CN107641599A

CN107641599A - 一种香蕉枯萎病菌培养基及其应用

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Publication number: CN107641599A
Application number: CN201710903818.8A
Authority: CN
Inventors: 聂燕芳; 李云锋; 李华平; 周玲菀; 陈敏; 王振中
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2017-09-29
Filing date: 2017-09-29
Publication date: 2018-01-30
Anticipated expiration: 2037-09-29
Also published as: CN107641599B

Abstract

本发明公开了一种香蕉枯萎病菌培养基及其应用，所述培养基含有以下组分：葡萄糖的终浓度为10 g/L，天冬氨酸的终浓度为2～8 g/L，20×硝酸盐、200×铁盐、1000×维生素、1000×微量元素的体积分数分别为5%、0.5%、0.1%、0.1%；所述培养基的pH值为6.2～6.5。本发明提供的培养基既能促进香蕉枯萎病菌分生孢子的萌发，又能避免外源大分子蛋白质的干扰，有利于香蕉枯萎病菌分泌蛋白质的分析。

Description

一种香蕉枯萎病菌培养基及其应用

技术领域

本发明涉及微生物培养技术领域，具体地，涉及一种香蕉枯萎病菌培养基及其应用。

背景技术

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense，Foc）引起的一种真菌性病害，是香蕉生产上最重要的病害之一，在我国几乎所有的香蕉产区都有发生，发病蕉园的发病率一般为30～50%，重病区可达90%以上，严重威胁香蕉产业的可持续性发展。Foc主要通过分生孢子从香蕉的根部或伤口入侵，再进入维管束生长繁殖，进而导致香蕉维管束细胞褐变坏死，最终导致香蕉整株枯萎。由于Foc遗传背景复杂，目前对于其致病性机制仍不清楚。分泌蛋白质是指在细胞内合成后分泌到细胞外起作用的蛋白质，是植物病原真菌的一类重要致病因子；分泌蛋白在病原真菌对寄主植物的侵入、定殖和扩展等致病过程中均具有重要作用。因此，开展香蕉枯萎病菌分泌蛋白质的研究有利于分析Foc的致病机理。但是，目前对于香蕉枯萎病菌分泌蛋白质的分析尚缺乏成熟的研究体系，而培养基的成分对Foc分生孢子的萌发和分泌蛋白质的分析有很重要的影响。

目前常用的Foc培养基有：PDA培养基（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉20 g，用蒸馏水定容至1 L）；查氏培养基（NaNO₃3 g、K₂HPO₄1 g、KCl 0.5 g、MgSO₄·7H₂O 0.5 g、FeSO₄·7H₂O 0.018 g、蔗糖30 g，用蒸馏水定容至1 L，pH 6.0）；CM培养基（葡萄糖10 g、蛋白胨2 g、酵母浸膏1 g、酪蛋白水解物1 g、20×硝酸盐50 mL、1000×维生素1 mL、1000×微量元素1 mL，用蒸馏水定容至1 L，pH 6.5）；Bilai’s培养基（KH₂PO₄ 1 g、KNO₃ 1 g、KCl 0.5g、MgSO₄·7H₂0 0.5 g、淀粉0.2 g、葡萄糖0.2 g、蔗糖0.2 g，用蒸馏水定容至1 L）。在这些现有的香蕉枯萎病菌培养基中，有多种因素干扰Foc分泌蛋白质的研究：其中，PDA培养基和CM培养基中的部分组分（马铃薯、蛋白胨和酵母浸膏等）含有复杂的蛋白质组分；含无机盐的培养基（查氏培养基和Bilai’s培养基），则存在Foc分生孢子萌发率偏低的问题，这些因素均是干扰Foc分泌蛋白质分析的重要因素。而现有技术中，尚未见文献和专利报道既适合于香蕉枯萎病菌分生孢子萌发同时又有利于其分泌蛋白质分析的培养基。

发明内容

本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一种香蕉枯萎病菌培养基，本发明所提供的培养基既能促进香蕉枯萎病菌分生孢子的萌发，又能避免外源大分子蛋白质的干扰，有利于香蕉枯萎病菌分泌蛋白质的分析。

本发明的另一目的是提供上述培养基在提高香蕉枯萎病菌孢子萌发率以及在香蕉枯萎病菌分泌蛋白质分析中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种香蕉枯萎病菌培养基，含有以下组分：葡萄糖的终浓度为10 g/L，天冬氨酸的终浓度为2～8 g/L，20×硝酸盐、200×铁盐、1000×维生素、1000×微量元素的体积分数分别为5%、0.5%、0.1%、0.1%，去离子水余量；所述培养基的pH值为6.2～6.5。

本发明经过研究，发现培养基营养成分对香蕉枯萎病菌的生长发育有着重要影响，培养基中的氮源对香蕉枯萎病菌生长的影响尤为明显。本发明提供的培养基组分中含有香蕉枯萎病菌生长所必需的营养物质（碳源、维生素、微量元素、铁盐），能够满足香蕉枯萎病菌正常生长的要求；此外，组分中含有的氮源为简单有机氮源（天冬氨酸），既能显著提高香蕉枯萎病菌分生孢子的萌发率，又能减少培养基中的外源蛋白（或大分子肽段）的干扰，有利于香蕉枯萎病菌分生孢子分泌蛋白质的分析。

优选地，所述天冬氨酸的终浓度为4 g/L。

优选地，所述20×硝酸盐的成分组成为：NaNO₃120 g、KCl 10.4 g、MgSO₄·7H₂O10.4 g、KH₂PO₄30.4 g，加蒸馏水至1 L。

优选地，所述200×铁盐的成分组成为：FeSO₄·7H₂O 7.5 g、Na₂EDTA·2H₂O 5.6g，加蒸馏水至1 L。

优选地，所述1000×维生素的成分组成为：甘氨酸2 g、烟酸0.5 g、生物素0.5 g、盐酸吡哚醇0.5 g、盐酸硫胺素0.4 g、核黄素0.5 g、肌醇0.1 g，加去离子水至1 L。

优选地，所述1000×微量元素的成分组成为：ZnSO₄·7H₂O 22 g、H₃BO₃11 g、MnCl₂·4H₂O 5 g、KI 8 g、CoCl₂·6H₂O 17 g、CuSO₄·5H₂O 16 g、Na₂MoO₄·2H₂O 15 g，加蒸馏水至1 L。

更优选地，所述培养基还含有香蕉组织诱导物3.2%（w/v），该培养基的配置步骤为：先将香蕉组织诱导物与4.8%体积的培养基混合，包裹于截留分子量为10 kD的透析袋中，再将透析袋置于剩余的95.2%体积的培养基中即得。

优选地，所述香蕉组织诱导物为巴西蕉的根和/或球茎。

本发明还请求保护上述香蕉枯萎病菌培养基在提高香蕉枯萎病菌孢子萌发率以及在香蕉枯萎病菌分泌蛋白质分析中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的香蕉枯萎病菌培养基，既能促进香蕉枯萎病菌分生孢子的萌发，使Foc1和Foc4分生孢子的萌发率分别高达92.2%和90.5%；又能减少培养基中的外源蛋白（或大分子肽段）的干扰，且每升培养基中可以制备340～400 μg的分泌蛋白质，有利于香蕉枯萎病菌分生孢子分泌蛋白质的分析。此外，本发明提供的香蕉枯萎病菌培养基不含蛋白质组分，制备方法简易，适合推广应用。

附图说明

图1为应用例1中Foc1分生孢子在不同培养基中的萌发率。

图2为应用例1中Foc4分生孢子在不同培养基中的萌发率。

图3为应用例1中Foc分生孢子在NCM培养基中的三个典型生长阶段。

图4为应用例1中Foc1分生孢子在NCM培养基和NCM诱导培养基中的萌发率。

图5为应用例1中Foc4分生孢子在NCM培养基和NCM诱导培养基中的萌发率。

图6为应用例2中Foc分生孢子分泌蛋白质的SDS-PAGE电泳图；泳道M为标准分子量蛋白；泳道1为Foc1在NCM培养基中培养10 h后的分泌蛋白质；泳道2为Foc4在NCM培养基中培养10 h后的分泌蛋白质。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

一种香蕉枯萎病菌培养基（编号为NCM培养基），含有以下组分：葡萄糖的终浓度为10g/L，天冬氨酸的终浓度为4 g/L，20×硝酸盐、200×铁盐、1000×维生素、1000×微量元素的体积分数分别为5%、0.5%、0.1%、0.1%，去离子水余量；所述培养基的pH值为6.5。

所述20×硝酸盐的成分组成为：NaNO₃120 g、KCl 10.4 g、MgSO₄·7H₂O 10.4 g、KH₂PO₄30.4 g，加蒸馏水至1 L。

所述200×铁盐的成分组成为：FeSO₄·7H₂O 7.5 g、Na₂EDTA·2H₂O 5.6 g，加蒸馏水至1 L。

所述1000×维生素的成分组成为：甘氨酸2 g、烟酸0.5 g、生物素0.5 g、盐酸吡哚醇0.5 g、盐酸硫胺素0.4 g、核黄素0.5 g、肌醇0.1 g，加去离子水至1 L。

所述1000×微量元素的成分组成为：ZnSO₄·7H₂O 22 g、H₃BO₃11 g、MnCl₂·4H₂O5 g、KI 8 g、CoCl₂·6H₂O 17 g、CuSO₄·5H₂O 16 g、Na₂MoO₄·2H₂O 15 g，加蒸馏水至1 L。

NCM培养基的具体配制步骤为：葡萄糖10 g、天冬氨酸4 g、20×硝酸盐50 mL、200×铁盐5 mL、1000×维生素1 mL、1000×微量元素1 mL，用去离子水定容至1 L，调节pH值至6.5。分装250 mL于500 mL锥形瓶中，121℃灭菌20 min即得。

实施例2

一种香蕉枯萎病菌培养基（编号为NCM-2培养基），含有以下组分：葡萄糖的终浓度为10g/L，天冬氨酸的终浓度为2 g/L，20×硝酸盐、200×铁盐、1000×维生素、1000×微量元素的体积分数分别为5%、0.5%、0.1%、0.1%，去离子水余量；所述培养基的pH值为6.5。

NCM-2培养基的具体配制步骤为：葡萄糖10 g、天冬氨酸2 g、20×硝酸盐50 mL、200×铁盐5 mL、1000×维生素1 mL、1000×微量元素1 mL，用去离子水定容至1 L，调节pH值至6.5。分装250 mL于500 mL锥形瓶中，121℃灭菌20 min即得。

实施例3

一种香蕉枯萎病菌培养基（编号为NCM-3培养基），含有以下组分：葡萄糖的终浓度为10g/L，天冬氨酸的终浓度为8 g/L，20×硝酸盐、200×铁盐、1000×维生素、1000×微量元素的体积分数分别为5%、0.5%、0.1%、0.1%，去离子水余量；所述培养基的pH值为6.5。

NCM-3培养基的具体配制步骤为：葡萄糖10 g、天冬氨酸8 g、20×硝酸盐50 mL、200×铁盐5 mL、1000×维生素1 mL、1000×微量元素1 mL，用去离子水定容至1 L，调节pH值至6.5。分装250 mL于500 mL锥形瓶中，121℃灭菌20 min即得。

实施例4

一种香蕉枯萎病菌培养基（编号为NCM诱导培养基），含有以下组分：葡萄糖的终浓度为10 g/L，天冬氨酸的终浓度为4 g/L，20×硝酸盐、200×铁盐、1000×维生素、1000×微量元素的体积分数分别为5%、0.5%、0.1%、0.1%，香蕉组织诱导物3.2%（w/v），去离子水余量；所述培养基的pH值为6.5。

NCM诱导培养基的具体配制步骤为：葡萄糖10 g、天冬氨酸4 g、20×硝酸盐50 mL、200×铁盐5 mL、1000×维生素1 mL、1000×微量元素1 mL，用去离子水定容至1 L，调节pH值至6.5。取4叶期巴西蕉，剪取根和球茎部分，用液氮充分研磨至细粉状，即得到香蕉组织诱导物。将8.5 g香蕉组织诱导物与12.5 mL培养基混合，包裹于截留分子量为10 kD的透析袋中，再将透析袋置于250 mL培养基中，121℃灭菌20 min即得。

应用例1

以查氏培养基、CM培养基、NCM-1培养基作为对照，对比实施例1～4所得培养基中Foc分生孢子的萌发情况：

1.培养基配制

（1）查氏培养基配制：NaNO₃3 g、K₂HPO₄1 g、KCl 0.5 g、MgSO₄·7H₂O 0.5 g、FeSO₄·7H₂O 0.018 g、蔗糖30 g，用蒸馏水定容至1 L，调节pH值至6.0，121℃灭菌20 min即得。

（2）CM培养基配制：葡萄糖10 g、蛋白胨2 g、酵母浸膏1 g、酪蛋白水解物1 g、20×硝酸盐50 mL、1000×维生素1 mL、1000×微量元素1 mL，用蒸馏水定容至1 L，调节pH值至6.5，121℃灭菌20 min即得。

（3）NCM-1培养基配制：葡萄糖10 g、20×硝酸盐50 mL、200×铁盐5 mL、1000×维生素1 mL、1000×微量元素1 mL，用去离子水定容至1 L，调节pH值至6.5，121℃灭菌20 min即得。

所述20×硝酸盐、200×铁盐、1000×维生素、1000×微量元素的成分均与实施例1中相同。

2.病原菌培养

选用香蕉枯萎病菌1号生理小种（Foc1）和4号生理小种（Foc4），将Foc1和Foc4菌丝接种到PDA培养基上进行活化，28℃恒温培养4 d。用打孔器打取直径为0.5 cm的菌块，转接于2L的液体査氏培养基（250 mL/瓶，共8瓶），在120 r/min、28℃条件下振荡培养4 d；培养液经细胞筛过滤后，于4℃下10000×g离心15 min，弃去上清液，加入适量的新鲜液体査氏培养基，使分生孢子浓度为8×10⁶个/mL；即为浓缩的Foc1和Foc4分生孢子悬浮液。

3.香蕉枯萎病菌分生孢子在不同培养基中的萌发情况

将浓缩的Foc1和Foc4分生孢子悬浮液分别接种于查氏培养基、CM培养基、NCM-1培养基、实施例1～3所得培养基中，使分生孢子终浓度为5×10⁶个/mL；在120 r/min、28℃条件下培养，于10 h后取样，观察孢子萌发情况。Foc1和Foc4分生孢子的萌发率分别如图1和图2所示：

Foc1分生孢子在CM培养基中的萌发率最高（98.9%），在査氏培养基中的萌发率最低（仅为47.6%）。在实施例1所得培养基中，Foc1分生孢子的萌发率为92.2%。在NCM-1培养基中，分生孢子的萌发率为67.2%。在光学显微镜下进行观察，发现Foc1分生孢子在NCM培养基和CM培养基中萌发形成的成熟菌丝更多，而在査氏培养基中萌发形成的菌丝较短。

Foc4分生孢子在不同培养基中的萌发情况与Foc1相似，其在实施例1所得培养基中的萌发率可达到90.5%，在CM培养基中为95.3%，在査氏培养基中的萌发率最低（为49.6%）。在光学显微镜下进行观察，发现Foc4分生孢子在NCM培养基和CM培养基中萌发形成的成熟菌丝更多，而在査氏培养基中萌发形成的菌丝较短。

根据Foc1和Foc4分生孢子在NCM培养基中的生长情况，均可以将其分为3个典型生长阶段（如图3所示）。具体为：（1）接种后5 h内为分生孢子的膨大/芽管开始形成期；（2）接种后6 h～8 h为分生孢子的芽管伸长期；（3）接种后9 h后为成熟菌丝形成期。

以上结果表明：Foc分生孢子在实施例1～3所得培养基中的萌发率显著高于在查氏培养基、NCM-1培养基中的萌发率，即实施例1～3所得培养基对Foc分生孢子的萌发具有促进作用。

4.香蕉枯萎病菌分生孢子在NCM培养基和NCM诱导培养基中的萌发情况

将浓缩的Foc1和Foc4分生孢子悬浮液分别接种于实施例1和实施例4所得培养基中，使分生孢子终浓度为5×10⁶个/mL；在120 r/min、28℃条件下培养，分别于1～12 h时取样，观察孢子萌发情况。Foc1和和Foc4分生孢子的萌发率分别如图4和图5所示：

在实施例4所得培养基中，Foc1分生孢子在三个典型阶段的萌发率均高于在实施例1所得培养基中的萌发率（图4）。此外，Foc1分生孢子在诱导培养基中开始膨大（1 h）和芽管出现（5 h）的时间均早于对照组（分别为2 h和6 h）。Foc4分生孢子在实施例4所得培养基中的萌发情况与Foc1相似（图5）。上述结果表明，实施例4所得培养基对Foc分生孢子的萌发具有促进作用。

应用例2

将浓缩的Foc1和Foc4孢子悬浮液分别接种于实施例1所得培养基中，每组处理接种2 L（具体为250mL/瓶，共8瓶），于120 r/min、28℃条件下培养10 h。采用丙酮沉淀法制备分泌蛋白，具体为：将培养液用0.45 μm滤膜抽滤，再用截留分子量为10 kDa的超滤膜进行浓缩。加入100%丙酮，-20℃沉淀2 h。于4℃下18000×g离心20 min，去上清。用溶解缓冲液（150mM Tris-HCl缓冲液、8mol/L尿素、1.5%w/v DTT、pH 8.0）溶解，测定分泌蛋白质的浓度及获得量。

结果表明，Foc1和Foc4分泌蛋白质的获得量为340～400 μg/L。将Foc分泌蛋白质进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色结果如图6所示：结果表明，所获得Foc分泌蛋白质的条带主要分布于15～80 kDa之间。

Claims

1.一种香蕉枯萎病菌培养基，其特征在于，所述培养基含有以下组分：葡萄糖的终浓度为10 g/L，天冬氨酸的终浓度为2～8 g/L，20×硝酸盐、200×铁盐、1000×维生素、1000×微量元素的体积分数分别为5%、0.5%、0.1%、0.1%，去离子水余量；所述培养基的pH值为6.2～6.5。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述天冬氨酸的终浓度为4 g/L。

3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述20×硝酸盐的成分组成为：NaNO₃120 g、KCl 10.4 g、MgSO₄·7H₂O 10.4 g、KH₂PO₄30.4 g，加蒸馏水至1 L。

4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述200×铁盐的成分组成为：FeSO₄·7H₂O 7.5 g、Na₂EDTA·2H₂O 5.6 g，加蒸馏水至1 L。

5.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述1000×维生素的成分组成为：甘氨酸2 g、烟酸0.5 g、生物素0.5 g、盐酸吡哚醇0.5 g、盐酸硫胺素0.4 g、核黄素0.5 g、肌醇0.1 g，加去离子水至1 L。

6.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述1000×微量元素的成分组成为：ZnSO₄·7H₂O 22 g、H₃BO₃11 g、MnCl₂·4H₂O 5 g、KI 8 g、CoCl₂·6H₂O 17 g、CuSO₄·5H₂O16 g、Na₂MoO₄·2H₂O 15 g，加蒸馏水至1 L。

7.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基还含有香蕉组织诱导物3.2%（w/v）。

8.根据权利要求7所述的培养基，其特征在于，所述培养基的配置步骤为：先将香蕉组织诱导物与4.8%体积的权利要求1所述培养基混合，包裹于截留分子量为10 kD的透析袋中，再将透析袋置于剩余的95.2%体积的权利要求1所述培养基中即得。

9.根据权利要求7所述的培养基，其特征在于，所述香蕉组织诱导物为巴西蕉的根和/或球茎。

10.权利要求1至9任一所述香蕉枯萎病菌培养基在提高香蕉枯萎病菌孢子萌发率以及在香蕉枯萎病菌分泌蛋白质分析中的应用。