KR101905204B1

KR101905204B1 - Pam 억제제를 포함하는, 단백질 발현을 위한 세포 배지 및 배양 방법

Info

Publication number: KR101905204B1
Application number: KR1020137013920A
Authority: KR
Inventors: 코리나 존데르거; 줄리아 슈무차르드; 크리스틴 힐; 토마스 스탄글러
Original assignee: 산도즈 게엠베하
Priority date: 2010-11-09
Filing date: 2011-11-09
Publication date: 2018-10-05
Also published as: US9062337B2; EP2638064B1; CA2816394A1; SG190182A1; PL2638064T3; DK2638064T3; JP6298295B2; SI2638064T1; EP2638064A2; JP2013541963A; JP2017035084A; KR20130131355A; KR101991215B1; CN103298830A; AU2011328166B2; US10106828B2; HUE055573T2; WO2012062810A3; KR20180082643A; EP2450375A1

Abstract

본 발명은 단백질을 발현하기 위한 세포 배양 배지에 관한 것으로, 상기 배지는 PAM 억제제, 또는 그것의 생리학적 동등제를 포함한다. 본 발명은 단백질을 발현하기 위한 세포 배양 방법에 관한 것으로, 상기 방법에서 PAM 억제제, 또는 그것의 생리학적 동등제를 이용한다.

Description

PAM 억제제를 포함하는, 단백질 발현을 위한 세포 배지 및 배양 방법{Cell culture medium and process for protein expression, said medium and process comprising a PAM inhibitor}

본 발명은 PAM 억제제 또는 그의 생리학적 동등제를 포함하는 세포 배양 배지 및 배양 방법에 대한 것이다.

단백질은 주로 아미노산 서열(1차적 구조)로 특징지어지긴 하지만, 번역후 변형(post-translational modifications)과 같이 2차, 3차, 4차적 구조에 영향을 끼치는 다른 측면도 역시 단백질의 특징에 영향을 미친다. 이러한 일부의 번역후 변형은 생물학적치료제 약물의 안전성과 효과를 포함하는 단백질의 나중의 기능에서 큰 역할을 한다.

단백질이 이종성(heterogeneity)을 가지게 되는 한 주요 부분은 전하 패턴인데, 예를 들어 아스파라긴과 같은 아미노산의 탈아미드화에 의해서, 당화에 의해서 또는 N-말단 글루타민을 피로글루탐산으로 가공하는 것을 통해 만들어지는 산성 변이체, 또는 예를 들어 C-말단 라이신 변이체 및 특히 C-말단 프롤린 아미드기와 같은 아미드화 아미노산과 같은 염기성 변이체를 포함하는 전하 패턴이다.

C-말단 프롤린 아미노기가 만들어지는 것은 어떤 경우, 예를 들어 원치 않는 이종성의 원인이 되거나 그러한 변이체가 단백질 활성 또는 면역원성에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 경우, 또는 만들어질 단백질 내에서, 예를 들면 프롤린 아미드와 같은 아미드화 아미노산의 양이 기준 단백질에 비해 높거나 낮은 경우에는 원치 않는 결과가 된다.

상당히 조절가능한 물리화학적 환경에서 만들어지는 저분자량 약물과 달리, 단백질, 특히 생물학적치료제로 쓰이는 단백질을 생산하는 것은 조절하기 어려운 상당히 복잡한 일인데, 왜냐하면 이러한 생산을 위해서 살아있는 세포 배양 시스템을 사용하기 때문이다. 따라서 일정한 제품 품질과 일정하게 높은 수율을 가지도록 하여 생산공정의 효율을 높이고, 생산된 단백질의 생리학적 활성도 및 그로부터 만들어진 약물의 안전성이 증가 및/또는 미세하게 맞춰질 수 있도록 하거나/또는 만들어진 단백질의 번역후 특징이 기준 단백질의 것과 일치하게 하기 위해 특히 만들어진 단백질의 번역후 변형을 제어할 수 있는 도구를 가지는 것이 매우 중요하다.

본 발명의 목적은 이러한 요구사항에 부응하는, 단백질 발현을 위한 방법 및 배지를 제공하는 것이다.

이 목적은 본 발명의 독립항에 따른 방법 및 수단에 의해 달성된다. 종속항은 바람직한 실시예와 관련된 것이다. 수치로 한정된 값의 범위는 그 경계값을 포함한다.

본 발명에 따르면 PAM 억제제 또는 그의 생리학적 동등제를 포함하는 세포 배양 배지 및 배양 방법이 제공된다.

도 1: CEX-CPB 분석법에서 '슈도 1K"로 정량화된, CHO 세포에서 발현된 단클론항체(키메라 IgG) 상에서의 프롤린 아미드(PA) 형성에 대한 PAM 억제제의 영향. 세포 배양 배지에 10μM 또는 100μM의 농도로 넣었을 때 슈도 1K의 양이 약 10%에서 약 8%까지, 또는 약 5%까지 각각 줄어들어, PBA가 프롤린 아미드의 형성에 대해 가장 강력한 효과를 나타냈다. CEX-CPB법에서의 5%의 슈도 1K는 펩타이드 매핑에 의해 확인되는 중쇄 당 0-2%의 프롤린 아미드에 해당한다.
도 2: 펩타이드 매핑에 의해 정량화된, CHO 세포에서 발현된 Fc-융합 단백질에서의 프롤린 아미드 형성에 미치는 PAM 억제제 PBA의 영향. 재조합 CHO 세포의 배지에 여러 농도의 PBA를 최대 100μM까지 넣자, 프롤린 아미드의 양(중쇄 당 %)은 용량의존적 효과 곡선을 그리며 약 2% (PBA 없음)에서 약 0.1% (PBA 100μM)까지 줄었다.
도 3: 펩타이드 매핑에 의해 정량화된, CHO 세포에서 발현된 Fc-융합 단백질에서의 프롤린 아미드 형성에 미치는 PAM 억제제 PBA의 영향. 재조합 CHO 세포의 배지에 50μM 또는 100μM의 PBA를 넣었을 때, 프롤린 아미드는 각각 >4%에서 <1%및 <0.5%로 줄어드는 결과를 보였다(중쇄 당 %).

발명의 요약

본 발명을 구체적으로 설명하기에 앞서, 본 발명이 설명된 장치의 특정 구성부분 또는 설명된 방법의 특정 공정단계에 한정되는 것이 아니며 이러한 장치 및 방법은 다양하게 바뀔 수 있음을 분명히 한다. 또한 여기서 사용한 용어들은 오직 특정 실시예를 설명하기 위한 목적으로만 쓰이며 제한하기 위한 것은 아니다. 명세서 및 청구항에서 단수를 가리키는 "하나의", "한", "그"와 같은 한정어는, 문맥상 명백하게 달리 정의되지 않는다면, 단수 및/또는 복수의 개념을 포함하는 것으로 쓰였다. 또한 수치값으로 한정된 변수의 범위가 주어진 경우에 그 범위는 이 경계값을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면에 따르면, 단백질의 발현을 위한 세포 배양 배지가 제공되는데, 이 배지는 PAM 억제제, 또는 그것의 생리학적 동등제를 포함한다. 본 발명의 다른 측면에 따르면 단백질의 발현을 위한 세포 배양 방법이 제공되는데, 이 방법에서 PAM 억제제 또는 그것의 생리학적 동등제가 사용된다.

PAM(peptidylglycine alpha amidating monooxigenase, 펩티딜글리신 알파아미드화 모노옥시게나제)는, 차례로 펩타이드의 C-말단 절단 및 알파아미드화에 촉매로 작용하는 두 가지 효소작용을 하는 다기능성 단백질이다. 펩티딜글리신 알파-히드록실화 모노옥시게나제(peptidylglycinealpha-hydroxylating monooxygenase, PHM)는 이 반응의 첫 단계에 촉매로 작용하고, 구리(Cu) 또는 구리 이온, 아스코르브산염 및 산소 분자에 의존한다. 아연 의존성 펩티딜아미도-글리콜산염 리아제(peptidylamido-glycolate lyase, PAL)는 이 반응의 두 번째 단계, C-말단 프롤린을 프롤린 아미드로 아미드화시키는 반응에서 촉매로 작용한다.

PAM 억제제는 PAM 복합체의 촉매작용률을 낮추는 물질이다. 츄(Chew)(2003)는 PAM 억제제가 항-증식성 약물로 쓰일 수 있다고 시사했고, Bauer 등(2007)은 몇몇 PAM 억제제가 항염증 효과가 있다고 했다. 그러나 현재까지 PAM 억제제를 특별히 단백질 발현, 더 구체적으로 이종 단백질 발현 세포 배지나 방법에서 쓰려는 용도는 알려진 바가 없다.

PAM 억제제의 예는 아래 목록과 같다:

S-(티오벤조일)티오글리콜산(S-(Thiobenzoyl)thioglycolic acid)

N-(페닐티오아세틸)알라닌(N-(Phenylthioacetyl)alanine)

S-(4-메틸티오벤조일)티오글리콜산(S-(4-Methylthiobenzoyl)thioglycolic acid)

4-시아노-4-메틸-4-티오벤조일-설파닐부티르산(4-Cyano-4-methyl-4-thiobenzoyl-sulfanylbutyric acid)

S-(4-메틸티오벤조일)티오글리콜산 에틸 에스테르(S-(4- Methylthiobenzoyl)thioglycolic acid ethyl ester)

S-(N-페닐티오카르바모일)-3-머캅토프로피온산(S-(N-Phenylthiocarbamoyl)-3-mercaptopropionic acid)

S-(페닐티오아세틸)티오글리콜산(S-(Phenylthioacetyl)thioglycolic acid)

S-(N-페닐티오카르바모일)티오글리콜산(S-(N-Phenylthiocarbamoyl)thioglycolic acid)

S-(3-페닐티오프로피오닐)티오글리콜산(S-(3-Phenylthiopropionyl)thioglycolic acid)

N-글리콜산 페닐 우레탄(N-Glycolic Acid phenyl urethane)

(D,L)-티오르판((D,L)-Thiorphan)

(페닐티오)아세트산((Phenylthio)acetic acid)

(2-니트로페닐티오)아세트산((2-Nitrophenylthio)acetic acid)

S-(티오라우로일)티오글리콜산염(S-(Thiolauroyl)thioglycolate)

디설피람(disulfiram)

아황산나트륨(Sodium sulfite)

4-페닐-3-부테노산(4-phenyl-3-butenoic acid, PBA)

티오프로닌(tiopronin)

캡토프릴(Captopril)

EDTA

아황산암모늄(Ammonium sulfite)

히드로시나모일-페닐알라닐-호모시스테인(Hydrocinnamoyl-phenylalanyl-homocysteine).

위에 쓰인 바대로, 상기 PAM 억제제들의 생리학적 동등제도 역시 본 발명의 범위 안에 포함된다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 발현은 이종 단백질 발현이다.

본 발명의 다른 바람직한 실시예에서, 상기 이종 발현은 포유동물 세포를 기초로 한 발현 시스템에서 일어난다. 바람직하게는, 발현되는 단백질은 다음으로 구성되는 그룹에서 선택되는 적어도 하나의 단백질이다:

항체, 또는 항체의 일부 또는 파생물,

융합단백질, 및/또는

비항체 단백질.

바람직하게는, 본 발명의 방법 및 배지는 다음 단백질 중 하나의 전부 또는 일부와 동일하거나 상당히 유사한 아미노산 서열을 가지는 단백질의 (재조합) 생산에 적합하다: Flt3 리간드, CD40 리간드, 에리스로포이에틴(erythropoietin, EPO), 다르베포에틴 알파를 포함하는 다르베포에틴(darbepoetin), 및 트롬보포이에틴과 같은 적혈구 생산 촉진 단백질, 칼시토닌, 렙틴, Fas 리간드, NF-카파 B 수용체 작용제 리간드(ligand for receptor activator of NF-kappa B, RANKL), 종양 괴사 인자(tumour necrosis factor, TNF)-관련 사멸 유도 리간드(TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL), 흉선 기질 유래 림포포이에틴, 과립구 콜로니 자극인자, 과립구-대식구 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), 비만세포 성장인자, 줄기세포 성장인자, 상피성장인자, 각질세포 성장인자, 대핵세포(megakaryote) 성장인자 및 발달인자(development factor)를 포함하는 성장인자, RANTES, 성장호르몬, 인슐린, 인슐리노트로핀, 인슐린양 성장인자, 부갑상선 호르몬, 알파 인터페론, 베타 인터페론 및 감마 인터페론을 포함하는 인터페론, 신경 성장인자, 뇌유래 향 신경성 인자, 시냅토태그민양 단백질(synaptotagmin-like proteins 1-5, SLP1-5), 뉴로트로핀-3" 글루카곤, IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17 및 IL-18를 포함하는 인터루킨, 콜로니 자극인자, 림포톡신-p, 종양 괴사인자(TNF), 백혈병 억제인자, 온코스타틴-M, 및 세포 표면 분자 ELK 및 Hek에 대한 다양한 리간드(예컨대 eph-연관 키나제 또는 LERKS 리간드).

본 발명의 방법 및 배지를 이용하여 생산될 수 있는 단백질에는 또한, 앞서 말한 임의의 단백질들의 수용체의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 단백질과, 앞서 말한 임의의 단백질들의 수용체에 대한 억제제, 및 그러한 수용체 또는 억제제에 실질적으로 유사한 단백질이 포함될 수 있다.

또한 본 발명의 방법 및 배지를 이용하여 생산될 수 있는 단백질에는, 분화항원(CD 단백질이라 불림)의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 단백질, 또는 그것들의 리간드 또는 그것들의 리간드와 실질적으로 유사한 단백질을 포함될 수 있다. 이러한 항원의 예를 들면, CD20, CD22, CD27, CD30, CD39, CD40, 및 이에 결합하는 리간드를 포함하는 분화항원을 들 수 있다.

효소활성을 가지는 단백질 또는 그것의 리간드 또한 본 발명의 방법 및 배지를 이용하여 만들어질 수 있다. 예를 들면, 뒤에 나오는 단백질, 또는 그것의 리간드 또는 이것들 중 하나에 실질적으로 유사한 단백질이다: 메탈로프로티나제-디신테그린(metalloproteinase-disintegrin) 족 구성원, 키나제, 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 조직 플라스미노겐 활성자(tissue plasminogen activator), 인자 VIII, 인자 IX, 아포지단백 E, 아포지단백 A-1, 글로빈들, IL-2 억제제, 알파-1 안티트립신, TNF-알파 전환효소, 앞서 언급한 효소 중 하나에 대한 리간드 및 수많은 다른 효소 및 그의 리간드.

본 발명의 방법 및 배지는 또한, 특정 표적 단백질에 결합하거나 그것의 활성을 조절하도록 시험관(in vitro)에서 선택된 키메라 단백질, 및 항체 또는 그것들의 일부 및 키메라 항체, 즉 하나 또는 그 이상의 쥐 항체 면역 글로불린의 가변 영역에 결합된 인간 항체 면역글로불린의 불변 영역을 가지는 항체, 또는 그 단편 또는 그와 실질적으로 유사한 단백질을 생산하도록 쓰일 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 항체 및, 세포독성 또는 발광성 물질을 포함하는 결합물질(conjugates)을 생산하는데 쓰일 수 있다. 본 발명의 방법 및 배지를 이용하여 만들어질 수 있는 항체, 시험관 선택된 키메라 단백질, 또는 항체/세포독성물질 또는 항체/발광분자(luminophore)의 결합체는, 예를 들면, 상기 언급된 단백질 및/또는 다음의 항원들 중 선택된 하나 또는 조합이 포함되지만 그에 한정하는 것은 아니다: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80(B7.1), CD86(B7.2), CD147, IL-la, IL-1, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-2 수용체, IL-4 수용체, IL-6 수용체, IL-13 수용체, IL-18 수용체 서브유닛, PDGF-베타 및 그것들의 유사체(analogue), VEGF, TGF, TGF-베타2, TGF-p1, EGF 수용체 VEGF 수용체, 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor), 오스테오프로테게린(osteoprotegerin) 리간드, 인터페론 감마, B 림프구 자극제, C5 보체, IgE, 종양 항원 CA125, 종양 항원 MUC1, PEM 항원, ErbB2/HER-2, 환자의 혈청에서 수치가 상승하는 종양-관련 에피토프, 유방, 직장, 편평상피세포, 전립선, 췌장, 폐, 및/또는 신장암 세포 및/또는 흑색종, 신경교종, 또는 신경아세포종 세포에서 발현되는 종양-관련 에피토프 또는 단백질, 종양의 괴사 중심부(necrotic core), 인테그린 알파 4 베타 7, 인테그린 VLA-4, B2 인테그린, TRAIL 수용체 1,2,3, 및 4, RANK, RANK 리간드, TNF-알파, 부착분자 VAP-1, 상피세포 부착분자(EpCAM), 세포간 부착분자-3(ICAM-3), 루코인테그린 아데신(leukointegrin adhesin), 혈소판 당단백질 gp IIb/IIIa, 심장 미오신 중쇄, 부갑상선 호르몬, MHC I, 암배항원(carcinoembryonic antigen, CEA), 알파페토단백(alpha-fetoprotein, AFP), 종양괴사인자(TNF), Fc-y-1 수용체, HLA-DR 10 베타, HLA-DR 항원, L-셀렉틴, 및 IFN-감마.

본 발명의 방법 및 배지는 또한 앞서 언급된 단백질 또는 실질적으로 유사한 단백질 중 임의의 것을 포함하는 재조합 융합 단백질을 생산하는데 쓰일 수 있다. 예를 들어, 상기 언급된 단백질 중 적어도 하나의 단백질에, 루신 지퍼(leucine zipper), 작살구조(coiled coil), 항체의 Fc 부분, 또는 실질적으로 유사한 단백질과 같은 멀티머화(multimerisation) 도메인을 더한 재조합 융합단백질이 본 발명의 방법 및 배지를 써서 만들어질 수 있다. 이러한 재조합 융합 단백질에는 특히 TNFR 또는 RANK의 적어도 일부가 항체의 Fc 부분에 융합된 단백질이 포함된다.

바람직한 일 실시예에서, 상기 포유류 세포를 기초로 한 발현 시스템은 다음으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상이다:

아기 햄스터 신장세포주(예:BHK21)

중국 햄스터 난소세포주(예: CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DXB, 또는 CHO-dhfr^-)

쥐(murine) 골수종 세포주(예: SP2/0)

마우스 골수종 세포주(예: NS0)

인간 배아 신장세포주(예: HEK-293)

인간 망막 유래 세포주(예: PER-C6), 및/또는

양수세포주(예:CAP).

바람직하게는, 햄스터 세포를 기초로 한 발현 시스템을 이용할 수 있다. BHK21("아기 햄스터 신장") 세포는 시리아 햄스터 세포의 유사 이배체(quasi diploid)로 확립된 세포주에 속하며, 신생 햄스터 신장 조직의 비정상적으로 빠르게 자라는 일차 배양군으로부터의 클론에서 유래된 것이다. 본 발명의 범위 안에서 쓰일 수 있는 상업적으로 이용가능한 BHK-21 세포주의 비제한적인 예로 BHK-21(C-13); BHK21-pcDNA3.1-HC; BHK570; Flp-In-BHK 세포주; 및/또는 BHK 21(클론 13) 햄스터 세포주가 있다.

중국 햄스터 난소(CHO) 세포는 중국 햄스터의 난소에서 유래된 세포주이다. 이것은 생물학 및 의학 연구에서 종종 쓰이고 치료용 단백질의 상업적 생산에 쓰인다. 그것은 1960년대에 도입되었고, 원래 단일층 배양군으로 자란다. 오늘날, CHO 세포는 재조합 단백질 치료제의 산업적 생산을 위한 포유세포 숙주 중 가장 널리 쓰이고 있고, 보통 부유 배지(suspension culture)에서 자란다.

본 발명의 범위 내에서 쓰일 수 있는 상업적으로 이용가능한 CHO 세포주의 비제한적 예는 FreeStyle™ CHO-S 세포; ER-CHO 세포주; CHO 1-15 500 CHINESE HAM; CHO-DXB, CHO-dhfr-, CHO DP-12 클론#1934; CHO-CD36; CHO-ICAM-1; CHO-K1; 난소; HuZP3-CHOLec3.2.8.1; xrs5; CHO-K1/BB2 세포; CHO-K1/BB3 세포; CHO-K1/EDG8/G알파 15 세포; CHO-K1/M5 세포; CHO-K1/NK1 세포; CHO-K1/NK3 세포; CHO-K1/NMUR1 세포; CHO-K1/NTSR1 세포; CHO-K1/OX1 세포; CHO-K1/PAC1/G알파 15 세포; CHO-K1/PTAFR 세포; CHO-K1/TRH1 세포; CHO-K1/V1B 세포; 5HT1A G알파-15-NFAT-BLA CHO-K1 세포주; AVPR2 CRE-BLA CHO-K1 세포주; SFM 적응 CHO-S 세포; DG44 세포; Flp-In-CHO 세포주; GeneSwitch-CHO 세포주; NFAT-bla CHO-K1 세포주; T-REx-CHO 세포주; GenoStat CHO K-1 안정화(stable) 세포주; GenoStat CHO K-1 안정화 세포주 키트; CHO-K1 세포주 햄스터, CHO-PEPT1 세포주이다. 특히 바람직한 실시예에서, 햄스터 세포를 기초로 한 발현 시스템은 CHO-dhfr-세포주이다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 방법은 아래의 것으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오리액터 또는 배양 용기에서 이루어진다:

쉐이크 플라스크

T-플라스크

주머니(bag)

롤러 보틀(roller bottle)

바이오리액터, 및/또는

스피너 플라스크(spinner flask).

바람직하게는, 상기 바이오리액터 또는 배양 용기는 50㎖에서 40000ℓ사이의 부피를 가진다. 표준 바이오리액터 또는 배양 용기 크기의 예: 50 ㎖(예: 쉐이크 플라스크 또는 T-플라스크), 500㎖, 2ℓ, 5ℓ, 15ℓ, 100ℓ 및 300ℓ(예: 바이오리액터 또는 주머니), 및 1000ℓ, 2000ℓ, 5000ℓ, 10000ℓ, 25000ℓ 및 40000ℓ(대형 바이오리액터).

다른 바람직한 실시예에서, 세포 배양은 부착 배양, 예를 들어 단층 배양으로 실시될 수 있다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 세포 배양은 부유 배지에서 실시될 수 있다.

본 발명은 연속 및 불연속 세포 배양 과정에서 쓰일 수 있다. 다른 알려진 반응기 기술, 예컨대 관류 기술 또는 그와 유사한 기술 또한 쓰일 수 있다. 배치 공정 및 피드배치(fed-batch) 공정이 특히 바람직하다.

PAM 억제제가 아미드화 아미노산 잔기, 특히 C-말단 프롤린 아미드 잔기의 형성에 영향을 미치도록 작용하는 것이 특히 바람직하다.

대부분의 경우, 만들어지는 단백질 내 아미노산 쇄 당 아미드화 아미노산 잔기의 양이 1% 미만인 것이 바람직하다.

본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, PAM 억제제는 4-페닐-3-부테노산(4-phenyl-3-butenoic acid, PBA) 또는 그것의 생리학적 동등제이다.

PBA(트랜스-스티릴-아세트산, 또는 4-PBA으로도 알려짐)는 방선균 스트렙토마이세스 코양겐시스(Streptomyces koyangensis)에 의해 생산되는 약물이고, 항염 및 항진균 효능이 있다고 알려져 있다. 또한, 그것은 혈관확장을 억제하는 것으로 보인다.

본 발명의 개념 안에서, PBA는, C-말단 글리신 잔기의 절단을 억제하는 것으로 보이는데, 즉 PAM 복합체의 한 효소인 펩티딜글리신 알파-히드록실화 모노옥시게나제(Peptidylglycinealpha-hydroxylating monooxygenase, PHM)의 억제제이다.

매우 놀랍게도, 본 발명의 발명자들은, PAM 억제제, 예를 들면 4-페닐-3-부테노산(PBA)이 단독, 또는 하나 또는 그 이상의 다른 약물과 함께, 용량의존적 방식으로 아미드화 아미노산 잔기, 특히 C-말단 프롤린 아미드의 양을 조절 및/또는 조정하기 위해, 세포 배양 공정, 단백질 발현 공정, 세포 배양 배지 및/또는 단백질 발현 배지에서 쓰일 수 있다는 것을 처음으로 밝혀냈다. 이러한 발견을 뒷받침하는 데이터는 여기, 예를 들어 도 1, 도 2 및 도 3과 각 설명부분에 기재하였다.

바람직하게는, 4-페닐-3-부테노산(PBA), 또는 그것의 생리학적 동등체를 0.01μM 이상 300μM(=μMol ℓ^-1) 이하의 농도로 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 농도 범위가 5μM 이상 200μM 이하, 더더욱 바람직하게는 10μM 이상 150 μM 이하, 가장 바람직하게는 45μM 이상 110μM이하이다. 다른 PAM 억제제, 또는 그것의 생리학적 동등체의 경우에는 다른 농도 범위가 적용될 수 있다.

피드용액(feed solution)("샷 용액(shot solution)"이라고도 불림)에서의 농도는 세포 배양 배지, 또는 세포 배양액에서보다 상당히 높을 수도 있는데. 예를 들면 3M(= Mol l^-1)까지이다.

세포 덩어리를 사용하는 경우에는, 4-페닐-3-부테노산(PBA), 또는 그것의 생리적인 동등체가 세포 덩어리 당 0.01mmol/kg 이상 1 mmol/kg 이하의 농도로 쓰일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 농도 범위는 세포 덩어리 당 0.03 mmol/kg 이상 0.5 mmol/kg 이하의 농도 범위이다.

피드용액("샷 용액"이라고도 불림)에서의 농도는 세포 배양 배지 또는 세포 배양액에서보다 훨씬 높을 수 있는데, 즉 피드용액 kg당 0.1 mmol 이상 10 mmol 이하, 바람직하게는 피드용액 kg 당 0.4 mmol 이상 5 mmol 이하이다.

다음 표 1은 다섯 가지 다른 치료제 단백질의 생산에 있어서 PBA가 실제적으로 어떻게 적용되었는지 보여준다.

단백질	PBA 농도		적용된 샷 용액의 양	샷 용액의 적용 모드
	발효시작시	샷 용액
	[mmol/kg cell mass]	[mmol/kg shot solution]
1	0.066	0.440	200 kg/샷, 5 샷	발효 시작 후 적어도 84시간 후, 살아있는 세포 농도가 4.0 E+06 일 때 처음 샷을 했고, 처음 적용 후 24, 48, 72 및 96시간 +/- 2시간 후 적용
2	0.050	0	0	n.a.
3	0.042	0.626	40 kg/샷, 8 샷	살아있는 세포 농도가 5.4 -7.0E+06일 때 첫 샷 그 이후 10일 + 12일이 될 때까지 매일
4	0	4.994	25 kg 1 샷 5kg 5샷	접종 전 첫 샷, 4, 6, 8, 10 및 12일에 2-6샷
5	0	4.994	37,5 kg 1샷 15 kg 5샷	0일에 최종 작업 용적의 1.5%, 4, 6, 8, 10 및 12일에 최종 작업 용적의 0.6%

PAM 억제제, 또는 그것의 생리학적 동등체는 세포 배양 과정을 시작할 때 배지에 첨가될 수 있다. 또는, PAM 억제제, 또는 그것의 생리학적 동등체는 예를 들면, 피드 배지("피드 용액" 또는 "샷 용액"이라고도 불림)의 성분으로서 세포 배양 과정 중에 첨가될 수 있다.

이런 세포 배양 공정에서 얻어진 단백질은 약학적 조제약의 제조에 쓰일 수 있다. 또한, 이러한 세포 배양 공정에서 얻어진 단백질은 약학적으로 허용가능한 계면활성제, 수용제(recipient), 담체, 희석제 및 부형제와 같은 생물학적으로 활성인 다른 약 성분과 함께 투여될 수 있다.

정의

여기에 쓰인 "PAM 억제제"라는 용어는 PAM 효소 복합체의 촉매율을 낮추는 약물을 말한다. 상기 PAM 억제제는 또한 PAM 효소 복합체에 같은 방식으로 영향을 미치거나, 또는 C-말단 글리신 잔기를 자르는 일을 하는 펩티딜글리신 알파-히드록실화 모노옥시게나제(PHM)나, 실제 아미드화 반응을 담당하는 펩티딜아미도-글리콜레이트 리아제(peptidylamido-glycolate lyase, PAL)에 영향을 미칠 수 있다.

여기에 쓰인 용어, "PAM 억제제의 생리학적 동등제"란 생리학적인 세팅을 했을 때(예:세포 배양액), 상기 PAM 억제제들과 같은 잠재적 효능을 가지는 PAM 억제제의 화학적 유도체를 말한다. 상기 동등제로는, 예를 들면 (화학적으로 적절할 때마다) 녹거나 아무 곳에나 존재하는(ubiquitous) 에스테라제에 의해 가수분해되어 배지에서 실제 PAM 억제제로 되는 상기 PAM 억제제들의 염 또는 에스테르이다.

여기에 쓰인 용어 "약학적 제제"란, 포유동물, 특히 사람에게 투여하기에 적당하거나 적합하게 만들어진 조성물을 가리킨다.

"융합 단백질"이란 용어는 여기에서 "융합 펩타이드"와 같은 뜻으로 쓰이며, 원래 별개의 단백질을 코딩하던 두 개 이상의 유전자를 합쳐서 만들어지는 단백질을 의미한다. 이러한 융합 유전자의 번역을 통해 원래의 단백질 각각으로부터 유래한 기능성을 가지는 하나의 폴리펩타이드가 만들어진다. 이 용어의 의미는 키메라 및 인간화 항체뿐만 아니라, 예를 들어 수용체 도메인과 IgG Fc 단편으로 이루어지는 구성체를 포함한다.

여기에 쓰인 용어 "이종 단백질 발현" 및 "이종 단백질"은, 발현 시스템, 예컨대 숙주세포에서 자연적으로는 만들어지지 않는 단백질과 펩타이드를 지칭한다. 후자는 상기 이종 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형되어야 한다.

여기에 쓰인 용어 "항체"는 단클론 항체(mAb), 다중특이적(multispecific) 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 다클론 항체, 낙타화(camelized) 항체, 단일사슬 Fvs(scFv), 단일사슬 항체, 면역학적으로 활성인 항체 단편(예를 들어 에피토프에 결합할 수 있는 항체 단편, 예를 들면 Fab 단편, Fab'단편, F(ab')₂ 단편, Fv 단편, 면역특이적으로 항원에 결합하는 VL 또는 VH 도메인 또는 상보성 결정 영역(complementary determining region, CDR) 등을 가지는 단편, 이중-기능성 또는 다중-기능성 항체, 이황화 결합 이중특이적 Fvs(sdFv), 내부체(intrabody) 및 이체(diabody), 및 상기 언급된 것들의 임의의 에피토프 결합 부분을 지칭한다. 특히 "항체"라는 용어는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 즉 항체 결합 부위를 가지는 분자를 포함하는 개념이다. 면역글로불린 분자는 어떤 유형(예: IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 분류(예: IgG_b IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgAi 및 IgA₂) 또는 하위 분류라도 가능하다.

여기에 쓰인 용어 "비항체 단백질"이란, 항체가 아닌 생리학적으로 활성인 단백질을 말한다. 이러한 정의에는 특히, 인슐린, 소마트로핀, 에리스로포이에틴, 인터페론 알파 또는 G-CSF, 조직 플라스미노겐 활성자(tissue plasminogen activator, tPA), 인자 VIII 및/또는 인터루킨 2, 또는 그것들의 단편 또는 유도체가 포함된다.

여기에 쓰인 용어 "항체의 단편(부분)"은, 특정한 경우에는, 특정 항체성, 예를 들면 표적 결합능을 가지는 이러한 항체의 단편을 일컫는다. 이러한 단편의 예는 다음과 같다:

CDR(complementarity determining region)

고가변영역(hypervariable region),

가변 도메인(Fv),

IgG 중쇄(VH, CH1, 힌지, CH2 및 CH3 영역으로 구성)

IgG 경쇄(VL 및 CL 영역으로 구성), 및/또는

Fab 및/또는 F(ab)2.

여기에서, "항체의 유도체"라는 용어는 통상의 항체 개념과 구조적으로는 다르지만, 일부 구조적인 연관성을 가지고, 몇 가지 기능성을 보유하는 단백질 구성체를 가리키는데, 예를 들면 scFv, 또한 이중-, 삼중-(또는 그 이상) 특이적 항체 구성체, 페길화(pegylated) 항체 구성체 및 그와 유사한 것들을 가리킨다.

유사한 개념이 본 발명의 의미 중에서 "단백질의 단편 또는 유도체"에도 적용된다.

여기에 쓰인, "세포 배양 배지"라는 용어는 세포를 배양하는 환경에서 쓰는 모든 종류의 배지를 지칭한다. 전형적으로, 세포 배양 배지는 아미노산, 에너지원으로서 적어도 하나의 탄수화물, 미량원소, 비타민, 소금 및 가능한 추가 성분(예: 세포의 성장 및/또는 생산성 및/또는 생산물의 품질에 영향을 미치기 위함)을 포함한다.

여기에 쓰인, "피드(feed)", "피드배지", "피드용액"이란 용어는 어떤 종류의 세포 배양 배지 또는, 통상 세포의 성장 및/또는 생산성 및/또는 생산물의 품질에 영향을 미치기 위해 세포 배양 과정에서 세포 배양군에 보충제로서 첨가되는 특정 성분의 용액을 가리킨다.

여기에 쓰인, "세포 배양액"은 세포들이 자라고 있는 실제 액체를 가리킨다. 이것은 상기 액체가, 위의 정의에 따른 세포 배양 배지 또는 피드에 반해, 세포에 의해 만들어진 대사체, 세포 잔해, 세포 단백질(예: 효소, 또는 재조합 단백질) 및/또는 상기 PAM 억제제의 분해물을 포함할 수 있고, 또한 그것의 영양분은 감소될 수 있는 것을 의미한다.

여기에 쓰인, "아미드화 아미노산 잔기의 양"이라는 용어는 단백질의 C-말단에서 단백질 발현 중 또는 후에 만들어지는 아미드화 아미노산 잔기를 말한다. 이것은 특히, 아미드화 프롤린의 양과 관련이 있다. 특정 환경에서, 단백질 내의 프롤린 잔기는, 예를 들면 프롤린 아미드(Pro-NH₂)가 만들어지는 것처럼 번역 후에 아미드화될 수 있다. 기준 단백질에 비해 만들어진 단백질 내의 프롤린 아미드의 양이 높거나 낮은 경우와 같이 특정한 경우는 바람직하지 않다.

PAM 효소 복합체에 의해 영향을 받는 프롤린 아미드화는 기본적으로 번역된 단백질의 Pro와 R 사이의 C-말단 펩타이드 결합의 가수분해와 산화에 의존하는데, 여기서 R은 하나 이상의 아미노산 잔기일 수 있고, 예를 들면, Gly, Leu, Ile, Val, 또는 Phe, 또는 Gly-Lys일 수 있다. 이 반응은 대부분의 경우 PAM 효소 복합체(상기 참조)에 의해 촉진된다. 발현 숙주 및 단백질 발현 조건에 따라서, 번역된 단백질에서 적어도 하나의 번역 후 Pro-NH₂를 포함하는 비율은 0% 이상, 100% 이하의 범위일 수 있다. 상기 아미드화는 단백질의 pH를 높이며, 따라서 염기성 변이체가 되도록 한다.

단클론항체 또는 그 유도체에서, 프롤린 아미드(proline amide, PA)는 전형적으로 라이신 및 글리신의 C-말단의 번역 후 제거 및 그 후 남은 프롤린 잔기의 C-말단의 아미드화에 의해, 예를 들면 단백질의 중쇄에서 형성된다.

프롤린의 아미드화는 여러 단백질, 예를 들어 칼시토닌의 기능에 있어 중요성을 가진다. mAb에서의 그것의 기능은 지금까지 알려지지 않았다.

프롤린 아미드의 양은 전하, 소수성 또는 크기(mass)와 같은 물리-화학적인 차이에 의해 아미드화된 변이체를 아미드화되지 않은 것과 구분함으로써 동정하고 정량화할 수 있다. 가장 일반적인 방법은 프롤린 아미드화 후에 전하가 바뀌는 것을 이용한 CEX-CPB 법(카르복시펩티다제 B를 이용한 분해 후의 양이온 교환 크로마토그래피)과 같은 이온교환 크로마토그래피이다. 항체의 경우, 크로마토그래피 분리 전에 카르복시펩티다제 B 다이제스쳔을 이용하여 라이신 잔기를 제거함으로써 프롤린 아미드 변이체와 라이신 변이체가 함께 용리(co-elution)되는 것을 막을 수 있다. 그러나 기본 단백질(background) 정량치의 몇 퍼센트(예: 4%)까지 다른 염기성 변이체들이 추가로 함께 용리될 수 있다. 기본 단백질과 프롤린 아미드 변이체를 합친, 하나의 C-말단 라이신 잔기를 가진 항체 변이체의 크로마토그래피 조성물을 "슈도 1K(Pseudo 1K)"라 명명한다. "슈도 2K"는 용리된 두 개의 C-말단 라이신 잔기를 가진 항체 변이체 크로마토그래피 조성물에 프롤린 변이체와 기본 단백질을 합친 것이 용리된 것을 포함한다. CEX 법(즉, CPB 분해로 라이신을 제거하지 않은 CEX)과의 차이는 라이신 잔기를 가지는 항체 변이체의 양을 가리키며, "리얼 1K(real 1K)" 및 "리얼 2K"로 명명한다. CEX(-CPB)에 의해 정량하면 용액 내의 전체 항체 분자 대비 프롤린 아미드화 항체의 퍼센티지가 나온다. 확실하게 아미드화 프롤린 변이체를 동정하고 정량할 수 있는 분석 시험 방법은 엔도펩티다제(예:LysC, 트립신)으로 분해한 단백질을 RP-HPLC(reversed-phase high-performance-liquid-chromatography)하는 것으로, UV(자외선) 또는 MS(질량분석) 탐지를 이용하는, 펩타이드 매핑이라고도 불린다. RP-HPLC 펩타이드 매핑에 의한 정량을 통해 전체 중쇄 대비 프롤린 아미드화 중쇄 항체의 퍼센티지가 나온다.

"슈도 1K"는 CEX-CPB에 의해 측정된 변이체로, 여기서 항체(IgG)의 두 개의 중쇄 중 하나는 그것의 C-말단에 프롤린 아미드를 가진다. "슈도 2K"는 단클론 항체의 두 개의 중쇄가 C-말단에 프롤린 아미드를 가지는, CEX-CPB에 의해 측정된 변이체이다.

여기에 쓰인, 주어진 약물의 "농도"라는 용어는 세포 배양 배지(예: 세포 배양 배지, 피드배지, 피드용액), 또는 세포배양액 내의 농도에 관한 것이다.

디스클레이머(Disclaimer)

명세서를 과도하게 길게 만들지 않고 광범위한 기술 공개를 하기 위해 본 발명의 출원인은 명세서에 언급한 특허 및 특허출원을 여기에 참고문헌으로서 포함시킨다.

상기 설명된 실시예에 기재된 구성의 특정 조합 및 특징은 오직 예시적인 것이다; 본 명세서 및 참고문헌으로 포함된 특허/출원의 가르침들은 다른 가르침들과 바꾸거나 대체할 수 있으며, 참고문헌으로 포함된 특허/출원 또한 확실히 고려할 수 있다. 본 발명이 속하는 분야의 숙련자들은, 본 발명에서 청구된 발명의 개념 및 범위에서 벗어나지 않으면서 당업자가 여기에 설명된 것들을 변화시키고, 변형하며 다르게 실시할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서 앞의 설명들은 오직 예시일 뿐이며 한계를 지으려는 의도는 없다. 본 발명의 범위는 뒤의 청구항 및 그것의 균등범위에 의해 정해진다. 또한, 명세서 및 청구항에 쓰인 참고문헌 표시는 청구된 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.

실시예 및 도면에 대한 간단한 설명

본 발명품의 추가적인 상세사항, 특징, 특성 및 장점이 종속항 및 각 도면과 실시예의 상세한 설명에, 예시적인 방법으로, 언급되었고, 본 발명의 바람직한 실시예를 보여준다. 그러나, 이 도면들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

실험예: 아미노산 아미드화/프롤린 아미드 형성에 미치는 PAM 억제제의 효과

실험에서, 본 발명자들은 알려진 PAM 억제제들이 잠재적인 배지 성분이라는 것에 초점을 맞췄다. 그 중에서 선별된 성분들은, 즉, 아황산염, 티오프로닌, 캡토프릴, EDTA, 아황산암모늄, L-히스티딘, D-히스티딘, 암모늄 메타 티오몰리브데이트, L-카르노신, 페니실라민, 4-페닐-3-부테노산(PBA)이다.

아미노산 아미드화/프롤린 아미드 형성에 미치는 PAM 억제제의 효과를 연구하기 위해서 두 개의 재조합 단백질, 즉, 단클론 항체(인간-마우스-키메라 IgG) 및 Fc-융합 단백질을 사용했다. CHO 세포를 발현 시스템으로 사용했다.

PBA가 프롤린 아미드 형성에 가장 강력한 영향을 보였고, 성장이나 다른 생산물 품질에 심각한 영향을 미치지는 않았다.

이 결과를 바탕으로, 본 발명자들은 PBA의 첨가(예:100 μM)를 통해 세포 배양 배지를 개조할 수 있다는 결론을 내렸다. 또한, PBA를 배지 뿐 아니라 피드용액에 첨가할 수도 있다. 예를 들면, PBA 없이, 또는 저농도의 PBA와 함께 배양을 시작해서, 세포 배양군이 최고 세포 밀도에 이른 후이나 아직 주요량의 재조합 단백질이 생산되기 전에 더 많은 양의 PBA를 첨가할 수 있다. 이렇게 함으로써, 성장기 동안 최종량의 PBA가 존재하는 경우에 비해 더 높은 최고 세포 밀도 및 수확시 더 많은 양의 생산물을 거둘 수 있다.

참고문헌

Chew, G: Substrate-Based Inhibitors of Peptidylglycine Amidating Monooxygenase (PAM) as Anti-Proliferative Drugs for Cancer. Master Thesis (University of South Florida), 2003

Bauer et al (2007): Anti-Inflammatory Effects of 4-Phenyl-3-butenoic Acid and 5-(Acetylamino)-4-oxo-6-phenyl-2-hexenoic Acid Methyl Ester, Potential Inhibitors of Neuropeptide Bioactivation J Pharmacol Exp Ther March 2007 320:1171-1177

Claims

피드 및 펩티딜글리신 알파 아미데이팅 모노옥시게나제(PAM) 억제제를 포함하는
단백질의 이종 발현용 세포 배양 배지.
세포 배양 배지 내에서 세포를 배양하는 단계를 포함하며,
상기 세포 배양 배지는 피드 및 펩티딜글리신 알파 아미데이팅 모노옥시게나제(PAM) 억제제를 포함하는
단백질의 이종 발현을 위한 세포 배양 방법.
제1항에 있어서, 상기 발현은 이종 단백질 발현인 세포 배양 배지.
제3항에 있어서, 상기 이종 단백질 발현은 포유동물 세포를 기초로 한 발현 시스템에서 일어나는 것인 세포 배양 배지.
제1항에 있어서, 상기 단백질은 다음으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나인 세포 배양 배지:
항체, 또는 항체의 단편 또는 유도체,
융합 단백질, 및
비-항체 단백질.
제4항에 있어서, 상기 포유동물 세포를 기초로 한 발현 시스템은 다음으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나인 세포 배양 배지:
아기 햄스터 신장세포주,
중국 햄스터 난소세포주,
쥐 골수종 세포주,
마우스 골수종 세포주,
인간 배아 신장세포주,
인간 망막 유래 세포주, 및 양수세포주.
삭제
제1항에 있어서, 상기 PAM 억제제는 4-페닐-3-부테노산(4-phenyl-3-butenoic acid, PBA)인 세포 배양 배지.
제8항에 있어서, 상기 4-페닐-3-부테노산(PBA)는 0.01μM 이상 3M 이하의 농도로 쓰이는 것인 세포 배양 배지.
제2항에 있어서, 상기 발현은 이종 단백질 발현인 방법.
제10항에 있어서, 상기 이종 단백질 발현은 포유동물 세포를 기초로 한 발현 시스템에서 일어나는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 단백질은 다음으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나인 방법:
항체, 또는 항체의 단편 또는 유도체,
융합 단백질, 및
비-항체 단백질.
제11항에 있어서, 상기 포유동물 세포를 기초로 한 발현 시스템은 다음으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나인 방법:
아기 햄스터 신장세포주,
중국 햄스터 난소세포주,
쥐 골수종 세포주,
마우스 골수종 세포주,
인간 배아 신장세포주,
인간 망막 유래 세포주, 및 양수세포주.
제2항에 있어서, 상기 PAM 억제제는 아미드화 아미노산 잔기의 형성에 영향을 미치도록 작용하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 PAM 억제제는 4-페닐-3-부테노산(4-phenyl-3-butenoic acid, PBA)인 방법.
제15항에 있어서, 상기 4-페닐-3-부테노산(PBA)는 0.01μM 이상 3M 이하의 농도로 쓰이는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 방법은 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오리액터 또는 배양 용기에서 실시되는 것인 방법.
쉐이크 플라스크(shake flask),
T-플라스크(T-flask),
롤러보틀(roller bottle),
주머니(bag),
바이오리액터(bioreactor), 및
스피너 플라스크(spinner flask).