CN107630054A - 培南类药物中间体的生物转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种培南类药物中间体的生物转化方法，其特征在于，包括以下步骤：以式Ⅰ化合物、NaS为底物，以生物酶为催化剂，建立生物转化体系进行转化反应，得到含有培南类药物中间体的转化液。其立体选择性强、反应条件温和、操作简便、成本低、污染少，催化剂专一，高效，用量少；产物收率>90％，晶体纯度>98％，光学纯度>99％。
Description
技术领域
本发明涉及一种氨基酸衍生物的制备方法，具体地指一种培南类药物中间体的生物转化方法。
背景技术
碳氢霉烯(培南)类药物如美罗培南、亚胺培南等是现阶段常用的强抗菌药，对耐药菌有良好的抗菌作用，尤其是对B型酶具有很强的抑制功能，同时也是内酰胺酶的抑制剂。
美罗培南是由Dainippon Sumitomo Pharma研发，于1995年首次在意大利上市，它是第一个能单独用药的碳氢霉烯类抗生素，同时也是首个1β-甲基碳氢霉烯类抗生素，该类抗生素对β-内酰胺酶和肾脱氢肽Ⅰ酶(DHP-Ⅰ)稳定，无需与脱氢肽酶抑制剂联用，是目前治疗重症及多重耐药菌感染的重要药物之一，在临床上得到了越来越广泛的运用。其结构式如下所示：
其关键中间体结构式如下：
现有技术中，合成美罗培南侧链的工艺路线中，总收率最高的为以下工艺：
其总收率达到71.6％，但是反应条件苛刻，操作困难，试剂昂贵，成本过高，难以应用于工业化生产，最重要的是，美罗培南全合成的改进硫醇侧链的脱硫酰基可在强碱或酸性条件下进行反应，但该反应也需要大量的强酸或碱性物质中和反应混合物，然而碳氢霉烯环系对酸或碱敏感，在此条件下回降低收率并使产物不纯。
因此，研发一种合成美罗培南侧链的改进工艺具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的问题就是克服背景技术不足，提供一种培南类药物中间体的生物转化方法，该方法通过一种微生物/酶催化的技术，利用药物的手性前体实现高效、低成本、无污染的生物催化合成体系，而后制备培南类药物中间体。
培南类药物中间体的生物转化方法，包括以下步骤：以式Ⅰ化合物、NaS为底物，以生物酶为催化剂，建立生物转化体系进行转化反应，得到含有培南类药物中间体的转化液，其中式Ⅰ化合物的结构式如下：
其中，R1为H或PNZ(对硝基苄氧基甲酰基)，R2为OH或二甲基氨基。
优选地，生物酶为共表达重组丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶。
进一步地，共表达重组丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶为为基因工程菌(湿菌体)、冻干粉、固定化酶或固定化细胞。
进一步地，共表达重组丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶的基因工程菌中外源丝氨酸乙酰转移酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述共表达重组丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶的基因工程菌中外源半胱氨酸合成酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
再进一步地，基因工程菌为具有重组载体pETDuet-1的大肠杆菌。
再进一步地，转化体系中加入表面活性剂，所述表面活性剂为失水山梨醇酯和吐温80按质量比为3-5︰20组成的混合物。
再进一步地，转化体系中加入添加剂，所述添加剂为MgCl2和EDTA。
再进一步地，转化体系中，含共表达重组丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶的基因工程菌的浓度控制为10-20g/L；所述表面活性剂与含共表达重组丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶的基因工程菌的质量比控制为3-5％；所述添加剂与含共表达重组丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶的基因工程菌的质量比为2-6％。
再更进一步地，转化体系中包括缓冲溶液，缓冲溶液选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液、MOPS缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、Tris-盐酸缓冲溶液中的一种。
对所得的转化液进行纯化，包括如下步骤：
1)将含有(2S,4S)-2-羧酸-4-巯基吡咯烷的转化液用盐酸酸化后，加入亚硝酸钠，再用活性炭脱色至无色；
2)将步骤1)中脱色后的含有(2S,4S)-2-羧酸-4-巯基吡咯烷的转化液，过离子交换柱，洗脱；
3)将步骤2)洗脱后所得的洗脱液浓缩，用无水乙醇析晶，过滤；
4)将步骤3)过滤后所得的晶体加入无水乙醇，搅拌均匀后静置8-16h，抽滤，烘干，即得精制(2S,4S)-2-羧酸-4-巯基吡咯烷晶体。
共表达重组丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶的基因工程菌，具体制备方法是：选择来源于Lactobacillus casei的丝氨酸乙酰转移酶的基因序列，进行人工设计，设计后的基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；将该序列通过全基因合成，全基因合成的丝氨酸乙酰转移酶编码基因经EcoRI和NotI双酶切后克隆入表达载体pETDuet-1的多克隆位点1，得到重组质粒1，选择来源于Lactobacillus casei的半胱氨酸合成酶的基因序列，进行人工设计，设计后的基因序列如序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；将该序列通过全基因合成，全基因合成的半胱氨酸合成酶经BglⅡ和XhoI双酶切后克隆入重组质粒1的多克隆位点2，基因经测序确认后，转化至E.coli BL21(DE3)，置于氨苄青霉素平板上挑选单菌落，接入含氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含氨苄青霉素的TB培养基中，接种量为含氨苄青霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0.1mM，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶共表达的基因工程菌全细胞。
本发明的优点主要体现在如下几方面：
其一，与单纯的化学法相比，本发明的方法立体选择性强、反应条件温和、操作简便、成本低、污染少；
其二，本发明催化剂专一，高效，用量少，含脯氨酸-4-羟化酶的工程菌全细胞添加浓度不超过20g/L；
其三，本发明制备的产品收率高、纯度高，收率>90％，晶体纯度>98％，光学纯度>99％。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但该实施例不应该理解为对本发明的限制。
培南类药物中间体的生物转化方法，包括以下步骤：以式Ⅰ化合物、NaS为底物，以生物酶为催化剂，建立生物转化体系进行转化反应，得到含有培南类药物中间体的转化液，其中式Ⅰ化合物的结构式如下：
其中，R1为H或PNZ(对硝基苄氧基甲酰基)，R2为OH或二甲基氨基。
优选地，生物酶为共表达重组丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶。
进一步地，共表达重组丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶为基因工程菌(湿菌体)、冻干粉、固定化酶或固定化细胞。
进一步地，共表达重组丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶的基因工程菌中外源丝氨酸乙酰转移酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述共表达重组丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶的基因工程菌中外源半胱氨酸合成酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
再进一步地，基因工程菌为具有重组载体pETDuet-1的大肠杆菌。
再进一步地，转化体系中加入表面活性剂，所述表面活性剂为失水山梨醇酯和吐温80按质量比为3-5︰20组成的混合物。
再进一步地，转化体系中加入添加剂，所述添加剂为MgCl2和EDTA。
再进一步地，转化体系中，含共表达重组丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶的基因工程菌的浓度控制为10-20g/L；所述表面活性剂与含共表达重组丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶的基因工程菌的质量比控制为3-5％；所述添加剂与含共表达重组丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶的基因工程菌的质量比为2-6％。
再更进一步地，转化体系中包括缓冲溶液，缓冲溶液选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液、MOPS缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、Tris-盐酸缓冲溶液中的一种。
实施例1
共表达重组丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶的基因工程菌，具体制备方法是：选择来源于Lactobacillus casei的丝氨酸乙酰转移酶的基因序列，进行人工设计，设计后的基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；将该序列通过全基因合成，全基因合成的丝氨酸乙酰转移酶编码基因经EcoRI和NotI双酶切后克隆入表达载体pETDuet-1的多克隆位点1，得到重组质粒1，选择来源于Lactobacillus casei的半胱氨酸合成酶的基因序列，进行人工设计，设计后的基因序列如序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；将该序列通过全基因合成，全基因合成的半胱氨酸合成酶经BglⅡ和XhoI双酶切后克隆入重组质粒1的多克隆位点2，基因经测序确认后，转化至E.coli BL21(DE3)，置于氨苄青霉素平板上挑选单菌落，接入含氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含氨苄青霉素的TB培养基中，接种量为含氨苄青霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0.1mM，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到含共表达重组丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶的基因工程菌。
实施例2
培南类药物中间体的生物转化方法，反应在1L摇瓶中进行，向摇瓶中加入300mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，以反式-4-羟基-L-脯氨酸(20g，0.1527mol)、NaS(23.4g，0.3mol)为底物，以4.2g实施例1得到的含共表达重组丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶的基因工程菌为生物酶催化剂，加入表面活性剂和添加剂建立生物转化体系进行转化反应，得到含有(2S,4S)-2-羧酸-4-巯基吡咯烷的转化液。其中，表面活性剂为失水山梨醇酯和吐温80按质量比为1︰5组成的混合物，即加入0.035g失水山梨醇酯和0.175g吐温80。添加剂为MgCl2和EDTA。加入MgCl2的浓度为0.16g，添加EDTA 0.008g。生物转化体系的温度控制为35℃；生物转化体系的pH值控制为7，所述转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min。
反应式如下：
对含有(2S,4S)-2-羧酸-4-巯基吡咯烷的转化液进行纯化，包括如下步骤：
1)将含有(2S,4S)-2-羧酸-4-巯基吡咯烷的转化液用盐酸酸化后，加入亚硝酸钠，再用活性炭脱色至无色；
2)将步骤1)中脱色后的含有(2S,4S)-2-羧酸-4-巯基吡咯烷的转化液，过离子交换柱，洗脱；
3)将步骤2)洗脱后所得的洗脱液浓缩，用无水乙醇析晶，过滤；
4)将步骤3)过滤后所得的晶体加入无水乙醇，搅拌均匀后静置8h，抽滤，烘干，即得精制(2S,4S)-2-羧酸-4-巯基吡咯烷晶体(20.89g，0.1421mol)。
所制备的(2S,4S)-2-羧酸-4-巯基吡咯烷收率为93.1％，晶体纯度达到99.4％，光学纯度为99.7％。
实施例3
(2S,4S)-2-羧酸-4-巯基吡咯烷的生物转化方法，反应在500mL的摇瓶中进行，向摇瓶中加入150mL Tris-盐酸缓冲溶液，以(2S,4S)-2-羧酸-4-巯基吡咯烷(13.1g，0.1mol)、NaS(15.6g，0.2mol)为底物，以3g实施例1得到的含共表达重组丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶的基因工程菌为生物酶催化剂，加入表面活性剂和添加剂建立生物转化体系进行转化反应，得到含有(2S,4S)-2-羧酸-4-巯基吡咯烷的转化液。其中，表面活性剂为失水山梨醇酯和吐温80按质量比为1︰4组成的混合物，即加入0.018g失水山梨醇酯和0.072g吐温80。添加剂为MgCl2和EDTA。加入MgCl2的浓度为0.17g，添加EDTA 0.01g。生物转化体系的温度控制为40℃；生物转化体系的pH值控制为8，摇床的转速控制为250r/min。
反应式如实施例2。
对含有(2S,4S)-2-羧酸-4-巯基吡咯烷的转化液进行纯化，纯化方法如实施例2，得到精制(2S,4S)-2-羧酸-4-巯基吡咯烷晶体(13.49g，0.0918mol)。
所制备的(2S,4S)-2-羧酸-4-巯基吡咯烷收率为91.8％，晶体纯度达到98.9％，光学纯度为99.5％。
实施例4
向溶有(2S,4S)-2-羧酸-4-巯基吡咯烷的2M氢氧化钠溶液中滴加氯甲酸对硝基苄酯的二氯甲烷溶液，TLC跟踪至反应完全，纯化，得到(2S,4S)-2-羧基-4-羟基-1-(对硝基苄氧基甲酰)-1-吡咯烷；
氮气保护下，向溶有(2S,4S)-2-羧基-4-羟基-1-(对硝基苄氧基甲酰)-1-吡咯烷和三乙胺的二氯甲烷的溶液中滴加氯甲酸异丙酯，搅拌反应2h，加入二甲胺盐酸盐，反应0.5h后，滴加三乙胺，搅拌反应2h，依次用1M HCl，饱和NaCl，5％碳酸氢钠，饱和NaCl洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏得到(2S,4S)-2-(二甲基氨基甲酰)-4-巯基-1-(对硝基苄氧基甲酰)-1-吡咯烷。
实施例5
培南类药物中间体的生物转化方法，反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，包括以(2S,4S)-2-(二甲基氨基甲酰)-4-羟基-1-(对硝基苄氧基甲酰)-1-吡咯烷(20.22g，0.06mol)、NaS(11.7g，0.15mol)为底物，以4.2g实施例1得到的含共表达重组丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶的基因工程菌为生物酶催化剂，加入表面活性剂和添加剂建立生物转化体系进行转化反应，得到含有(2S,4S)-2-(二甲基氨基甲酰)-4-巯基-1-(对硝基苄氧基甲酰)-1-吡咯烷的转化液。其中，表面活性剂为失水山梨醇酯和吐温80按质量比为3︰20组成的混合物，即加入0.0219g失水山梨醇酯和0.1461g吐温80。添加剂为MgCl2和EDTA。加入MgCl2的浓度为0.08g，添加EDTA 0.004g。生物转化体系的温度控制为35℃；生物转化体系的pH值控制为7，所述转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min。
其中，PNZ为对硝基苄氧基甲酰。
对含有(2S,4S)-2-(二甲基氨基甲酰)-4-巯基-1-(对硝基苄氧基甲酰)-1-吡咯烷的转化液进行纯化，纯化方法如实施例2。得到(2S,4S)-2-(二甲基氨基甲酰)-4-巯基-1-(对硝基苄氧基甲酰)-1-吡咯烷晶体。
所制备的(2S,4S)-2-(二甲基氨基甲酰)-4-巯基-1-(对硝基苄氧基甲酰)-1-吡咯烷收率为96.4％，晶体纯度达到97.8％，光学纯度为99.6％。
本说明书中未作详细描述的内容，属于本专业技术人员公知的现有技术。
<110> 武汉茵茂特生物技术有限公司
<120> 培南类药物中间体的生物转化方法
<160> 2
<210> 1
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggaaaaaa gcccgctgaa aattggcatt ctgaacgtga tgcatgataa agcggatacc 60
aaaacccgtc tgcagcatgt gctgacccat accgatattc cggtggatct gcatttttat 120
tatccgatga cccattatgc gggccgtacc gtgccggaag cggtgagcag cattctggat 180
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cagcatgtgg cggatcatcg taacgataac cat 813
<110> 武汉茵茂特生物技术有限公司
<120> 培南类药物中间体的生物转化方法
<160> 2
<210> 2
<211> 927
<212> DNA
<213> 人工序列
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atggtgaccg cggcggataa cattaccggc ctgattggca acaccccgct gctgaaactg 60
aaccgtgtgg tgccggaaga tgcggcggat gtgtatgtga aactggaatt ttttaacccg 120
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aaactgggca aaggcaaaag cgtggtgacc gtggcgccgg ataacggcga acgttatctg 900
agcaccgatc tgtttaaatt tgaagat 927
Claims (9)
1.一种培南类药物中间体的生物转化方法，其特征在于，包括以下步骤：以式Ⅰ化合物、NaS为底物，以生物酶为催化剂，建立生物转化体系进行转化反应，得到含有培南类药物中间体的转化液，其中式Ⅰ化合物的结构式如下：
其中，R1为H或对硝基苄氧基甲酰基，R2为OH或二甲基氨基。
2.根据权利要求1所述的培南类药物中间体的生物转化方法，其特征在于，所述生物酶为共表达重组丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶。
3.根据权利要求1所述的培南类药物中间体的生物转化方法，其特征在于，所述共表达重组丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶为为基因工程菌、冻干粉、固定化酶或固定化细胞。
4.根据权利要求1所述的培南类药物中间体的生物转化方法，其特征在于，所述共表达重组丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶的基因工程菌中外源丝氨酸乙酰转移酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述共表达重组丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶的基因工程菌中外源半胱氨酸合成酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的培南类药物中间体的生物转化方法，其特征在于，所述基因工程菌为具有重组载体pETDuet-1的大肠杆菌。
6.根据权利要求1所述的培南类药物中间体的生物转化方法，其特征在于，转化体系中加入表面活性剂，所述表面活性剂为失水山梨醇酯和吐温80按质量比为3-5︰20组成的混合物。
7.根据权利要求1所述的培南类药物中间体的生物转化方法，其特征在于，转化体系中加入添加剂，所述添加剂为MgCl2和EDTA。
8.根据权利要求1所述的培南类药物中间体的生物转化方法，其特征在于，转化体系中，所述含共表达重组丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶的基因工程菌的浓度控制为10-20g/L；所述表面活性剂与含共表达重组丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶的基因工程菌的质量比控制为3-5％；所述添加剂与含共表达重组丝氨酸乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶的基因工程菌的质量比为2-6％。
9.根据权利要求1所述的培南类药物中间体的生物转化方法，其特征在于，转化体系中包括缓冲溶液，缓冲溶液选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液、MOPS缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、Tris-盐酸缓冲溶液中的一种。
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- 2017-04-13 CN CN201710240006.XA patent/CN107630054A/zh active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20180126 |
|
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