对于比较的结合物的IC50的测量以连续的方式进行(例如保持cref固定)，则分子相互作用的强度或稳定性可以通过IC50评价，并且在本文中将该测量判断为等于KD或表观KD。
p)本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的半衰期通常可以如WO 08/020079第57页段o)所描述的以及本文所提及的那样定义，指例如由于氨基酸序列或化合物的降解和/或天然机制造成的序列或化合物的清除或隔离，所述序列、化合物或多肽在体内的血清浓度减少50％所花费的时间。本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的体内半衰期可以用其本身已知的任何方式确定，例如通过药代动力学分析确定。适合的技术对本领域技术人员来说是清楚的，通常可以是如WO 08/020079第57页段o)所描述的。如WO 08/020079第57页段o)中还提及的，半衰期可以用参数例如t1/2-α,t1/2-β和曲线下面积(AUC)表示。例如可以参考下面的实验部分，以及标准手册，例如Kenneth,A等:Chemical Stability ofPharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists和Peters等,Pharmacokinete analysis:A Practical Approach(1996)。还可以参考"Pharmacokinetics",M Gibaldi&D Perron,Marcel Dekker出版,第2版修改版(1982)。术语“半衰期的增加”或“增加的半衰期”也如WO08/020079第57页段o)所定义的，特别指t1/2-β的增加，伴随或不伴随着t1/2-α和/或AUC或二者的增加。
q)关于靶标或抗原，术语靶标或抗原上的“相互作用位点”指靶标或抗原上的位点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基序列段(stretch)，其是靶标或抗原的与配体、受体或其它结合配偶体的结合位点、催化位点、切割位点、变构相互作用位点、多聚化(例如同聚化或异二聚化)中涉及的位点；或者靶标或抗原的生物学作用或机制中涉及的靶标或抗原上的任何其它位点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基序列段(stretch)。更通常地，“相互作用位点”可以是本发明的氨基酸序列或多肽能够结合并使得靶标或抗原(和/或涉及所述靶标或抗原的任何途径、相互作用、信号传导、生物学机制或生物学效应)被调节(如本文所定义的)的所述靶标或抗原上的任何位点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基序列段(stretch)。
r)当其与第一抗原以(所述氨基酸序列或多肽与第二靶标或多肽结合的亲和力)至少10倍、如至少100倍、和优选至少1000倍和至多可达10000倍或更高的亲和力/抗体亲抗原性(如上所述的，适合地表达为KD值，KA值，Koff速率和/或Kon速率)结合，则将免疫球蛋白单可变结构域或多肽称为相对于第二靶标或抗原而言对第一靶标或抗原是“特异的”。例如，第一抗原可以与靶标或抗原以比所述氨基酸序列或多肽与第二靶标或抗原结合的KD小至少10倍，例如小至少100倍，其优选小至少1000倍，例如10000倍以下的KD值结合。优选地，当与第二靶标或抗原相比，免疫球蛋白单可变结构域或多肽对第一靶标或抗原是“特异的”时，它针对(如本文所定义的)所述的第一靶标或抗原，而不针对所述第二靶标或抗原。
s)交叉阻断(cross-block)”、“被交叉阻断(cross-blocked)”和“交叉阻断的(cross-blocking)”在本文中可互换使用，指免疫球蛋白单可变结构域或多肽干扰天然配体与其一种或多种受体结合的能力。本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽能够干扰另一种化合物如天然配体与其靶标，例如CXCR4结合的程度，并且因此无论其是否可被称为根据本发明的交叉阻断，可以使用竞争性结合检测测定。一种特别适合的定量交叉阻断检测使用基于FACS-或基于ELISA的方法或测量标记的(例如带His标记的或生物素化的)根据本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽及其它结合试剂之间就它们与靶标的结合而言的竞争。实验部分一般性地描述了用于测定结合分子是否交叉阻断或者能交叉阻断本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽的适合的基于FACS-、基于ELISA-或基于置换的检测。应当认识到所述检测可用于本文所描述的任何免疫球蛋白单可变结构域或其它结合试剂。因此，通常，根据本发明的交叉阻断氨基酸序列或其它结合剂是例如与上述交叉阻断检测中的靶标结合的，以使得在检测过程中以及在存在本发明的第二氨基酸序列或其它结合剂的条件下，所记录的根据本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽被0.01 mM或更少量的待测的可能的交叉阻断试剂(交叉阻断试剂可以是另一种常规单克隆抗体例如IgG，经典单价抗体片段(Fab,scFv))和改造的变体(例如双抗体、三抗体、微抗体、VHHs、dAbs、VHs、VLs)的置换为最大理论置换(例如被需要被交叉阻断的非标记的(例如未标记的)免疫球蛋白单可变结构域或多肽置换)的60％-100％之间(例如在基于的竞争检测中)或者80％-100％之间(例如在基于FACS的竞争检测中)。
t)如果所述VHH1型免疫球蛋白单可变结构域或1型VHH序列具有85％同一性(使用VHH1共有序列作为查询序列并且将具有标准设置(即，blosom62得分矩阵)的blast算法)用于VHH1共有序列(QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCISSS-DGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA),并且在位置50强制地具有半胱氨酸(即，C50)(使用Kabat编号)，则表明氨基酸序列如例如根据本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽是“VHH1型免疫球蛋白单可变结构域”或“1型VHH序列”。
u)如果氨基酸序列例如根据本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽对两个不同抗原或抗原决定簇(例如来自两个不同哺乳动物物种的血清白蛋白，例如人血清白蛋白和猕猴血清白蛋白)是特异的，那么将其称为对这些不同的抗原或抗原决定簇是“交叉反应的”。
v)如WO 08/020079(通过引用合并入本文)第58和59页段q)所进一步描述的，根据Kabat等给出的VH结构域的通用编号(“Sequence of proteins of immunologicalinterest”,US Public Health Services,NIH Bethesda,MD,公布号91)对免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸残基进行编号，如Riechmann和Muyldermans,J.Immunol.Methods 2000Jun 23；240(1-2):185-195的文章(参见例如该出版物的图2)中应用于骆驼科动物的VHH结构域的那样，相应地，免疫球蛋白单可变结构域的FR1包含1-30位的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的CDR1包含31-35位的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的FR2包含36-49位的氨基酸，免疫球蛋白单可变结构域的CDR2包含50-65位的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的FR3包含66-94位的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的CDR3包含95-102位的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的FR4包含103-113位的氨基酸残基。
w)所给出的附图、序列表和实验部分/实施例仅仅是进一步举例说明本发明，不应理解或解释为以任何方式限制本发明和/或所附权利要求的范围，除非本文另外明确指出。
x)半数最大抑制浓度(IC50)是化合物在抑制生物或生化功能方面的效应，例如药理学效应的测量。该定量测量表示半数抑制给定生物学过程(或过程的组分，即酶、细胞、细胞受体、趋化作用、HIV进入、HIV复制、HIV逆转录酶活性等)需要多少ISV或纳米抗体(抑制剂)。换句话说，其是物质的半数最大(50％)抑制浓度(IC)(50％IC，或IC50)。药物的IC50可以通过构建剂量响应曲线和检查不同浓度的拮抗剂如本发明的ISV或纳米抗体对逆转激动活性的影响来确定。可以通过确定抑制半数的激动剂的最大生物学响应所需的浓度对给定拮抗剂如本发明的ISV或纳米抗体计算IC50值。术语半数最大有效浓度(EC50)是指在指定的暴露时间之后，诱导基线和最大值之间的半数的响应的化合物浓度。在本文中其用作多肽的、ISV的或纳米抗体的效力的测量值。分级的剂量响应曲线的EC50表示观察到其最大效应的50％的情况下化合物的浓度。浓度优选以摩尔单位表达。
在生物系统中，配体浓度的小的改变通常导致响应符合S形曲线函数的快速改变。随配体浓度增加而响应增加开始变缓处的拐点是EC50。这可以通过对最佳拟合线求导来从数学上确定。在多数情况下，依赖于图表来评估是方便的。在实验部分提供EC50的情况下，设计实验以尽可能精确地反映KD。换句话说，EC50值因此可以被认为是KD值。术语“平均KD”涉及与至少1个，但优选多于1个，如至少2个实验中获得的平均KD值。术语“平均”是指数学术语“平均”(数据的总和除以数据中的项数)。
还涉及IC50，其是化合物的抑制(50％抑制)的测量值。对于竞争结合测定和功能性拮抗剂测定，IC50是剂量响应曲线的最常见概要测量。对于激动剂/刺激剂测定，最常见的概要测量是EC50。
不同种类的小分子抑制剂对HIV感染的协同抑制是已知的。一般而言，这些抑制剂针对来源于病毒的组分，但是更少涉及参与HIV感染的细胞宿主组分，诸如人类受体(CD4)和共同受体。本发明人证明了通过针对共同受体(CR)和受体CD4的双特异性多肽的结合导致了两种结合部分在抑制HIV感染中的协同作用(参见实施例4)。令人惊奇地，双特异性多肽比两个单独部分的组合格外地更加有效(参见实施例8)。
本发明涉及特定多肽，也称为“本发明的多肽”、“双特异性多肽”、“双特异性构建体”或“双特异性纳米抗体构建体”，其包含或基本上由以下各项组成：(i)第一结构单元，其基本上由第一免疫球蛋白单可变结构域组成，其中所述第一免疫球蛋白单可变结构域结合细胞表面上的第一靶标，HIV受体诸如CD4；和(ii)第二结构单元，其基本上由第二免疫球蛋白单可变结构域组成，其中所述第二免疫球蛋白单可变结构域结合细胞表面上的第二靶标、优选HIV共同受体，且其中所述CR不是CD4。
两种或多种药剂之间的“协同作用”是指药剂的组合效应大于它们的加和效应。说明性地，药剂可以是肽，蛋白质、诸如抗体，小分子，有机化合物及其药物形式。使用联合指数(Combination Index,CI)方法通过分析剂量-反应曲线可以量化药剂之间的协同、加和或拮抗效应。大于1的CI值表示拮抗作用；等于1的CI值表示加和效应；小于1的CI值表示协同效应。在一个实施方案中，协同相互作用的CI值小于0.9。在另一个实施方案中，CI值小于0.8。在一个优选实施方案中，CI值小于0.7(参见实施例4以及Chou和Talalay，1984，其通过引用并入本文)。术语拮抗剂在本领域中是公知的。本质上，术语拮抗剂涉及对抗和阻断行为的物质。例如，拮抗剂对其同源受体具有亲和力但没有效力，并且结合将破坏相互作用并抑制受体处激动剂或反向激动剂的功能。
“HIV”是指人类免疫缺陷病毒。HIV应包括但不限于HIV-1和HIV-2。HIV-1包括但不限于细胞外病毒颗粒和与HIV-1感染细胞相关的HIV-1形式。人类免疫缺陷病毒(HIV)可以是两种已知类型的HIV(HIV-1或HIV-2)中的任一种。HIV-1病毒可以表示任何已知的主要亚型(A、B、C、D、E、F、G、H或J类)，偏远亚型(O组)或尚待确定的HIV-1亚型。HIV-1JRFL是最初在尸检时从AIDS患者的脑组织中分离的株。该病毒已被克隆，并且其包膜糖蛋白的DNA序列是已知的(GenBank登录号U63632)。就对病毒进入抑制剂的敏感性而言，已知HIV-1JFRL是极具代表性的主要HIV-1分离株。“JRCSF”是指亚型B的HIV-1分离株。JRCSF是最初从AIDS患者的脑脊髓液和脑组织分离的株(Science 236,819-822,1987)。该病毒已被克隆，并且其基因组DNA序列是已知的(GenBank登录号M38429)。与HIV分离株JRFL不同，JRCSF无法有效地感染巨噬细胞。使用CXCR4的(X4)HIV-1克隆NL4.3获自国立卫生研究院NIAID AIDS试剂项目(National Institutes of Health NIAID AIDS Reagent program)(Bethesda，MD)。使用CCR5的(R5)HIV-1株BaL获自医学研究委员会AIDS试剂项目(Medical Research CouncilAIDS reagent project)(Herts，UK)。双趋向性(R5/X4)HIV-1HE株最初从Leuven大学医院的患者分离。
本发明的多肽经设计以抑制HIV感染。
术语“HIV感染”是指HIV进入易感细胞。1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的细胞感染是由病毒包膜(Env)糖蛋白gp120和gp41介导的，它们在病毒和病毒感染的细胞的表面上表达为非共价寡聚复合物。病毒进入靶细胞是通过细胞表面的一系列事件进行的，包括(1)HIV表面糖蛋白gp120与细胞表面受体CD4之间的高亲和力相互作用，(2)Env与融合共同受体的结合，和(3)病毒跨膜糖蛋白gp41的构象变化，其介导了病毒和细胞膜的融合。
本质上，抑制HIV感染涉及抑制HIV生命周期中的至少一种功能，优选多于一种功能。这些功能包括例如HIV与受体CD4的结合，HIV与共同受体的结合，HIV进入靶细胞，HIV的复制，HIV逆转录酶活性，HIV诱导的细胞死亡，和/或HIV诱导的细胞-细胞合胞体形成。优选地，HIV的传播受到抑制。HIV感染的抑制可以通过体外和体内的各种方法来测量。优选地，抑制HIV感染导致减少病毒载量或维持减少的病毒载量，并优选通过改善HIV感染的受试者的医学状况。术语“病毒载量”是指血样中HIV颗粒的量，通常表示为每毫升血液的拷贝数。例如，超过100,000拷贝/ml的病毒载量将被认为是高的，而小于10,000拷贝/ml的病毒载量将被认为是低的。优选地，病毒载量降低到不可检测的水平(<50拷贝/ml)。
如本文所用，抑制包括完全抑制和部分抑制二者。因此，本公开包括包含两个以上免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其以大于1％、大于2％、大于5％、大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％、大于90％或多达100％的抑制程度来抑制HIV与CD4和/或共同受体(诸如CXCR4)的结合。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽抑制HIV感染达约10％、20％、30％、40％、50％、60％、80％、90％和优选95％以上(诸如100％)(如HIV感染测定所测量的)。
应该理解的是，抑制也可以用IC50(抑制浓度)来表示，定义为50％的HIV被抑制而不结合受体或共同受体(诸如例如CXCR4)时的抑制浓度。在一些实施方案中，包含两个以上免疫球蛋白单可变结构域的多肽抑制HIV结合CD4或共同受体(诸如例如CXCR4)的IC50是低于500μM，低于100μM，低于50μM，低于10μM，低于50μM，低于1μM，低于500nM，低于100nM，低于90nM，低于80nM，低于70nM，低于60nM，低于50nM，低于40nM，低于30nM，低于20nM，低于10nM，低于9nM，低于8nM，低于7nM，低于6nM，低于5nM，低于4nM，低于3nM，低于2nM，低于1nM,低于100pM,低于50pM,低于10pM，低于5pM、4、3、2、1、0.5pM，或甚至或甚至更小，诸如小于0.4pM。
在一些实施方案中，本发明的多肽抑制HIV结合CD4和/或共同受体(诸如例如CXCR4)的IC50低于50nM。在一些实施方案中，本发明的多肽抑制HIV结合CD4和/或共同受体(诸如例如CXCR4)的IC50低于1nM。在一些实施方案中，本发明的多肽抑制HIV结合CD4和/或共同受体(诸如例如CXCR4)的IC50低于10pM。
类似地，抑制也可以用EC50表示(参见上文)。因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中HIV抑制的平均EC50值是在10nM至0.1pM之间，诸如10nM以下的平均EC50值，甚至更优选9nM以下的平均EC50值，诸如小于8、7、6、5、4、3、2、1、0.5nM或甚至更小，诸如小于400、300、200、100、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5pM或甚至更小，诸如小于0.4pM。
在一个方面，本公开提供了包含两个以上免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其抑制HIV与CD4和/或共同受体(诸如例如CXCR4)的结合。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽抑制HIV与CD4+CXCR4+细胞的融合。
抗HIV化合物在抑制HIV感染中的效力可以通过本领域技术人员普遍已知的各种方法来测量。例如，可以用转化的T细胞系(SupT1、H9、Molt4)、原代血源性单核细胞(PBMC)或巨噬细胞进行基于细胞的抗病毒测定。HIV复制的实验读出可以通过p24病毒抗原的ELISA、监测逆转录酶、tat-表达、监测报告病毒或通过病毒抗原(分别例如Gag蛋白或Env)的细胞内或表面染色来进行。使用多种表达HIV受体和共同受体的稳定报告细胞系的单循环感染性测定可以用于使用单循环或准单循环测定来评价HIV的感染性或基于HIV的假型的感染性。抗HIV化合物在抑制HIV感染中的效力也可以通过用于HIV的体外模型来测量，包括评价从潜伏感染的细胞中重新激活病毒复制并产生HIV病毒的能力的测定；同步感染中的测定，病毒进入抑制的评价，HIV逆转录酶活性的确定，整合酶测定；抗性变体的表征，包括确定基因型和表型变异；HIV蛋白酶活性的评价，进入测定，整合测定，抗体中和测定，共同受体确定，HIV诱导的CD4和I类MHC的下调，慢性感染细胞(具有确定的HIV复制)中的抗HIV活性，感染细胞中CPE效应的评价(合胞体形成、凋亡、直接杀死)。所有这些方法是确定的方法且是本领域技术人员公知的。
在一些实施方案中，HIV与CD4或CR(诸如例如CXCR4)的结合(的抑制)由生化测定确定。在一些实施方案中，HIV与CD4或CR(诸如例如CXCR4)的结合(的抑制)由功能性测定确定。在一些实施方案中，测定是竞争测定，例如与天然配体的竞争测定，和/或可以包括与标准的比较。
在一些实施方案中，生化测定包括这样的步骤：使包含完整或部分CD4或CR序列(诸如例如CXCR4序列)的多肽或者表达这种序列的细胞与HIV或一种或多种HIV蛋白或可与CD4或CR(诸如例如CXCR4序列)结合的HIV蛋白片段接触。随后可以通过多种方法确定结合，包括ELISA(例如通过使用检测一种或两种结合配偶体的存在的抗体)，表面等离子共振或基于荧光的技术(诸如FRET)。
功能性测定包括基于CD4和/或CR(诸如例如CXCR4)和/或HIV的一种或多种生物学功能的抑制或增加的测定，并且通常在活细胞(例如，表达CD4和/或CXCR4的细胞，参见实验部分)上进行。例如，CXCR4激活(例如通过天然配体结合)引发了当CXCR4被HIV结合时被抑制的细胞信号传导途径。因此，监测这种途径的下游事件，例如cAMP的水平，提供了一种功能性测定，其允许确定HIV的CXCR4结合和/或天然配体的置换(参见实施例部分)。或者，HIV结合表达CD4和/或CR(诸如例如CXCR4)的细胞可以导致细胞功能(例如吞噬作用)的改变，并且可以通过量化由HIV结合诱导的细胞功能来监测HIV结合的抑制。
在HIV传播期间，CD4+T细胞不仅可以被无细胞病毒体感染，更重要的是也可以通过与供体HIV感染的T细胞的紧密细胞-细胞接触而受到感染。如实施例9所述，这可以基于细胞共培养物中巨细胞或合胞体的出现来测量。因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽抑制HIV诱导的细胞-细胞合胞体形成。
本发明的多肽提供比现有技术抗体更特异的HIV感染抑制。优选地，本发明的双特异性多肽包含至少两个结合部分，诸如例如两个结构单元、ISV或纳米抗体，其中至少第一结合部分(功能性ISV)对CD4特异。
术语本发明的多肽、双特异性多肽、双特异性构建体和双特异性纳米抗体构建体、双特异性和双特异性抗体在本文中可替换地使用。
因此，本发明涉及多肽，其包含第一和第二免疫球蛋白单可变结构域(ISV)，其中
-所述第一ISV结合存在于细胞表面上的CD4；
-所述第二ISV结合存在于所述细胞表面上的共同受体(CR)；并且
其中所述CR不是CD4。
在一个方面，本公开提供了抑制HIV结合CXCR4的包含一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽。
在一些实施方案中，多肽包含如本文公开的至少两个以上免疫球蛋白单可变结构域。在一些实施方案中，多肽基本上由如本文公开的两个以上免疫球蛋白单可变结构域组成。“基本上由”两个以上免疫球蛋白单可变结构域“组成”的多肽是除了如本文公开的两个以上免疫球蛋白单可变结构域之外不具有另外的免疫球蛋白单可变结构域的多肽。例如，基本上由两个免疫球蛋白单可变结构域组成的多肽不包括任何另外的免疫球蛋白单可变结构域。然而，应当理解的是基本上由两个以上免疫球蛋白单可变结构域组成的多肽可以包括另外的功能性，诸如标记、毒素、一个或多个接头、结合序列等。这些另外的功能性包括基于氨基酸的基团和基于非氨基酸的基团二者。在一些实施方案中，多肽由如本文公开的一个或多个免疫球蛋白单可变结构域组成。应该理解的是，术语“多肽构建体”和“多肽”在本文中可替换地使用(除非上下文另有明确说明)。
在一些实施方案中，多肽包括包含如本文公开的免疫球蛋白单可变结构域的多价或多特异性构建体。在一些实施方案中，多肽包含如本文公开的一种或多种基于抗体的支架和/或基于非抗体的支架。在一些实施方案中，多肽包含血清结合蛋白部分。在一些实施方案中，血清结合蛋白部分是免疫球蛋白单可变结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白单可变结构域是VHH、人源化的VHH或骆驼源化的VH。
两个或更多个免疫球蛋白单可变结构域可以组合成单个多肽，产生多价和/或多特异性多肽，例如双特异性多肽。双价和/或双特异性多肽允许与单个免疫球蛋白单可变结构域相比改善的构建体亲合力(即，对于期望的抗原)，和/或用于可以结合两种或更多种不同抗原的构建体。在一些实施方案中，多特异性多肽包含结合相同靶标的两个以上免疫球蛋白单可变结构域，由此增加对结合单一抗原的亲和力。在一些实施方案中，多肽是双互补位的。本发明的双特异性或多特异性多肽包含或基本上由至少两个结构单元(例如ISV)组成，其中第一结构单元(例如第一ISV)在通过第二结构单元(例如第二ISV)结合其抗原(即第二靶标)时，对其抗原(即第一靶标)具有增加的亲和力。这样的增加的亲和力(表观亲和力)，由于亲合力效应，也称为‘条件性双特异性或多特异性结合’。这样的双特异性或多特异性多肽也称为‘本发明的条件性结合的双特异性或多特异性多肽’。
将理解的是，第一结构单元和第二结构单元在多肽上的顺序(取向)可以根据本领域技术人员的需要选择，以及根据可取决于这些结构单元在多肽中的位置的相对亲和力选择。多肽是否包含接头是设计选择的问题。然而，与其他取向相比，一些取向(有或没有接头)可以提供优选的结合特征。例如，第一和第二结构单元在本发明的多肽中的顺序可以是(从N-末端到C-末端)：(i)第一结构单元(例如第一ISV，诸如第一纳米抗体)-[接头]-第二结构单元(例如第二ISV，诸如第二纳米抗体)；或(ii)第二结构单元(例如第二ISV，诸如第二纳米抗体)-[接头]-第一结构单元(例如第一ISV，诸如第一纳米抗体)；(其中接头是任选的)。所有取向都包括在本发明中。含有提供所需(结合)特性的结构单元取向的多肽可以容易地通过常规筛选鉴定，例如如实验部分举例说明的。
如前所述，发明人尤其证明了即使在强制性实验室环境中，完成HIV对双特异性多肽的抗性也是极其困难的(参见实施例8)。令人惊讶地发现即使在针对一种靶标具有抗性的HIV株中(例如抗-CD4部分)，双特异性多肽对抑制HIV感染仍然是有效的。因此，这种性质将双特异性多肽的使用扩展到这样的可能的效力：其针对对一种部分药剂不具有固有抗性的异源株以及对另一种部分不具有固有抗性的另一种HIV株。
本发明涉及抑制受试者中易感细胞被HIV病毒的HIV感染的方法，所述HIV病毒对CD4拮抗剂具有抗性或已经变得具有抗性，所述方法包括使易感细胞经受有效HIV感染抑制剂量的如本文所述的多肽(其抑制HIV与CD4+CXCR4+细胞的融合)，优选其中有效HIV感染抑制剂量包含每千克受试者体重0.1mg至25mg，以致由此抑制易感细胞被HIV1感染，所述HIV1对CD4拮抗剂具有抗性或已经变得具有抗性。
如本文中使用的，术语“效力”是药剂，如多肽、ISV或纳米抗体，其生物学活性的测量。药剂的效力可以通过本领域中已知的任何合适的方法，如例如实验部分中所述的方法确定。基于细胞培养的效力测定常常是用于确定生物学活性的优选形式，因为它们测量药剂诱导的生理学响应，并且可以在相对短的时期产生结果。基于产物的作用机制，可以使用基于各种类型的细胞的测定，包括但不限于增殖测定、细胞毒性测定、报告基因测定、细胞表面受体结合测定和测量对功能上关键的蛋白或其他信号分子(如磷酸化蛋白、酶、细胞因子、cAMP等)的诱导/抑制的测定，全部是本领域中已知的。来自基于细胞的效力测定的结果可以表达为“相对效力”，如通过将本发明的双特异性多肽与对于相应参考单价ISV(例如仅包含一种ISV或一种纳米抗体，任选地进一步包含不相关纳米抗体的多肽(参见实验部分))获得的响应相比较来确定的。
表明当在给定测定中对于化合物(例如双特异性多肽)所获得的响应比由参考化合物(例如相应单价ISV或纳米抗体)导致的响应好(例如功能上好)至少2倍，但优选为至少3倍，如至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少75倍、至少100倍，并且甚至更优选为甚至至少200倍，或甚至至少500倍，或甚至1000倍时，化合物(例如双特异性多肽)比参考化合物(例如化合物诸如小分子或针对相同靶标的(常规)抗体或相应单价或单特异性ISV或纳米抗体或包含相应单价或单特异性ISV或纳米抗体的多肽)更具效力。
本发明的细胞尤其涉及哺乳动物细胞，并且优选为灵长类细胞并且甚至更优选为人细胞。
细胞优选是免疫细胞，诸如T辅助细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突细胞，优选CD4+T辅助细胞(也称为CD4细胞、CD4+细胞、T辅助细胞或T4细胞)，优选CD4+CXCR4+细胞，甚至更优选人细胞。在一些实施方案中，细胞是在体内的。在一些实施方案中，细胞是在体外的。
膜(也称为质膜或磷脂双层)围绕细胞的胞质，其是细胞的外边界，即膜是细胞的表面。该膜用于将细胞与外界环境分离和保护细胞并且大多由磷脂双层制成。该膜中嵌入的是多种蛋白分子，如通道、泵和细胞受体。因为膜是流体，蛋白分子可以在膜内移动。
对于免疫球蛋白单可变结构域的一般描述，对以下进一步描述，以及对本文引用的现有技术进行参考。然而在这点上，应该注意，本描述和现有技术主要描述所谓的“VH3型”的免疫球蛋白单可变结构域(即，与VH3型的人生殖系序列如DP-47、DP-51或DP-29具有高度序列同源性的免疫球蛋白单可变结构域)，其形成本发明的优选方面。然而，应该注意，本发明在其最广泛的意义上覆盖任何类型的免疫球蛋白单可变结构域并且例如还涵盖属于所谓“VH4型”的免疫球蛋白单可变结构域(即，与VH4型的人生殖系序列如DP-78具有高度序列同源性的免疫球蛋白单可变结构域)，如例如WO 07/118670中所述的。
通常，免疫球蛋白单可变结构域(尤其是VHH序列和序列优化的免疫球蛋白单可变结构域)可以尤其特征为在一个以上的构架区序列(也如本文中进一步描述的)中存在以上“特征残基(Hallmark residues)”(如本文所述)。
因此，通常，免疫球蛋白单可变结构域可以定义为具有(一般)结构的氨基酸序列(参见下式1)
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1至FR4分别是指构架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别是指互补决定区1至3。
在优选的方面，本发明提供包含至少一个为具有以下(一般)结构的氨基酸序列的免疫球蛋白单可变结构域的多肽
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1至FR4分别是指构架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别是指互补决定区1至3，并且其中：
i)根据Kabat编号的位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108处的氨基酸残基中的至少一个选自下表A-1中提及的特征残基；并且其中：
ii)所述氨基酸序列与WO 2009/138519中所示的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种(参见WO 2009/138519中SEQ ID NO：1至125)具有至少80％，更优选为90％，甚至更优选为95％氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度，不考虑形成CDR序列(在序列中用X表示)的氨基酸残基；并且其中：
iii)CDR序列通常如本文中进一步限定的(例如，可以以本文中提供的信息确定的组合中的CDR1、CDR2和CDR3，注意CDR定义根据Kabat编号体系计算)。
表A-1：VHHs中的特征残基
本发明的免疫球蛋白还可以含有C-末端延伸(X)n(其中n为1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(并且优选1或2，诸如1)；并且各X是(优选天然存在的)氨基酸残基，该氨基酸残基独立地选自且优选独立地选自由丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)组成的组)，其涉及所有标题为“Improved immunoglobulin variable domains(改进的免疫球蛋白可变结构域)”的WO 12/175741和美国临时申请：2014年5月16日递交的US61/994552；2014年6月18日递交的US 61/014,015；2014年8月21日递交的US 62/040,167；和2014年9月8日递交的US 62/047,560(全部转让于Ablynx N.V.)。
而且，这样的免疫球蛋白单可变结构域可以以任何适当的方式来自于任何适当的来源，例如可以是天然存在的VHH序列(即来自于适合的骆驼科动物种属，例如美洲驼)或者合成的或半合成的VHs或VLs(例如来自于人)。这种免疫球蛋白单可变结构域可以包括通过例如亲和力成熟(例如由合成的、随机的或天然存在的免疫球蛋白序列开始)、CDR移植、镶饰、组合来源于不同免疫球蛋白序列的片段、使用重叠引物进行PCR装配、以及本领域技术人员熟知的改造的免疫球蛋白序列的类似技术改变的“人源化的”或者其它“序列优化的”VHHs，“骆驼源化的”免疫球蛋白序列(特别是骆驼源化的重链可变结构域序列，即骆驼源化的VHs)，以及人VHs，人VLs，骆驼科动物的VHHs；或者前述任一种的任何适当的组合，如本文进一步描述的。如本文中所述，特别优选的本发明的免疫球蛋白单可变结构域的类型包含具有与天然存在的VHH结构域的氨基酸序列对应，但被“人源化(humanized)”的氨基酸序列的免疫球蛋白单可变结构域，所述人源化即通过用在来自人类(例如上文指出的)的常规4-链抗体的VH结构域中的相应一个或多个位置处出现的氨基酸残基中的一个或多个替代所述天然存在的VHH序列(并且尤其是在构架序列中)的氨基酸序列中的一个以上氨基酸残基。这可以以技术人员将明确的本身已知的方式进行，例如基于本文中进一步的描述和本文引用的人源化方面的现有技术。再次，应该注意，本发明的这样的人源化的免疫球蛋白单可变结构域可以以本身已知的任何合适的方式获得并且因此不严格限于使用包含天然存在的VHH结构域的多肽作为起始材料获得的多肽。
另一特别优选的本发明的免疫球蛋白单可变结构域的类型包含具有对应于天然存在的VH结构域的氨基酸序列，但被“骆驼化(camelized)”的氨基酸序列的免疫球蛋白单可变结构域，所述骆驼化即通过用重链抗体的VHH结构域中的一个或多个相应位置处存在的氨基酸残基中的一个或多个替代来自常规4-链抗体的天然存在的VH结构域的氨基酸序列中的一个以上氨基酸残基。这可以以技术人员将明确的本身已知的方式，例如基于本文中所述进行。这样的“骆驼化”置换优选插入在VH-VL界面处形成和/或存在的氨基酸位置处，和/或在所谓的骆驼科特征残基处，如本文中定义的(还参见例如WO 94/04678以及Davies和Riechmann(1994和1996))。优选地，用作用于产生或设计骆驼化免疫球蛋白单可变结构域的起始材料或起始点的VH序列优选为来自哺乳动物的VH序列，更优选为人类的VH序列，如VH3序列。然而，应该注意的是，本发明的这样的骆驼化的免疫球蛋白单可变结构域可以以任何本身已知的合适的方式获得，并且因此不严格限于使用包含天然存在的VH结构域的多肽作为起始材料获得的多肽。
例如，又如本文中进一步描述的，“人源化”和“骆驼化”二者可以通过提供分别编码天然存在的VHH结构域或VH结构域的核苷酸序列进行，并随后以本身已知的方式，以这样的方式改变所述核苷酸序列中的一个以上密码子：新核苷酸序列分别编码本发明的“人源化”或“骆驼化”免疫球蛋白单可变结构域。该核酸可以随后以本身已知的方式表达，从而提供本发明所需的免疫球蛋白单可变结构域。备选地，分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列，可以分别设计本发明所需的人源化或骆驼化的免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸序列，并随后使用本身已知的肽合成技术从头合成。此外，分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列或核苷酸序列，可以分别设计编码所需的本发明的人源化或骆驼化的免疫球蛋白单可变结构域的核苷酸序列，并随后使用本身已知的用于核酸合成的技术从头合成，这之后，因此获得的核酸可以以本身已知的方式表达，从而提供本发明所需的免疫球蛋白单可变结构域。
通常，包含或基本上由单个结构单元、单个免疫球蛋白单可变结构域或单个纳米抗体组成的蛋白或多肽在本文中将分别称为“单价”蛋白或多肽或称为“单价构建体”，或单价结构单元，单价免疫球蛋白单可变结构域或单价纳米抗体。包含或基本上由两种以上免疫球蛋白单可变结构域(如至少两种本发明的免疫球蛋白单可变结构域)组成的蛋白和多肽将在本文中称为“多价”蛋白或多肽或称为“多价构建体”，并且与本发明的相应单价免疫球蛋白单可变结构域相比，这些提供某些优势。从本文中进一步的描述，这样的多价构建体的一些非限制实例将变得明确。本发明的多肽是“多价的”，即包含两个以上结构单元或ISV，其中至少第一结构单元、ISV或纳米抗体和第二结构单元、ISV或纳米抗体不同，并且针对不同靶标，如抗原或抗原决定簇。含有至少两个结构单元、ISVs或纳米抗体(其中至少一个结构单元、ISV或纳米抗体针对第一抗原的本发明的多肽(即，针对第一靶标，如例如CD4)并且至少一个结构单元、ISV或纳米抗体针对第二抗原(即，针对不同于第一靶标的第二靶标，如例如CR，例如CXCR4)，还将被称为本发明的“多特异性”多肽，并且该多肽中存在的结构单元、ISV或纳米抗体在本文中还将被称为是“多价形式”。因此，例如，本发明的“双特异性”肽是包含至少一个针对第一靶标(例如CD4)的结构单元、ISV或纳米抗体和至少一个针对第二靶标(即，针对不同于所述第一靶标的第二靶标，如例如CR，例如CXCR)的其它结构单元、ISV或纳米抗体的多肽，而本发明的“三特异性”多肽是包含至少一个针对第一靶标(例如，CD4)的结构单元、ISV或纳米抗体，针对不同于所述第一靶标的第二靶标(例如CR，如例如CXCR)的第二结构单元、ISV或纳米抗体和至少一个针对第三抗原(即，不同于第一和第二靶标二者)，如，例如，血清白蛋白等的其他结构单元、ISV或纳米抗体的多肽。如将从说明书明确的，在本发明的多特异性多肽可以包含至少针对第一靶标的第一结构单元、ISV或纳米抗体，针对第二靶标的第二结构单元、ISV或纳米抗体和任意数量的针对一个以上可以分别与第一和/或第二靶标相同或不同的靶标的结构单元、ISVs或纳米抗体的意义上，本发明不限于双特异性多肽。结构单元、ISVs或纳米抗体可以任选地经由接头序列连接。
因此，本发明还涉及三特异性或多特异性多肽，其包含或基本上由至少三个结合部分，如三个ISV组成，其中所述至少三个结合部分中的至少一个以低、中等、高亲和力针对第一靶标，所述至少三个结合部分的至少一个部分以高亲和力针对第二靶标，和增加半衰期的至少第三结合部分，如例如白蛋白结合物。
如通过上述和本文的进一步描述变得清楚的那样，本发明的免疫球蛋白单可变结构域可以用做“结构单元”以形成本发明的多肽，例如通过适当地将它们与其它基团、残基、结构部分或结合单元组合，以形成本文所述的化合物或构建体(例如但不限于本文所描述的本发明的双/三/四/多价的和双/三/四多特异性的多肽)，其在一个分子内组合了一种或多种所希望的特性或生物学功能。
本发明的化合物或多肽通常可以通过下述方法制备：其包含至少一个将一个或多个本发明的免疫球蛋白单可变结构域与一个或多个另外的基团、残基、结构部分或结合单元任选地通过一个或多个适合的接头适当地连接的步骤，以提供本发明的化合物或多肽。本发明的多肽还可以通过下述方法制备：其通常包括提供编码本发明的多肽的核酸，以适当的方式表达所述核酸，回收表达的本发明的多肽的步骤。这种方法可以以本身已知的方式实施，其对于本领域技术人员来说是清楚的，例如基于在本文进一步描述的方法和技术。
由本发明的氨基酸序列开始，设计/选择和/或制备本发明的化合物或多肽的工艺在本文中也被称为本发明的所述氨基酸序列的“格式化(formatting)”；作为本发明的化合物或多肽的一部分的本发明的氨基酸被称为“格式化的”或“格式形式的”本发明的所述化合物或多肽。本发明的氨基酸序列格式化方式的实例以及这种格式的实例在本文公开的基础上对本领域技术人员来说是清楚的；这种格式化的免疫球蛋白单可变结构域形成本发明的另一个方面。
例如，这种另外的基团、残基、结构部分或结合单元可以是一个或多个另外的免疫球蛋白单可变结构域，这样所述化合物或构建体是(融合)蛋白或(融合)多肽。在优选的但是非限制性的方面，所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单元是免疫球蛋白序列。更优选地，所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单元选自由结构域抗体、适合用作结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域(ISV)、“dAb”’s、适合用作dAb的免疫球蛋白单可变结构域、或纳米抗体组成的组。或者，这种基团、残基、结构部分或结合单元可以例如是化学基团、残基、结构部分，其本身可以具有或不具有生物学和/或药理学活性。例如但不受其限制地，这种基团可以与一个或多个本发明的免疫球蛋白单可变结构域连接以提供本发明的氨基酸序列或多肽的“衍生物”，如本文进一步描述的。
包含一个或多个本文描述的衍生物或基本上由其组成，并且任选地进一步包含一个或多个任选地通过一个或多个接头连接的其它基团、残基、结构部分或结合单元的化合物或构建体也在本发明的范围内。优选地，所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单元是免疫球蛋白单可变结构域。在上述的化合物或构建体中，本发明的一个或多个免疫球蛋白单可变结构域和一个或多个基团、残基、结构部分或结合单元可以直接彼此连接和/或通过一个或多个适合的接头或间隔子连接。例如，当一个或多个基团、残基、结构部分或结合单元是免疫球蛋白单可变结构域时，接头也可以是免疫球蛋白单可变结构域，以使获得的化合物或构建体是融合(蛋白)或融合(多肽)。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述ISV是VHH、人源化的VHH或骆驼源化的VH。
第一个结构单元，ISV，诸如例如本发明的纳米抗体或VHH，对其第一靶标(即CD4和多态变体)具有亲和力。本发明的第一结构单元、ISV或纳米抗体可以例如针对所述第一靶标的抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚单位或构象(在可用的情况下)。针对它对其靶标自身的亲和力选择第一结构单元，例如第一ISV，诸如例如纳米抗体或VHH，不考虑任何亲合力效应的影响。优选的第一结构单元在表A-2(B)中描述。
“CD4”或“T细胞表面糖蛋白CD4”是指包含与HIV-1gp120包膜糖蛋白结合的胞质结构域、疏水性跨膜结构域和胞外结构域的成熟、天然、膜结合的CD4蛋白。CD4也被称为T细胞表面抗原T4/Leu-3。优选地，CD4是人CD4，优选由Uniprot登录号P01730-1(OMIM：186940)表示，例如由以下氨基酸序列表示：
MNRGVPFRHLLLVLQLALLPAATQGKKVVLGKKGDTVELTCTASQKKSIQFHWKNSNQIKILGNQGSFLTKGPSKLNDRADSRRSLWDQGNFPLIIKNLKIEDSDTYICEVEDQKEEVQLLVFGLTANSDTHLLQGQSLTLTLESPPGSSPSVQCRSPRGKNIQGGKTLSVSQLELQDSGTWTCTVLQNQKKVEFKIDIVVLAFQKASSIVYKKEGEQVEFSFPLAFTVEKLTGSGELWWQAERASSSKSWITFDLKNKEVSVKRVTQDPKLQMGKKLPLHLTLPQALPQYAGSGNLTLALEAKTGKLHQEVNLVVMRATQLQKNLTCEVWGPTSPKLMLSLKLENKEAKVSKREKAVWVLNPEAGMWQCLLSDSGQVLLESNIKVLPTWSTPVQPMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRCRHRRRQAERMSQIKRLLSEKKTCQCPHRFQKTCSPI(SEQID NO：1).
如前所述，HIV感染的特征在于在感染者中CD4+T细胞数量的下降。健康的成年人/青少年的CD4计数的范围是500个细胞/ml至1,200个细胞/ml。CD4计数测量了血样中CD4细胞的数量。HIV感染减少了包含CD4的细胞的数量。非常低的CD4计数(小于200个细胞/mm3)是确定携带HIV的人是否已经进展为3期感染(AIDS)的方法之一。
本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽对所述CD4具有选自由以下组成的组的结合速率常数(Kon)：至少约102M-1s-1、至少约103M-1s-1、至少约104M-1s-1、至少约105M- 1s-1、至少约106M-1s-1、107M-1s-1、至少约108M-1s-1、至少约109M-1s-1和至少约1010M-1s-1，优选如通过表面等离子共振所测量的。
本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽对所述CD4具有选自由以下组成的组的解离速率常数(Koff)：至多约10-3s-1、至多约10-4s-1、至多约10-5s-1、至多约10-6s-1、至多约10-7s-1、至多约10-8s-1、至多约10-9s-1和至多约10-10s-1，优选如通过表面等离子共振所测量的。
本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽对所述CD4具有选自由以下组成的组的解离常数(KD)：至多约10-7M、至多约10-8M、至多约10-9M、至多约10-10M、至多约10-11M和至多约10-12M，优选如通过表面等离子共振所测量的。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISV以这样的平均KD值与CD4结合：在10nM至0.1pM之间的平均KD值，诸如10nM以下的平均KD值，甚至更优选9nM以下的平均KD值，诸如小于8、7、6、5、4、3、2、1、0.5nM或甚至更小，诸如小于400、300、200、100、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5pM或甚至更小，诸如小于0.4pM，优选如通过SPR所测量的，例如通过KinExA确定的。动力学排阻分析(Drake等2004,AnalyticalBiochemistry 328:35-43)在不标记结合配偶体的情况下测量溶液中的结合事件，并且是基于动力学排阻复合物的解离。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISV当以单价测量时具有高亲和力。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述平均KD通过表面等离子共振(SPR)在重组蛋白上测量。
本发明还涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISV以10nM至0.1pM之间的EC50值，诸如10nM以下的平均EC50值，甚至更优选9nM以下的平均KD值，诸如小于8、7、6、5、4、3、2、1、0.5nM或甚至更小，诸如小于400、300、200、100、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5pM或甚至更小，诸如小于0.4pM的平均KD值结合细胞表面上的第一靶标。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述平均EC50在包含所述靶标1但基本上缺少所述靶标2的细胞上测量。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述平均KD通过FACS、ELISA，在单价第一ISV(诸如纳米抗体)或包含单价第一ISV(诸如纳米抗体)的多肽上确定。
在实施例中已经表明，KD与EC50良好关联。
还预期的是，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽将通常结合其靶标的所有天然存在的或合成的类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段；或至少结合含有一个以上与本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽结合于CD4并且尤其是人CD4的一个或多个抗原决定簇或一个或多个表位基本上相同的抗原决定簇或表位的CD4并且尤其是人CD4的那些类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段。再次，在这样的情况下，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽可以以与本发明的免疫球蛋白单可变结构域结合(野生型)受体(例如CD4)的亲和力和特异性相同或不同(即，高于或低于)的亲和力和/或特异性结合这样的类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段。
本发明还涉及包含在本发明的多肽中的CD4结合物，其不削弱或抑制或仅最低限度地削弱或抑制CD4的天然功能，其中CD4作为辅助T细胞受体(TCR)与抗原呈递细胞通信的受体起作用。使用其胞内结构域，CD4通过募集一种酶(酪氨酸激酶Lck)来放大由TCR产生的信号，所述酶是激活活化的T细胞的信号级联的许多分子组分所必需的。由此产生各种类型的T辅助细胞。CD4也使用其胞外结构域与抗原呈递细胞表面上的II类MHC分子直接相互作用。本领域技术人员完全有知识来确定和测量CD4的(天然)功能，例如通过在细胞上的测定、竞争ELISA或FACS并且例如在实验部分中描述的。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中例如相对于在缺少所述第一ISV的情况下的抑制，所述第一ISV以小于约50％诸如40％、30％、或20％或甚至小于10％抑制所述第一靶标的药理学效应。
本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽以小于约50％诸如40％、30％或20％或甚至小于10％(诸如小于5％)抑制通过CD4的多聚化。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中例如相对于在缺少所述第一ISV的情况下的抑制，所述第一ISV以小于约50％诸如40％、30％、或20％或甚至小于10％抑制所述第一靶标(与T细胞受体)的多聚化。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISV结合关于CD4的天然功能的变构位点。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISV基本上不抑制或仅少量地抑制所述第一靶标的(天然)功能，例如辅助T细胞受体(TCR)与抗原呈递细胞通信和/或募集酪氨酸激酶Lck。
本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽以小于约50％诸如40％、30％或20％或甚至小于10％(诸如小于5％)抑制通过CD4募集Lck。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中例如相对于在缺少所述第一ISV的情况下的抑制，所述第一ISV以小于约50％诸如40％、30％、或20％或甚至小于10％抑制通过所述第一靶标的信号传导(例如募集Lck)。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中例如相对于在缺少所述第一ISV的情况下的抑制，所述第一ISV以小于约50％诸如40％、30％、或20％或甚至小于10％抑制所述第一靶标的(天然)功能。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中在趋化测定中，例如相对于在缺少所述第一ISV的情况下的抑制，所述第一ISV以小于约50％诸如40％、30％、或20％或甚至小于10％抑制趋化作用。
在一个优选实施方案中，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISV基本上由4个构架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1选自由以下组成的组：SEQ ID NOs:82-85；以及与SEQ ID NOs:82-85具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
(ii)CDR2选自由以下组成的组：SEQ ID NOs:88-91；以及与SEQ ID NOs:88-91具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
(iii)CDR3选自由以下组成的组：SEQ ID NO:96-99以及与SEQ ID NOs:96-99具有1、2、3或4个氨基酸差异的氨基酸序列；
本发明还涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISV基本上由4个构架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中所述ISV选自由以下组成的组：
-CDR1是SEQ ID NO:82，CDR2是SEQ ID NO:88，且CDR3是SEQ ID NO:96；
-CDR1是SEQ ID NO:83，CDR2是SEQ ID NO:89，且CDR3是SEQ ID NO:97；
-CDR1是SEQ ID NO:84，CDR2是SEQ ID NO:90，且CDR3是SEQ ID NO:98；以及
-CDR1是SEQ ID NO:85，CDR2是SEQ ID NO:91，且CDR3是SEQ ID NO:99。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISV基本上由4个构架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中CDR1是SEQ ID NO:85，CDR2是SEQ ID NO:91，且CDR3是SEQ ID NO:99。
本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISV选自由以下组成的组：01B6(SEQID NO:17)、01E2(SEQ ID NO:18)、01H12(SEQ ID NO:19)和03F11(SEQ ID NO:20)，优选所述第一ISV是03F11(SEQ ID NO:20)。
如本文所述，本发明的多肽含有至少两个结构单元，诸如本发明的ISV(例如纳米抗体)，其中第二结构单元，ISV(例如纳米抗体)针对参与HIV感染的第二靶标，即HIV感染的共同受体，包括相关的多态变体。优选的第二结构单元在表A-2(A)中描述。
还预期的是，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽将通常结合其靶标的所有天然存在的或合成的类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段；或至少结合含有一个以上与本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽结合于共同受体、优选CXCR4并且尤其是人CXCR4的一个或多个抗原决定簇或一个或多个表位基本上相同的抗原决定簇或表位的共同受体、优选CXCR4并且尤其是人CXCR4的那些类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段。再次，在这样的情况下，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽可以以与本发明的免疫球蛋白单可变结构域结合(野生型)共同受体(例如CXCR4)的亲和力和特异性相同或不同(即，高于或低于)的亲和力和/或特异性结合这样的类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段。
本发明涉及如上文所述的多肽，其中所述多肽对所述CR具有选自由以下组成的组的结合速率常数(Kon)：至少约102M-1s-1、至少约103M-1s-1、至少约104M-1s-1、至少约105M-1s-1、至少约106M-1s-1、107M-1s-1、至少约108M-1s-1、至少约109M-1s-1和至少约1010M-1s-1，优选如通过表面等离子共振所测量的，所述CR优选是CXCR4。
本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽对所述CR具有选自由以下组成的组的解离速率常数(Koff)：至多约10-3s-1、至多约10-4s-1、至多约10-5s-1、至多约10-6s-1、至多约10-7s-1、至多约10-8s-1、至多约10-9s-1和至多约10-10s-1，优选如通过表面等离子共振所测量的，所述CR优选是CXCR4。
本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽对所述CR具有选自由以下组成的组的解离常数(KD)：至多约10-7M、至多约10-8M、至多约10-9M、至多约10-10M、至多约10-11M和至多约10-12M，优选如通过表面等离子共振所测量的，所述CR优选是CXCR4。
本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第二ISV以这样的平均KD值与CR结合：在10nM至0.1pM之间的平均KD值，诸如10nM以下的平均KD值，甚至更优选9nM以下的平均KD值，诸如小于8、7、6、5、4、3、2、1、0.5nM或甚至更小，诸如小于400、300、200、100、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5pM或甚至更小，诸如小于0.4pM，优选如通过SPR所测量的，例如通过KinExA确定的，所述CR优选是CXCR4。
当，设计本发明的多肽时，针对其自身亲和力选择第二结构单元，例如第二ISV，不考虑任何亲合力效应的影响。
在进一步的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第二ISV当以单价测量时具有高亲和力。
本发明还涉及如本文所述的多肽，其中所述平均KD在单价第二ISV上通过本领域中已知的任何技术，如例如SPR、FACS或ELISA(间接)确定。
本发明的第二ISV可以例如针对所述共同受体并且尤其是人CXCR4的第二抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚单位或构象(在可用的情况下)。
本发明的第二靶标可以是已知作为共同受体参与HIV进入的细胞表面上的任何靶标，诸如细胞受体。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中例如相对于在缺少所述第二ISV的情况下的抑制，所述第二ISV以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、80％、90％并且优选95％或甚至100％抑制HIV与所述第二靶标(诸如例如CR，例如CXCR4)的结合。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中例如相对于在缺少所述第二ISV的情况下的药理学效应，所述第二ISV抑制HIV感染的药理学效应，诸如例如HIV进入靶细胞、HIV的复制、HIV逆转录酶活性、HIV诱导的细胞死亡和/或HIV诱导的细胞-细胞合胞体形成，其中所述第二靶标以约20％、30％、40％、50％、60％、80％、90％并且优选95％或甚至100％参与。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中例如相对于在缺少所述第二ISV的情况下的置换，所述第二ISV对于所述共同受体置换约20％、30％、40％、50％、60％、80％、90％并且优选95％以上的HIV。
优选地，多肽当结合时损害或抑制HIV感染。在优选实施方案中，所述第二靶标的功能和或所述第二靶标在结合双特异性多肽时不受到损害或仅最低限度地受到损害。因此，结合双特异性多肽导致了有限的或可忽略的副作用和/或毒性。
如本文所使用的，共同受体包括但不限于能够结合HIV包膜蛋白的共同受体的胞外部分。本领域技术人员将理解，关于HIV感染的共同受体(诸如例如CXCR4、CCR5、CCR1、CCR2、CCR3、CCR8、CX3CR1、FPRL1、GPR1、GPR15、APJ、STRL33和D6)的序列、功能和配体的更多信息可以通过OMIM和Uniprot网站找到。下表中提供了具体的OMIM和Uniprot登录号。
本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述CR选自由CXCR4、CCR5、CCR1、CCR2、CCR3、CCR8、CX3CR1、CXCR6、FPRL1、GPR1、GPR15、APJ、STRL33和D6组成的组，以及其多态变体。优选地，所述共同受体是CXC趋化因子受体4(CXCR4)。共同受体优选地是人共同受体，优选人CXCR4。
5型C-C趋化因子受体，也称为CCR5或CD195，是参与免疫系统(由于其作为趋化因子的受体)的白血细胞表面的蛋白质。该受体的天然配体，RANTES、MIP-1β和MIP-1α。优选地，CCR5氨基酸序列表示为：
MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIAARLLPPLYSLVFIFGFVGNMLVILILTNCKRLKSMTDIYLLNLAISDLFFLLTVPFWAHYAAAQWDFGNTMCQLLTGLYFIGFFSGIFFIILLTIDRYLAVVHAVFALKARTVTFGVVTSVITWVVAVFASLPGIIFTRSQKEGLHYTCSSHFPYSQYQFWKNFQTLKIVILGLVLPLLVMVICYSGILKTLLRCRNEKKRHRAVRLIFTIMIVYFLFWAPYNIVLLLNTFQEFFGLNNCSSSNRLDQAMQVTETLGMTHCCINPIIYAFVGEKFRNYLLVFFQKHIAKRFCKCCSIFQQEAPERASSVYTRSTGEQEISVGL(SEQ ID NO：3).
CCR1也已被指定为CD191(分化抗原簇191)。该受体的配体包括巨噬细胞炎性蛋白1α(macrophage inflammatory protein 1 alpha，MIP-1α)、调节激活正常T表达和分泌蛋白(regulated on activation normal T expressed and secreted protein，RANTES)、单核细胞趋化蛋白3(monocyte chemoattractant protein 3，MCP-3)和髓样祖细胞抑制因子-1(myeloid progenitor inhibitory factor-1，MPIF-1)。
2型C-C趋化因子受体(CCR2或CD192)。CCR2具有两种主要形式，CC CKR2A和CCCKR2B。CCR2是CCL2的受体，CC CKR2A的主要激动剂是MCP1，而MCP1和MCP3二者是CC CKR2B同种型的配体。
3型C-C趋化因子受体(CCR3)是在人类中由CCR3基因编码的蛋白质(也指定为CD193)。该受体结合并响应于多种趋化因子，包括嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)(CCL11)、嗜酸性粒细胞趋化因子-3(CCL26)、MCP-3(CCL7)、MCP-4(CCL13)和RANTES(CCL5)。
趋化因子(C-C基序)受体8，也称为CCR8，是在人类中由CCR8基因编码的蛋白质。CCR8也已被指定为CDw198。CCR8的配体是CCL1。CCL8也作为CCR8激动剂起作用。
CX3C趋化因子受体1(CX3CR1)，也称为分形趋化因子(fractalkine)受体或G蛋白偶联受体13(GPR13)，是在人类中由CX3CR1基因编码的蛋白质。该受体结合趋化因子CX3CL1(也称为神经趋化因子(neurotactin)或分形趋化因子)。
6型C-X-C趋化因子受体(CXCR6)是在人类中由CXCR6基因编码的蛋白质。CXCR6也已被指定为CD186(分化抗原簇186)和STRL33。STRL33是在淋巴组织和活化的T细胞中表达，并且在激动的外周血淋巴细胞中被诱导。STRL33是一种趋化因子的受体。该受体的其它名称为Bonzo和TYMSTR。
FPRL1:N-甲酰肽受体2是在人类中由FPR2基因编码的G蛋白偶联受体(GPCR)蛋白。
GPR1是跨膜受体的G蛋白偶联受体家族的成员。它作为趋化素(chemerin)的受体起作用。
G蛋白偶联受体15(GPR15)是在人类中由GPR15基因编码的蛋白质，孤儿异三聚体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)偶联受体。
apelin受体(也称为APJ受体)是结合apelin和Apela/ELABELA/Toddler的G蛋白偶联受体。
D6或趋化因子结合蛋白2是在人类中由CCBP2基因编码的蛋白质。
CXCR4也被称为融合素(fusin)或CD184。例如，在Steen等人(Targeting CXCR4inHIV Cell-Entry Inhibition(在HIV细胞进入抑制中靶向CXCR4),Mini-Reviews inMedicinal Chemistry,2009,9,1605-1621)中提供了CXCR4功能的总结。CXCR4的功能主要受CXCR4与其天然配体基质细胞衍生因子-1(SDF-1)(也称为CXCL12(趋化因子C-X-C基序配体12)的相互作用的调节。然而，MIF也可以作为CXCR4的配体起作用(参见例如Schwartz等人,FEBS Lett 2009,583:2749；Bernhagen等人,Nat.Med.2007,13:587)。发现SDF-1有两种形式，SDF-1α/CXC12a和SDF-1β/CXC12b，它们由两种基因的可变剪接产生。CXCR4比大多数其他趋化因子受体更广泛地表达，并且长期以来被认为其与天然配体SDF-1的关系是严格单配的。然而，CXCR7也使用SDF-1作为配体，并且最近的证据已表明泛素也可以作为CXCR4的配体起作用(Saini V等人,(2010).J.Biol.Chem.285(20):15566–76)。CXCR4/SDF-1轴(axis)参与免疫细胞运输，因为它在体内调节B细胞、浆细胞、CD4+T细胞和树突细胞的趋化作用并激活活化的上皮细胞上的滚动(rolling)T细胞的紧密粘附以及随后的跨内皮迁移。CXCR4/SDF-1轴对于正常的骨髓细胞生成和淋巴细胞生成是必需的，并且另外对于许多器官系统的正确胚胎发育是关键的。CXCR4在许多组织中表达，诸如外周血白细胞、脾脏、胸腺、脊髓、心脏、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾胰脏、小脑、大脑皮质和髓质、脑微血管、冠状动脉和脐带内皮细胞。缺乏CXCR4或SDF-1的小鼠具有受损的造血功能、脱轨的小脑神经元迁移、大血管的缺陷形成和心室间隔缺损，这能够导致心力衰竭(参见例如Ma等人，PNAS 1998，95：9448-9453；Zou等人，Nature 1998，393：595-599)。优选地，CXCR4氨基酸序列表示为：
MEGISSIPLPLLQIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGIVGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGNFLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVGVWIPALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVVVFQFQHIMVGLILPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFENTVHKWISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTESESSSFHSS(SEQ ID NO：2).
向CXCR4、CCR5、CCR1、CCR2、CCR3、CCR8、CX3CR1、FPRL1、GPR1、GPR15、APJ、STRL33和D6可以被HIV用作共同受体以进入细胞，CXCR4、CCR5、CCR1、CCR2、CCR3、CCR8、CX3CR1、FPRL1、GPR1、GPR15、APJ、STRL33和D6的“天然”功能处于趋化因子信号传导中。共同受体(第二靶标)的“天然”功能涉及(在缺少HIV结合的情况下)所述共同受体引发的可测量的生物或生化性质的任何改变，包括由趋化因子信号传导造成的细胞的生理学改变，诸如增殖、分化、迁移、存活、凋亡、转运过程、代谢、运动性、细胞因子释放、细胞因子组成、第二信使、酶、受体等的改变。优选地，靶标的功能通过本领域公知的基于细胞培养的效力测定确定。共同受体的一种或多种“天然”功能可以通过本领域技术人员已知的任何合适的测定确定，诸如ELISA、FACS、Scatchard分析、SPR、功能性测定等，例如如本文中讨论的。
本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽，和包含其的组合物的功效或效力，可以使用任何合适的体外测定、基于细胞的测定、体内测定和/或本身已知的动物模型、或其任意组合测试，取决于涉及的具体疾病或病症。合适的测定和动物模型将对于技术人员来说是明确的，并且例如包括配体置换测定(Burgess等人，Cancer Res 200666：1721-9)，二聚化测定(WO2009/007427A2，Goetsch，2009)，信号传导测定(Burgess等人，Mol CancerTher 9:400-9)，增殖/存活测定(Pacchiana等人，J Biol Chem 2010Sep M110.134031)，细胞粘附测定(Holt等人，Haematologica 2005 90：479-88)和迁移测定(Kong-Beltran等人，Cancer Cell 6:75-84)，内皮细胞出芽测定(Wang等人，J Immunol.2009；183:3204-11)，和体内移植物模型(Jin等人，Cancer Res.2008 68:4360-8)，以及用于以下实验部分和本文中引用的现有技术中的测定和动物模型。表达对所述第二靶标的抑制的方式是通过IC50。
在一个方面，本发明提供了抑制HIV结合共同受体(优选CXCR4)并且不从该共同受体置换天然配体的免疫球蛋白单可变结构域。
本发明涉及根据前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽以小于约50％诸如40％、30％或20％或甚至小于10％(诸如小于5％)抑制天然配体结合所述CR。
在一些实施方案中，天然配体是基质细胞-衍生因子-1β(SDF-1β)或基质细胞-衍生因子-1α(SDF-1α)。在一些实施方案中，在本发明的多肽的存在下，从CXCR4置换SDF-1α或SDF-1β的IC50是10nM或更高。在一些实施方案中，在免疫球蛋白单可变结构域的存在下，从CXCR4置换SDF-1α或SDF-1β的IC50是250nM或更高。在一些实施方案中，在本发明的多肽的存在下，从CXCR4置换SDF-1α或SDF-1β的IC50是1μM或更高。在一些实施方案中，在免疫球蛋白单可变结构域的存在下，从CXCR4置换SDF-1α或SDF-1β的IC50大于HIV抑制的IC50。
在一些实施方案中，HIV抑制的IC50低于50nM，低于10nM，或低于1nM。在一些实施方案中，在多肽的存在下，从CXCR4置换SDF-1α或SDF-1β的IC50大于HIV抑制的IC50。
在一些实施方案中，在免疫球蛋白单可变结构域或其多肽构建体的存在下从CXCR4置换SDF-1α或SDF-1β的IC50比免疫球蛋白单可变结构域或其多肽构建体抑制HIV结合CR(诸如CXCR4)的IC50大1pM以上、10pM以上、100pM以上、500pM以上、1nM以上、10nM以上、20nM以上、30nM以上、40nM以上、50nM以上、60nM以上、70nM以上、80nM以上、100nM以上、500nM以上、1μM以上、10μM以上、50μM以上、100μM以上、高达1mM。
在一些实施方案中，在免疫球蛋白单可变结构域或其多肽的存在下从CXCR4置换SDF-1α或SDF-1β的IC50大于免疫球蛋白单可变结构域或其多肽抑制HIV结合CXCR4的IC50的1％以上、2％以上、5％以上、10％以上、20％以上、50％以上、100％以上、2倍以上、5倍以上、10倍以上、20倍以上、50倍以上、100倍以上、1000倍以上、高达10,000倍以上。
在一些实施方案中，本发明的多肽抑制HIV结合CD4和/或共同受体(诸如例如CXCR4)比AMD3100抑制HIV结合CXCR4更强(例如，具有更低的IC50)。
在一些实施方案中，本发明的多肽抑制HIV结合CD4和/或共同受体(诸如例如CXCR4)比283D2-20GS-283D4(参见WO2009/138519)抑制HIV结合CXCR4更强(例如，具有更低的IC50)。
因为多种细胞表面受体需要二聚化来激活，所以优选的是在这种情况下，本发明的第二ISV不损害这些二聚化位点。
在一些实施方案中，免疫球蛋白单可变结构域及其多肽不从共同受体(例如CXCR4)置换天然配体。在一些实施方案中，天然配体是基质细胞-衍生因子-1β(SDF-1β)或基质细胞-衍生因子-1α(SDF-1α)。
如本文所用，置换包括完全置换和部分置换二者。因此，本公开包括免疫球蛋白单可变结构域和包含一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其不置换天然配体，或者从CR(例如CXCR4)置换小于1％、小于2％、小于5％、小于10％、小于20％、小于30％、小于40％、小于50％、小于60％、小于70％、小于80％、小于90％、高达小于99％置换的天然配体。在一些实施方案中，在免疫球蛋白单可变结构域或其多肽的存在下从CR置换天然配体(诸如例如从CXCR4置换SDF-1α或SDF-1β)的IC50是1pM以上、10pM以上、100pM以上、500pM以上、1nM以上、10nM以上、20nM以上、30nM以上、40nM以上、50nM以上、60nM以上、70nM以上、80nM以上、100nM以上、500nM以上、1μM以上、10μM以上、50μM以上、100μM以上、高达1mM。
本发明还涉及如本文所述的多肽，其中所述第二ISV基本上由4个构架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1选自由以下组成的组：SEQ ID NOs:34-40；以及与SEQ ID NOs:34-408具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
(ii)CDR2选自由以下组成的组：SEQ ID NOs:48-56；以及与SEQ ID NOs:48-56具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；和
(iii)CDR3选自由以下组成的组：SEQ ID NO:67-75以及与SEQ ID NOs:67-75具有1、2、3或4个氨基酸差异的氨基酸序列。
本发明还涉及如本文所述的多肽，其中所述第二ISV基本上由4个构架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中所述ISV选自由以下组成的组：
-CDR1是SEQ ID NO:34，CDR2是SEQ ID NO:48，且CDR3是SEQ ID NO:67；
-CDR1是SEQ ID NO:34，CDR2是SEQ ID NO:49，且CDR3是SEQ ID NO:68；
-CDR1是SEQ ID NO:35，CDR2是SEQ ID NO:50，且CDR3是SEQ ID NO:69；
-CDR1是SEQ ID NO:36，CDR2是SEQ ID NO:51，且CDR3是SEQ ID NO:70；
-CDR1是SEQ ID NO:37，CDR2是SEQ ID NO:52，且CDR3是SEQ ID NO:71；
-CDR1是SEQ ID NO:35，CDR2是SEQ ID NO:53，且CDR3是SEQ ID NO:72；
-CDR1是SEQ ID NO:38，CDR2是SEQ ID NO:54，且CDR3是SEQ ID NO:73；
-CDR1是SEQ ID NO:39，CDR2是SEQ ID NO:55，且CDR3是SEQ ID NO:74；以及
-CDR1是SEQ ID NO:40，CDR2是SEQ ID NO:56，且CDR3是SEQ ID NO:75。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第二ISV基本上由4个构架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中CDR1是SEQ ID NO:35，CDR2是SEQ ID NO:50且CDR3是SEQ ID NO:69。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第二ISV选自由以下组成的组：238D4(SEQ ID NO:4)、281A5(SEQ ID NO:5)、281E10(SEQ ID NO:6)、281D4(SEQ ID NO:7)、281A6(SEQ ID NO:8)、281F12(SEQ ID NO:9)、283B6(SEQ ID NO:10)、283E2(SEQ ID NO:11)、283F1(SEQ ID NO:12)、15F5(SEQ ID NO:13)、15G11(SEQ ID NO:14)、15A1(SEQ IDNO:15)和10C3(SEQ ID NO:16)，优选地其中所述第二ISV是281F12(SEQ ID NO:9)。
在一个实施方案中，本发明涉及包含第一和第二免疫球蛋白单可变结构域(ISV)的多肽，其中所述第一ISV结合存在于细胞表面上的CD4和/或多态变体；所述第二ISV结合存在于所述细胞表面上的共同受体(CR)，优选其中所述CR选自由以下组成的组：CXCR4、CCR5、CCR1、CCR2、CCR3、CCR8、CX3CR1、CXCR6、FPRL1、GPR1、GPR15、APJ和D6以及相关的多态变体。优选地，所述CR是CXCR4。
在一个优选实施方案中，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISV基本上由4个构架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1选自由以下组成的组：SEQ ID NOs:82-85；以及与SEQ ID NOs:82-85具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
(ii)CDR2选自由以下组成的组：SEQ ID NOs:88-91；以及与SEQ ID NOs:88-91具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
(iii)CDR3选自由以下组成的组：SEQ ID NO:96-99以及与SEQ ID NOs:96-99具有1、2、3或4个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且，其中所述第二ISV基本上由4个构架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1选自由以下组成的组：SEQ ID NOs:34-40；以及与SEQ ID NOs:34-40具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
(ii)CDR2选自由以下组成的组：SEQ ID NOs:48-56；以及与SEQ ID NOs:48-56具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
(iii)CDR3选自由以下组成的组：SEQ ID NO:67-75以及与SEQ ID NOs:67-75具有1、2、3或4个氨基酸差异的氨基酸序列。
本发明还涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISV基本上由4个构架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中所述ISV选自由以下组成的组：
-CDR1是SEQ ID NO:82，CDR2是SEQ ID NO:88，且CDR3是SEQ ID NO:96；
-CDR1是SEQ ID NO:83，CDR2是SEQ ID NO:89，且CDR3是SEQ ID NO:97；
-CDR1是SEQ ID NO:84，CDR2是SEQ ID NO:90，且CDR3是SEQ ID NO:98；以及
-CDR1是SEQ ID NO:85，CDR2是SEQ ID NO:91，且CDR3是SEQ ID NO:99。
其中所述第二ISV基本上由4个构架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中所述ISV选自由以下组成的组：
-CDR1是SEQ ID NO:34，CDR2是SEQ ID NO:48，且CDR3是SEQ ID NO:67；
-CDR1是SEQ ID NO:34，CDR2是SEQ ID NO:49，且CDR3是SEQ ID NO:68；
-CDR1是SEQ ID NO:35，CDR2是SEQ ID NO:50，且CDR3是SEQ ID NO:69；
-CDR1是SEQ ID NO:36，CDR2是SEQ ID NO:51，且CDR3是SEQ ID NO:70；
-CDR1是SEQ ID NO:37，CDR2是SEQ ID NO:52，且CDR3是SEQ ID NO:71；
-CDR1是SEQ ID NO:35，CDR2是SEQ ID NO:53，且CDR3是SEQ ID NO:72；
-CDR1是SEQ ID NO:38，CDR2是SEQ ID NO:54，且CDR3是SEQ ID NO:73；
-CDR1是SEQ ID NO:39，CDR2是SEQ ID NO:55，且CDR3是SEQ ID NO:74；以及
-CDR1是SEQ ID NO:40，CDR2是SEQ ID NO:56，且CDR3是SEQ ID NO:75。
在一个优选实施方案中，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISV基本上由4个构架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1选自由以下组成的组：SEQ ID NO:85以及与SEQ ID NO:85具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
(ii)CDR2选自由以下组成的组：SEQ ID NO:91以及与SEQ ID NO:91具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
(iii)CDR3选自由以下组成的组：SEQ ID NO:99以及与SEQ ID NO:99具有1、2、3或4个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且，其中所述第二ISV基本上由4个构架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1选自由以下组成的组：SEQ ID NO:35以及与SEQ ID NO:35具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
(ii)CDR2选自由以下组成的组：SEQ ID NO:50以及与SEQ ID NO:50具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
(iii)CDR3选自由以下组成的组：SEQ ID NO:69以及与SEQ ID NO:69具有1、2、3或4个氨基酸差异的氨基酸序列。
在一个优选实施方案中，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISV基本上由4个构架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1由SEQ ID NO:85表示；
(ii)CDR2由SEQ ID NO:91表示；以及
(iii)CDR3由SEQ ID NO:99表示；
并且，其中所述第二ISV基本上由4个构架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1由SEQ ID NO:35表示；
(ii)CDR2由SEQ ID NO:50表示；以及
(iii)CDR3由SEQ ID NO:69表示。
在优选的实施方案中，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISV选自由以下组成的组：01B6(SEQ ID NO:17)、01E2(SEQ ID NO:18)、01H12(SEQ ID NO:19)和03F11(SEQ ID NO:20)，并且其中所述第二ISV选自由以下组成的组：238D4(SEQ ID NO:4)、281A5(SEQ ID NO:5)、281E10(SEQ ID NO:6)、281D4(SEQ ID NO:7)、281A6(SEQ ID NO:8)、281F12(SEQ ID NO:9)、283B6(SEQ ID NO:10)、283E2(SEQ ID NO:11)、283F1(SEQ ID NO:12)、15F5(SEQ ID NO:13)、15G11(SEQ ID NO:14)、15A1(SEQ ID NO:15)和10C3(SEQ IDNO:16)。
在优选的实施方案中，本发明涉及选自由以下组成的组的多肽：03F11-9GS-281F12(SEQ ID NO:101)、03F11-25GS-281F12(SEQ ID NO:102)、03F11-35GS-281F12(SEQID NO:103)、281F12-9GS-03F11(SEQ ID NO:104)、281F12-25GS-03F11(SEQ ID NO:105)、281F12-35GS-03F11(SEQ ID NO:106)、15G11(Q108L)-15GS-ALB11-15GS-03F11(Q108L)(SEQ ID NO:107)、15F05(Q108L)-15GS-ALB11-15GS-03F11(Q108L)(SEQ ID NO:108)和281F12(Q108L)-15GS-ALB11-15GS-03F11(Q108L)(SEQ ID NO:109)。
在本发明的一个特定的但非限制性的方面中，其将在本文中进一步描述，本发明的多肽与作为其来源的免疫球蛋白单可变结构域相比在血清中具有增加的半衰期(如本文进一步描述的)。例如，本发明的免疫球蛋白单可变结构域可以与一个或多个延长半衰期的基团或结构部分(例如PEG)连接(以化学方式或其它方式)，以提供具有增加的半衰期的本发明的氨基酸序列的衍生物。
如实施例中证明的，半衰期延长不实质上影响效力。这表明半衰期延长的双特异性构建体仍然能够同时结合其各自的靶标。
在本发明的一个特定方面，本发明的化合物或本发明的多肽与本发明的相应氨基酸序列相比可以具有增加的半衰期。这种化合物和多肽的一些优选的但是非限制性的实例在本文进一步公开的基础上对本领域技术人员来说将会变得清楚，例如包括已经进行化学修饰以增加其半衰期(例如通过聚乙二醇化)的本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽；包含至少一个用于结合血清蛋白(例如血清白蛋白)的额外的结合位点的本发明的免疫球蛋白单可变结构域；或者包含至少一个与增加本发明氨基酸序列半衰期的结构部分(特别是至少一个氨基酸序列)连接的本发明的氨基酸序列的本发明的多肽。包含这种延长半衰期的结构部分或免疫球蛋白单可变结构域的本发明的多肽的实例在本文进一步公开的基础上对本领域技术人员来说将会变得清楚；例如包括但不限于其中本发明的一个或多个免疫球蛋白单可变结构域适当地与一个或多个血清蛋白或其片段(例如(人)血清白蛋白或其适合的片段)或与一个或多个能结合血清蛋白的结合单元(例如能结合血清蛋白例如血清白蛋白(例如人血清白蛋白)、血清免疫球蛋白例如IgG、或转铁蛋白的结构域抗体、适合用作结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域、"dAb"’s、适合用作dAb的免疫球蛋白单可变结构域、或纳米抗体；参考本文的进一步描述和所提及的参考文献)连接的多肽；其中本发明的氨基酸序列与Fc部分(例如人Fc)或其适合的部分或片段连接的多肽；或其中本发明的一个或多个免疫球蛋白单可变结构域适当地与一个或多个能结合血清蛋白的小蛋白或肽(例如但不限于WO 91/01743,WO 01/45746,WO 02/076489,WO2008/068280,WO2009/127691和PCT/EP2011/051559中描述的蛋白和肽)连接的多肽。
通常，具有增加的半衰期的本发明的化合物或多肽的半衰期优选是本发明的相应氨基酸序列本身的半衰期的至少1.5倍，其优选至少2倍，例如至少5倍，例如至少10倍或大于20倍。例如，具有增加的半衰期的本发明的化合物或多肽例如在人中可以具有比本发明的相应氨基酸序列本身增加大于1小时，其优选大于2小时，更优选大于6小时，例如大于12小时，或者甚至大于24,48或72小时的半衰期。
在本发明的优选的但是非限制性的方面，本发明的这种化合物或多肽例如在人中具有比本发明的相应氨基酸序列本身增加大于1小时，其优选大于2小时，更优选大于6小时，例如大于12小时，或者甚至大于24,48或72小时的血清半衰期。
在本发明的另一个优选的但是非限制性的方面，本发明的这种化合物或多肽表现出在人中至少约12小时，其优选至少24小时，更优选至少48小时，更优选至少72小时或更长的血清半衰期。例如，本发明的化合物或多肽可以具有至少5天(例如约5-10天)，其优选至少9天(例如约9-14天)，更优选至少约10天(例如约10-15天)，或者至少约11天(例如约11-16天)，更优选至少约12天(例如约12-18天或更长)，或者大于14天(例如约14-19天)的半衰期。
在本发明的特别优选但非限制性方面，本发明提供这样的本发明的多肽：包含第一和第二免疫球蛋白单可变结构域(ISV)；并且进一步包含一种以上(优选为一种)如本文所述的结合血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域，例如Alb8、Alb23、Alb129、Alb132、Alb11、Alb11(S112K)-A、Alb82、Alb82-A、Alb82-AA、Alb82-AAA、Alb82-G、Alb82-GG、Alb82-GGG的结合血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域(参见下表HLE)。
表HLE
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，进一步包含血清蛋白结合部分。
本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述血清蛋白结合部分与血清白蛋白结合。
本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述血清蛋白结合部分是结合血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域。
本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述结合血清白蛋白的ISV基本上由4个构架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中CDR1是SFGMS(SEQID NO:124)，CDR2是SISGSGSDTLYADSVKG(SEQ ID NO:125)且CDR3是GGSLSR(SEQ ID NO:126)。
本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述结合血清白蛋白的ISV包括Alb8、Alb23、Alb129、Alb132、Alb11、Alb11(S112K)-A、Alb82、Alb82-A、Alb82-AA、Alb82-AAA、Alb82-G、Alb82-GG、Alb82-GGG。
在本发明的多肽中，两个以上结构单元、ISV(诸如例如纳米抗体)和任选地一个以上多肽一个以上其他基团、药物、药剂、残基、部分或结合单元可以直接彼此连接(如例如WO99/23221中所述)和/或可以通过一个以上合适的间隔区或接头，或其任意组合彼此连接。用于多价和多特异性多肽的合适的间隔区或接头将对于技术人员是明确的，并且可以通常是本领域中用于连接氨基酸序列的任何接头或间隔区。优选地，所述接头或间隔区适于用于构建预期用于药用的蛋白或多肽。与预期相反，如实施例所证明的，第一ISV和第二ISV之间的接头长度没有明显的影响。
一些特别优选的间隔区包括本领域中用于连接抗体片段或抗体结构域的间隔区和接头。这些包括上文引用的一般背景中提及的接头，以及例如本领域中用于构建双抗体(diabodies)或ScFv片段的接头(然而，就这一点，应该注意，在双抗体和ScFv片段中，使用的接头序列应该具有允许相关VH和VL结构域靠拢以形成完整的抗原-结合位点的长度、柔性程度和其他性质，对用于本发明的多肽的接头的长度或柔性没有特定限制，因为各个纳米抗体本身形成完整的抗原-结合位点)。
例如，接头可以是合适的氨基酸序列，并且尤其是1至50个之间，其优选为1至30个之间，如1至10个之间的氨基酸残基的氨基酸序列。这样的氨基酸序列的一些优选的实例包括gly-ser接头，例如类型(glyxsery)z的，如(例如(gly4ser)3或(gly3ser2)3，如WO 99/42077中所述的，和本文提及的在申请中由Ablynx描述的GS30、GS15、GS9和GS7接头(参见例如WO06/040153和WO 06/122825)，以及铰链状区域，如天然存在的重链抗体或类似序列的铰链区(如WO 94/04678中所述)。优选的接头在如下表接头中描述。
表接头
一些其他特别优选的接头是多聚丙氨酸(如AAA)，以及接头GS30(WO 06/122825中的SEQ ID NO：85)和GS9(WO 06/122825中的SEQ ID NO：84)。
其他合适的接头通常包含有机化合物或聚合物，尤其是适于在用于药用的蛋白中使用的那些。例如，聚(乙二醇)部分已经被用于连接抗体结构域，参见例如WO 04/081026。
包括在本发明的范围内的是，使用的一个或多个接头(尽管不是至关重要，因为其通常用于在ScFv片段中使用的接头)的长度、柔性程度和/或其他性质可以对本发明的最终多肽的性质具有一些影响，包括但不限于对趋化因子、或对于一种以上的其他抗原的亲和力、特异性或亲合力。基于本文公开的内容，任选地在一些有限的常规实验后，技术人员将能够确定用于本发明的特定多肽的一个或多个最佳接头。
例如，在包含针对第一和第二靶标的结构单元、ISV或纳米抗体的本发明的多价多肽中，接头的长度和柔性优选为这样：其允许存在于多肽中的本发明各个结构单元、ISV或纳米抗体结合于其同源靶标，例如各个靶标上的抗原决定簇。再次，基于本文公开的内容，任选地在一些有限的常规实验后，技术人员将能够确定用于本发明的特定多肽的一个或多个最佳接头。
还在本发明的范围内的是，使用的一个或多个接头赋予本发明的多肽一种以上其他有利性质或功能性，和/或提供一个以上用于形成衍生物和/或用于连接功能基团(例如如本文所述用于本发明的纳米抗体的衍生物)的位点。例如，含有一个以上带电氨基酸残基的接头可以提供改善的亲水性质，而形成或含有小的表位或标签的接头可以用于检测、鉴定和/或纯化的目的。再次，基于本文中公开的内容，任选地在一些有限的常规实验后，技术人员将能够确定用于本发明的特定多肽的最佳接头。
最后，当两个以上接头用于本发明的多肽时，这些接头可以相同或不同。再次，基于本文中的公开内容，任选地在一些有限的常规实验后，技术人员将能够确定用于本发明的特定多肽的最佳接头。
通常，为了容易表达和生产，本发明的多肽将是线性多肽。然而，在其最广泛的意义上，本发明不限于此。例如，当本发明的多肽包含三个以上结构单元、ISV或纳米抗体时，可能通过使用具有三个以上“臂”的接头连接它们，每个“臂”连接于结构单元、ISV或纳米抗体，从而提供“星形”构建体。尽管通常不优选，还可能使用环形构建体。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISV和所述第二ISV以及可能的所述结合血清白蛋白的ISV直接地彼此连接或经由接头连接。
本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述接头选自由5GS、7GS、9GS、10GS、15GS、18GS、20GS、25GS和30GS的接头组成的组。
本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述血清蛋白结合部分是基于非抗体的多肽(例如PEG)。
在目前的医学背景下，HIV感染是逐步变得更糟的医疗状况的趋势，并且如果不治疗会导致AIDS并且有可能导致死亡。HIV感染导致在感染的人中CD4+T细胞数量的下降。低于CD4+T细胞的临界数量时，细胞介导的免疫力实际上丢失，并且出现被多种机会性微生物感染，导致获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。(进行性)HIV感染的这些现象是本领域中公知的。
本发明的多肽的药理学效应将最终归属于抑制或削弱至少一种、但优选多于一种HIV感染的结果。
在一个方面，本公开提供了用于降低受试者中的HIV滴度(例如病毒载量(load))的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的免疫球蛋白单可变结构域或包含一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽以降低受试者中的HIV滴度。在一些实施方案中，施用的免疫球蛋白单可变结构域或其多肽抑制HIV与CD4和/或CR(诸如例如CXCR4受体)的结合，但是优选不从所述CR(诸如例如CXCR4)置换天然配体。在一些实施方案中，施用的免疫球蛋白单可变结构域或其多肽仅具有最小的不希望的副作用。
免疫球蛋白单可变结构域及其多肽抑制HIV与CD4和/或CR(诸如例如CXCR4)的结合。通过结合CD4和/或CR(诸如例如CXCR4)，免疫球蛋白单可变结构域或其多肽阻止HIV进入细胞。在细胞环境之外HIV不能长时间存活。因此，如果HIV不能进入细胞并保留在细胞外环境中，那么HIV将最终死亡并被身体处理，最终导致人体内HIV滴度的降低。
确定受试者中HIV量(HIV滴度)的方法在本领域中是常规的(参见上文)。通常，提供来自受试者的血样，并且直接地(通过测定HIV的存在)或间接地(例如通过测定针对HIV的抗体的存在)确定HIV的量(例如，HIV-颗粒的量)。确定HIV的存在或者针对HIV的抗体的存在是本领域中常规的并且可以例如通过ELISA进行。确定受试者中HIV的量的额外方法包括上述讨论的功能性抑制测定，确定特异性抗原的存在和量的测定、诸如p24抗原测试(例如可通过PerkinElmer和Advanced Bioscience Laboratories商购)，以及例如通过逆转录酶活性确定编码HIV基因组的特异性核酸的存在和量的测定(例如ExaVir Load；CavidiTech-AB,Uppsala,Sweden；参见例如Sivapalasingam等人,J Clin Microbiol 2005,43,3793)。
本文公开的方法适用于任何形式的HIV，包括HIV-1和HIV-2，以及所有的亚类，例如HIV-1B、HIV-1D等。在一些实施方案中，本文公开的方法适用于与HIV相关的病毒，诸如猿猴病毒SIV。
本发明涉及用于治疗有需要的受试者(感染HIV、优选HIV-1、优选C亚型)的如本文所述的多肽。
本发明涉及包含如本文所述的多肽的药物组合物。
本发明涉及将预防性和/或治疗性多肽递送至体内特定位置、组织或细胞类型的方法，所述方法包括将如本文所述的多肽施用于受试者的步骤。
本发明涉及治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括施用如本文所述的多肽。
此外，本发明涉及治疗如上文所述的受试者的方法，其中所述受试者感染HIV R5、HIV X4和/或HIV X4R5。
在一个方面，本公开提供了用于治疗患有HIV感染的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用免疫球蛋白单可变结构域或包含一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽构建体以治疗HIV感染。在一些实施方案中，施用的免疫球蛋白单可变结构域或其多肽构建体抑制HIV与CD4和/或CR(诸如例如CXCR4)的结合，但是优选不从所述CR(诸如例如CXCR4)置换天然配体。在一些实施方案中，施用的免疫球蛋白单可变结构域或其多肽构建体仅具有最小的不希望的副作用。
本文使用的术语“治疗患有HIV感染的受试者”是指导致了受试者中与HIV感染相关的症状严重度(例如机会性微生物感染)或症状数量(例如机会性感染的数量)的减少。
在一些实施方案中，治疗患有HIV的受试者导致了所述受试者中白血细胞计数的增加。
在一些实施方案中，治疗患有HIV的受试者导致了所述受试者中CD4+T细胞数量的增加。
在一些实施方案中，治疗患有HIV的受试者导致了所述受试者中HIV滴度的降低。
因此，本发明涉及降低受试者中的HIV滴度的方法，所述方法包括将治疗有效量的如本文所述的多肽施用至受试者以降低受试者中的HIV滴度。
在一些实施方案中，治疗患有HIV的受试者导致了人体中机会性微生物感染数量的降低。
例如，可以通过确定与HIV感染相关的一个或多个生理参数的变化(例如，降低HIV滴度、减少感染的细胞的数量、增加CD4+T细胞的量)，或者通过以全身水平评价受试者的健康(例如，机会性感染的数量的减少)来评价治疗是否有效。
在一个方面，本公开提供了以最小的不需要的副作用治疗患有HIV感染的受试者的方法。传统的抗HIV治疗方案(例如ART)，包括施用HIV蛋白酶抑制剂和HIV逆转录酶抑制剂，与许多不需要的副作用相关，包括肝毒性、胃气胀(bloating)、食欲不振等。本领域普通技术人员可以例如通过评价肝毒性、胃气胀等的水平来确定不需要的副作用是否已经降低。在一些实施方案中，不需要的副作用是与干细胞动员相关的副作用。确定干细胞动员水平的方法是本领域中已知的。
如本文所用，受试者包括对HIV感染敏感的哺乳动物(例如人)，或者对相关病毒诸如SIV的感染敏感的哺乳动物(例如猴)。在一些实施方案中，所述受试者是灵长类动物。在一些实施方案中，所述受试者是人类。在一些实施方案中，所述受试者正在接受或已经接受一种或多种抗HIV治疗方案(例如，ART疗法或其组分)。
如本发明中证明的，即使当使用单价纳米抗体诱导抗性时，HIV株也很难变得对本发明的多肽具有抗性。
令人惊奇地，即使在对受体中的一者具有抗性的病毒上，双特异性多肽在抑制HIV1进入方面以皮摩尔的范围保持强效力，这表明双特异性多肽的仅一个臂的功能性足以用于有效抑制，同时另一个臂可以提供结合亲合力。
因此，本发明涉及治疗感染HIV的受试者的方法，所述方法包括施用如本文所述的多肽，其中所述HIV至少3个月，诸如至少6个月或甚至更长，诸如例如9个月、11个月、1年、1.5年、2年或甚至更长不发展(例如延迟)对所述多肽的抗性。
在上述方法中，本发明的氨基酸序列、ISV’s(诸如例如纳米抗体)和/或多肽和/或包含其的组合物可以以任何适当的方式施用，这取决于要用的特定的药物制剂或组合物。因此，例如，本发明的氨基酸序列、ISV’s(诸如例如纳米抗体)和/或多肽和/或包含其的组合物可以经口、腹膜内(例如，静脉内、皮下、肌内或通过避开胃肠道的任何其它施用途径)、鼻内、经皮、局部、通过栓剂、通过吸入方式施用，这也取决于要用的特定的药物制剂或组合物。临床医生将能够选择适当的施用途径和用于所述施用的适当的药物制剂或组合物，这取决于要预防或治疗的疾病或病症以及临床医生公知的其它因素。
本发明的氨基酸序列、ISV’s(诸如例如纳米抗体)和/或多肽和/或包含其的组合物按照治疗方案进行施用，所述治疗方案适于预防和/或治疗要被预防或治疗的HIV感染。临床医生将通常能够确定适宜的治疗方案，取决于以下因素，诸如要被治疗的HIV感染的阶段，要被治疗的HIV感染的严重度和/或其症状的严重度，要用的本发明的特定的氨基酸序列、ISV(诸如例如纳米抗体)或多肽，要用的特定的施用途径和药物制剂或组合物，患者的年龄、性别、体重、饮食、综合病况，以及临床医生公知的类似因素。
一般地，所述治疗方案将包括以一种或多种药学上有效量或剂量施用本发明的一种或多种氨基酸序列、ISV’s(诸如例如纳米抗体)和/或多肽，或一种或多种包含其的组合物。仍基于上述因素，临床医生可以确定施用的具体量或剂量。
通常，为了预防和/或治疗本文提及的HIV感染，并且取决于要治疗的疾病的具体株或类型和阶段、要用的本发明的特定的氨基酸序列、ISV(诸如例如纳米抗体)和/或多肽的效力、使用的特定施用途径和特定药物制剂或组合物，本发明的氨基酸序列、ISV’s(诸如例如纳米抗体)和多肽将一般以每天每kg体重1克至0.01毫克的量施用，优选每天每kg体重0.1克至0.01毫克，诸如每天每kg体重约0.1、1、10、100或1000毫克，例如每kg受试者体重0.1mg至25mg；或者作为单一的每日剂量或在一天内作为多次分剂量连续地(例如通过输注)施用。临床医生将通常能够确定合适的每日剂量，这取决于本文提及的因素。还应该清楚，在特定的情况下，临床医师可以选择偏离这些量，例如基于上文引用的因素以及他的专业判断。一般地，考虑到亲和力/亲合力、功效、生物分布、半衰期以及技术人员公知的类似因素的不同，关于施用量的一些指导可以从通过基本上相同的途径通常施用的相当的针对相同施用靶标的常规抗体或抗体片段的量而获得。
通常，在上述方法中，将使用单一的本发明的氨基酸序列、ISV(诸如例如纳米抗体)或多肽。然而，使用组合的两种或更多种本发明的氨基酸序列、ISV(诸如例如纳米抗体)和/或多肽在本发明的范围之内。
本发明的ISV’s(诸如例如纳米抗体)、氨基酸序列和多肽还可以与一种或多种其它药物活性化合物或成分组合使用，即作为组合治疗方案，其可以引起或者可以不引起协同效应。并且，基于上文引用的因素及其专业判断，临床医生将能够选择所述的其它化合物或成分，以及合适的组合治疗方案。
特别地，本发明的氨基酸序列、ISV(诸如例如纳米抗体)和多肽可以与其它药物活性化合物或成分组合使用，所述其它药物活性化合物或成分是或者能够用于预防和/或治疗本文引用的HIV感染和/或任何机会性感染、疾病和/或病症，其结果可以获得或者可以不获得协同效应。所述化合物和成分的实例，以及施用它们的途径、方法和药物制剂或组合物是临床医生所清楚的。
当两种或更多种物质或成分用作组合治疗方案的一部分时，它们可以通过相同的施用途径或者通过不同的施用途径在基本上相同的时间或在不同时间(例如，基本上同时地、连续地或者按照备选方案)施用。当所述物质或成分通过相同的施用途径同时施用时，它们可以作为不同的药物制剂或组合物或者作为组合的药物制剂或组合物的一部分进行施用，这是技术人员所清楚的。
为了避免HIV抗药性并延长疗效，当代的抗HIV治疗方案包括抗HIV药物的混合物(cocktail)。因此，将本发明的多肽包含在抗HIV治疗方案(例如，ART疗法或其组分)中是有利的。在一些实施方案中，使用本发明的多肽以及ART疗法或其组分治疗所述受试者，所述ART疗法或其组分诸如例如一种或多种蛋白酶抑制剂(PR)，例如安普那韦(AMP)、阿扎那韦(ATV)、茚地那韦(IDV)、洛匹那韦(LPV)、奈非那韦(NFV)、利托那韦(RTV)或沙奎那韦(SQV)；和/或逆转录酶抑制剂(RTIs)，例如非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)[阿巴卡韦(ABC)、地拉韦啶(DLV)、依法韦仑(EFV)、奈韦拉平(NVP)和替诺福韦(TFV)]；或核苷类似物逆转录酶抑制剂(NRTI)[去羟肌苷(ddl)、司他夫定(d4T)、拉米夫定(3Tc)和齐多夫定(ZDV)]。
在一些实施方案中，HIV对一种或多种抗HIV治疗方案(例如ART疗法或其组分)具有抗性或者已经变得具有抗性，例如，其中HIV对一种或多种蛋白酶抑制剂(PR)具有抗性或者已经变得具有抗性，所述一种或多种蛋白酶抑制剂(PR)例如安普那韦(AMP)、阿扎那韦(ATV)、茚地那韦(IDV)、洛匹那韦(LPV)、奈非那韦(NFV)、利托那韦(RTV)或沙奎那韦(SQV)；和/或逆转录酶抑制剂(RTIs)，例如非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)[阿巴卡韦(ABC)、地拉韦啶(DLV)、依法韦仑(EFV)、奈韦拉平(NVP)和替诺福韦(TFV)]；或核苷类似物逆转录酶抑制剂(NRTI)[去羟肌苷(ddl)、司他夫定(d4T)、拉米夫定(3TC)和齐多夫定(ZDV)]。
本发明还涉及治疗感染HIV的受试者的方法，其包括施用如本文所述的多肽，其中所述受试者对至少一种其它抗HIV药剂具有抗性。
在一些实施方案中，所述受试者在接受一种或多种抗HIV治疗方案(例如，ART疗法或其组分)时具有不需要的副作用。
本发明涉及在与PR、RTI和/或NRTI的组合治疗中治疗如本文所述的受试者的方法。
本发明还涉及治疗对非抗体CD4和/或CR(例如CXCR4)拮抗剂具有抗性或已经变得具有抗性的感染HIV的人类受试者中获得性免疫缺陷综合征的症状的方法，所述方法包括以这样的量将本发明的多肽施用至所述人类受试者：所述量对治疗人类受试者中获得性免疫缺陷综合征的症状有效。
在一个方面，本公开提供了用于抑制病毒感染表达CD4和/或CR(诸如例如CXCR4)的细胞的方法，所述方法包括将表达CD4和/或CR(诸如例如CXCR4)的细胞与任何本发明的多肽构建体接触以抑制病毒对细胞的感染。在一些实施方案中，所述方法允许抑制体外的细胞感染，即其中所述细胞不在受试者中。在一些实施方案中，所述方法允许抑制体内的细胞感染，即其中所述细胞在受试者中。
在一个实施方案中，本发明提供了用于抑制HIV结合CR的方法，所述方法包括将CR与本发明的多肽接触以抑制病毒与CR的结合，其中将CR与所述多肽接触抑制了HIV与CR的结合，并且其中将CR与所述多肽接触不从CR置换天然配体。
在一个实施方案中，本发明提供了用于减少HIV从CR置换结合的天然配体的方法，所述方法包括将CR与本发明的多肽接触，其中所述接触减少了HIV从CR置换天然配体。
在一个实施方案中，本发明提供了用于抑制病毒感染表达CR的细胞的方法，所述方法包括将表达CR的细胞与本发明的多肽接触以抑制病毒感染所述细胞，优选地，其中将CR与多肽接触不从所述CR置换天然配体。
在一个实施方案中，本发明提供了抑制人受试者中HIV相关病症的发病或进展的方法，其中所述抑制通过抑制HIV与所述受试者中CXCR4+CD4+靶细胞的融合而有效，所述HIV对以下具有抗性：(i)一种或多种HIV蛋白酶，(ii)一种或多种HIV逆转录酶抑制剂，(iii)一种或多种HIV蛋白酶抑制剂和一种或多种HIV逆转录酶抑制剂，或(iv)本发明多肽的一种ISV，所述方法包括向所述受试者以预定的间隔施用有效融合抑制剂量的本发明的多肽，优选其中多肽的每次施用向所述受试者递送每kg受试者体重0.1mg至25mg，从而由此抑制受试者中HIV相关病症的发病或进展。
在一个方面，本公开提供了用于预防受试者中HIV感染的方法，所述方法包括向受试者施用免疫球蛋白单可变结构域或包含一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽构建体以预防受试者中的HIV感染。在一些实施方案中，施用的免疫球蛋白单可变结构域或其多肽构建体抑制HIV与CD4和/或CR(诸如例如CXCR4)的结合，但是不从所述CR(诸如例如CXCR4)置换天然配体。在一些实施方案中，施用的免疫球蛋白单可变结构域或其多肽构建体仅具有最小的不希望的副作用。
本发明涉及预防受试者中HIV感染的方法，所述方法包括将治疗有效量的如本文所述的多肽施用至受试者以预防受试者的HIV感染。
在一个方面，本公开提供了预防受试者中HIV感染的方法。在一些实施方案中，通过阻止HIV进入和/或积累于受试者中的CD4+T细胞来实现预防HIV感染。因此，在一些实施方案中，即使在受试者已经暴露于HIV并且可能具有已经暴露于HIV的一个或多个病症之后，通过阻止HIV进入和/或积累于受试者中的CD4+T细胞也可以预防HIV感染。
预防HIV感染是指完全预防和部分预防(例如，被HIV感染的百分比减少，例如约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或者更高或更低或中间的百分比)二者。例如，受试者在通过特定途径(例如静脉注射)暴露于HIV时可能被HIV感染的机会是50％，但是施用本文公开的免疫球蛋白单可变结构域或其多肽构建体导致了在暴露时被HIV感染的机会仅为10％(因此导致被感染的机会减少80％)。
预防感染可以使用建立的HIV和SIV感染的猿模型来确定。例如，一组动物(例如猴)可以被施用免疫球蛋白单可变结构域或其多肽构建体，并且随后暴露于HIV/SIV，同时也暴露于HIV/SIV的对照组不被施用免疫球蛋白单可变结构域或其多肽构建体。如果在已施用免疫球蛋白单可变结构域或其多肽构建体的组中HIV/SIV感染的发生率低于对照组，则免疫球蛋白单可变结构域及其构建体对预防HIV感染是有效的。
在一个实施方案中，本发明提供了减少人受试者感染HIV感染的可能性的方法，所述HIV对以下具有抗性：(i)一种或多种HIV蛋白酶，(ii)一种或多种HIV逆转录酶抑制剂，(iii)一种或多种HIV蛋白酶抑制剂和一种或多种HIV逆转录酶抑制剂，或(iv)本发明多肽的一种ISV，所述方法包括向所述受试者以预定的时间表施用本发明的多肽，优选其中多肽的每次施用向所述受试者递送每kg受试者体重0.1mg至25mg，从而由此减少人受试者感染抗性HIV感染的可能性。
在一些实施方案中，治疗方法包括施用一个或多个免疫球蛋白单可变结构域和包含本文所述的免疫球蛋白单可变结构域的多肽构建体以及一种或多种已知的或推定的抗病毒化合物或表现出抗病毒活性的化合物。已知的或推定的抗病毒化合物是抑制或阻止病毒感染、病毒复制和/或与病毒感染相关的疾病发展的化合物。在一些实施方案中，已知的或推定的抗病毒化合物是已知的或推定的抗HIV化合物。
抗病毒药物可以被分类为靶向病毒的生命周期阶段之一。一类抗病毒药物是基于干扰病毒进入。如本文所述，病毒与特定的受体结合以渗入靶细胞。病毒进入可以通过阻断病毒进入方式来抑制。具有这种作用模式的抗病毒药物是抗-受体抗体，受体的天然配体和能够结合受体的小分子。第二类抗病毒药物是抑制病毒合成的化合物。具有这种作用模式的抗病毒药物是与DNA和RNA结构单元类似但是使得用于复制病毒的蛋白质机器(例如逆转录酶或DNA聚合酶)去活化的核苷类似物。其他药物靶向阻断病毒DNA的转录因子，即核酶，这可以干扰病毒DNA的产生。其它药物靶向病毒RNA以进行破坏，包括针对病毒核酸序列的siRNA和反义核酸。另一类抗病毒药物涉及可以干扰病毒特异性蛋白质的功能的药物。这一类包括HIV蛋白酶抑制剂。抗病毒药物也包括针对病毒释放阶段的药物。此类药物包括干扰构建病毒颗粒所必需的蛋白质的化合物。另一类抗病毒药物是刺激免疫系统以靶向病毒感染的药物。属于这一类的药物是干扰素，其抑制感染的细胞中的病毒合成，以及可以靶向感染的细胞以便免疫系统进行破坏的抗体。其它抗病毒剂描述于美国专利号6,130,326和6,440,985，以及公开的美国专利申请2002/0095033。因此，应该认识到，本文鉴定的化合物具有抗病毒活性，并且可以通过上述的任何抗病毒机制起作用。在一些实施方案中，本文鉴定的化合物阻止或抑制病毒复制(例如病毒DNA复制)。
在一些实施方案中，抗病毒化合物是这样的抗病毒化合物：其是抗HIV化合物。在一些实施方案中，抗病毒化合物用于抗HIV疗法，诸如例如WO2009/014638的表1、4和5中描述的抗病毒化合物。在一些实施方案中，抗HIV化合物是HIV蛋白酶抑制剂或HIV逆转录酶抑制剂。
化合物的抗病毒活性可以在基于体外细胞的测定中测定。抗病毒活性可以由以下产生：i)化合物与病毒的相互作以阻止细胞的感染或者以阻止感染后病毒的复制、发展和/或增殖，ii)化合物对细胞的作用以阻止病毒感染或者以阻止感染后病毒的复制、发展和/或增殖，或iii)任何其它机制，或其任何组合。无论作用方式如何，如果组合物在基于细胞的测定中减少了感染的细胞的百分比或数量，则组合物可以具有抗病毒活性。在一些实施方案中，当化合物(或两种或更多种化合物的组合)将感染的细胞的百分比或数量减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或更多(例如，在基于细胞的测定中)时，则其具有抗病毒活性。在一些实施方案中，当化合物减少了细胞内病毒核酸的量时，化合物具有抗病毒活性。在某些实施方案中，化合物抑制细胞内病毒核酸的复制(例如，化合物将病毒复制的量减少约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更高或更低或中间的减少百分比)。应当理解，可以使用细胞测定法测量病毒复制的减少，并且在化合物存在的情况下测量病毒DNA的量或随着时间的推移的病毒DNA复制速率(或任何其他的病毒复制度量)并将其与在不存在化合物的情况下或在对照化合物存在下的病毒复制比较。
在一些实施方案中，治疗和/或预防方法包括施用一个或多个免疫球蛋白单可变结构域和包含本文所述的免疫球蛋白单可变结构域的多肽构建体以及施用针对DNA病毒的疫苗。疫苗被定义为这样的药物组合物：当以有效量施用至受试者时刺激保护性抗体或保护性T细胞应答的产生。在一些实施方案中，疫苗是包含由DNA病毒序列编码的一种或多种多肽序列的蛋白质疫苗。在一些实施方案中，疫苗是包含DNA病毒核酸的核酸疫苗。疫苗的施用方案是本领域普通技术人员已知的。在一些实施方案中，用于预防DNA病毒感染的多肽疫苗的量的范围是0.01至100微克/剂量，例如0.1至50微克/剂量。为了实现足够的免疫应答和随后的针对DNA病毒感染的保护(例如，“免疫(immunizing)”受试者)，每个受试者可能需要数个剂量。术语“免疫(immunizing)”是指物质在存在或不存在佐剂的情况下无论是单独还是当与载体连接时在受试者中引起体液和/或细胞应答的能力，并且也是指部分或完全阻断感染物的感染性的免疫应答。
在一些实施方案中，治疗或预防方法包括施用一个或多个免疫球蛋白单可变结构域和包含本文所述的免疫球蛋白单可变结构域的多肽构建体以及施用减少HIV疗法的不需要的副作用的化合物或疗法。所述化合物的实例包括抗恶心药、食欲增强剂和抗抑郁药。
在一个方面，本公开提供了用于施用治疗有效量的免疫球蛋白单可变结构域和包含一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的多肽构建体的方法。ISV或多肽的治疗有效量是免疫球蛋白单可变结构域或多肽提供医学上希望的结果(例如，降低HIV滴度)的剂量。有效量将根据要治疗的特定病况、要治疗的受试者的年龄和身体状况、病况的严重度、治疗的持续时间、同时疗法(如果存在)的性质、特定的施用途径以及在健康从业人员的知识和专业内的类似因素而变化。例如，用于治疗或预防疾病或病症(例如，患有HIV感染)的治疗有效量将是足以减少疾病或病症或其症状的进展或抑制疾病或病症或其症状的量。类似地，用于降低受试者中的HIV滴度的治疗有效量将是足以降低受试者中的HIV滴度的量。应该理解是的，非免疫球蛋白单可变结构域疗法也可以以治疗有效量施用。
在一个方面，本公开提供了用于施用免疫球蛋白单可变结构域和包含一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的其多肽构建体的方法。在一些实施方案中，免疫球蛋白单可变结构域或多肽作为药物组合物施用。除了免疫球蛋白单可变结构域和其多肽构建体之外，药物组合物包括药学上可接受的载体。
如详细描述的，本公开的药物组合物可以被特别地配制以以固体或液体形式施用，所述固体或液体形式包括适于以下的那些：口服施用，例如灌剂(drench)(水性或非水性溶液或混悬液)、片剂(例如靶向口腔、舌下和系统性吸收的那些)、大丸剂(bolus)、散剂(powder)、颗粒剂(granule)、用于施用至舌头的糊剂(paste)；肠胃外施用，例如作为例如无菌溶液或混悬液或缓释制剂通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射的肠胃外施用；局部施用，例如作为施用于皮肤、肺或口腔的霜剂(cream)、软膏剂(ointment)或控释贴剂(patch)或喷雾剂(spray)；阴道内或直肠内，例如作为阴道栓剂(pessary)、霜剂或泡沫剂；舌下；经眼睛(ocularly)；经皮；或经鼻、肺和到其它粘膜表面。
本文使用的短语“药学上可接受的”是指这样的那些化合物、材料、组合物和/或剂型：在合理的医学判断范围内，其适合用于接触人类和动物的组织，且没有过度的毒性、刺激、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。
本文使用的短语“药学上可接受的载体”是指参与从一个器官或身体的一部分向另一个器官或身体的另一部分运送或运输主题化合物的药学上可接受的材料、组合物或载体，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料。每种载体必须是“可接受的”，其含义是，与制剂的其它成分相容，且对患者无害。可以充当药学上可接受的载体的物质的一些实例包括：糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄蓍胶(tragacanth)；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油类，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；和用于药物制剂中的其它无毒的相容物质。
本公开的制剂包括适于口服、经鼻、局部(包括口腔和舌下)、直肠、阴道和/或肠胃外施用的那些。制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过制药领域中公知的任何方法制备。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分(例如，免疫球蛋白单可变结构域或其多肽构建体)的量将根据要治疗的宿主和特定的施用方式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将通常是产生治疗效果的化合物的量。通常，该量将在约1％至约99％的活性成分的范围内，优选约5％至约70％，最优选约10％至约30％。
在某些实施方案中，制剂包含赋形剂，其选自由环糊精、脂质体、胶束形成剂(例如胆汁酸)和聚合载体(例如聚酯和聚酐)组成的组。在某些实施方案中，前述制剂提供经口地生物可利用的免疫球蛋白单可变结构域或多肽构建体。
制备这些制剂或组合物的方法包括将免疫球蛋白单可变结构域或多肽构建体与载体以及任选地一种或多种辅助成分结合的步骤。一般地，通过将免疫球蛋白单可变结构域或多肽构建体均匀且紧密地与液体载体或细碎的固体载体或二者结合，并且然后使产物成形(如果需要)来制备制剂。
适于口服施用的制剂可以是以下形式：胶囊、扁囊剂(cachet)、丸剂(pill)、片剂、锭剂(lozenge)(使用调味基质，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)、散剂、颗粒剂，或者作为呈水性或非水性液体的溶液或混悬液，或者作为水包油或油包水液体乳剂，或者作为酏剂(elixir)或糖浆(syrup)，或者作为软锭剂(pastille)(使用惰性基质，诸如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)和/或者作为漱口水等，各自含有预定量的免疫球蛋白单可变结构域或多肽构建体作为活性成分。免疫球蛋白单可变结构域或多肽构建体发明也可以作为大丸剂、药糖剂(electuary)或糊剂施用。
在用于口服施用的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸(dragee)、散剂、颗粒剂等)中，活性成分与一种或多种药学上可接受的载体混合，诸如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或以下中的任一者：填充剂或增充剂(extender)，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；粘合剂，诸如例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；保湿剂(humectant)，诸如甘油；崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；溶液缓凝剂，诸如石蜡；吸收促进剂，诸如季铵化合物；湿润剂，诸如例如鲸蜡醇、甘油单硬脂酸酯和非离子表面活性剂；吸附剂，诸如高岭土和膨润土；润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物；和着色剂。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可以包含缓冲剂。类似类型的固体组合物也可以用作在使用诸如乳糖(lactose)或牛奶糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软壳和硬壳明胶胶囊中的填充剂。
片剂可以任选地与一种或多种辅助成分通过压制或模制来制备。压制片剂可以使用粘合剂(例如明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如羟基乙酸淀粉钠或交联的羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂来制备。模制片剂可以在合适的机器中制备，其中粉状化合物的混合物用惰性液体稀释剂润湿。
片剂和药物组合物的其它固体剂型(诸如糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂)可以任选地用包衣和外壳(诸如药物配制领域公知的肠溶衣和其它包衣)刻痕或制备。它们也可以经配制以便提供其中活性成分的缓慢或控制释放，例如使用以提供所需释放曲线的不同比例的羟丙基甲基纤维素，其它聚合物基质，脂质体和/或微球体。它们可以经配制以用于快速释放，例如冷冻干燥。它们可以通过例如通过保留细菌的过滤器过滤来灭菌，后者通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述灭菌剂可以在使用前即刻溶解在无菌水或一些其它无菌可注射介质中。这些组合物还可以任选地含有遮盖剂(opacifying agent)，并且可以是这样的组合物：它们仅在或优选在胃肠道的某个部分释放活性成分，任选地以延迟的方式。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。活性成分也可以是微囊形式，如果合适的话，具有一种或多种上述赋形剂。
用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、混悬液、糖浆和酏剂。除了活性成分之外，液体剂型可以含有本领域常用的惰性稀释剂(诸如例如水或其它溶剂)，增溶剂和乳化剂，诸如乙醇，异丙醇，碳酸乙酯，乙酸乙酯，苯甲醇，苯甲酸苄酯，丙二醇，1,3-丁二醇，油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)，甘油，四氢呋喃醇，聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯，以及它们的混合物。
除了惰性稀释剂之外，口服组合物还可以包括佐剂(诸如湿润剂)，乳化剂和悬浮剂，甜味剂，调味剂，着色剂，加香剂和防腐剂。
除了活性化合物以外，混悬液可以含有悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶，及其混合物。
用于直肠或阴道施用的药物组合物的制剂可以作为栓剂呈现，其可以通过将免疫球蛋白单可变结构域或多肽构建体与一种或多种合适的非刺激性赋形剂或载体混合来制备，所述赋形剂或载体包括例如可可脂，聚乙二醇，栓剂蜡或水杨酸酯，并且其在室温下是固体，但是在体温下是液体，并且因此将在直肠或阴道腔中融化并释放活性化合物。
适于阴道施用的制剂还包括含有本领域已知的合适载体的阴道栓剂、棉塞、霜剂、凝胶、糊剂、泡沫剂或喷雾制剂。
用于局部或经皮施用免疫球蛋白单可变结构域或多肽构建体的剂型包括散剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂(lotion)、凝胶、溶液、贴剂和吸入剂。活性化合物可以在无菌条件下与药学上可接受的载体以及可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。
软膏剂、糊剂、霜剂和凝胶可以含有赋形剂，诸如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅氧烷、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌，或其混合物。
散剂和喷雾剂可以含有赋形剂，诸如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末，或这些物质的混合物。喷雾剂可以额外地含有常规推进剂，诸如氯氟烃和挥发性未取代的烃(诸如丁烷和丙烷)。
经皮贴剂具有提供将免疫球蛋白单可变结构域或多肽构建体控制递送至身体的附加优点。将化合物溶解或分散在适当的介质中可以制得所述剂型。吸收促进剂也可以用于增加化合物通过皮肤的通量。提供速率控制膜或将化合物分散在聚合物基质或凝胶中可以控制所述通量的速率。
眼的制剂，眼软膏、散剂、溶液等也被认为是在本公开的范围内。
适于肠胃外施用的药物组合物包含一种或多种免疫球蛋白单可变结构域或多肽构建体，其与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散液、混悬液或乳液或者可以在使用前重构为无菌可注射溶液或分散液的灭菌散剂，它们可以含有糖、醇、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质或悬浮剂或增稠剂。
可以用于药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括水，乙醇，多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其合适的混合物，植物油(诸如橄榄油)和可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。例如，通过使用包衣材料(诸如卵磷脂)、通过在分散液的情况下保持所需的粒度以及通过使用表面活性剂可以保持适当的流动性。
这些组合物还可以含有佐剂，诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如尼泊金(paraben)、氯丁醇、苯酚山梨酸等，可以确保阻止微生物对主题化合物的作用。将等渗剂(诸如糖、氯化钠等)包含在组合物中也是所期望的。另外，可通过包含延迟吸收的药剂(诸如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的延长的吸收。
在一些情况下，为了延长药物的效应，期望减缓从皮下或肌内注射的药物吸收。这可以通过使用具有差的水溶性的结晶或无定形材料的液体混悬液来完成。然后，药物的吸收速率取决于其溶解速率，这又可以取决于晶体大小和结晶形式。或者，肠胃外施用的药物形式的延迟吸收通过将药物溶解或悬浮于油性载体中来完成。
通过在生物可降解的聚合物(诸如聚乳酸-聚乙交酯)中形成主题化合物的微囊基质来制得可注射的储存形式。取决于药物与聚合物的比例以及施用的特定聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其它生物可降解的聚合物的实例包括聚-(原酸酯)和聚(酸酐)。还通过将药物包裹在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备储存可注射制剂。
本说明书中说明和讨论的实施方案仅意在教导本领域技术人员本发明人已知的最佳方式以实现和使用本发明。如本领域技术人员根据上述教导理解的，在不偏离本发明的情况下，本发明的上述实施方案的改进和变化形式是可能的。因此要理解，在权利要求和其对等物的范围内，本发明可以除了如具体描述的之外实践。
本申请中引用的所有参考文献(包括文献参考文献、公开的专利、公开的专利申请和共同待定的专利申请)，尤其是对于上文参考的教导，在此明确通过引用结合。
所给出的附图和实验部分/实施例仅仅是进一步举例说明本发明，不应理解或解释为以任何方式限制本发明和/或所附权利要求的范围，除非本文另外明确指出。
实验部分
实施例1：简介
HIV多样性是非常广泛的(特别是包膜gp120)，以致设计能够引发广泛交叉反应性中和抗体的HIV疫苗是非常困难的挑战。
该病毒复制迅速并且具有高突变率，这产生了高度多样化的“准物种”。这些准物种是达尔文选择压力的可育底物，有利于最适应、最“适合”的遗传变异。努力开发有效的治疗方法和疫苗必须克服感染HIV的个体和受影响的群体中复杂的进化动态。
由于HIV从个体传播到个体，所以遗传多样性的病毒面对的是人类中最高度多态的基因家族--其编码人白细胞抗原(HLA)I和II类蛋白。这些蛋白质分别确定哪个特定的肽序列(表位)被呈递至宿主CD8+和CD4+T细胞并被其识别。在遗传多样性的HIV变体与遗传多样性的的人类宿主之间的对抗中，可以选择病毒变体以在特定的病毒表位中包含突变，从而逃避宿主免疫效应细胞的识别，导致了抗性HIV。
然而，尽管病毒多样性是非常高的，但是大多数的HIV组、株、分支和亚型需要细胞受体CD4以及共同受体CXCR4(X4)、CCR5(R5)或CCR5/CXCR4二者(双趋向性(dual tropic)R5/X4)，以主要进入并感染CD4+靶免疫T细胞(参见图1)。
本发明人猜测同时阻断受体和共同受体二者不仅可以阻止HIV进入，而且如果不阻止抗性也可以延迟抗性。令人惊讶地，使用双特异性CXCR4-CD4多肽优于各个阻断剂的组合，并且可以阻止HIV进入并克服抗性。
实施例2：单价CD4纳米抗体的鉴别和特性
实施例2.1：CD4纳米抗体候选物的选择
之前利用人外周血淋巴细胞从免疫文库鉴别了一组CD4纳米抗体。美洲驼58、59和60按照标准方案免疫，所述标准方案具有间隔为2周的6次加强免疫，每次加强使用约1x108个人外周血淋巴细胞(hPBL)。最后一次加强后4天和9天收集血液。另外，最后一次加强后4天从动物中收集约1g淋巴结活检样本。
根据制造商的说明书使用Ficoll-Hypaque从血样中制备外周血单核细胞。接下来，从这些细胞和淋巴结组织中提取总RNA(如果有的话)，并将其用作RT-PCR的起始材料以扩增编码纳米抗体的基因片段。将这些片段克隆到噬菌粒载体pAX50中。根据标准方法制备噬菌体(参见例如本文中引用的申请人递交的现有技术和申请)。
选择展现结合CD4的噬菌体。纳米抗体噬菌体文库58、59和60用于选择重组人CD4(ImmunoDiagnostics,Inc.,cat#7001,lot#5S30/1.5)。将重组人CD4以10μg/ml、0.1μg/ml和0μg/ml(对照)直接固定在Maxisorp 96孔微量滴定板(Nunc)上。在与噬菌体文库温育并充分洗涤后，用100mM三乙胺(TEA)洗脱结合的噬菌体。将洗脱的噬菌体扩增并在类似的第二轮选择中应用。用TEA洗脱后，将第二轮获得的噬菌体再次扩增并在类似的第三轮选择中应用，其中在与噬菌体温育并充分洗涤后，用TEA非特异性地洗脱结合的噬菌体，或者用250nM的gp120HIV-1IIIB(Immunodiagnostic)特异性地洗脱。培养从洗脱的噬菌体池得到的各个菌落，并且i)诱导以用于产生新的噬菌体，ii)根据标准方法用IPTG诱导以用于纳米抗体表达和提取(周质提取物)(参见例如本文中引用的申请人递交的现有技术和申请)。
2.2筛选结合CD4的纳米抗体
为了确定对CD4的结合特异性，使用单克隆噬菌体池在ELISA结合测定装置中测试选择的克隆。简言之，将1μg/ml受体重组人CD4(ImmunoDiagnostics Inc.,cat#7001)固定在Maxisorp ELISA平板(Nunc)上，并使用PBS中的4％Marvel脱脂牛奶封闭游离的结合位点。接下来，将来自在100μl 1％Marvel PBS中的不同克隆的单克隆噬菌体诱导物的15μl上清液与固定的抗原结合。在温育和洗涤步骤后，使用HRP-缀合的单克隆-抗-M13抗体(Gentaur Cat#27942101)显示噬菌体结合。与不接受噬菌体或接受不相关噬菌体的对照相比，基于OD值确定结合特异性。图2显示了噬菌体ELISA中4个克隆与重组人CD4的结合。所述序列在表2.2中描述。
表2.2 CD4纳米抗体
将结合CD4的纳米抗体进行序列分析，并将独特的克隆再克隆到大肠杆菌表达载体中，允许进一步表征为纯化的纳米抗体。在表达载体pAX50中产生单价CD4纳米抗体作为C-末端连接的myc,His6-标记的蛋白。
为了检查选择的纳米抗体是否识别细胞表面表达的CD4，进行流式细胞术实验，其中对纯化的CD4纳米抗测试与表达人CD4的Jurkat和THP-1细胞的特异性结合。鼠Ba/F3骨髓细胞被用作阴性对照细胞。将纯化的纳米抗体(100nM)在PBS(Invitrogen#14190)中的10％FBS(Invitrogen,Cat10270-106)中(最终体积为100μl)在4℃与105个细胞结合30分钟。使用小鼠抗-myc抗体(Serotec,Cat#MCA2200)，接着山羊抗-小鼠-PE抗体(Jackson#115-115-164)检测结合的纳米抗体。通过使用TOPRO3(分子探针T3605)染色细胞来确定死亡细胞群体百分比。使用BD FACS Array生物分析仪系统、PE过滤器585/42和Topro过滤器661/16，获得了两万项。排除TOPRO3+细胞，并计算平均通道荧光(mean channel fluorescence,MCF)。通过使用10μg/ml的抗-CD4单克隆抗体(Diaclone,克隆B-A1cat#854.030.000)确认CD4在Jurkat和THP-1细胞中的表达。进行细胞染色，使用抗-myc和/或山羊抗小鼠-PE抗体抗体作为阴性对照。对于4种不同纳米抗体和对照抗体获得的结果显示在图2中，证实了所有纳米抗体与细胞表面上表达的CD4结合，其中纳米抗体03F11在THP-1细胞上显示了最高的结合信号。
2.3筛选阻断CD4-gp120相互作用的纳米抗体
除了其对T细胞的作用外，CD4还用作HIV进入的主要受体。因此对于纯化的CD4纳米抗体，分析阻断CD4与病毒gp120蛋白的相互作用的能力。通过亲和层析和脱盐层析从周质提取物中纯化单价His-标记的纳米抗体，并在基于ELISA的竞争方案中使用。简言之，通过先前涂布在96孔Maxisorp微量滴定板(Nunc)的20μg/ml的绵羊抗-gp120抗体D7324(Aalto Bio Reagents)捕获1μg/ml的gp120HIV-1IIIB(Immunodiagnostic)，并使用PBS中的1％酪蛋白进行封闭。平行地，将0.5μg/ml的生物素化CD4与500nM的不同纯化的纳米抗体在100μl 0.1％酪蛋白/PBS中温育。1小时后，将生物素化的CD4-纳米抗体预混合物与捕获的gp120温育1小时。使用HRP-缀合的Extravidin(Sigma E2886)检测结合的生物素化的CD4。将封闭小鼠抗CD4IgG2a抗体(Diaclone,克隆B-A1cat#854.030.000)用作阳性对照。阻断活性被确定为与不添加纳米抗体的孔相比的O.D.信号损失。
图2的图片C显示了使用选择的结合人CD4的克隆的这种阻断测定的结果。
结果表明纳米抗体03F11和01B6阻断CD4与gp120的体外相互作用。
2.4 CD4纳米抗体3F11的特性
随后，使用抗-flag-标签的检测，在FACS中对纳米抗体03F11(也称为3F11)分析对原代人T细胞、MOLM-13和THP-1细胞的剂量依赖性结合。EC50值结果在表2.4中描述。在原代细胞上，03F11同样显示了强结合，EC50值是0.76nM(图2的图片D)。为了确认抗-CD4纳米抗体的特异性，还评价了03F11对使用CD8+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotech,Cat.130-096-495)从人PBMC中分离的细胞毒性CD8+T细胞(得到94％纯度的CD8+细胞)的结合。利用抗-CD403F11纳米抗体未观察到与细胞毒性CD8+T细胞的结合(数据未显示)。
结果表明纳米抗体能够与受体CD4结合并阻止与HIV-1gp120结合的相互作用。
表2.4单价CD4纳米抗体3F11的特性
实施例3 CXCR4纳米抗体候选物的鉴别和选择
在本实施例中，发明人着手鉴别和表征抗-CXCR4纳米抗体，其能够在HIV1感染性测定中用作功能性拮抗剂。
优选地，这些CXCR4纳米抗体将与干扰gp120相互作用但是不干扰配体CXCL12的结合的一个或多个表位结合，因此纳米抗体将不干扰天然CXCR4信号转导。
3.1 CXCR4纳米抗体的配体置换
为此，在放射-配体置换测定中，对CXCR4纳米抗体分析它们与HEK293T-CXCR4细胞的结合，以及它们与配体CXCL12(或SDF-1a)对受体结合的竞争能力。各个CXCR4纳米抗体的序列在表3.1A中描述。
表3.1A CXCR4纳米抗体
简言之，将瞬时转染以CXCR4的HEK293细胞的膜提取物与纯化的纳米抗体的系列稀释物和75pM的[125I]-CXCL12温育。在100nM冷的SDF-1的存在下确定非特异性结合。测定进行三次，并且计算SDF-1抑制的平均百分数和Ki值(表3.1B)。
表3.1B单价CXCR4纳米抗体的配体置换亲和力
在图2.1中，显示了281F12具有Ki为27nM的中等效力，并且仅具有部分功效，而其它CXCR4纳米抗体显示了在置换配体与CXCR4受体的结合中的完全功效。
这将表明纳米抗体281F12不损害或仅最低限度地损害天然CXCR4信号转导。
3.2纳米抗体对HIV-1复制的抑制
为了确定单价CXCR4纳米抗体和单价CD4 3F11纳米抗体是否能够阻断使用CXCR4的HIV1株的复制，利用CXCR4和CCR5特异性HIV克隆进行HIV-1感染测定。
在内源性表达CD4和CXCR4而不表达CCR5的人MT-4细胞中对NL4.3、使用CCR5的(R5)HIV-1株BaL、双趋向性(R5/X4)HIV-1株HE和双趋向性(R5/X4)HIV-2ROD株进行研究。使用显微镜评价和MTS存活力染色法来确定活性(IC50)和毒性(CC50)。使用CXCR4的(X4)HIV-1克隆NL4.3获自国立卫生研究院NIAID AIDS试剂项目(National Institutes of HealthNIAID AIDS Reagent program)(Bethesda，MD)，使用CCR5的(R5)HIV-1株BaL获自医学研究委员会AIDS试剂项目(Medical Research Council AIDS reagent project)(Herts，UK)。双趋向性(R5/X4)HIV-1HE株最初从Leuven大学医院的患者分离。在所有实验中，AMD3100(特异性CXCR4拮抗剂)和maraviroc(特异性CCR5拮抗剂)用作对照。MT-4细胞接种在96-孔板中。将纳米抗体以不同浓度与HIV-1一起加入并且将板维持在37℃，于10％CO2中。病毒导致的致细胞病变效应通过病毒感染的细胞培养物的每日显微镜评价来监测。在感染后的第4-5天，当在阳性对照(即，未处理的HIV-感染的细胞)中观察到强烈的致细胞病变效应时，经由四唑化合物MTS的原位减少，使用CellTiterAQueous一种溶液细胞增殖测定(Promega,Madison,WI))评价细胞存活力。在490nm用96-孔板读数器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)分光光度测量吸光度并且与四个细胞对照重复(没有病毒和药物的细胞)和四个病毒对照孔(没有药物的病毒感染的细胞)比较。对于来自剂量响应曲线的各个多肽计算IC50，即，抑制HIV-诱导的细胞死亡达50％的药物浓度。从暴露于药剂的未感染的细胞的存活力的减少，确定各个多肽的CC50或50％细胞毒性浓度。
对于CXCR4纳米抗体在MT-4细胞上的各个IC50值在表3.2中描述。对于CD4纳米抗体的IC50值在表2.4中描述。针对CD4的纳米抗体03F11在MT-4细胞中以0.52μg/ml的IC50(相当于34.7nM)抑制X4HIV-1NL4.3复制。抗-CXCR4-定向的纳米抗体281F12具有相当的效力，并且以0.34μg/ml的平均IC50(相当于22.7nM)抑制HIV-1NL4.3复制。
在人PBMC(内源性表达CD4、CXCR4和CCR5亚群)上针对HIV-1X4NL4.3株、HIV-1X4UG270临床分离株分支D、X4HIV-1CI#17临床分离株分支B、X4HIV-1CM237临床分离株分支B和针对HIV-1R5BaL株，对相同的一组CXCR4纳米抗体也进行了评价。再次，AMD3100和AMD14031(maraviroc)在所有实验中用作对照。通过密度离心，从健康供体分离外周血单核细胞(PBMCs)(Lymphoprep；Nycomed Pharma,AS Diagnostics,Oslo,Norway)并用植物血细胞凝集素刺激3天。将活化的细胞用PBS清洗并且如之前描述的进行病毒感染(Schols等人.J Exp Med 1997；186:1383-1388)。PHA刺激的母细胞以0.5×106个细胞/孔接种到48孔板(Costar；Elscolab,Kruibeke,Belgium)中，所述48孔板在含有IL-2的培养基中含有不同浓度的化合物。以100TCID50的HIV-1或HIV-2的最终剂量加入病毒悬液。在开始感染后8-10天，在培养上清中通过酶联免疫吸附测定检测病毒p24Ag(Perkin Elmer，Brussels，Belgium)。对于HIV-2p27Ag检测，使用来自Innogenetics(Temse,Belgium)的INNOTEST。
表3.2总结了在4X4HIV-1株中CXCR4纳米抗体的HIV中和的结果。
结果表明CXCR4纳米抗体显示了在依赖于CXCR4的不同临床分离株上一致的中和能力，而这些都不能阻断BaL株的感染(IC50>1000ng/mL，结果未显示)。在测试的组中，281E10和283F1是在所有X4株上非常有效的拮抗剂，而281F12是最不有效的纳米抗体，IC50在9-16nM之间。HIV1中和的效力与26nM的配体置换Ki具有相同的亲和力范围。
HIV-1复制的抑制(与其较差的配体置换能力组合)使得CXCR4纳米抗体281F12成为用于与CD4纳米抗体3F11格式化为双特异性构建体的合适的初始候选物。
表3.2：对CXCR4纳米抗体评价其阻断在PBMC中不同临床HIV1分离株(即，HIV-1X4NL4.3株、HIV-1X4UG270临床分离株(分支D)、HIV-1CI#17临床分离株(分支B)、HIV-1CM237临床分离株(分支B)和针对HIV-1R5BaL株)的感染力。纳米抗体根据效力排序。作为对照化合物，包括AMD3100(特异性CXCR4拮抗剂)和maraviroc(特异性CCR5拮抗剂)。
实施例4：单价CXCR4和CD4的组合研究
为了测试CXCR4和CD4纳米抗体对HIV-1活性的组合效应，将每种选择的纳米抗体单独或与另一种抗HIV化合物组合进行测试。
使用的抗HIV化合物是(1)AMD3100(普乐沙福(plerixafor)，商品名Mozobil，Genzyme)，其是特异性CXCR4拮抗剂；(2)T-20(恩夫韦地(enfuvirtide)，商品名Roche)，其是用作HIV融合抑制剂的gp41-模拟肽；(3)CADA(环三氮杂-二磺酰胺(cyclotriaza-disulfonamide))，其是用作特异性CD4-靶向HIV进入抑制剂的CD4下调化合物；(4)RPA-T4(抗-CD4小鼠mAb)，其结合CD4的D1结构域并且可以阻断HIV gp120结合并抑制合胞体形成。
使用上述MTS存活力染色法，通过测量MT-4细胞中NL4.3的致细胞病变效应来确定组合前和组合后的抗HIV-1EC50和EC95。基于Chou和Talalay(Chou和Talalay,1984)的中值效应原理，使用CalcuSyn软件(Biosoft,Cambridge,UK)计算组合指数(CI)。得到的两种药物的组合指数方程是：
其中(Dx)1是指抑制系统x％的“单独”(D)1，(Dx)2是指抑制系统x％的“单独”(D)2，而在分子中，(D)1+(D)2“组合”也抑制x％。请注意，最后两项的分母是MEE的表达。CI-值<0.9表示协同作用，0.9<CI<1.1表示加和效应，并且CI>1.1表示拮抗作用。
测试组合的各自的CI值在表4中描述。在与纳米抗体281F12(抗-CXCR4)、与AMD3100(抗-CXCR4)、与T-20和与CADA(下调CD4)组合中观察到抗-CD4纳米抗体3F11的协同作用。然而，对于抗-CD4单克隆抗体RPA-T4观察到拮抗作用，这表明这些化合物可以与CD4上的重叠表位结合。对于CADA和T-20观察到抗-CXCR4纳米抗体281F12的协同作用，但是对于AMD3100仅观察到加和作用(表4)。
这些结果一起论证了双特异性多肽(例如，CXCR4纳米抗体281F12和CD4纳米抗体3F11)对HIV1进入的组合阻断。
剂量降低：与单一药物治疗相比，组合治疗后CBA浓度的降低
CI(组合指数)：CI由来自一式两份的2-5个独立实验的平均±SEM表示。
CI<0.9：协同作用0.9<CI<1.1：加和效应并且CI>1.1：拮抗作用
协同作用水平：以EC95-水平计算的协同作用：+，轻度协同作用(CI:0.85-0.90)；++，中度协同作用(CI:0.70-0.85)；+++，协同作用(CI,0.30-0.70)；++++，强协同作用(CI,0.10-0.30)
实施例5.双特异性CXCR4-CD4多肽的构建
实施例4证明了单独CXCR4纳米抗体281F12(SEQ ID NO:9)和CD4纳米抗体3F11(SEQ ID NO:20)对HIV进入的组合阻断的协同效应。接下来，发明人着手评价双特异性构建体中CD4和CXCR4受体二者的双重阻断对HIV感染性的影响。如下概述的产生双特异性CXCR4-CD4多肽。
因为CXCR4和CD4充当gp120的共同受体，所以预期它们在细胞表面上接近。CCR5、CXCR4和CD4主要在细胞表面上的微绒毛上发现，它们在所有细胞类型中(包括巨噬细胞和T细胞)形成同质的微团簇。此外，gp120诱导CD4–CXCR4膜共定位。然而，两种纳米抗体结构单元之间对于同时结合两种受体并随后阻断HIV1进入的最佳距离是未知的。由于此原因，产生具有不同长度的柔性间隔区的双特异性多肽，所述间隔区用于连接两个纳米抗体结构单元：分别为(Gly4SerGly4)(9GS)、(Gly4Ser)5(25GS)和(Gly4Ser)7(35GS)。
将抗-CD4纳米抗体3F11和抗-CXCR4纳米抗体281F12的构建体引入到制备载体pAX100。该载体衍生自pUC119并且含有LacZ启动子、卡那霉素抗性基因、多克隆位点、OmpA前导序列、C-末端c-myc标签和His6标签。通过与相应接头融合将281F12置于3F11的N-末端和C-末端位置来产生双特异性构建体，得到8种不同双特异性构建体(表5A)。所有构建体的正确的核苷酸序列通过序列分析确认(对于所有序列的概述，参见表5B)。单价和双特异性纳米抗体构建体在大肠杆菌中生产并且通过使用Nickel 6FF的固定化金属亲和层析(IMAC)纯化为myc-His标记的蛋白质。用250mM咪唑从柱上洗脱纳米抗体并且随后针对于dPBS脱盐。
表5A
随后将正确的单价和双特异性构建体重新克隆入pAX205载体用于在酵母毕赤酵母(Pichia pastoris)中产生作为FLAG3-His6-标记的蛋白。通过用限制酶消化，线性化编码双特异性构建体的质粒，之后转化入毕赤酵母株X-33。进行毕赤酵母转化子的小规模测试表达以选择具有良好表达水平的克隆。为此，在24孔深孔板中进行各个构建体的4个克隆的4ml规模的表达。通过SDS-PAGE评价培养基中纳米抗体构建体的表达。收集培养基级分并且用作用于使用Nickel 6FF的固定化金属亲和层析(IMAC)的起始材料。用250mM咪唑从柱上洗脱纳米抗体构建体并且随后在Atoll(ATO002)上的G-25Superfine上针对dPBS脱盐。纳米抗体构建体的纯度和完整性通过SDS-PAGE和使用抗-VHH和抗-标签检测的蛋白质印迹验证。
表5B
实施例6.双特异性CXCR4-CD4多肽的结合分析
为了评价格式化为双特异性构建体是否影响CXCR4纳米抗体对CXCR4的结合，对整组的双特异性多肽分析对病毒脂质颗粒(Integral Molecular)上CXCR4的结合。简言之，在4℃将2个单位的空VLP和hCXCR4脂质颗粒在96孔maxisorp板上包被过夜。在次日，将游离结合位点用PBS中的4％marvel脱脂牛奶在室温封闭2h。然后，在用PBS清洗平板3次后，将100nM、10nM、1nM和0nM的纯化的多肽加入至包被的孔中并在室温温育1h。在用PBS清洗3次后，结合的多肽用小鼠抗-c-myc(Roche,cat#11667149001)和兔抗-小鼠-HRP(DAKO,cat#P0260)抗体检测，二者都在室温1h。基于O.D.值确定结合并且与以下对照相比：不相关纳米抗体，未包被孔，母体单价结构单元和单克隆抗CXCR4抗体12G5二者(R&D Systems,cat#MAB170)。
图2.2显示对于CXCR4脂质颗粒相对对照脂质颗粒的结合ELISA的结果。对于CD4纳米抗体观察到对于双特异性构建体的取向影响，并且仅在CXCR4纳米抗体置于N-末端位置的情况下，保留CXCR4结合。接头长度的改变不能克服CXCR4纳米抗体的对靶标结合的该损失，除了可能对于CD4-25GS-CXCR4构建体以外，其与C-末端位置具有CXCR4部分的两个其他双特异性抗体相比，似乎较少被削弱。
在流式细胞术中，对该组CXCR4-CD4双特异性多肽分析对具有两个靶标CXCR4和CD4的不同相对表达水平的细胞系的剂量依赖性的结合。将细胞与Fc-封闭溶液(MiltenyiBiotec cat#130-059-901)温育30分钟，之后用单克隆抗-CXCR4抗体12G5(R&D#MAB170)和单克隆抗-CD4抗体BA1(Diaclone#854030000)染色。用小鼠抗-c-myc(AbD Serotec,cat#MCA2200)和山羊抗-小鼠-PE(Jackson ImmunoResearch,cat#115-115-171)抗体检测结合的多肽，二者都在4℃震荡30min。基于MCF值确定结合并与对照比较。
Jurkat细胞、THP-1细胞和Molm-13细胞上CD4和CXCR4的表达水平，以及单价和双特异性纳米抗体构建体对每一种细胞系的结合曲线在图2.3中描述。
Jurkat细胞和Molm-13细胞的EC50值在表6中列出。Jurkat E6.1细胞显示不表达或低水平表达CD4的细胞的异源群体。单价CD4 3F11纳米抗体仅显示非常低的对Jurkat细胞的MCF结合水平，尽管EC50值与在THP-1和MOLM-13细胞上的相似(EC50分别是1.1nM相对于0.5nM相对于0.7nM)。
表6：双特异性CXCR4-CD4多肽对具有不同表达水平的CXCR4和CD4的细胞的结合亲和力和效力。通过测量经由CXCR4的SDF-1介导的趋化作用的抑制来评价功能性阻断。结果是3次实验的平均值。
#双特异性相对于单价CXCR4纳米抗体281F12的效力的倍数增加。
在Jurkat细胞上，双特异性CXCR4-CD4纳米抗体构建体具有与单价CXCR4纳米抗体构建体相似的EC50值，与高CXCR4表达水平一致。双特异性纳米抗体构建体比单价CXCR4纳米抗体具有稍高的荧光水平。对于双阳性THP-1细胞，与两种单价纳米抗体构建体相比，观察到双特异性CXCR4-CD4纳米抗体构建体的曲线的明显迁移。双特异性纳米抗体构建体达到高得多的平台MCF水平。然而，双特异性和单价纳米抗体构建体之间的EC50值的差异仅是中等的(EC50 0.29nM(CXCR4-CD4)相对于0.5nM(CD4)相对于3.1nM(CXCR4))。对于MOLM-13细胞，双特异性多肽的EC50值与CD4纳米抗体3F11相似。并且这里也观察到增加的平台水平。相反取向的(CD4-CXCR4)双特异性纳米抗体构建体的结合曲线与单价CD4纳米抗体3F11重叠。
流式细胞术中该总荧光的增加可以代表加和结合(单独结合于各个靶标)，以及同时结合细胞表面上的两个靶标。
实施例7：双特异性构建体显示对CXCR4增加的亲和力和抑制效力
7.1：通过CXCR4-CD4双特异性构建体抑制CXCR4-介导的趋化作用
为了评价双特异性CXCR4-CD4多肽是否对表达两种受体的细胞显示增加的亲和力和效力，进行CXCR4-依赖性的功能性测定。在Jurkat(CXCR4+/CD4低)和Molm-13细胞(CXCR4++/CD4++)上确定该组双特异性CD4-CXCR4纳米抗体对CXCL12-诱导的趋化作用的剂量依赖性抑制，以直接比较表达两种或仅一种受体的细胞。
对双特异性多肽，分析对内源性表达CXCR4的细胞上CXCL12-诱导的趋化作用的抑制。作为化学吸引剂，750pM SDF-1a(R&D Systems)的浓度用于Jurkat细胞系，100,000个细胞/孔，并且用于MOLM-13细胞系，500,000个细胞/孔。将SDF-1a和系列稀释的纳米抗体构建体以总体积29μl添加到小趋化性板(Neuprobe 106-5)的底部。将趋化性滤膜(Disposibla，孔径5μm)置于孔的顶部，确保膜与下面的孔中的溶液接触。在膜的顶部加入纳米抗体稀释液(10μl，以每孔中膜下面的系列稀释的最终浓度的5倍)，然后加入40μl的细胞悬液。平板在湿润的培养箱(5％CO2)中37℃温育3小时。温育后，小心取出滤器，并且将下面孔中的细胞重新悬浮在现有的溶液中。将完整的细胞悬浮液转移至白色聚苯乙烯Costar板的相应孔中。在这之后，将30μl的Cell Titer Glo试剂(Promega G7571)加入到各个孔中，然后在黑暗中振荡以温育10分钟。使用具有发射滤光片700的Envision 2103多标记读数器(Perkin Elmer)测量发光(1秒/孔)。在各个板上，包括相应的单价CXCR4纳米抗体作为参考，允许计算各个板内双特异性多肽的倍数增加。作为另外的对照，包括单价纳米抗体的1:1混合物。作为参考，抗-CXCR4抗体12G5包括在各个板上。
代表性实施例的结果在图2.4中显示，并且IC50值在表6中提供(n＝3次实验的平均值)。
与单价CXCR4纳米抗体相比，双特异性CXCR4-CD4构建体对双阳性细胞显示约150倍的强烈的效力增强，而CD4纳米抗体本身对SDF-1功能不具有任何作用。明显地，尽管由于构建体中C-末端位置导致它们对CXCR4亲和力的强烈降低，但是相反取向的双特异性构建体仍能够阻断CXCR4功能，尽管该阻断仅是部分的。
因为功能性阻断主要经由CXCR4介导，所以预期通过同时结合抗-CD4纳米抗体导致的亲合力转化为趋化作用的抑制方面的增加的效力。
这表明在双特异性构建体中的各个纳米抗体能够同时结合它们的相应靶标，并且促进在共表达受体和共同受体二者的细胞上的亲合力。
7.2.双特异性CXCR4-CD4纳米抗体构建体对CXCL12至CXCR4的抑制
通过流式细胞术在CD4+T细胞(SUPT-1细胞)的结合抑制测定中评价单价和双特异性CXCR4-CD4纳米抗体构建体置换CXCR4的天然配体(SDF-1或CXCL-12)的能力。简言之，用测定缓冲液(具有20mM HEPES缓冲液和0.2％牛血清白蛋白的Hanks’平衡盐溶液，pH 7.4)洗涤人T-淋巴样SupT1-CXCR4细胞一次，然后在室温下与以指定浓度稀释于测定缓冲液中的试剂温育15分钟。从Almac Sciences(Craigavon,UK)获得CXCL12AF647(在其第二个至最后一个氨基酸位点携带AlexaFluor 647部分的人CXCL12)。在与化合物的温育期之后，将稀释于测定缓冲液中的CXCL12AF647(25ng/ml)加入到细胞-化合物混合物中并在室温下温育30分钟。此后，将细胞在测定缓冲液中洗涤两次，固定在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1％多聚甲醛中，并在配有635-nm红色二极管激光器(Becton Dickinson)的FACSCalibur流式细胞仪的FL4通道上进行分析。根据公式(1-[MFI-MFINC]/[MFIPC-MFINC])x 100计算CXCL12AF647结合的抑制百分比，其中MFI是在抑制剂的存在下与CXCL12AF647温育的细胞的平均荧光强度，MFINC是在阴性对照中测量的平均荧光强度(即，未标记的细胞的自体荧光)，并且MFIPC是阳性对照(即，仅暴露于CXCL12AF647的细胞)的平均荧光强度。
各自的IC50值在表7.2中显示。
抗-CXCR4纳米抗体281F12阻断了特异性标记的CXCL12AF647与CXCR4的结合，表达的IC50是6.3nM。双特异性构建体3F11-281F12和281F12-3F11具有十分相似的效力，分别为1.5nM和0.97nM，相对于T细胞上的单价纳米抗体281F12好4-倍至6.5-倍。抗-CD4纳米抗体3F11不干扰CXCL12AF647与T细胞上的CXCR4的结合。
表7.2：CXCR4-CD4多肽抑制CXCR4的配体结合和活化
7.3双特异性CXCR4-CD4多肽构建体对SDF-1诱导的钙信号传导的抑制
在抑制CXCL-12诱导的Ca2+-信号传导中评价单价和双特异性CXCR4-CD4构建体抑制CXCR4受体的下游信号转导的能力。对此，将U87.CD4.CXCR4成胶质细胞瘤细胞装载在测定缓冲液(具有20mM HEPES缓冲液和0.2％牛血清白蛋白的Hanks’平衡盐溶液，pH 7.4)中以4μM的荧光钙指示剂氟-3乙酰氧基甲基酯(Molecular Probes)，在室温下45分钟。在用测定缓冲液充分洗涤之后，将细胞在相同缓冲液中与纳米抗体构建体在37℃预温育10min或与AMD3100在37℃预温育10min。接下来，基本上如Princen等人(Princen等人,2003Cytometry 51,35-45)所描述的，通过使用荧光成像板读数器(FLIPR；MolecularDevices,Sunnyvale,CA,USA)在所有孔中同时监测荧光作为时间的函数，在37℃测量响应于CXCL12的细胞内钙动员。
IC50值在表7.2中显示。
没有一种单价多肽自身诱导任何显著的Ca2+-信号传导。对于在U87.CD4.CXCR4细胞中抑制CXCL-12诱导的Ca2+-信号传导，不同取向的双特异性多肽CXCR4-CD4和CD4-CXCR4之间没有观察到IC50值的差异。相对于IC50为66.7nM的单价多肽CXCR4 281F12，效力增强是12-至20-倍。单价纳米抗体3F11不展现CXCL-12诱导的Ca2+-信号传导抑制。
总之，这些结果表明双特异性CXCR4-CD4构建体在共表达两种靶标的细胞上同时结合CD4和CXCR4二者增强了CXCR4结合部分的亲和力和效力，而不具有明确的取向影响。
7.4双特异性CXCR4-CD4多肽构建体对抗-CXCR4抗体结合的抑制
通过流式细胞术在不同的细胞系(SUPT-1CD4+T细胞、THP-1和Jurkat细胞)上评价单价和双特异性CXCR4-CD4纳米抗体构建体置换抗-CXCR4mAb 12G5的结合的能力。
简言之，用测定缓冲液(具有20mM HEPES缓冲液和0.2％牛血清白蛋白的Hanks’平衡盐溶液，pH 7.4)洗涤细胞一次，然后在室温下与以指定浓度稀释于测定缓冲液中的纳米抗体温育15分钟。接下来，将抗-CXCR4mAb 12G5(PE-标记的,10nM)加入到细胞-试剂混合物中并在室温下温育30分钟。此后，细胞在测定缓冲液中洗涤两次。在SUPT-1的情况下，将细胞固定在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1％多聚甲醛中。随后，在FACS Calibur流式细胞仪(Becton-Dickinson)的FL2通道上分析细胞。
结果在表7.2和图3中描述。
在Jurkat细胞上，与单价CXCR4纳米抗体构建体相比，双特异性281F12-3F11纳米抗体构建体损失了2-倍的效力，在相反取向上观察到～50-倍的损失。在共表达CXCR4和CD4的SUPT-1和THP-1细胞上，与尽管具有双相曲线的单价281F12纳米抗体构建体相比，双特异性281F12-3F11纳米抗体构建体显示了增强的12G5mAb结合的置换。猜测这是由3F11纳米抗体臂的CD4结合所提供的亲合力造成的。
实施例8：双特异性CXCR4-CD4构建体的有效且广泛的HIV1中和
对使用CXCR4的(X4)HIV-1克隆NL4.3感染的MT-4细胞，并在来自不同健康供体的植物血细胞凝集素(PHA)刺激的PBMCs(表达CD4+/CXCR4+/CCR5+)中，测试双特异性CXC4-CD4构建体和相应的单价CXCR4和CD4构建体的抑制效应的特异性。使用CCR5的(R5)HIV-1株BaL用于感染PBMCs。
8.1.HIV-1感染测定
如实施例3.2中所述，通过测量不同HIV-1株在MT-4和U87细胞系的致细胞病变效应，或者通过定量PBMC的培养上清中病毒p24抗原产生，确定双特异性CD4-CXCR4纳米抗体构建体和对应的单价CXCR4和CD4纳米抗体构建体的抗-HIV-1效力。
MT-4细胞中的HIV1中和结果在表8.1.1中以IC50值描述。
在NL4.3株感染的MT-4细胞中，CXCR4纳米抗体特异抑制经由CXCR4的抗-X4HIV1进入，但是不抑制与CCR5结合。CD4纳米抗体有效阻断X4HIV1感染，具有与在MT-4细胞中CXCR4单价抗体相似的IC50值。双特异性CXCR4-CD4构建体在PHA-刺激的PBMCs中对抑制MT-4细胞中的HIV-1X4病毒复制是极为有效的，效力为30-370pM。双特异性CXCR4-CD4构建体的效力增加是单价CXCR4纳米抗体的250-320倍，具有最短接头似乎比更长的接头稍好。具有相反取向的纳米抗体的双特异性多肽，即具有减小的对于CXCR4的亲和力，在此功能性测定中活性较低，但是仍比CD4单价纳米抗体显著更加有效。
接下来，我们评价观察到的双特异性构建体的效力是否是由CXCR4和CD4纳米抗体的组合阻断造成的，或者两种纳米抗体连接到双特异性构建体中是否对效力增强是必需的。为此，对于单独的或具有1:1摩尔比的双特异性281F12-35GS-3F11纳米抗体构建体和单价纳米抗体，比较MT-4细胞中NL4.3感染性的抑制。
结果显示在图4中。
虽然与最佳单价纳米抗体相比，单价CXCR4和CD4纳米抗体构建体的混合物导致了IC50提高约2倍，但是双特异性构建体提供了320-倍的提高，具有150pM的效力。因此，与单独的单价对应物或单价对应物的组合相比，双特异性CXCR4-CD4多肽同时结合CXCR4和CD4二者导致对使用CXCR4的HIV-1的中和的亲合力和强烈增强效力。连接是重要的，但是接头长度的明确影响是不明显的。
表8.1.1：具有不同接头长度的双特异性纳米抗体对CXCR4-趋向性NL4.3(X4)和CCR5-趋向性(R5)BaL病毒的抗HIV特异性属性(profile)。
#观察到高供体可变性
对纳米抗体进一步评估它们在来自具有额外的X4和双趋向性X4-R5特异性HIV克隆的不同供体的PHA刺激的PBMC中的抗HIV活性。对于这些实验，我们限于具有最长接头(35GS；因为接头长度没有明显影响)的双特异性构建体，以及对应的单价纳米抗体和AMD3100。
PHA刺激的母细胞以0.5×106个细胞/孔接种到48孔板(Costar；Elscolab,Kruibeke,Belgium)中，所述48孔板含有在含有IL-2的培养基中不同浓度的化合物。以100TCID50的HIV-1或HIV-2的最终剂量加入病毒储液。在开始感染后8-10天，在培养上清中通过酶联免疫吸附测定检测病毒p24Ag(Perkin Elmer，Brussels，Belgium)。对于HIV-2p27Ag检测，使用来自Innogenetics(Temse,Belgium)的INNOTEST。在每次测定中，AMD3100作为对照化合物进行评价。
结果显示在表8.1.2中。
抗-CXCR4纳米抗体281F12在每个PBMC供体中都非常一致地抑制HIV-1NL4.3，IC50为46.7nM。抗-CD4单价纳米抗体3F11对HIV-1NL4.3具有弱活性。在5个不同PBMC供体中获得了约580nM的IC50，但是在没有测量到活性的9个其它PBMC供体中没有获得(由于目前还不清楚的原因)。双特异性281F12-35GS-3F11构建体显示出有效的抗HIV-1活性，具有低至86.7pM(2.6ng/ml)的IC50，而双特异性3F11-35GS-281F12构建体一致地抑制复制，平均IC50为29nM。AMD3100的平均IC50是3.3nM。
对纳米抗体进一步评价它们对X4-R5双趋向性HIV分离株的抗HIV活性。最初在内源性表达CD4和CXCR4而不表达CCR5的人MT-4细胞中对双趋向性(R5/X4)HIV-1株HE和双趋向性(R5/X4)HIV-2ROD株进行研究。(R5/X4)HIV-1HE株最初从Leuven大学医院的患者分离。使用显微镜评价和MTS存活力染色法来确定活性(IC50)和毒性(CC50)。对于最有效的双特异性281F12-3F11构建体在双趋向性HIV1HE和HIV2ROD株上获得了一致的pM效力。
在表达CCR5和CXCR4共同受体二者的PBMC中，纳米抗体3F11对双趋向性R5/X4HIV-1HE不具有活性，而纳米抗体281F12具有中等活性，IC50为266.7nM。相反地，双特异性281F12-35GS-3F11构建体展现出有效的抗HIV-1HE活性，IC50为1.5nM，而双特异性3F11-35GS-281F12构建体经常丧失其活性。在其活性测定中AMD3100的活性也是变化的并且有时丧失活性，很可能是由供体PBMC中CXCR4(非常高)和CCR5(非常低，但是以1-20％变化)的共同受体表达水平造成的。值得注意地，在该细胞测定系统中，AMD14031/maraviro从未显示出任何显著的抗HIV-1HE活性。
综合这些结果表明，双特异性多肽在不同的X4和双趋向性X4-R5HIV株中具有宽的覆盖，并且在阻断病毒感染中以皮摩尔-低纳摩尔的范围具有一致的高效力。
表8.1.2：与X4株NL4.3相比，纳米抗体在MT-4细胞和PBMC上针对不同的双趋向性分离株的抗HIV活性属性。
8.2 CXCR4-共同受体使用的特异性
CXCR4纳米抗体的效力对于进入取决于使用CXCR4共同受体的HIV-1株是特异的。阻断仅一个HIV-1共同受体的一个可能劣势是，其可能触发最初未被靶向的HIV亚型的再次出现。
我们测试了在不同供体的PBMC中不同的CCR5-依赖性HIV-1株、(R5)HIV-1株BaL(获自医学研究委员会AIDS试剂项目(Herts，UK))和临床分离株DJ259(分支C)和SM145(分支C)中双特异性纳米抗体构建体的HIV活性。在R5病毒中，仅双特异性构建体中的CD4纳米抗体促进病毒中和。不受任何理论的束缚，猜测的是因为CXCR4在PBMC上表达，所以在这些细胞中双特异性多肽中的CXCR4纳米抗体可以结合CXCR4结合并促进亲合力，并且以这种方式增强CD4纳米抗体的抑制效力。
结果在表8.1.1和8.1.2中显示。
双特异性CXCR4-CD4构建体可以抑制MT-4细胞中BaL的感染性，IC50值为2.5nM，相对于单价CD4纳米抗体效力增强了约200-倍(表8.1.1)。双特异性CXCR4-CD4构建体是比相反取向的构建体更加有效的BaL抑制剂，这可能是由281F12的不利位置(其中CXCR4结合受到损害)造成的。通过中和两种R5临床分离株(SMI145和DJ259)来确认结果，其中双特异性CXCR4-CD4构建体保持1.5nM的效力，即具有比单独的单价纳米抗体3F11好17倍和20倍的效力。
综合这些结果表明CXCR4纳米抗体的细胞结合亲和力，甚至在其中CXCR4纳米抗体不主动促成功能性进入阻断的R5HIV1株中，CXCR4纳米抗体促进了双特异性CXCR4-CD4多肽的高效力。
因此，本发明的双特异性多肽可以有效地用于治疗这样的感染：其中HIV对一个部分具有抗性或者HIV使用另一个共同受体(例如，双特异性多肽不靶向的CR)。
8.3进入抑制剂抗性HIV1病毒的中和
为了证实“锚”在双特异性多肽中其它部分的亲合力中的贡献，关于HIV感染的阻断，评价一组对CXCR4小分子抑制剂AMD3100有抗性的HIV-1突变体、CXCR-4配体或对照抗体12G2(Polymun Scientific(Vienna,Austria))。
双特异性CXCR4-CD4纳米抗体对AMD3100抗性病毒的IC50值在图5和表8.3中描述。
单价CXCR4纳米抗体显示100-倍的效力损失，与AMD3100类似，而CD4效力不受影响。对于阻断AMD3100抗性病毒的感染，各个CXCR4-CD4双特异性多肽保持效力低于1nM，是单价CD4结构单元的20倍好。对整组抗性病毒，CXCR4-CD4双特异性多肽以0.3-1.1nM的IC50值保持强烈的中和效力。
因此，双特异性多肽似乎对不再结合靶标中的一个的突变体相对不敏感。
8.4产生3F11和281F12抗性HIV-1NL4.3病毒
病毒逃逸突变体是通过以IC90浓度在单价纳米抗体的存在下经多次传代培养NL4.3而产生的。以增加浓度的单价纳米抗体(从EC50浓度开始)传代MT-4细胞，在7个月的细胞培养后获得HIV-1NL4.3 3F11-抗性病毒。在针对CXCR4的纳米抗体281F12的存在下专门细胞培养传代HIV-1NL4.3超过2年，最终获得了HIV-1NL4.3 281F12-抗性病毒。为了比较，在11个月后获得了抗性AMD3100株的产生。
确定抗性株的包膜gp120序列，得到以下突变：
-3F11-res株的gp120：V40(A,V),R118(K,R),N158(N,S),S160(N,S),T311(T,I),T378(T,I)。
-281F12res株的gp120：S169L,V170N,M296I,H300Y(V3区),S435F,K460N,L464I。
由此鉴定的抗性病毒克隆被用于测试与单价多肽相比的双特异性多肽的效力。
相应的IC50值在表8.3中显示。
纳米抗体3F11(抗-CD4)完全丧失了其对HIV-1NL4.3 3F11res病毒的活性，而且也丧失了其对HIV-1NL4.3 281F12res病毒的活性。然而，在SDF-1res和AMD3100res病毒上保持了3F11的阻断能力，这表明所述损失对于281F12res株的突变具有特异性的，并且与gp120-CXCR4相互作用本身无关。
纳米抗体281F12(抗-CXCR4)完全丧失针对HIV-1NL4.3 281F12res病毒和AMD3100res病毒的活性，但是对HIV-1NL4.3 3F11res病毒具有活性，当病毒储液在MT-4细胞中被适当地滴定并重新评价时活性与野生型病毒相当(IC50:0.3μg/ml)。AMD3100几乎保持了其对HIV-1NL4.3 3F11res病毒的活性(IC50 18nM，14ng/ml)，但是显著地丧失了对HIV-1NL4.3 281F12res病毒的活性(IC50 400nM，317ng/ml)，这表明CXCR4上的重叠结合位点。
表8.3：在MT-4细胞和PBMC中确定的具有进入抑制剂抗性HIV-1NL4.3变体的双特异性CXCR4-CD4构建体的抗HIV活性属性。
双特异性281F12-35GS-3F11多肽保持对HIV-1NL4.3 3F11res病毒的完全活性，并且显著地对HIV-1NL4.3 281F12res病毒损失仅约8-倍的活性(对比野生型和抗性病毒，从187pM到1.4nM)，而针对NL4.3 3F11res病毒的效力是基本完整的。双特异性3F11-35GS-281F12多肽(对于其功能性在很大程度上依赖于CD4纳米抗体结合)对于HIV-1NL4.33F11res病毒损失了16-倍的活性(比较野生型和抗性病毒，从6nM到96nM)，并且对于HIV-1NL4.3 281F12res病毒完全丧失了其活性。
这些数据表明即使在对靶标中的一者具有抗性的病毒上，双特异性CXCR4-CD4多肽在抑制HIV1进入方面以皮摩尔的范围保持强效力，这表明双特异性CXCR4-CD4多肽的仅一个臂的功能性足以用于有效抑制，同时另一个臂可以提供结合亲合力。实际上，我们还未成功产生双抗性HIV。
综合这些结果表明，双特异性多肽在不同HIV株中具有宽的覆盖率(参见表8.3)。
因此，双特异性多肽可以代表克服对HIV感染的抗性的有力手段。
8.5在TZM-bl基于细胞的测定中HIV1感染性的阻断
还对一组双特异性CXCR4-CD4多肽组和相应的单特异性纳米抗体评价它们在TZM-bl细胞(即，转染人CD4和CCR5的表达低水平CXCR4的HeLa细胞)中的抗HIV-1活性。
在具有10％胎牛血清(FBS)和10mM HEPES的DMEM(Dulbecco’s Modified EagleMedium(Dulbecco改进的Eagle培养基)；Life Technologies,Waltham,MA,USA)中，将TZM-b1细胞以1x 104个细胞/孔接种到透明的96孔板。随后，加入化合物并将细胞/化合物混合物在37℃温育。30分钟后，以100pg p-24HIV-1Ag/孔加入HIV。温育48小时后，分析测定板。为了进行分析，将Steadylite加底物溶液(PerkinElmer,Waltham,MA,USA)加至测定板。在黑暗中的10分钟温育期后，在SpectraMax L发光微板读数器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)上在白色96孔板中分析裂解的细胞悬浮液的发光信号。测量HIV-1Tat蛋白表达诱导的萤光素酶活性作为HIV复制量的评价(参见Measuring HIVneutralization in a luciferase reporter gene assay(在荧光素酶报告基因测定中测量HIV中和作用).Montefiori,Methods Mol Biol.2009；485:395-405)。
结果在表8.5中提供。
表8.5：在TZM-bl基于细胞的测定中CXCR4-CD4多肽的抗HIV活性属性。
在这些细胞中，纳米抗体3F11(抗-CD4)以131nM的IC50抑制X4HIV-1NL4.3复制，而抗-CXCR4纳米抗体281F12的IC50是23.5nM。双特异性多肽281F12-35GS-3F11显示出抗HIV-1活性，具有低至27pM的IC50，而3F11-35GS-281F12在TZM-bl细胞中抑制X4HIV-1NL4.3，具有1.8nM的IC50。在对CXCR4 281F12或CD4 3F11纳米抗体具有抗性的NL4.3株中效力得以保持。
在TZM-b1细胞中，纳米抗体或双特异性多肽或者AMD3100均不具有针对双趋向性R5/X4HIV-1HE、双趋向性R5/X4HIV-2ROD和R5HIV-1BaL病毒的活性。值得注意的是，在这些测定中用作对照的特异性CCR5抑制剂AMD14031/maraviroc不阻断HIV-1NL4.3、HIV-1HE或HIV-2ROD，但是有效地阻断R5HIV-1BaL病毒(IC50：4.2μM)。在另外两种R5临床分离株中，双特异性CXCR4-CD4纳米抗体保持nM效力，两种取向具有相似的活性。
实施例9：HIV-介导的细胞-细胞融合的抑制
在HIV传播期间，CD4+T细胞不仅可以被无细胞病毒体感染，更重要的是也可以通过与供体HIV感染的T细胞的紧密细胞-细胞接触而受到感染。为了模拟这些细胞-细胞相互作用，我们将感染HIV-1的细胞(HUT-78/HIV-1)与未感染的SupT1CD4+靶T细胞持续地共培养。在不到20小时中，在感染和未感染的T细胞之间形成许多合胞体或巨细胞。通过用NL4.3或HIV1IIIb感染HUT-78细胞，产生了持续感染HIV-1的HUT-78细胞。每3-4天将细胞传代培养，并使用HIV-1p24Ag ELISA在培养上清中监测持续的病毒感染。对于共培养测定，将不同浓度的测试化合物以及1×105个SupT1细胞/0.5mL加入到96孔板。彻底洗涤HUT-78/HIV-1细胞以从培养基中除去游离病毒，并将5x 104个细胞(50μl)转移到96孔板中。2天后，基于细胞共培养物中巨细胞或合胞体的出现，通过显微镜确定EC50-值。对合胞体的总数进行计数。
对于抑制合胞体形成的各个IC50值在表9中显示。
表9：双特异性多肽对HIV-1介导的细胞-细胞融合的抑制。感染HIV-1的细胞(HUT-78/HIV-1NL4.3或HIV1IIIb细胞)与未感染的SupT1CD4+靶T细胞的共培养。
靶细胞 SupT1 SupT1
细胞/HIV1株 HUT-78/NL4.3 HUT-78/IIIb
纳米抗体 IC50(M)n＝4 IC50(M)n＝3
3F11 2.80E-06 4.6E-06
281F12 3.60E-06 1.8E-06
281F12-35GS-3F11 2.31E-09 1.1E-09
3F11-35GS-281F12 2.86E-08 2.3E-08
AMD3100 1.12E-06 2.2E-05
对于单价3F11的平均IC50值是2.7μM，并且对于281F12的平均IC50值是3.6μM。双特异性多肽281F12-35GS-3F11可以有效地阻断，IC50为2.3nM，而双特异性多肽3F11-35GS-281F12的IC50值为28.7nM。与其在HIV复制测定中的活性相比，AMD3100在该细胞-细胞传播测定中失去活性，显示1.1μM的IC50。
因此，双特异性多肽是干扰HIV细胞(共)受体/gp120介导的融合过程的最有效化合物。
实施例10：CXCR4纳米抗体结合gp120结合位点
我们进一步追求特异性阻断HIV进入且优选不干扰天然CXCR4信号转导的CXCR4纳米抗体。
为了鉴定特异性阻断CXCR4上gp120的相互作用但不干扰或最低限度地干扰CXCL12结合的CXCR4纳米抗体，对一组70个先前鉴定的CXCR4纳米抗体分析它们中和MT-4细胞中NL4.3HIV1感染的能力。CXCR4特异性纳米抗体也在从来自健康供体的血液血沉棕黄层分离的PBMC中进行评价，并且针对X4HIV-1NL4.3和R5HIV-1BaL复制进行测试。MT-4细胞的中和作用的IC50值在图6中描述，表明一系列的效力，其中最有效的纳米抗体15A01处于次纳摩尔范围内。如所预期的，CXCR4纳米抗体中没有一种中和PBMC中BaL R5的感染(数据未显示)。
另外，在流式细胞术中，通过置换在表达hCXCR4的瞬时转染的Caki细胞上的生物素化的SDF-1来分析CXCR4纳米抗体的配体竞争。为此，将纳米抗体的系列稀释物与30nM的生物素化的SDF-1(R&D Systems Fluorikine试剂盒)预温育，并在4C下温育至Caki-CXCR4细胞1小时，其后使用extravidin-PE可视化配体结合。在该测定中使用的生物素-SDF-1竞争物浓度低于在剂量滴定中获得的EC50值，其中IC50值应该反映Ki。计算配体置换IC50值，并且与NL4.3(X4)中和效力进行比较。
通过比较不同的效力，与配体置换相比，若干CXCR4纳米抗体在HIV1中和作用中的IC50值之间具有大于10-倍的差异，如图7中描述的。CXCR4纳米抗体15F5和15G11是特别感兴趣的，对CXCR4几乎不显示任何配体置换。两种纳米抗体都具有相当大的HIV1中和能力，比281F12纳米抗体具有更好的效力(IC50值分别为4.7nM和17.7nM)。
因此，产生了一组在HIV阻断以及配体置换中具有一系列效力的纳米抗体。
实施例11：gp120竞争的CXCR4纳米抗体的表征
关于与人和猕猴CXCR4结合以及与如前所述的在细胞外环2中具有限定的点突变的人CXCR4变体(Jaenchen等人2011)结合，对显示与gp120结合位点(15F5、15G11、10C3和15A1)结合的单价CXCR4纳米抗体进行进一步表征。
允许CXCR4纳米抗体结合分别转染人CXCR4、猕猴(“cyno”)CXCR4、hCXCR4-V196E、hCXCR4D187V和hCXCR4F189V的HEK细胞。抗-CXCR4mAb 12G5与所有点突变体结合，并且因此用作膜表达的对照(Jaenchen等人2011)。对于表位作图(epitope mapping)，在HEK293T细胞中进行pCDNA3.1载体中的CXCR4突变体、猕猴CXCR4和野生型人CXCR4的瞬时转染，然后使用Myc-标签检测、接着第二抗-小鼠PE检测通过流式细胞术对纳米抗体结合进行评价。测试了两种浓度(10nM和100nM)的纳米抗体。重复实验，结果基本相同。纳米抗体与HEK293ThCXCR4细胞的结合使用下式进行标准化：根据下式计算与纳米抗体结合各个突变体受体的百分比：(1-[(MFIhCXCR4*比率12G5mAb)-MFI突变体]/[MFIhCXCR4*比率12G5 mAb])x 100，其中MFI是抗-myc检测的平均荧光强度,且比率12G5mAb：(MFI 12G5突变体/MFI 12G5hCXCR4)。对于每种纳米抗体浓度计算结合突变体受体的百分比，并且当观察到小于25％的残余结合时，认为位置是关键的。
CXCR4结合分析的结果在表11中描述。
CXCR4纳米抗体15F5和15A1与猕猴CXCR4以及与人CXCR4同样地很好地结合，并且仅对残基F189V的突变敏感。纳米抗体15G11的结合受到细胞外环2中F189V、V196E和D187V位置处突变的损害，但是其与猕猴CXCR4很好地结合。纳米抗体10C3的结合在所有测试的CXCR4突变体以及在猕猴CXCR4上都是降低的。
表11：CXCR4纳米抗体对于Hek293T细胞上表达的突变体CXCR4受体的结合分析。
#％相对于hCXCR4的结合，与在HEK细胞上表达的猕猴(cyno)或突变体CXCR4受体的结合。将表达水平标准化为12G5结合。
CXCR4纳米抗体进一步表征为抑制CXCR4拮抗剂与CXCR4的结合。对于竞争实验，将CXCR4纳米抗体的系列稀释物与1nM的抗-CXCR4抗体12G5预温育，并使其与Jurkat细胞结合。简言之，500nM至0.05nM范围内的不同纳米抗体的系列稀释物与1nM的12G5在室温温育1小时。然后，将该混合物加入并与细胞温育，其在4℃震荡30分钟。在用PBS 10％FBS洗涤3次后，用山羊抗-小鼠-PE(Jackson Immuno-research,cat#115-115-164)检测结合的抗体(12G5)，其在4℃震荡30分钟。基于在不存在纳米抗体的情况下来自12G5结合的信号的减少和当存在不同量的纳米抗体时的信号来确定抑制效力。
这些结果显示在图8中。
所有纳米抗体能够从CXCR4完全置换12G5的结合，其中单价抗-CXCR4纳米抗体15F5是IC50为1.25nM的最佳竞争剂，接着是15G11(6.2nM)和281F12(13nM)。
为了评价与抗-CXCR4AMD3100的竞争，将固定浓度的CXCR4纳米抗体以它们各自的EC30结合浓度与10000nM至1nM范围内的AMD-3100的系列稀释物预温育，并使其与Jurkat细胞在室温结合1小时。平行地，1x105个细胞与Fc-阻断溶液(Miltenyi Biotec cat#130-059-901)预温育，其在4℃震荡30分钟，然后加入AMD-3100纳米抗体混合物并在4℃温育另外30分钟。在用PBS 10％FBS洗涤3次后，用小鼠抗-c-myc(AbD Serotec,cat#MCA2200)和山羊抗-小鼠-PE(Jackson Immunoreseach,cat#115-115-164)抗体检测结合的抗体。基于当不存在ADM3100时的信号的减少和当存在增加浓度的该分子时的信号来确定抑制效力。
这些结果显示在图8中。
AMD3100可以完全竞争所有测试CXCR4纳米抗体的结合，效力是～100nM。
总之，CXCR4纳米抗体15F5和15G11是有效的HIV1拮抗剂，抑制AMD3100和mAb 12G5与细胞表达的CXCR4的结合，但不与CXCR4配体CXCL12竞争，并且因此是与抗-CD4纳米抗体3F11格式化为双特异性构建体的合适候选物。
实施例12：产生半衰期延长的CXCR4-CD4双特异性多肽
双特异性CXCR4-CD4构建体用抗-白蛋白纳米抗体进行格式化，以便延长其在血清中的半衰期以用于体内实验。为此，将相应的CXCR4纳米抗体与具有柔性15GS-接头的抗-白蛋白纳米抗体融合，然后将CD4纳米抗体与第二15GS接头连接。CXCR4纳米抗体281F12、15F05和15G11被格式化为半衰期延长的双特异性构建体(SEQ ID NO:107,SEQ ID NO:108,SEQ ID NO:109)。作为参照，单价CXCR4281F12也与抗-白蛋白纳米抗体(SEQ ID NO:110)融合。使用包含特定限制性位点的不同组引物，通过分开的PCR反应(1个用于N-末端纳米抗体亚单位，1个用于中间纳米抗体亚单位，并且1个用于C-末端纳米抗体亚单位)产生多价构建体。
将所有的构建体克隆到来源于pPICZα(Life Technologies)的毕赤酵母表达载体中，并且含有AOX1启动子，Zeocin的抗性基因，大肠杆菌和毕赤酵母二者必需的复制起点以及多克隆位点，其前面是酿酒酵母α-MF信号肽的编码信息。在具有纳米抗体编码序列的框中，所述载体编码C-末端(Flag)3标签和(His)6标签。信号肽通过真核宿主的分泌途径将表达的纳米抗体导向细胞外环境。在序列确认后，然后根据标准程序(EasySelectTM毕赤酵母表达试剂盒手册,Life Technologies)将来源于pAX159的表达构建体转化到毕赤酵母X-33中。从培养基中纯化纳米抗体使用His-标签的标准亲和层析进行，然后是凝胶过滤步骤。所有纳米抗体的完整性和纯度通过MS分析和SDS-PAGE确认。氨基酸序列在表12中提供。
实施例13：半衰期延长的CXCR4-CD4双特异性物对CXCR4介导的趋化作用的抑制
为了验证半衰期延长的双特异性CXCR4-CD4多肽的功能性，基本上如实施例7.1中所描述的进行CXCR4-依赖性功能测定。在Jurkat E6(CXCR4+/CD4低)和Molm-13细胞(CXCR4++/CD4++)上，与不具有抗-白蛋白结构单元的相同构建体相比，确定半衰期延长的单价281F12-ALB和双特异性281F12-ALB-3F11对CXCL12-诱导的趋化作用的剂量依赖性抑制。作为化学吸引剂，750pM SDF-1a(R&D Systems)的浓度用于Jurkat细胞系，100,000个细胞/孔，并且1nM SDF-1a的浓度用于MOLM-13细胞系，500,000个细胞/孔。
代表性实验的结果显示在图9A+B中。
与抗-白蛋白纳米抗体的融合基本上不影响单价CXCR4 281F12或双特异性CXCR4-ALB-CD4构建体在Jurkat细胞上的亲和力和效力，其中所有纳米抗体格式显示了相似的效力(取决于测定，IC50值在16至80nM之间；图9A)。在双阳性MOLM-13细胞上，半衰期延长的双特异性CXCR4-CD4构建体的效力与相应的非半衰期延长的双特异性对应物相似，这表明抗-白蛋白纳米抗体不影响与各个靶标的同时结合(图9B)。
这些结果表明半衰期延长的双特异性CXCR4-ALB-CD4构建体也能够同时结合它们各自的靶标，并且保持了相对于单价CXCR4-ALB的阻断CXCR4功能的效力增强。
表12
*“ID”表示SEQ ID NO:
实施例14：半衰期延长的CXCR4-CD4双特异性物对HIV1中和作用的阻断
类似于实施例8中所描述的，在MT-4细胞系中在HIV1感染测定中评价半衰期延长的双特异性CXCR4-CD4多肽对阻断使用CXCR4的HIV1株NL4.3的复制的能力。在该测定中，将通过使用CXCR4纳米抗体281F12和使用15F05产生的半衰期延长的双特异性CXCR4-ALB-CD4构建体与相应的单价纳米抗体和281F12-35GS-3F11双特异性多肽直接比较。包括AMD3100作为参考。
结果在表14.1中描述。
结果表明，两种半衰期延长的CXCR4-ALB-CD4构建体在原型X4株NL4.3的HIV1中和测定中保持了次纳摩尔效力，其中具有CXCR4纳米抗体15F05的构建体具有比具有281F12的构建体略好的效力。
这些结果确认了在半衰期延长的CXCR4-ALB-CD4纳米抗体中保持了有效的抗HIV1活性。
表14.1：在MT-4细胞中X4NL4.3株的半衰期延长的CXCR4-CD4多肽对HIV1感染性的抑制。AMD-3100用作对照化合物。显示三次实验的平均IC50。
化合物 格式 IC50(nM)
AMD3100 对照 6.26
3F11 CD4Nb 60.69
281F12 CXCR4 59.38
281F12-3F11 CXCR4-CD4 0.13
281F12-ALB-3F11 CXCR4-Alb-CD4 0.33
15F05-ALB-3F11 CXCR4-Alb-CD4 0.23
15F05 CXCR4NB 4.32
实施例15：3F11结合猕猴CD4
为了进行体内研究，优选的是与猴直系同源物的交叉反应性结合。对于双特异性CXCR4-ALB-CD4构建体中的CXCR4纳米抗体和ALB结构单元，确认了猕猴交叉反应性。为了解决抗-CD4纳米抗体的交叉反应性，使用flag标签的检测(小鼠-抗Flag,Sigma catnr.F1804)通过流式细胞术来评价单价CD4 3F11对猕猴CD4+HSC-F T细胞系的剂量依赖性结合。
结果在图10中显示。
结果表明，3F11与猕猴CD4具有交叉反应性，但没有达到饱和，并且与人CD4相比，与猕猴CD4的结合亲和力是降低的。

Claims (17)

1.包含第一免疫球蛋白单可变结构域(ISV)和第二免疫球蛋白单可变结构域的多肽，其中
-所述第一ISV结合存在于细胞表面上的CD4；
-所述第二ISV结合存在于所述细胞表面上的CXCR4；并且
其中所述第一ISV基本上由4个构架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1选自由以下组成的组：SEQ ID NOs:85、84、83和82；以及与SEQ ID NOs:85、84、83和82具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
(ii)CDR2选自由以下组成的组：SEQ ID NOs:91、90、89和88；以及与SEQ ID NOs:91、90、89和88具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
(iii)CDR3选自由以下组成的组：SEQ ID NO:99、98、97和96；以及与SEQ ID NOs:99、98、97和96具有1、2、3或4个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且，其中所述第二ISV基本上由4个构架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中
(i)CDR1选自由以下组成的组：SEQ ID NOs:35、34、36-40；以及与SEQ ID NOs:35、34、36-40具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
(ii)CDR2选自由以下组成的组：SEQ ID NOs:50、48-49和51-56；以及与SEQ ID NOs:50、48-49和51-56具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；
(iii)CDR3选自由以下组成的组：SEQ ID NO:69、67-68、70-75以及与SEQ ID NOs:69、67-68、70-75具有1、2、3或4个氨基酸差异的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述第一ISV选自由以下组成的组：03F11(SEQ IDNO:20)、01B6(SEQ ID NO:17)、01E2(SEQ ID NO:18)和01H12(SEQ ID NO:19)，并且其中所述第二ISV选自由以下组成的组：281F12(SEQ ID NO:9)、238D4(SEQ ID NO:4)、281A5(SEQID NO:5)、281E10(SEQ ID NO:6)、281D4(SEQ ID NO:7)、281A6(SEQ ID NO:8)、283B6(SEQID NO:10)、283E2(SEQ ID NO:11)、283F1(SEQ ID NO:12)、15F5(SEQ ID NO:13)、15G11(SEQ ID NO:14)、15A1(SEQ ID NO:15)和10C3(SEQ ID NO:16)。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中所述多肽抑制人免疫缺陷病毒(HIV)或猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的感染。
4.根据权利要求3所述的多肽，其中所述HIV选自由HIV-1和HIV-2组成的组。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中所述细胞是人类细胞，优选人CD4+细胞，甚至更优选人CD4+T细胞。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的多肽，其中所述多肽预防所述HIV的感染至少3个月，诸如至少6个月或甚至更长，诸如例如9个月、11个月、1年、1.5年、2年或甚至更长。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的多肽，其中所述多肽抑制HIV感染达约10％、20％、30％、40％、50％、60％、80％、90％和优选95％以上，诸如100％，例如如HIV感染测定所测量的。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的多肽，其中所述多肽抑制HIV与CD4+CXCR4+细胞的融合。
9.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽抑制天然配体与所述CXCR4的结合达小于约50％，诸如40％、30％或20％或甚至小于10％诸如小于5％，其中所述天然配体是基质细胞-衍生因子-1β(SDF-1β)或基质细胞-衍生因子-1α(SDF-1α)。
10.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其进一步包含血清蛋白结合部分或PEG。
11.根据权利要求10所述的多肽，其中所述血清蛋白结合部分是结合血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域。
12.包含根据前述权利要求中任一项所述的多肽的组合物。
13.用于治疗和/或预防受试者中HIV感染的根据权利要求1-11中任一项所述的多肽。
14.根据权利要求13所述的多肽，其中所述多肽预防HIV感染达至少3个月，诸如至少6个月或甚至更长，诸如例如9个月、11个月、1年、1.5年、2年或甚至更长。
15.根据权利要求13或14所述的多肽，其中所述多肽抑制HIV感染达约10％、20％、30％、40％、50％、60％、80％、90％和优选95％以上，诸如100％，例如如HIV感染测定所测量的。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的多肽，其中所述多肽抑制HIV与CD4+CXCR4+细胞的融合。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的多肽，其中所述多肽抑制天然配体与所述CXCR4的结合达小于约50％，诸如40％、30％或20％或甚至小于10％，诸如小于5％，其中所述天然配体是基质细胞-衍生因子-1β(SDF-1β)或基质细胞-衍生因子-1α(SDF-1α)。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110655577A (zh) * 2018-06-13 2020-01-07 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 APJ抗体及其与Elabela的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2352764B1 (en) * 2008-10-14 2018-03-28 Ablynx N.V. AMINO ACID SEQUENCES TARGETING HUMAN CD4 and CXCR4, CCR5, TLR4, ALPHAV INTEGRIN, BETA3-INTEGRIN,BETA1-INTEGRIN, HUMAN ALPHA2-INTEGRIN, CD81, SR-BI, CLAUDIN-1, CLAUDIN-6 AND/OR CLAUDIN-9, RESPECTIVELY, AND NEUTRALIZING VIRAL ENTRY
CN107646039B (zh) 2015-04-02 2022-04-15 埃博灵克斯股份有限公司 具有有效抗hiv活性的双特异性cxcr4-cd4多肽
WO2017085172A2 (en) * 2015-11-18 2017-05-26 Ablynx Nv Improved serum albumin binders
EP3471753A1 (en) 2016-06-20 2019-04-24 Kymab Limited Anti-pd-l1 and il-2 cytokines
IL302613A (en) 2017-09-08 2023-07-01 Maverick Therapeutics Inc Binding proteins are activated under limited conditions
CN114390938A (zh) 2019-03-05 2022-04-22 武田药品工业有限公司 受约束的条件性活化的结合蛋白
WO2024133935A1 (en) 2022-12-23 2024-06-27 Ablynx Nv Protein-based conjugation carriers
WO2024170756A1 (en) 2023-02-17 2024-08-22 Ablynx N.V. Polypeptides binding to the neonatal fc receptor

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007025276A2 (en) * 2005-08-25 2007-03-01 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Use of hiv envelope/ cd4 complexes as immunogenic complexes for the generation of antibodies
CN101198374A (zh) * 2005-05-02 2008-06-11 健康与医药研究学院 具有抗hiv中和活性的抗体或其片段
CN101370525A (zh) * 2005-08-19 2009-02-18 艾博特公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
WO2011083140A1 (en) * 2010-01-08 2011-07-14 Ablynx Nv Immunoglobulin single variable domain directed against human cxcr4
US20110318347A1 (en) * 2008-10-14 2011-12-29 Ablynx N.V. Amino acid sequences targeting human cd4, cxcr4, ccr5, tlr4, alphav integrin, beta3-integrin, beta1-integrin, human alpha2-integrin, cd81, sr-bi, claudin-1, claudin-6 and claudin-9, respectively, and neutralizing viral entry

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
WO1994004678A1 (en) 1992-08-21 1994-03-03 Casterman Cecile Immunoglobulins devoid of light chains
SK284054B6 (sk) 1996-10-16 2004-08-03 Icn Pharmaceuticals, Inc. Substituované triazolové nukleozidy, farmaceutický prostriedok s ich obsahom a ich použitie
AU2152299A (en) 1997-10-27 1999-05-24 Unilever Plc Multivalent antigen-binding proteins
EP1469883A2 (en) 1998-02-19 2004-10-27 Xcyte Therapies, Inc. Compositions and methods for regulating lymphocyte activation
AU751201B2 (en) 1998-09-04 2002-08-08 Viropharma Incorporated Methods for treating or preventing viral infections and associated diseases
PT1240337E (pt) 1999-12-24 2007-01-31 Genentech Inc Métodos e composições para prolongar as meias-vidas de eliminação de compostos bioactivos
EP1377306A1 (en) 2001-03-09 2004-01-07 Dyax Corp. Serum albumin binding moieties
PT1639011E (pt) 2003-06-30 2009-01-20 Domantis Ltd Anticorpos (dab) de domínio único peguilados
CA2583017A1 (en) 2004-10-13 2006-04-20 Ablynx N.V. Single domain camelide anti-amyloid beta antibodies and polypeptides comprising the same for the treatment and diagnosis of degenerative neural diseases such as alzheimer's disease
US7807162B2 (en) 2005-05-20 2010-10-05 Ablynx N.V. Single domain VHH antibodies against von Willebrand factor
CA2649009A1 (en) 2006-04-14 2007-10-25 Ablynx N.V. Dp-78-like nanobodies
CA2666599A1 (en) 2006-08-18 2008-02-21 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with il-6-mediated signalling
EP2097449A1 (en) 2006-12-05 2009-09-09 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins
EP2014681A1 (en) 2007-07-12 2009-01-14 Pierre Fabre Medicament Novel antibodies inhibiting c-met dimerization, and uses thereof
WO2009014638A2 (en) 2007-07-19 2009-01-29 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Methods of inhibiting infection by diverse subtypes of drug-resistant hiv-1
WO2009127691A1 (en) 2008-04-17 2009-10-22 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
US9212226B2 (en) 2008-05-16 2015-12-15 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against CXCR4 and other GPCRs and compounds comprising the same
HUE031828T2 (en) 2011-06-23 2017-08-28 Ablynx Nv Procedures for Predicting, Detecting, and Reducing Aspiration Protein Interference in Assays Containing Immunoglobulin Variable Single Domain
CN107646039B (zh) 2015-04-02 2022-04-15 埃博灵克斯股份有限公司 具有有效抗hiv活性的双特异性cxcr4-cd4多肽

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101198374A (zh) * 2005-05-02 2008-06-11 健康与医药研究学院 具有抗hiv中和活性的抗体或其片段
CN101370525A (zh) * 2005-08-19 2009-02-18 艾博特公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
WO2007025276A2 (en) * 2005-08-25 2007-03-01 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Use of hiv envelope/ cd4 complexes as immunogenic complexes for the generation of antibodies
US20110318347A1 (en) * 2008-10-14 2011-12-29 Ablynx N.V. Amino acid sequences targeting human cd4, cxcr4, ccr5, tlr4, alphav integrin, beta3-integrin, beta1-integrin, human alpha2-integrin, cd81, sr-bi, claudin-1, claudin-6 and claudin-9, respectively, and neutralizing viral entry
WO2011083140A1 (en) * 2010-01-08 2011-07-14 Ablynx Nv Immunoglobulin single variable domain directed against human cxcr4

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JAHNICHEN SVEN等: "CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells", 《PNAS》 *
MATTHIAS MACK等: "Preferential targeting of CD4-CCR5 complexes with bifunctional inhibitors: A novel approach to block HIV-1 infection", 《JOURNAL OF IMMUNOLOGY》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110655577A (zh) * 2018-06-13 2020-01-07 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 APJ抗体及其与Elabela的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用

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