CN107629995A - 用于蛋白表达的细胞培养基和方法，所述培养基和方法包括一种pam抑制剂 - Google Patents

用于蛋白表达的细胞培养基和方法，所述培养基和方法包括一种pam抑制剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于蛋白表达的细胞培养基，该培养基包括PAM抑制剂或其生理等同物，还涉及一种用于蛋白表达的细胞培养方法，在该方法中，PAM抑制剂或其生理等同物被使用。

Description

用于蛋白表达的细胞培养基和方法，所述培养基和方法包括 一种PAM抑制剂
本申请是申请号为201180053542.X，申请日为2011年11月09日，名称为“用于蛋白表达的细胞培养基和方法，所述培养基和方法包括一种PAM抑制剂”的分案申请。
技术领域
本发明涉及包含PAM抑制剂或其生理等同物的细胞培养基和培养方法。
背景技术
虽然蛋白质的主要特征是它们的氨基酸序列(一级结构)，其它方面，如转译后修饰，也贡献蛋白质的一些特性，影响二级，三级和四级结构。一些转译后修饰对后期蛋白质活性发挥了显著作用，包括生物药品的安全性和有效性。
蛋白质异质性的一个主要方面是电荷分布，其包括酸性变种，例如通过氨基酸如天冬酰胺的脱酰胺化，通过糖基化或通过N-末端谷氨酰胺到焦谷氨酸，以及基本的变种的处理，及例如，C-末端赖氨酸的变体和酰胺化的氨基酸，特别是C-末端脯氨酸酰胺残基以形成。
C-末端脯氨酸酰胺残基的形成，在某些情况下，然而，是不需要的，例如，如不希望的异质性的来源，或所述变种潜在影响蛋白质的活性或免疫原性的情况下，或当酰胺化氨基酸的量，如脯氨酸酰胺，在蛋白质里相对参考蛋白质被生产的过高或过低。
相对于在高度可控的物理化学条件下生产的小分子药物，蛋白质的生产，特别是用作生物治疗药物的蛋白质的生产，是一个非常复杂的问题，是很难控制的，因为生产利用活细胞培养系统。因此，重要的是手边有一个工具箱，允许控制，特别是生产蛋白质的转译后修改，为了能够提供稳定的产品质量和稳定的高产出率，提高生产过程的效率，增加，和/或微调生产的蛋白质的生理活性和派生药物的安全，和/或匹配生产蛋白质和参考蛋白质的转译后特性。
本发明的目的是提供一种用于蛋白质表达的方法和培养基来满足这些要求。
这些目的是通过根据本发明的独立权利要求的方法和手段来满足。从属权利要求与优选的实施例相关。应当理解的是被数值界定的数值范围被理解为包括所述端点值。
发明内容
在本发明被仔细描述前，应当理解，本发明并不局限于描述装置的特定部件或描述方法的步骤，因为这些装置和方法可能改变。也应当理解的是，本发明所用的术语目的只是描述特定的实施例，并不意在对其进行限制。必须指出的是，用在说明书和附属权利要求中的单数形式“一”，“一个”和“该”包括单数和/或复数对象，除非上下文中另有明确规定。而且应当理解的是，如果参数范围被给定，通过数值来界定，该范围被视为包括这些端点值。
根据本发明的第一方面，提供一种用于蛋白质表达的细胞培养基，该培养基包括一种PAM抑制剂或其生理等同物。根据本发明的另一方面，提供一种用于蛋白质表达的细胞培养方法，在该方法中，一种PAM抑制剂或生理等同物被使用。
PAM(肽α-酰胺单加氧酶)是一种多功能蛋白，其含有两个顺序作用的酶的活性来催化C-末端截断和α-酰胺化的肽。肽α羟基化单加氧酶(PHM)催化该反应的第一步，并依赖于铜(Cu)或铜离子，抗坏血酸盐和分子氧。依赖锌的肽基酰氨基甘醇酸酯裂解酶(PAL)催化该反应的第二步骤，酰胺化的C-末端脯氨酸酰胺。
PAM抑制剂是降低PAM复合物催化率的物质。Chew(2003)表明PAM抑制剂可能是有用的抗增殖药物，而Bauer等(2007)表明，一些PAM抑制剂具有抗炎作用。然而，到目前为止，在细胞培养基或培养方法中使用PAM抑制剂，特别在基因表达中，更特别在异源蛋白质的表达中没有被描述。
PAM抑制剂的一些例子，在下面的表中提到：
·S-(硫代苯甲酰基)巯基乙酸
·N-(苯硫基乙酰基)丙氨酸
·S-(4-甲硫基苯甲酰)巯基乙酸
·4-氰基-4-甲基-4-硫代苯甲酰基-硫烷基丁酸
·S-(4-甲硫基苯甲酰)巯基乙酸乙基酯
·S-(N-苯氨基硫甲酰基)-3-巯基丙酸
·S-(苯基硫代乙酰基)巯基乙酸
·S-(N-苯氨基硫甲酰基)巯基乙酸
·S-(3-苯硫基丙酰基)巯基乙酸
·N-羟基酸苯基氨基甲酸乙酯
·(D，L)-四氢噻吩
·(苯硫基)乙酸
·(2-硝基苯硫基)乙酸
·S-(月桂硫代)巯基
·双硫仑
·亚硫酸钠
·4-苯基-3-丁烯酸(PBA)
·硫普罗宁
·卡托普利
·EDTA
·亚硫酸铵
·氢化肉桂-苯丙氨酰基-高半胱氨酸
如上所述，上述PAM抑制剂的生理等同物也被本发明包括。
在本发明的一个优选实施例，上述表达式一个异源蛋白质的表达。
在本发明的另一优选实施例中，所述异源表达发生在基于哺乳动物细胞的表达系统。优选的，所表达的蛋白质是选自下列组成的组中的至少一种蛋白质，该组组成为：
·抗体，或该抗体的片段或衍生物
·融合蛋白，和/或
·非抗体蛋白。
优选的，根据本发明的培养方法和培养基适合(充足)生产蛋白质，其包括氨基酸序列相同或实质上类似的全部或部分的下列蛋白质：Flt3配体，CD40配体，红细胞生成刺激蛋白如促红细胞生成素(EPO)，达依泊汀，包括慢性肾病，和血小板生成素，降钙素，瘦素，Fas配体，受体活化NF-κB的配体(RANKL)，肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体(TRAIL)，胸腺基质衍生的淋巴细胞，粒细胞集落刺激因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，生长因子包括肥大细胞生长因子，干细胞生长因子，表皮生长因子，角质细胞生长因子，巨核细胞生长和发育因子，趋化因子，生长激素，胰岛素，促胰岛激素，类胰岛素生长因子，甲状旁腺激素，干扰素，包括α-干扰素，β-干扰素，和γ-干扰素，神经生长因子，脑源性神经营养因子，突触结合蛋白样蛋白(SLP 1-5)，神经营养因子-3”胰高血糖素，白细胞介素IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17和IL-18，集落刺激因子，淋巴毒素-对，肿瘤坏死因子(TNF)，白血病抑制因子，制瘤素M，和各种配体的细胞表面分子ELK安利马赫(如弗激酶或LERKS的配位体)。
此外，通过使用本发明的培养方法和培养基，蛋白质能够被生产，包括蛋白质包括任一上述蛋白质受体的全部或部分氨基酸序列，任何上述蛋白受体的拮抗剂，和蛋白质基本上类似于这样的受体或拮抗剂。
另外，使用本发明的方法和培养基可以生产蛋白质，包括蛋白质，包括分化抗原(简称CD蛋白)的全部或部分氨基酸序列或它们的配体或蛋白质基本上类似的任一这些。这种抗原的例子是分化抗原，包括CD20，CD22，CD27，CD30，CD39，CD40和配体。
也可以使用本发明的方法和培养基生产酶活性蛋白质和它们的配体。例子包括蛋白质，其包括全部或部分的下列蛋白质之一，或它们的配体，或蛋白质基本上类似于其中一个：金属蛋白酶去整合素家族成员，激酶，葡糖脑苷脂酶，超氧化物歧化酶，组织型纤溶酶原激活剂，凝血因子VIII，因子IX，载脂蛋白E，载脂蛋白A-1，球蛋白，IL-2受体拮抗剂，α-1抗胰蛋白酶，肿瘤坏死因子-α转换酶，任何上述酶的配体，和许多其他的酶和它们的配体。
本发明的方法和培养基，也可用于生产在体外选择要绑定到一个特定的目标蛋白的嵌合蛋白质，并修改其活性，和抗体或其部分，嵌合抗体，即抗体具有人类不变抗体免疫球蛋白域耦合到一个或多个鼠可变抗体的免疫球蛋白结构域，及其片段，或实质上类似的蛋白质。本发明的方法也可用于生产包含抗体和细胞毒性或发光物的共轭物。抗体的实施例，在体外选择的嵌合蛋白质，或抗体/毒素或抗体/荧光体的结合物，可以使用本发明的方法和介质生产，包括那些能识别任何一个或组合的蛋白质，包括但不限于，任何上述的蛋白质和/或下面的抗原：CD2，CD3，CD4，CD8，CD11a，CD14，CD18，CD20，CD22，CD23，CD25，CD33，CD40，CD44，CD52，CD80(B7.1)，CD86(B7.2)，CD147，IL-la，IL-1，IL-2，IL-3，IL-7，IL-4，IL-5，IL-8，IL-10，IL-2受体，IL-4受体，IL-6受体，IL-13受体，IL-18受体亚单位，血小板衍生生长因子-β，和类似物，VEGF，TGF，TGF-β2，TGF-p1，EGF受体，VEGF受体，肝细胞生长因子，骨保护素配体，干扰素γ，B淋巴细胞刺激因子，C5补体，IgE抗体，肿瘤抗原CA125，肿瘤抗原MUC1，PEM抗原，ErbB2/HER-2，与肿瘤相关的抗原表位出现在升高等级的患者的血清中，癌相关抗原决定簇或蛋白的表达在乳腺癌，结肠癌，鳞状细胞癌，前列腺癌，胰腺癌，肺癌，和/或肾肿瘤细胞和/或黑色素瘤，神经胶质瘤，神经母细胞瘤，肿瘤坏死核心，整合α4β7，整合VLA-4，B2整合，TRAIL受体1，2，3和4，RANK，RANK配体，TNF-α，VAP-1的粘附分子，上皮细胞粘附分子(EpCAM)，细胞间黏附分子(ICAM-3)，白细胞整合附着力，血小板糖蛋白GP IIb/IIIa，心肌肌球蛋白重链，甲状旁腺激素，MHC I，癌胚抗原(CEA)，甲胎蛋白(AFP)，肿瘤坏死因子(TNF)，FC-y-1受体，HLA-DR 10β，HLA-DR抗原，L-选择和IFN-γ。
本发明的方法和培养基也可以用于生产重组的融合蛋白，包括任何上述的蛋白质或实质上类似的蛋白质。例如，含有上述蛋白之一，加一个多聚化域的重组融合蛋白，如亮氨酸拉链，卷曲，抗体的Fc部分，或基本相似的蛋白质，能被生产通过使用本发明的方法和培养基。具体而言，包括在这种重组融合蛋白的蛋白质，其中的至少一部分的TNFR或RANK融合至抗体的Fc部分。
在另一个优选的实施例中，所述哺乳动物细胞为基础的表达系统是从下列组成的组中选择的至少一种：
·幼仓鼠肾细胞系(如BHK21)
·中国仓鼠卵巢细胞系(如CHO-K1，CHO-DG44，CHO-DXB，或CHO-dhfr-)
·小鼠骨髓瘤细胞系(例如，SP2/0)
·小鼠骨髓瘤细胞系(例如，NS0)
·人胚肾细胞系(如HEK-293)
·人类视网膜衍生细胞系(如PER-C6)，和/或
·羊水细胞系(如CAP)。
优选地，仓鼠细胞为基础的表达系统正被使用。BHK21(“幼仓鼠肾”)细胞属于叙利亚仓鼠细胞既定路线准二倍体的，一个不同寻常的快速增长的原代培养的新生鼠肾组织的克隆的后代。BHK-21细胞系的非限制性实施例是可商购的，并且可以用在本发明上下文中的是BHK-21(C-13)；BHK21-pcDNA3.1-HC；BHK570；Flp-In-BHK细胞系；和/或BHK21(克隆13)仓鼠细胞系。
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是从中国仓鼠卵巢得到的细胞系。它们通常用于在生物学和医学研究和商业化治疗性蛋白的生产。他们引进于20世纪60年代，最初作为单层培养成长。今天，CHO细胞是用于重组蛋白质疗法工业生产中最常用的哺乳动物宿主，通常生长在悬浮培养物。
CHO细胞系的非限制性实施例是可商购的，并且可以用在本发明上下文中的是自由式CHO-S细胞；ER-CHO细胞系；CHO 1-15 500中国仓鼠；CHO-DXB，CHO-dhfr-，CHO DP-12克隆#1934；CHO-CD36；CHO-ICAM-1；CHO-K1；卵巢；HuZP3-CHOLec3.2.8.1；xrs5；CHO-K1/BB2细胞；CHO-K1/BB3细胞；CHO-K1/EDG8/Galpha15细胞；CHO-K1/M5细胞；CHO-K1/NK1细胞；CHO-K1/NK3细胞；CHO-K1/NMUR1细胞；CHO-K1/NTSR1细胞；CHO-K1/OX1细胞；CHO-K1/PAC1/Gα15细胞；CHO-K1/PTAFR细胞；CHO-K1/TRH1细胞；CHO-K1/V1B细胞；5HT1A Galpha-15-NFAT-BLACHO-K1细胞系；AVPR2CRE-BLA CHO-K1细胞系；CHO-S Cells SFM适应；DG44细胞；Flp-In-CHO细胞系；GeneSwitch-CHO细胞系；NFAT-bla CHO-K1细胞系；T-REx-CHO细胞系；GenoStatCHO K-1稳定细胞系；GenoStat CHO K-1稳定细胞系试剂盒；CHO-K1细胞系仓鼠，CHO-PEPT1细胞系。在一个特别的优选实施例中，仓鼠细胞表达系统是一个CHO-dhfr-细胞线。
在另一个优选的实施例中，所述方法发生在至少一个选自下列组成的组的生物反应器中或培养容器，该组组成为：
·摇瓶
·T形烧瓶
·袋
·滚瓶
·生物反应器，和/或
·微调烧瓶。
优选地，所述的生物反应器中或培养容器可以有50ml和40000l之间的体积。标准的生物反应器或培养容器的大小举例：50ml(例如摇瓶或T形烧瓶)，500ml，2l，5l，15l，100land 300l(例如生物反应器或袋)，and 1000l，2000l，5000l，10000l，25000l and 40000l(大型生物反应容器)。
在另一个优选的实施例中，细胞培养在贴壁培养中进行，例如单层培养。根据另一个优选实施例，细胞的培养也可能发生在悬浮培养中。根据本发明连续和不连续的细胞培养方法能够被利用。其他已知的反应器技术，例如，灌注技术或类似的，能够被利用。批处理和分批补料方法是特别优选的实施例。特别优选的PAM抑制剂用于影响酰胺化的氨基酸残基的形成，特别是C-末端脯氨酸酰胺残基。
对于大多数情况，可取的是，减少在生产的蛋白质的每个氨基酸链的酰胺化的氨基酸残基的量到<1％。
在本发明特定的优选实施例中，PAM抑制剂是4-苯基-3-丁烯酸(PBA)，或生理等同物。
PBA(也称为反式-苯乙烯基-乙酸，或4-PBA)是一种药剂，其中，由放射高阳链霉菌生产，并已报道有抗炎和抗真菌作用。此外，它似乎能抑制血管舒张。
在本文中，PBA似乎能抑制C-末端甘氨酸残基的裂解，也就是说，它是肽酰甘氨酸α-羟基化单加氧酶(PHM)的一种抑制剂，它是PAM复合物的一种酶。
令人惊奇的是，本发明的发明者第一次显示，PAM抑制剂，例如，4-苯基-3-丁烯酸(PBA)，在细胞培养过程中，蛋白质表达的过程中，细胞培养基和/或蛋白的表达介质，可以单独使用或与一个或多个其他药剂组合使用，以剂量依赖的方式，来控制和/或调整酰胺化的氨基酸残基，特别是C-末端脯氨酸酰胺的量。支持这些发现的数据在这里公开，例如，根据图1，图2和图3和各自的描述。
优选地，4-苯基-3-丁烯酸(PBA)，或其生理等同物，使用在≥0，01μM和≤300μM(＝μMol l-1)的浓度。更优选的是，所述浓度范围为≥5μM和≤200μM之间，甚至更优选≥10μM和≤150μM，和最优选≥45μM和≤110μM之间。对于其他PAM抑制剂，其生理等同物，其他浓度范围也可以使用。
应当指出的是，在进料溶液(也称作“注射溶液”)，浓度可显着高于在细胞培养基中，或在细胞培养液中，例如，高达3M(＝Mol l-1)。
当对比于细胞块，4-苯基-3-丁烯酸(PBA)，或生理上的等同物，可以用在浓度≥0.01mmol/kg的细胞块≤1mmol/kg的细胞块。更优选的是，所述浓度范围为≥0.03mmol/kg的细胞块和≤0.5mmol/kg的细胞块。
应当指出的是，在进料溶液(也称作“注射溶液”)，浓度可显着高于在细胞培养基中，或在细胞培养液中，即≥0.1且≤10mmol/kg进料溶液，优选≥0.4and≤5mmol/kg进料溶液。
以下表格显示PBA是如何实验上应用在五个不同治疗性蛋白的生产。
PAM抑制剂，或其生理等同物，在细胞培养过程的开始，可以添加到培养基中。另外，PAM抑制剂或其生理等同物，在细胞培养过程中可以补充，例如，作为一个进料培养基的成分(也成为“进料液”或“注射液”)。
从这样的细胞培养方法中得到的蛋白质，可用于药物制剂的制备。此外，这种细胞培养方法得到的蛋白质能够与生物活性剂的其它组分一起给药，如药学上可接受的表面活性剂，接受者，载体，稀释剂和车辆。
定义
“PAM抑制剂”，如本文所用，涉及一种降低了PAM酶复合物的催化率的制剂。所述PAM抑制剂从而影响PAM酶复合等，或影响肽酰甘氨酸的α-羟基化单加氧酶(PHM)，负责断裂的C-末端甘氨酸残基，或影响肽基酰氨基甘醇酸酯裂解酶(PAL)，它负责实际的酰胺化反应。
如本文所用，术语“PAM抑制剂的生理等同物”涉及化学的PAM抑制剂衍生物，其具有，在生理设置(例如，细胞培养液)中，与PAM抑制剂相同的潜力效果。所述等同物是，例如，所述PAM抑制剂的盐或酯(只要化学足够)，溶解或是被无处不在的酯酶水解，在培养基中形成实际的PAM抑制剂。
如本文所用的术语“药物制备”，表示组合物适用于或适于给药给哺乳动物，特别是人类。
至于术语“融合蛋白质”，这是本文中使用的术语“融合肽”的同义词，蛋白质是指通过接合两个或多个原本为独立的蛋白质编码的基因而创造的。该融合基因的翻译导致一个单一的多肽具有来自各原蛋白的功能特性。这个词的含义包括嵌合和人源化抗体，以及结构组成为，例如，一个受体域和IgG Fc段。
如本文所用，术语“异源蛋白质表达”和“异源蛋白质”指的是由表达系统不自然生产的蛋白质和肽，例如宿主细胞。后者需要转基因，以表达所述异源蛋白质。
如本文所用，术语“抗体”是指单克隆抗体(mAbs)，多特异性抗体，人抗体，人源化抗体，合成抗体，嵌合抗体，多克隆抗体，焦糖抗体，单链FVS(抗体)，单链抗体，免疫学活性抗体片段(例如，能够结合表位的抗体片段，例如，Fab片段，Fab'片段，F(AB')2片段，Fv片段，片段含有一个VL或VH结构域或互补决定区(CDR)免疫特异性结合抗原等)，双官能或多官能抗体，二硫键连接的双特异性FVS(sdFv)，胞内抗体和双抗体，和任何上述的表位结合片段。特别是，术语“抗体”意在包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性片段，即含有一个抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(如IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)，类(如IgGb IgG2，IgG3，IgG4，IgAi和IgA2)或子类。
如本文所用，术语“非抗体蛋白”涉及生理活性的蛋白质并不是抗体。这样的定义包括，除其他外，胰岛素，生长激素，促红细胞生成素，干扰素α或G-CSF，组织型纤溶酶原激活剂(tPA)，凝血因子VIII，和/或白细胞介素2，或它们的片段或衍生物。
如本文所用，术语“抗体片段”是指该抗体保留的片段，在某些情况下，特定抗体的性能，例如，针对结合能力。这样的片段的例子是：
·一个CDR(互补决定区)
·高变区，
·可变域(FV)
·一个IgG重链(由VH，CH1，铰链，CH2和CH3区域组成)
·一个IgG轻链(VL和CL区域组成)，和/或
·一个的Fab和/或的F(ab)2。
如本文所用，术语“抗体衍生物”是指蛋白质的构造在结构上不同，但仍然有一些结构性的关系，并保留一些功能特性，常见的抗体概念，例如单链抗体，以及双-，三-或更高的特异性抗体的构建，PEG化的抗体的结构和等。
类似的概念适用于“蛋白质的片段或衍生物”，在本发明的意义。
如本文所用，术语“细胞培养基”是指在培养细胞背景下使用的各种培养基。典型的是细胞培养基包括氨基酸，至少一种碳水化合物作为能量来源，微量元素，维生素，无机盐和可能的附加组件(例如为了影响细胞的生长和/或生产率和/或产品的质量)。
如本文所用，术语“进料”，“进料培养基”或“进料溶液”是指一种细胞培养基或特定组成的溶液，其中加入作为补充的细胞培养在这个过程中通常是为了影响细胞的生长和/或生产率和/或产品质量。
如本文所用，术语“细胞培养液”是指实际的液体，细胞在其中正在培养。这意味着，所述流体可以包含，相对于细胞培养基或根据上述定义的进料，细胞的代谢产物，细胞碎片，细胞的蛋白质(如酶，或重组蛋白)和/或所述PAM抑制剂的降解产物，可以进一步减少在其养分含量。
如本文所用，术语“酰胺化的氨基酸残基的量”涉及形成于或迟于在蛋白质C末端的蛋白质表达的酰胺化的氨基酸残基。这涉及，具体而言，酰胺化了的脯氨酸的量。在某些情况下，蛋白质的脯氨酸残基能够是酰胺化的转译后，导致例如，脯氨酸酰胺(Pro-NH2)的形成。在某些情况下，这是不必要的，例如，蛋白质中的脯氨酸酰胺的量生产的比参考蛋白质高或低。
PAM酶复合物影响脯氨酸酰胺化反应基本上依赖于翻译的蛋白质的亲和R之间的C-末端肽键的水解和氧化，其中R可以是一个或一个以上的氨基酸残基，例如，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，或Gly-赖氨酸。该反应是在大多数情况下，由PAM酶复合物(见上文)催化。根据表达宿主和蛋白表达的条件，翻译的蛋白质的份额携带至少一个翻译后的Pro-NH2可以在≥0-≤100％的范围内。所述酰胺导致蛋白质pH值升高，因此是一个基本型。
单克隆抗体或其衍生物，脯氨酸酰胺(PA)通常是由翻译后除去C-末端赖氨酸和甘氨酸和现在C-末端脯氨酸残基酰胺化而创建，例如在蛋白质的重链。
脯氨酸酰胺化是重要的各种蛋白质的功能，例如降钙素。其在单克隆抗体的功能是迄今为所止不知道的。
脯氨酸酰胺的量可以通过各种分析方法确定和量化，通过物理-化学的差异，如电荷，疏水性和质量区分酰胺化的变体和非酰胺化的变体。最常用的方法是离子交换层析，如CEX-CPB方法(羧肽酶B消化后的阳离子交换层析)，利用由于脯氨酸酰胺的电荷改变。对于抗体，共洗脱的脯氨酸酰胺变种与赖氨酸变种被避免，通过使用色谱分离之前的羧肽酶B消化除去赖氨酸残基。其他的共洗脱的基本变种，但是，可以导致在量化背景的百分之几(例如4％)。脯氨酸酰胺变种加背景，被称为“伪1K”具有一个C-末端赖氨酸残基的抗体变种的洗脱色谱位置。“伪2K”包括脯氨酸变种附加背景上面的色谱洗脱的有两个C-末端赖氨酸残基的抗体变体的位置。CEX方法(即CEX没有通过CPB消化去除赖氨酸)的差异，表明具有赖氨酸残基抗体变体的量，被称为“真实1K”和“真实2K”。由CEX(CPB)的量化，返回相对于在溶液中的所有的抗体分子的脯氨酸酰胺化抗体的百分比。明确可以识别和量化酰胺脯氨酸变异的分析测试方法是高效液相色谱法(反相高性能液体色谱法)的肽链内切酶(如LYSC，胰蛋白酶)消化的蛋白质，所谓的肽谱分析，使用UV(紫外线)或MS(质谱分析)检测。通过RP-HPLC肽谱分析定量返回脯氨酸酰胺化重链相对所有重链的一个抗体的百分比。
“伪1K”是由CEX-CPB确定的变体，其中一个抗体(lgG)两个重链中的一个在其C-末端具有脯氨酸酰胺。“伪2K”是由CEX-CPB确定的变体，其中单克隆抗体的两条重链具有在其末端的脯氨酸酰胺。
如本文所用，术语“浓度”的一个给定药剂涉及细胞培养基中的浓度(如细胞培养基，或进料培养基，或进料溶液)，或在细胞培养液中。
免责声明
为了提供了一个全面的披露而不是过度冗长的说明书，申请人在此结合参考上面所引用的专利和专利申请。
在上面详细的实施例中的元件和特征的特定组合仅是示例性的；这些教导转乘和代替其它的教导在这方面和专利/申请通过引用具有明确的预期。由于本领域的技术人员会意识到，变化，改进，本说明书中记载的其它的实施例，能发生在本领域普通技术人员上，在不脱离本发明权利要求的精神和范围的情况下。因此，前面的描述仅作为实施例的方式，并不意在作为限制。本发明的范围被定义在下面的权利要求及其等同于此。此外，在说明书和权利要求中使用的附图标记不限制本发明权利要求的范围。
实施例和附图的简要说明
本发明的目的其他细节，特征，特点和优点，在从属权利要求和各自的附图和实施例的以下描述中公开，其中，在一个示例性的方式，显示本发明的优选实施例中。然而，这些图不应被理解为限制本发明的范围。
实验：PAM抑制剂在氨基酸酰胺/脯氨酸形成的影响
在他们的实验中，发明人专注于公布PAM抑制剂作为潜在的培养基成分。在屏蔽组件中，即亚硫酸钠，硫普罗宁，卡托普利，乙二胺四乙酸，亚硫酸铵，L-组氨酸，D-组氨酸，元硫代铵，L-肌肽，青霉胺，4-苯基-3-丁烯酸(PBA)。
两个重组蛋白用于研究PAM抑制剂在氨基酸酰胺/脯氨酸形成的影响。即，一种单克隆抗体(人-鼠嵌合抗体)，和一个Fc融合蛋白。CHO细胞被作为表达系统。
PBA在脯氨酸酰胺形成展示了强大的功效，而不是显着影响增长或其它产品质量属性。
基于这些结果，发明人得出的结论是细胞培养基的组合物通过加入PBA(例如，100μM)是可适应的。在另一种方案中，PBA可以补充到培养基以及进料溶液。例如，培养可从没有或低量PBA开始，在细胞培养达到峰值细胞密度后，增加量的PBA能够添加，但是在主要量的重组蛋白被生产之前。在收获时，这可能支持更高峰值细胞密度和更高产品滴度，相对于在成长阶段已经知道最终的PBA的量。
附图
图1：PAM抑制剂对脯氨酸酰胺(PA)形成的影响，量化为“伪1K”CEX-CPB分析，在CHO细胞中表达的单克隆抗体(嵌合抗体)。当向细胞培养基中补充时，PBA显示在脯氨酸酰胺形成时具有最强的作用，在细胞培养基的浓度为10μM或100μM，分别的减少伪1K的量，从应用10％减到应用8％或5％。在CEX-CPB的5％的伪1K对应0-2％的被肽映射证实的每重链的脯氨酸酰胺。
图2：PAM抑制剂PBA在脯氨酸酰胺的形成在CHO细胞中表达的Fc-融合蛋白的影响，如肽映射所量化。补充各种浓度高达100μM的PBA的重组CHO细胞的培养物，降低脯氨酸酰胺的量(％每重链)，以剂量依赖效应曲线从应用2％(无PBA)到应用0.1％(100μMPBA)。
图3：PAM抑制剂PBA在脯氨酸酰胺的形成在CHO细胞中表达的Fc-融合蛋白的影响，如肽映射所量化。补充补充具有50μM或100μMPBA重组CHO细胞的培养物，导致脯氨酸酰胺(％每重链)从分别>4％下降到<1％和<0.5％。
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Claims (10)

1.一种用于蛋白质的异源表达的细胞培养方法，其中PAM抑制剂用作细胞培养基的组分，其中所述PAM抑制剂减少酰胺化氨基酸残基的形成量。
2.如权利要求1所述的用于蛋白质的异源表达的细胞培养方法，其特征在于，所述方法包括在所述细胞培养基中培养表达异源蛋白质的细胞，其中所述细胞培养基包括进料溶液，其中所述进料溶液还包括PAM抑制剂。
3.如权利要求2所述的用于蛋白质的异源表达的细胞培养方法，其特征在于，所述PAM抑制剂是浓度为100μM的PBA，其中所述PAM抑制剂在所述进料溶液中的浓度≤3M。
4.如权利要求1至3中任意一项所述的用于蛋白质的异源表达的细胞培养方法，其特征在于，所述酰胺化氨基酸残基是C-末端脯氨酰胺残基。
5.一种用于如权利要求1至4中任意一项所述的用于蛋白质的异源表达的细胞培养方法的细胞培养基，其特征在于，所述细胞培养基目的在于减少酰胺化氨基酸残基的形成量，所述细胞培养基包括进料培养基和PAM抑制剂。
6.如权利要求5所述的用于蛋白质的异源表达的细胞培养方法的细胞培养基，其特征在于，所述PAM抑制剂是浓度为100μM的PBA，其中所述PAM抑制剂在所述进料溶液中的浓度≤3M。
7.如权利要求1至6中任意一项所述的方法或细胞培养基，其特征在于，所述异源表达发生在一种基于哺乳动物细胞的表达系统。
8.如权利要求1至7中任意一项所述的方法或细胞培养基，其特征在于，所述蛋白质选自以下蛋白质中的至少一种：
·抗体，或该抗体的片段或其衍生物
·融合蛋白，和/或
·非抗体蛋白。
9.如权利要求7至8中任意一项所述的方法或细胞培养基，其特征在于，所述哺乳动物细胞为基础的表达系统是选自从下述中的至少一种：
·幼仓鼠肾细胞系
·中国仓鼠卵巢细胞系
·小鼠骨髓瘤细胞系
·小鼠骨髓瘤细胞系
·人胚肾细胞系
·人类视网膜衍生细胞系，和/或
·羊水细胞系。
10.如权利要求1至9中任意一项所述的方法，其特征在于，所述培养方法发生在至少一个生物反应器中或培养容器中，所述生物反应器中或培养容器选自：
·摇瓶
·T形烧瓶
·滚瓶
·袋
·生物反应器，和/或
·微调烧瓶。
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