CN107617123A - 用于形成生物粘附基质的制剂和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本申请涉及用于形成生物粘附基质的制剂和试剂盒。公开了包含明胶、藻酸盐和偶联剂，能够形成生物粘附基质的生物粘附制剂，其特征为快速固化、最佳粘度、高粘合强度、柔性、生物相容性和生物可降解性。还公开了还包含生物活性剂的这样的生物粘附制剂，以及由其形成的药物洗脱生物粘附基质，所述生物粘附基质能够递送生物活性剂至身体部位。还公开了在各种生物和医学程序中利用生物粘附制剂和基质的方法。

Description

用于形成生物粘附基质的制剂和试剂盒

本申请是申请日为2013年2月14日，申请号为201380020118.4，发明名称为“用于形成生物粘附基质的制剂和试剂盒”的申请的分案申请。

发明领域和背景

本发明，在其一些实施方案中，涉及生物粘附基质，且更具体地，但不排他地，涉及生物粘附基质、用于形成生物粘附基质的制剂和试剂盒，以及其用于粘附两个或更多个对象，包括生物对象诸如有生命力的组织、器官以及类似的对象的用途。

在最近几年，已发展了对用生物粘附基质(在本领域中还称为生物粘附组合物)代替或增加缝合线和缝合钉的增加的兴趣。该增加的兴趣的原因包括以其可实现内部手术程序的潜在速度；粘结物质达到完全封闭，从而防止流体渗漏的能力；处理的组织形成粘结而没有过度变形的可能性；避免需要拆线；引起患者较少疼痛；其应用需要较简单设备，该设备不对从从业者呈现锐器的损伤风险；其提供了较小的疤痕；并且降低感染的可能性。生物粘附剂还可被用于密封空气和体液泄漏，其可偶尔抵抗常规缝合线或缝合技术；用于局部伤口愈合；修复主动脉壁夹层；以及用于某些装置的内部和/或外部固定。

如同任何粘合剂基质，生物粘附基质在固化相应制剂后形成。因此，将制剂施加到，例如，生物对象，并且当经历混合、固化引发剂或其他固化引发条件时，固化从而得到生物粘附基质。

为了使生物粘附基质可接受，其必须具有一些特性，诸如生物相容性和生物可降解性，以及固化后的最佳结合强度和弹性。此外，生物粘附基质应设计成使得相应的制剂呈现用户友好的稠度和固化/粘接时间。更具体地，生物粘附制剂应呈现最佳的初始粘度和粘性，以允许足够和方便的应用；不太流动以免从伤口边缘流走，且不太粘稠，以免干扰均匀和合理施药，并同时以短固化/凝胶化时间迅速凝固，然而，不太短的固化/凝胶化时间，从而允许顺利应用到期望的部位。此外，生物粘附制剂/基质应呈现在体液的湿条件下迅速粘接至活组织的能力；生物粘附基质应形成桥，通常可渗透柔性桥；并且生物粘附制剂、基质和/或其代谢(降解)产物应不会导致局部毒害组织(histotoxic)或致癌效应，而不干扰身体的自然愈合机制。

生物粘附剂可被用于许多外科手术过程，包括角膜穿孔、外阴切开术、剖腹产情况、唇裂、皮肤和骨移植术、肌腱修复、疝气、甲状腺手术、牙周手术、牙龈切除术、牙植入、口腔溃疡、胃静脉曲张、内部器官诸如肝和胰的伤口、外部和内部医疗器械的附着和固定以及更多。

使用适当的生物粘附材料代替传统的打钉和镀覆方法(plating method)固定断裂的硬组织也被认为是有吸引力的技术。优势包括提供从一个断裂侧面至另一个断裂侧面的最佳负荷转换，避免应力遮蔽现象，以及修复小或薄的骨碎片的能力。然而，尽管有明确的医疗需要，至今不存在可用于临床应用的硬组织生物粘附产品。

作为组织粘合剂或组织密封剂有用的几种材料是当前可用的。

当前可用的一类粘合剂是氰基丙烯酸酯粘合剂。氰基丙烯酸酯，诸如2-辛基氰基丙烯酸酯，称为对组织形成强大的粘合，使快速止血成为可能，并且具有与存在于生物表面的流体接触时聚合的能力。然而，发现氰基丙烯酸酯粘合剂是细胞毒性的，预固化的粘合剂制剂的粘度过低，且固化的氰基丙烯酸酯基体是刚性的并不可生物降解的，干扰正常的伤口愈合。因此，非最佳粘度、高挠曲模量和动物实验中癌症的报道限制使用氰基丙烯酸酯表面施用在口腔黏膜以及危及生命的动静脉上。

其他已知的生物粘附制剂是基于明胶-间苯二酚-甲醛，其中明胶和间苯二酚的混合物在通过加入甲醛的几十秒内温热和交联。从此类制剂形成的生物粘合剂的优势是足够的粘结强度；然而，细胞毒性遮蔽了该优势。

用作组织封闭剂的另一种类型的当前可用的生物粘附利用源自牛和/或人类来源的组分。例如，基于纤维蛋白的粘合剂制剂通常通过将纤维蛋白原和因子XIII的溶液与凝血酶和CaCl₂的溶液混合来制备。将两种溶液通过配备了混合喷嘴的双注射器施加，并且该反应类似于血液凝固中白色纤维蛋白凝块。商购可得的实例包括Baxter和Ethicon Crosseal^TM。基于纤维蛋白的生物粘附基质的优势包括止血效应、生物可降解性、对结缔组织的良好粘附力和促进伤口愈合。如同使用任何人类起源的产物，缺点包括低强度(粘合和凝聚)、低粘度(难于仅应用于期望的部位)和感染的风险。在美国，纤维蛋白粘合剂从患者自身的血液制备，以防止污染；然而，该过程耗时且昂贵。其他限制因素包括在手术后几日可复发的肺手术中的空气泄漏，可能由于纤维蛋白粘合剂桥的过快的吸收。

其他已知的生物粘附剂是基于蛋白的组织粘附剂，其基于白蛋白或明胶。还描述了加入多胺，特别是聚(赖氨酸)或壳聚糖、或聚羧酸盐/酯，特别是柠檬酸或聚(丙烯酸)，以增加交联的速率。然而，此类生物粘合剂通常特征为不足的生物相容性和强度。

Sung等人[Journal of Biomedical Materials Research,卷46，期4，520–530页，15September 1999]报道了评价各种生物粘附制剂，包括基于明胶、藻酸盐和碳二亚胺的制剂。然而，由Sung等人报道的制剂，是基于约600mg/ml明胶含量或更高，其不提供可行的生物粘附制剂。

另外的背景技术包括美国专利申请号20030083286、20040156794、20060013873、20090098176、US20090099149和20110280952，以及美国专利号5,284,659和5,955,502，以及Hsu,S.等人，Biorheology,2007.44(1):17-28页；Otani,Y.等人,Biomaterials,1996.17(14):1387-1391页；Bae,S.K.等人,Journal of Adhesion Science and Technology,2002.16(4):361-372页；Mo,X.等人，Journal of Biomaterials Science,PolymerEdition,2000.11(4):341-351页；McDermott,M.K.，等人,Biomacromolecules,2004.5(4):1270页；Mo,X.等人，Journal of Biomedical Materials Research Part A,2010.94(1):326-332页；以及Okino,H.，等人，Journal of Biomedical Materials Research Part A,2002.59(2):233-245页。

发明概述

本发明人已设计并成功地制备和实践了能够形成生物粘附基质的新颖生物粘附制剂，其特征为快速固化、最佳的粘度、高粘合强度、柔性、生物相容性和生物可降解性。

本文中呈现的生物粘附制剂包括明胶、藻酸盐和偶联剂，并且还可包括生物活性剂，用于形成药物洗脱生物粘附基质(drug-eluting bioadhesive matrices)。

因此呈现的生物粘附制剂和基质可有利地用于各种生物和医学程序。

因此，根据本发明的一些实施方案的方面，提供了生物粘附制剂，其包含明胶、藻酸盐、偶联剂、水和至少一种生物活性剂；该制剂特征为范围从1Pa-sec至50Pa-sec的室温粘度。

在一些实施方案中，生物粘附制剂意图在固化后形成药物洗脱生物粘附基质，其中用于形成该基质的固化时间范围为从5秒至30分钟。

在一些实施方案中，生物粘附制剂是使得基质特征为以下的至少一个：

范围从2,000帕至60,000帕的有生命力的生物对象的粘合强度；

生理条件下范围从0.5Mpa至200MPa的挠曲强度；以及

范围从7天至6个月的生物可降解速率。

根据本发明的一些实施方案的另一个方面，提供了生物粘附制剂，其包含明胶、藻酸盐、偶联剂、和水；该制剂特征为范围从1Pa-sec至50Pa-sec的室温粘度。

在一些实施方案中，本文描述的任何制剂中的明胶的浓度范围为从50mg/ml至500mg/ml。

在一些实施方案中，本文描述的任何制剂中的藻酸盐的浓度范围为从5mg/ml至100mg/ml。

在一些实施方案中，本文描述的任何制剂中的偶联剂的浓度范围为从1mg/ml至50mg/ml。

在一些实施方案中，明胶的浓度范围为从200mg/ml至300mg/ml，藻酸盐的浓度范围为从20mg/ml至40mg/ml，且偶联剂的浓度范围为从10mg/ml至30mg/ml。

在一些实施方案中，如本文描述的生物粘附制剂还包括选自由以下组成的组的交联促进剂：NHS-酯、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、磺基-NHS、HOBt、HOAt、HBtU、HCtU、HAtU、TBtU、PyBOP、DIC和五氟苯酚。

在一些实施方案中，本文呈现的生物粘附制剂还包括如本文描述的填料。

在一些实施方案中，如本文描述的生物粘附制剂被鉴定为用于将至少两个对象彼此粘合，该对象中的至少一个为生物对象。

在一些实施方案中，如本文描述的生物粘附制剂在离体、体外或原位制备。

根据本发明的一些实施方案的另一个方面，提供了如本文呈现的生物粘附制剂在制造用作生物粘附基质的产品中的用途，并且，如果该制剂包含生物活性剂，用作药物洗脱生物粘附基质。

根据本发明的一些实施方案的另一个方面，提供了如本文呈现的制剂在制造用于将至少两个对象彼此粘合的产品中的用途，该对象中的至少一个为生物对象。

根据本发明的一些实施方案的另一个方面，提供了通过固化本文呈现的制剂形成的生物粘附基质。

根据本发明的一些实施方案的另一个方面，提供了通过制备本文呈现的包括生物活性剂的制剂，并允许经过固化时间而形成的药物洗脱生物粘附基质。

根据本发明的一些实施方案的另一个方面，提供了包括如本文呈现的生物粘附制剂的试剂盒。

根据本发明的一些实施方案的另一个方面，提供了形成生物粘附基质或药物洗脱生物粘附基质的方法，该方法通过制备如本文呈现的制剂并允许经过固化来进行。

在一些实施方案中，该方法还包括：将制剂施加在对象的至少一个上；并且邻接对象。

根据本发明的一些实施方案的另一个方面，提供了将至少两个对象彼此粘合的方法，该对象中的至少一个为生物对象，该方法通过以下来进行：制备如本文呈现的制剂；将该制剂施加在对象的至少一个上；邻接对象；并允许经过固化时间。

根据本发明的一些实施方案的另一个方面，提供了包括彼此共价偶联的明胶和藻酸盐的生物粘附基质。

在一些实施方案中，基质还包括封存在其中的至少一种生物活性剂，由此形成药物洗脱生物粘附基质。

在一些实施方案中，本文描述的任何生物粘附基质特征为以下的至少一个：

范围从2,000帕至60,000帕的有生命力的对象的粘合强度；在生理条件下范围从0.5Mpa至200MPa的挠曲强度；以及范围从7天至6个月的生物可降解速率。

在一些实施方案中，任何生物粘附基质通过制备本文中呈现的生物粘附制剂，并允许经过固化时间来形成。

在一些实施方案中，制剂的制备发生在离体、体外或原位。

尤其是，本申请提供了以下内容：

项目1.一种生物粘附制剂，所述生物粘附制剂包含：a)明胶；b)藻酸盐；c)偶联剂；和d)水，

其中在所述制剂中所述明胶的浓度小于500mg/ml，所述制剂特征为范围从1Pa-sec至50Pa-sec的室温粘度。

项目2.如项目1所述的生物粘附制剂，所述生物粘附制剂在固化后形成生物粘附基质，其中用于形成所述基质的固化时间范围为从5秒至30分钟。

项目3.如项目2所述的制剂，所述制剂使得所述基质特征为以下的至少一种：范围从2,000帕至60,000帕的有生命力的生物对象的粘合强度；生理条件下范围从0.5Mpa至200MPa的挠曲强度；以及范围从7天至6个月的生物可降解速率。

项目4.如项目1-3的任一项所述的制剂，其中在所述制剂中所述明胶的浓度范围为从100mg/ml至300mg/ml。

项目5.如项目1-4的任一项所述的制剂，其中在所述制剂中所述藻酸盐的浓度范围为从10mg/ml至60mg/ml。

项目6.如项目1-5的任一项所述的制剂，其中在所述制剂中所述偶联剂的浓度范围为从1mg/ml至50mg/ml。

项目7.如项目1-5的任一项所述的制剂，其中所述明胶的浓度范围为从200mg/ml至300mg/ml，所述藻酸盐的浓度范围为从20mg/ml至40mg/ml，且所述偶联剂的浓度范围为从10mg/ml至30mg/ml。

项目8.如项目1-7的任一项所述的制剂，所述制剂还包含交联促进剂。

项目9.如项目8所述的制剂，其中所述交联促进剂为N-羟基琥珀酰亚胺。

项目10.如项目8和9的任一项所述的制剂，其中，相对于在所述制剂中所述偶联剂的量，在所述制剂中所述交联促进剂的浓度范围为从1％至50％。

项目11.如项目10所述的制剂，其中所述明胶的浓度范围为从200mg/ml至300mg/ml，所述藻酸盐的浓度范围为从20mg/ml至40mg/ml，所述偶联剂的浓度范围为从5mg/ml至20mg/ml，且相对于在所述制剂中所述偶联剂的量，所述交联促进剂的浓度范围为从5％至20％。

项目12.如项目1-11的任一项所述的制剂，所述制剂还包含填料。

项目13.如项目12所述的制剂，其中在所述制剂中所述填料的浓度范围为从所述制剂的0.1％w/v至1％w/v。

项目14.如项目1-13的任一项所述的制剂，所述制剂还包含生物活性剂。

项目15.如项目14所述的制剂，其中在所述制剂中所述生物活性剂的浓度范围为从所述制剂的总体积的0.1％重量/体积至10％重量/体积。

项目16.如项目14和15的任一项所述的生物粘附制剂，所述生物粘附制剂用于在固化后形成药物洗脱生物粘附基质，其中用于形成所述基质的固化时间范围为从5秒至30分钟。

项目17.如项目1-16的任一项所述的制剂，所述制剂被鉴定用于将至少两个对象彼此粘合，所述对象中的至少一个为生物对象。

项目18.项目1-16的任一项的生物粘附制剂在制造用作生物粘附基质的产品中的用途。

项目19.项目1-16的任一项的生物粘附制剂在制造用作药物洗脱生物粘附基质的产品中的用途。

项目20.项目1-16的任一项的生物粘附制剂在制造用于将至少两个对象彼此粘合的产品中的用途，所述对象中的至少一个为生物对象。

项目21.一种生物粘附基质，所述生物粘附基质通过制备项目1-16的任一项的制剂并允许经过固化时间来形成。

项目22.如项目21所述的生物粘附基质，所述生物粘附基质还包括在其中封存的生物活性剂，所述生物粘附基质为药物洗脱生物粘附基质，并且通过制备项目14-16的任一项的制剂来形成所述基质。

项目23.一种试剂盒，所述试剂盒包括项目1-16的任一项的生物粘附制剂。

项目24.一种形成生物粘附基质或药物洗脱生物粘附基质的方法，所述方法包括制备项目1-16的任一项的制剂并允许经过固化时间。

项目25.如项目24所述的方法，其中所述生物粘附基质在至少两个对象之间形成，所述对象的至少一个为生物对象。

项目26.如项目24-25的任一项所述的方法，所述方法还包括：将所述制剂应用于所述对象的至少一个上；以及邻接所述对象。

项目27.一种将至少两个对象彼此粘合的方法，所述对象的至少一个为生物对象，所述方法包括：制备项目1-16的任一项的所述制剂；将所述制剂应用于所述对象的至少一个上；邻接所述对象；以及允许经过固化时间。

项目28.如项目26和27的任一项所述的方法，其中所述邻接和/或所述紧固经所述制剂的固化时间实现，以由此形成生物粘附基质。

项目29.一种生物粘附基质，所述生物粘附基质包含彼此共价偶联的明胶和藻酸盐和在其中封存的至少一种生物活性剂。

项目30.如项目29所述的基质，所述基质特征为以下的至少一种：范围从2,000帕至60,000帕的有生命力的生物对象的粘合强度；生理条件下范围从0.5Mpa至200MPa的挠曲强度；以及范围从7天至6个月的生物可降解速率。

项目31.如项目29和30的任一项所述的基质，所述基质被放置在至少两个对象之间，所述对象的至少一个为生物对象。

项目32.如项目29-31的任一项所述的基质，所述基质通过制备项目14-16的任一项的生物粘附制剂并允许经过固化时间来形成。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然类似或等于本文描述的方法和材料的方法和材料可被用于实践或测试本发明的实施方案，但是示例性方法和/或材料描述如下。在冲突的情况下，将以本专利说明书，包括定义为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并非意图必然是限制性的。

附图简述

本发明的一些实施方案在本文中，仅通过示例的方式，参考附图来描述。现将详细地参考特定附图，通过示例的方式并出于说明讨论本发明的实施方案的目的突出显示细节。就这点而言，结合附图的描述使得可如何实践本发明的实施方案对于本领域技术人员变得明显。

在附图中：

图1示出了显示根据本发明的一些实施方案的示例性生物粘附制剂中明胶和藻酸盐浓度对所得的生物粘附基质的粘合强度的效应的比较直方图，其中制剂中EDC的浓度为4mg/ml，明胶浓度变化如下：100mg/ml(左列)、150mg/ml(中列)和200mg/ml(右列)，且藻酸盐浓度变化如下：20mg/ml(黑色柱)、40mg/ml(灰色柱)和60mg/ml(白色柱)；

图2示出了显示根据本发明的一些实施方案的示例性生物粘附制剂中偶联剂(EDC)浓度对所得的生物粘附基质的粘合强度的效应的直方图，制剂中偶联剂(EDC)浓度变化如下：0mg/ml、4mg/ml、10mg/ml、15mg/ml和20mg/ml EDC，其中在制剂中明胶浓度为200mg/ml，且藻酸盐浓度为40mg/ml；

图3示出了显示根据本发明的一些实施方案的示例性生物粘附基质的粘合强度作为通过将明胶-藻酸盐混合物与偶联剂EDC混合形成预固化生物粘附制剂后的时间的函数的散点图，所述示例性生物粘附基质从包含200mg/ml明胶、40mg/ml藻酸盐、和20mg/ml EDC的示例性生物粘附制剂得到；

图4示出了显示水吸收(溶胀率)作为示例性生物粘附基质的浸入时间的函数的散点图，如对从包含200mg/ml明胶、40mg/ml藻酸盐、和20mg/ml EDC的示例性生物粘附制剂获得的根据本发明的一些实施方案的示例性生物粘附基质测量的；

图5示出了显示布比卡因含量对从包含200mg/ml明胶、40mg/ml藻酸盐、和20mg/mlEDC的示例性生物粘附制剂得到的根据本发明的一些实施方案的示例性生物粘附基质的粘合强度的效应的直方图，其中“A”表示无药物样品、“B”表示装载了1％w/v布比卡因的样品、“C”表示2％w/v布比卡因、以及“D”表示装载了3％w/v布比卡因的样品；

图6示出了显示布洛芬含量对从包含200mg/ml明胶、40mg/ml藻酸盐、和20mg/mlEDC的示例性生物粘附制剂得到的根据本发明的一些实施方案的示例性生物粘附基质的粘合的效应的直方图，其中“A”表示无药物样品、“B”表示装载了1％w/v布洛芬的样品、“C”表示2％w/v布洛芬、以及“D”表示装载了3％w/v布洛芬的样品；

图7示出了显示明胶浓度对布比卡因从根据本发明的一些实施方案的示例性生物粘附药物洗脱基质(从包含40mg/ml藻酸盐、20mg/ml EDC、3％w/v布比卡因和两种明胶浓度的示例性生物粘附制剂得到)的释放特性的效应的比较散点图，其中对具有100mg/ml明胶的制剂得到的结果由菱形来标记，以及具有200mg/ml明胶的制剂的结果由矩形来标记；

图8示出了显示藻酸盐浓度对布比卡因从根据本发明的一些实施方案的示例性生物粘附药物洗脱基质(从包含200mg/ml明胶、20mg/ml EDC、3％w/v布比卡因和三种藻酸盐浓度的示例性生物粘附制剂得到)的释放特性的效应的比较散点图，其中对具有20mg/ml藻酸盐的制剂得到的结果由菱形来标记，具有40mg/ml藻酸盐的制剂的结果由矩形来标记，以及具有60mg/ml藻酸盐的制剂的结果由三角形来标记；

图9示出了显示EDC浓度对布比卡因从根据本发明的一些实施方案的示例性生物粘附基质(从包含200mg/ml明胶、40mg/ml藻酸盐、3％w/v布比卡因和五种EDC浓度的示例性生物粘附制剂得到)的释放特性的效应的比较散点图，其中对不具有EDC的制剂得到的结果由圆形来标记，具有4mg/ml EDC的制剂的结果由X来标记，具有10mg/ml EDC的制剂的结果由三角形来标记，具有15mg/ml EDC的制剂的结果由菱形来标记，以及对具有20mg/ml EDC的制剂得到的结果由矩形来标记；

图10示出了显示布比卡因浓度对布比卡因从根据本发明的一些实施方案的示例性生物粘附药物洗脱基质(从包含200mg/ml明胶、40mg/ml藻酸盐、20mg/m EDC和三种布比卡因浓度的示例性生物粘附制剂得到)的释放特性的效应的比较散点图，其中对具有1％w/v布比卡因的制剂得到的结果由三角形来标记，具有2％w/v布比卡因的制剂的结果由菱形来标记，以及具有3％w/v布比卡因的制剂的结果由矩形来标记；

图11示出了显示EDC浓度对布洛芬从根据本发明的一些实施方案的示例性生物粘附药物洗脱基质(从包含200mg/ml明胶、40mg/ml藻酸盐、3％w/v布洛芬和三种EDC浓度的示例性生物粘附制剂得到)的释放特性的效应的比较散点图，其中对具有10mg/ml EDC的制剂得到的结果由三角形来标记，具有15mg/ml EDC的制剂的结果由菱形来标记，以及具有20mg/ml EDC的制剂的结果由来矩形标记；

图12示出了显示布洛芬浓度对布洛芬从根据本发明的一些实施方案的示例性生物粘附药物洗脱基质(从包含200mg/ml明胶、40mg/ml藻酸盐、20mg/ml EDC和三种布洛芬浓度的示例性生物粘附制剂得到)的释放特性的效应的比较散点图，其中对具有1％w/v布洛芬的制剂得到的结果由三角形来标记，具有2％w/v布洛芬的制剂的结果由菱形来标记，以及具有3％w/v布洛芬的制剂的结果由矩形来标记；

图13示出了显示明胶浓度对从包含40mg/ml藻酸盐和20mg/ml EDC的示例性生物粘附制剂得到的示例性生物粘附基质的水吸收的效应的比较直方图，其中白色柱表示对包含100mg/ml明胶的生物粘附制剂得到的结果，且灰色柱表示对包含200mg/ml明胶的生物粘附制剂获得的结果；

图14示出了显示藻酸盐浓度对从包含200mg/ml明胶和20mg/mlEDC的示例性生物粘附制剂得到的示例性生物粘附基质的水吸收的效应的比较直方图，其中白色柱表示对包含20mg/ml藻酸盐的生物粘附制剂得到的结果，且灰色柱表示对包含40mg/ml藻酸盐的生物粘附制剂获得的结果；

图15示出了显示EDC浓度对从包含200mg/ml明胶和40mg/ml藻酸盐的示例性生物粘附制剂得到的示例性生物粘附基质的水吸收的效应的比较直方图，其中白色柱表示对包含10mg/ml EDC的生物粘附制剂得到的结果，且灰色柱表示对包含20mg/ml EDC的生物粘附制剂获得的结果；

图16示出了显示在预先与根据本发明的一些实施方案的示例性生物粘附制剂的组分即明胶或藻酸盐温育24小时的培养基的存在下，成纤维细胞的细胞活力的变化的比较直方图，而在常规培养基的存在下保持的细胞用作对照，其中白色柱表示时间点0时获得的结果，且黑色柱表示24小时后获得的结果；以及

图17A、图17B示出了显示在从包含200mg/ml明胶和40mg/ml藻酸盐(图17A)，或300mg/ml明胶和30mg/ml藻酸盐(图17B)和不同浓度的EDC(0mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml和20mg/ml)的示例性生物粘附制剂得到的根据本发明的一些实施方案的示例性生物粘附基质的存在下，成纤维细胞的存活力的变化的比较直方图，其中白色柱表示24小时后获得的结果，且黑色柱表示48小时后获得的结果；

图18A、图18B示出了显示基于阿尔玛蓝(Alamar-Blue)还原实验，溶液中布比卡因(图18A)和布洛芬(图18B)浓度对成纤维细胞的细胞毒性效应的比较直方图，而将显著差异标记为“-*-”；

图19A、图19B、图19C、图19D示出了使用明胶(200mg/ml)、藻酸盐(40mg/ml)和EDC(20mg/ml)，没有加入药物(图19A)和以1％w/v布比卡因装载(图19B、图19C、图19D)制备的生物粘附基质在不同放大率下的ESEM断口组织照片；

图20A、图20B示出了使用明胶(200mg/ml)、藻酸盐(40mg/ml)和EDC(20mg/ml)，以1％w/v布洛芬)装载制备的生物粘附基质在不同放大率下的ESEM断口组织照片(fractograph)；

图21A、图21B示出了显示HA(图21A)和β-TCP(图21B)对包含明胶(200mg/ml)、藻酸盐(40mg/ml)和EDC(20mg/ml)的根据本发明的一些实施方案的示例性生物粘附基质对软组织的粘合强度的效应的比较直方图，而将显著差异标记为“*”；

图22A、图22B示出了显示HA(图22A)和β-TCP(图22B)对包含明胶(200mg/ml)、藻酸盐(40mg/ml)和减少的EDC(10mg/ml)的根据本发明的一些实施方案的示例性生物粘附基质对软组织的粘合强度的效应的比较直方图，而将显著差异标记为“*”；

图23示出了显示HA和β-TCP的加入对包含明胶(200mg/ml)、藻酸盐(40mg/ml)和EDC(20mg/ml)的选择的生物粘附制剂对硬组织(骨)的粘合强度的效应的直方图，而将显著差异标记为“-*-”；

图24A、图24B、图24C、图24D、图24E、图24F是由包含明胶(200mg/ml)、藻酸盐(40mg/ml)和EDC(20mg/ml)以及0.125％w/v HA(图24A)、0.5％w/v HA(以不同放大率的图24B和图24C)、0.125％w/vβ-TCP(图24D)和0.5％w/vβ-TCP(以不同放大率的图24E和图24F)的根据本发明的一些实施方案的生物粘附制剂制备的生物粘附基质的ESEM断口组织照片；

图25A、图25B示出了显示改变EDC浓度对基于包含200mg/ml明胶和40mg/ml LV藻酸盐(Ge-200:Al-40,图25A)和300mg/ml明胶和30mg/ml LV藻酸盐(Ge-300:Al-30,图25B)的生物粘附制剂的生物粘附基质的粘合强度的效应的直方图，而显著差异由“*”来指示；

图26A、图26B示出了显示明胶的布鲁姆数(Bloom number)对从包含200mg/ml明胶、40mg/ml LV藻酸盐和20mg/ml EDC的生物粘附制剂得到的生物粘附基质的粘合强度(图26A)，和其相应无EDC的Ge:Al溶液的粘度(图26B)的效应的直方图，而显著差异由“*”来指示；

图27A、图27B、图27C示出了显示明胶和藻酸盐浓度对由包含20mg/ml EDC、各种LV藻酸盐浓度和200mg/ml明胶(图27A)、300mg/ml明胶(图27B)和400mg/ml明胶(图27C)的制剂制备的生物粘附基质的粘合强度的效应的直方图，而显著差异由“*”来指示；

图28A、图28B、图28C示出了显示藻酸盐的粘度对由具有200mg/ml(图28A)、300mg/ml(图28B)和400mg/ml明胶(图28C)的不同明胶浓度(布鲁姆数＝90-110)的根据本发明的实施方案的生物粘附制剂制备的生物粘附基质的粘合强度的效应的比较直方图，而黑色柱表示LV藻酸盐，白色柱表示HV藻酸盐，藻酸盐浓度以x轴来指示，且EDC浓度在所有测试中为20mg/ml(在具有类似浓度但不同类型的藻酸盐的粘合剂的粘合强度之间的显著差异由“*”来指示，且各种HV藻酸盐粘合剂的粘合强度之间的显著差异由“v”来指示)；

图29示出了显示藻酸盐浓度和其粘度对包含具有90-110的布鲁姆数和200mg/ml的浓度的明胶的明胶-藻酸盐溶液的粘度的效应的比较直方图，而黑色柱表示LV藻酸盐，白色柱表示HV藻酸盐；

图30示出了描述生物粘附制剂组分的参数对粘合强度的效应的定性模式的示意流程图表示，而框中的箭头表示其中某一参数的减少导致下一个增加的实施方案，而所有其他实施方案，某一参数的增加导致下一个的增加；

图31A、图31B示出了显示EDC和NHS对根据本发明的一些实施方案的基于明胶-藻酸盐的生物粘附制剂的粘合强度的组合效应的比较直方图，而明胶浓度为200mg/ml、藻酸盐浓度为40mg/ml，且柱上的数字表示制剂中NHS的百分比(图31A)，和比较了展示最高粘合强度的生物粘附基质的直方图(图31B)；以及

图32A、图32B示出了显示示例性抗生素药物克林霉素对从包含200mg/ml明胶、40mg/ml藻酸盐、和20mg/ml EDC的根据本发明的一些实施方案的示例性生物制剂得到的示例性生物粘附基质的粘合强度的效应的直方图，而柱上的数值表示制剂中克林霉素的百分比(图32A)，以及NHS和克林霉素的加入对从包含200mg/ml明胶、40mg/ml藻酸盐和10mg/mlEDC的生物粘附制剂得到的基质的粘合强度的效应的直方图(图32B)。

发明的特定实施方案的描述

本发明在其一些实施方案中涉及生物粘附基质，且更具体地，但不排他地，涉及生物粘附基质、用于形成生物粘附基质的制剂和试剂盒，以及其用于粘附两个或更多个对象，包括生物对象诸如有生命力的组织、器官以及类似的对象的用途。

参考附图和所附说明书可更好地理解本发明的原理和操作。

在详细地解释本发明的至少一个实施方案之前，应当理解本发明不限于其应用于以下说明书中阐述的或由实施例示例的详细内容。本发明能够以各种方式实践或进行其他实施方案。还应理解，本文应用的措辞和术语是用于描述的目的，不应被视为限制。

当简化本发明以实践时，本发明人已开发并研究了基于明胶、藻酸盐和偶联剂诸如EDC，并尤其可有效地被用于粘附软组织的高效生物粘附制剂。

当进一步开发这些生物粘附制剂时，证明了这些生物粘附制剂形成可封存生物活性剂并随后有效洗脱生物活性剂，诸如各种麻醉剂和止痛药的生物粘附基质。本发明人使用布比卡因和布洛芬作为示例性生物活性剂已实践了这一药物洗脱生物粘附基质的新颖概念。研究了生物粘附制剂的组分对所得生物粘附基质的粘合强度和药物释放特性的效应，以及这些生物粘附基质的生物相容性。

当进一步开发这些生物粘附制剂时，发现某些填料，诸如羟基磷灰石(HA)和β-磷酸三钙(β-TCP)的加入提供了对硬组织的高效生物粘附。当简化本发明的一些实施方案以实践时，还证明了这些填料增加生物粘附基质对硬组织的粘合强度的潜力；发现HA和β-TCP改进生物粘附基质，因此得到可被用于软组织和硬组织两者应用的生物粘附制剂。

如本文使用的术语“生物粘附”是指物质(例如，制剂或基质)的以下特征，根据该特征，当物质与活组织接合时，该特征使向活组织粘附对象诸如，例如，另一个活的软和/或硬组织、活组织本身和/或无生命对象成为可能。

因此如本文使用，生物粘附制剂是指应用于此类活组织和/或待粘附到活组织的对象，以期粘附活组织和对象的制剂；且生物粘附基质是指将粘附于其上的活组织和对象粘合在一起的物质。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包括以下的生物粘附制剂：

a)明胶；

b)藻酸盐；

c)偶联剂；和

d)水。

此处应当注意和下文中所详细讨论的，根据本发明的一些实施方案，制剂被定义为成分的集合，其可被发现呈其中将所有组分混合成同一混合物的一种调和物的形式，或呈单独定量的成分，例如，单独定量的溶剂和干成分的形式。

如本文所提到的生物粘附制剂是相应生物粘附基质的前体。

在一些实施方案中，生物粘附基质通过固化生物粘附制剂来形成，使得该生物粘附制剂可被视为预固化制剂。

生物粘附制剂的基本成分：

如本文公开的生物粘附制剂包含至少两种类型的聚合物(例如，藻酸盐和明胶)和偶联剂。

生物粘附制剂设计为在偶联剂的存在下经历交联反应。

不受限于任何特定的理论，假设交联反应涉及明胶链与藻酸盐链的交联，基本上通过将明胶中的伯胺与藻酸盐中的羧基基团，和/或与一个或更多个其他的明胶分子偶联。当使用包含明胶作为主要组分和藻酸盐作为相对于明胶的次要组分的流体制剂时，假定大部分交联在明胶和藻酸盐之间形成。基本上是明胶和藻酸盐的交联聚合物的这一网络，在本文中称为基质，是流体生物粘附制剂的固化的半固体、凝胶产物。因此，该基质被视为通过使用偶联剂将明胶和藻酸盐偶联得到的偶联的明胶-藻酸盐基质。

如本文中使用的，并且是本领域中已知的，术语“明胶”描述了可在特定条件下形成凝胶的水溶性蛋白。明胶通常通过在胶原的酸性或碱性和部分水解条件下热溶解来获得。A型明胶通过酸方法来获得，并具有引起正电荷的高密度的氨基基团。B型明胶通过碱方法来获得，并具有引起负电荷的高密度的羧基基团。存在不同来源的胶原，诸如动物皮和骨，其提供具有一系列物理和化学特性的各种明胶形式。通常，明胶包含以部分有序的方式连接的十八种氨基酸；甘氨酸或丙氨酸是残基的约三分之一至一半，脯氨酸或羟脯氨酸是约四分之一，且剩余等等包括酸性或碱性氨基酸残基。通常，为了在水中溶解明胶，有必要通过加热或搅拌并加入热水以达到至少35℃的温度。适度加热提高溶解度，而重度加热可导致明胶的聚集或部分水解。明胶的粘度随种类、浓度、时间和温度而变化。与碱处理过的明胶相比，酸处理过的明胶具有轻微较大的固有粘度。明胶相对便宜，其是生物相容的，具有可忽略的免疫问题，并且其是可生物降解的。“布鲁姆(Bloom)”是测量凝胶或明胶的强度的测试。该测试确定由探针(通常具有0.5英寸的直径)偏转凝胶的表面4mm而不破坏它需要的重量(以克为单位)。结果以布鲁姆等级或布鲁姆数来表示，且通常在30布鲁姆和300布鲁姆之间。为了对明胶进行布鲁姆测试，在进行测试之前，将6.67％明胶溶液在10℃下保持17-18小时。

在本发明的实施方案的上下文中，明胶的替代选择可包括非动物来源的凝胶，诸如琼脂(从海藻收获的复杂碳水化合物)、角叉菜胶(从海藻收获的复杂碳水化合物)、果胶(在成熟的水果和蔬菜中存在的胶体碳水化合物)、魔芋(konjaka)(从魔芋属(Amorphophallus)植物提取的胶体碳水化合物)、瓜尔胶(瓜拉纳(guaran)，从属瓜尔豆(Cyamopsis tetragonolobus)的瓜尔豆(cluster bean)提取的半乳甘露聚糖类型)及其有或没有明胶的各种组合。

如本文中使用的，并且是本领域中已知的，术语“藻酸盐(alginate)”描述了阴离子多糖。在本文和本领域中还称为藻酸(alginic acid)的藻酸盐，是包含β-D甘露糖醛酸单体(M段)和α-L古洛糖醛酸(G段)的嵌段共聚物，不同形式的藻酸盐具有M/G的不同比。如本文使用的术语“藻酸盐”包含各种M/G比。M/G比根据藻类/植物的种类、来源和收获季节而变化。

在一些实施方案中，藻酸盐具有范围从0.3至4、从0.7至3、或从1至2的M/G比。在其他实施方案中，M/G比为0.7、0.9、1、1.3、1.5、1.7、1.9、2、2.3、2.5、2.7、3、3.5或4。

已知藻酸盐通过结合水形成粘性胶状物(在水中能够吸收其自身重量的200-300倍)。

在温和条件下在水溶液中，通过与在相邻藻酸盐链的G-段之间结合的二价阳离子相互作用，藻酸盐经历可逆凝胶化，产生离子间链桥。由于藻酸盐通常为具有羧基端的阴离子聚合物，其是已知的并用作良好的粘膜粘附剂。

天然存在的藻酸盐通常在海洋褐藻(例如，巨藻(Macrocystis pyrifera)、泡叶藻(Ascophyllum nodosum)和海带(Laminaria)和土壤细菌(假单胞菌(Pseudomonas)和固氮菌(Azotobacter)中产生。还涵盖了合成制备的藻酸盐。

藻酸盐相对便宜，其是生物相容的，在哺乳动物中不引起免疫应答，并且其是可生物降解的。

在本发明的一些实施方案的上下文中，藻酸盐可以展示多于2Pa-sec的高粘度(HV)形式使用，或以展示0.1-0.3Pa-sec的低粘度(LV)形式使用。如下文实施例部分所示，LV/HV藻酸盐形式的应用增加微调和优化本文呈现的生物粘附制剂的另一个参数。

如本文使用的术语“偶联剂”，是指可在两个或更多个官能基团之间分子内、分子间或两者催化或形成键的试剂。偶联剂被广泛用于增加聚合物网络并促进聚合物链之间的交联，因此，在本发明的一些实施方案的上下文中，偶联剂是可促进聚合物链之间的交联的偶联剂；或是可促进氨基官能基团和羧基官能基团之间，或在聚合物链的其他化学相容的官能基团之间的交联的偶联剂；或者是可促进凝胶和藻酸盐之间的交联的偶联剂。在本发明的一些实施方案中，术语“偶联剂”可被替换为术语“交联剂”。在一些实施方案中，聚合物中的一种用作偶联剂并充当交联聚合物。

“化学相容的”意指两种或更多种类型的官能团可彼此相互反应以形成化学键。

通常存在于明胶和藻酸盐中的示例性官能基团，包括，但不限于，胺(主要为伯胺–NH₂)、羧基(-CO₂H)、巯基和羟基(分别为-SH和-OH)、和羰基(-COH醛和-CO-酮)。

如在明胶中，以及各种天然存在的多糖和氨基糖苷类中发现的，伯胺存在于多肽链的N末端(称为α-胺)、赖氨酸(Lys，K)残基的侧链处(ε-胺)。因为在生理条件下其带正电荷，所以伯胺通常是蛋白和其他大分子向外面向的(即，发现在外表面上)；因此，其通常是缀合可及的。

羧基存在于多肽链的C-末端、天冬氨酸(Asp，D)和谷氨酸(Glu，E)的侧链、以及天然存在的氨基糖苷类和多糖诸如藻酸盐中。如同伯胺，羧基通常在大的聚合化合物诸如蛋白和多糖的表面上。

巯基和羟基分别存在于半胱氨酸(Cys，C)和丝氨酸(Ser，S)的侧链。羟基在多糖和氨基糖苷类中是丰富的。

羰基如酮或醛可经各种合成和/或天然的氧化处理在糖蛋白、糖苷类和多糖类中形成。

根据本发明的一些实施方案，偶联剂可根据官能基团的类型以及其间可形成的交联键的性质来选择。例如，羧基直接偶联至胺可使用碳化二亚胺类偶联剂，诸如EDC来得到；胺可通过以下被偶联至羧基、羰基和其他反应性官能基团：N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS-酯)、亚氨酸酯(imidoester)、PFP-酯或羟甲基膦；巯基可通过以下被偶联至羧基、羰基、胺和其他反应性官能基团：马来酰亚胺、卤乙酰基(溴-或碘-)、吡啶基二硫化物和乙烯基砜；如在氧化的碳水化合物中的醛类，可被酰肼偶联至其他反应性官能基团；且羟基可被异氰酸酯偶联至羧基、羰基、胺和其他反应性官能基团。

因此，可在本发明的一些实施方案中使用的合适的偶联剂包括，但不限于，碳化二亚胺、NHS-酯、亚氨酸酯、PFP-酯或羟甲基膦。

碳化二亚胺是促进羧基对伯胺直接偶联(缀合)的完全交联剂。因此，不像其他试剂，碳化二亚胺是零长度交联剂；其不会成为偶联的分子之间的最终交联的部分。因为肽、蛋白、多糖和氨基糖苷类包含多个羧基和胺，所以直接碳化二亚胺介导的偶联/交联通常导致多肽的无规聚合。

EDC，或N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐，是使羧基和氨基基团之间缩合以形成酰胺键和副产物脲成为可能的广泛使用的碳化二亚胺类偶联剂和交联剂。与胺/羟基反应物进行反应后，EDC不存在于偶联产物的结构中；因此其生物相容性和生物可降解性在本实施方案的上下文中不是问题。当明胶分子显示羧基和氨基基团两者时，该类型的聚合物可通过EDC经历分子间交联。

已知EDC和其尿素衍生物是细胞毒性的并抑制细胞生长。在活组织中针对氨基和羧基基团的该高反应性，以及尿素衍生物的释放，可能是EDC的细胞毒性的基础。

根据本发明的一些实施方案，碳化二亚胺类偶联剂的替代选择，包括但不限于，乙二醛、甲醛、戊二醛、聚戊二醛、葡聚糖、柠檬酸衍生物、微生物转谷氨酰胺酶和京尼平。

在一些实施方案中，偶联剂在偶联反应期间被用完，并且生成尿素衍生物作为胺和羧基基团之间的偶联反应的副产物。尿素衍生物的性质由所用的偶联剂的性质决定。

根据本发明的一些实施方案，各种偶联剂和交联剂可被组合或用作基于明胶和藻酸盐和偶联剂的任何给定的生物粘附制剂中的添加剂，以进一步促进交联反应。在一个代表性的实施例中，将NHS-酯加入至碳化二亚胺类偶联剂，诸如EDC中。

向EDC的交联反应加入NHS得到NHS活化的羧酸基团，其不太易水解，并且防止重排。另一方面，高浓度下的NHS可与EDC反应并与交联反应竞争，由此减少用于交联的EDC的有效量。因此，试剂诸如NHS在本文中被称为交联促进剂。

在本发明的上下文中，通过加入促进偶联反应和促进形成生物粘附基质中交联的形成的各种试剂，意图提高交联效率和/或降低形成显示如上文讨论的期望的特性的基质需要的偶联剂的量。因此，此类试剂在本文中被称为“交联促进剂”。交联促进剂的量被给定为重量/体积每重量/体积百分比(w/v/w/v)，即相对于偶联剂的量，并根据本发明的一些实施方案，该量的范围为从约1％至100％、或从1％至200％重量/体积每重量/体积百分比。

交联促进剂的代表性实例包括，但不限于，磺基-NHS、HOBt、HOAt、HBtU、HCtU、HAtU、TBtU、PyBOP、DIC五氟苯酚等。

如以下实施例部分中所示，交联剂和交联促进剂在本文呈现的生物粘附制剂中的组合得到了具有改进的粘合强度的生物粘附基质。此外，交联剂诸如EDC和交联促进剂诸如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的组合，允许显著减少生物粘附制剂中的EDC含量。由于使用EDC的医疗安全性和细胞毒性影响，EDC的含量的减少是有益的。

在一些实施方案中，相对于偶联剂的量，交联促进剂的量可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、100％、150％、200％，包括1％和200％之间的任何值，或甚至可以为更高。在本发明的一些实施方案中，相对于偶联剂的量，交联促进剂的量为5％、10％、15％、20％、30％或40％，包括从5％至40％之间的任何值。

当一前一后使用时，甚至当使用相对低浓度的EDC时，EDC和NHS得到更强粘合的生物粘附基质。示例性制剂包括为10mg/ml的EDC的量，以及相对于EDC的量为10％的NHS的量。

用于软和硬组织生物粘附制剂的填料：

为了提供适合用于在例如硬组织的环境下展示机械和化学性能的生物粘附制剂/基质，生物活性填料可被加入至制剂中。已知此类填料促进骨形成和骨整合，其被视为对于硬组织生物粘附制剂/基质高度期望的。

如在本发明的一些实施方案的上下文中使用的术语“填料”，是指通常基于富含矿物质来源的物质，其是生物相容的、无毒的，并且能够机械地加强基质，并在一些实施方案中，能够促进骨形成和骨整合。在一些实施方案中，“填料”物质以水不溶性物质，即具有水性介质中低溶解度的细粉末的形式存在于本文呈现的生物粘附制剂中。

根据本发明的一些实施方案，一些填料，至少在一定显著程度上，也是生物可吸收的，如可通过其生理吸收时间来评估的。已表明，一些生物可吸收的填料物质不仅作为防止软组织向内生长的简单的空间填料。此类填料物质，在经历生理吸收后，可留下被发现是长期稳定的并充当用于新骨形成的骨传导框架的一致网格的矿物质。还发现其促进对骨形成是必不可少的血管的形成。

如本文使用的术语“可吸收的”是指可经受吸收的物质，如该术语在下文中被定义的。当吸收过程在生物系统中发生时，该物质被称为“生物可吸收的”。

如本文使用的术语“吸收”，描述了物质通过化学、生物和/或生理过程的损耗。通常，该术语在本文和本领域中用于描述这样的过程，其涉及物质的分解，通过例如，化学或物理分解，诸如溶解、水解和/或吞噬作用，其可随后通过人体经由，例如，代谢吸收和/或排泄分解产物。因此，术语吸收通常在本文和本领域称为“生物吸收”。因此，如本文使用的短语“吸收期间”，是指吸收过程的时间段。

根据本发明的一些实施方案，填料的非限制性的实例，包括以下所列的材料(一些在括号中列出了其近似生理性吸收时间)：所有水合形式的硫酸钙、各种结晶形式的磷酸三钙(Ca₃(PO₄)₂)、β-磷酸三钙(β-TCP)(4-12个月)、微多孔羟基磷灰石(HA)颗粒(18-36个月)、具有合成肽的牛衍生的羟基磷灰石(18-36个月)、钙化藻(6-18个月)、合成颗粒状玻璃陶瓷(生物活性玻璃，18-24个月)、自体骨屑(3-7个月)、异体松质骨(allogeneic cancellousbone)(6-15个月)、辐射松质异体骨(irradiated cancellous allogeneic bone)(4-12个月)、无机牛骨(15-30个月)、多孔无机晶体(4-10个月)、多孔珊瑚羟基磷灰石(5-7年)以及涂覆了氢氧化钙的微孔BioplantHTR聚合物的复合材料(10-15年)。

本文中应注意，根据本发明的实施方案，取决于应用和预期用途，填料可呈细粉末或粗粉末的形式，即其颗粒可展现直径范围从约1μm至约2mm的平均粒径。在一些实施方案中，填料的平均粒径范围为从直径2μm-30μm、5μm-20μm、15μm-40μm、20μm-50μm、50μm-60μm或50μm-100μm。

如以下的实施例部分所示，将两种类型的示例性生物活性陶瓷填料羟基磷灰石(HA)和β-磷酸三钙(β-TCP)加入至本文呈现的生物粘附制剂，以在使用更低量的交联剂(例如，EDC)时得到相对于相应无填料制剂，展现改进的粘合强度的生物粘附制剂/基质，并且还发现非常适合于硬组织，诸如骨。这两种示例性填料特征为良好的生物相容性和无毒性，也能够促进骨形成和骨整合。

根据本发明的一些实施方案，根据所得的生物粘附基质的显微结构和所得的粘合强度，已研究了加入至生物粘附制剂中的填料诸如HA和β-TCP对离体软组织和硬组织两者的效应。发现，由于其与制剂中的水性介质的独特相互作用以及其在其中的低溶解度，填料形成推测作为基质的机械加固起作用的纤维和聚集物。

如以下实施例部分所示，填料诸如HA和β-TCP可被用在本文呈现的生物粘附制剂中，以诸如以下的生物粘附制剂的百分比重量/体积(％w/v)的量作为粉末：0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.2、0.225、0.25、0.275、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、1、1.5、2、3或更高。根据一些实施方案，填料的应用可允许相对于相应的无填料的生物粘附制剂，以低浓度使用EDC。如在下文呈现的试验结果中可见，根据本发明的一些示例性实施方案，发现分别包含0.5％和0.125％w/v浓度的HA或β-TCP的生物粘附基质具有比其无填料的对应物更高的粘合强度。

可将各种添加剂加入至制剂以修饰其固化前特性，诸如例如，用于改进的应用和延展限制的粘度调节剂、渗透促进剂、和用于在应用过程中和后续允许追踪的着色剂或荧光剂。可将各种添加剂加入至制剂以修饰其固化后特性，即影响所得基质的特性的添加剂，诸如例如，另外的偶联剂/交联剂、借助于为用于各种藻酸盐物质的交联剂充当胶凝剂的钙离子及其他稀土金属离子、塑化剂、硬化剂、软化剂和用于修饰基质的挠曲模量的其他试剂，以及影响当存在时的生物活性剂的释放速度、渗透和吸收的添加剂，如下文更详细地讨论的。

在本文中应注意，如同填料，可将本文描述的一些添加剂、以及一些生物活性剂以干粉的形式加入至制剂中。这可以是为了使用简便，希望维持减少或增加生物粘附制剂的一定的粘度值，或简单地因为生物活性剂的添加剂不溶于水性介质。

生物粘附制剂的特性：

如上文所讨论的，有效的生物粘附制剂的设计应同时考虑若干要求，包括，例如，可加工性和效率来做出，可加工性和效率还可翻译为安全性。

在可加工性和安全性考虑下，有效的生物粘附制剂应在室温下展现允许从业者在例如，临床条件下应用和使用制剂的粘度。例如，太粘并因此不容易被涂开的制剂将难以被应用于组织，而不够粘性并因此过度流动的制剂将是流动的并可能伴随不期望的泄漏、粘附不足，以及整体提高的副作用和降低的安全性。

还在可加工性和安全性考虑下，有效的生物粘附制剂应展示以下固化时间：如本文所定义，其允许在相对短时间内利用制剂完成操作，使得避免可导致提高的不良副作用和降低的安全性的延长的操作，然而，在另一方面，足够长以允许精确定位并如果需要，任选重定位。在一些实施方案中，例如在对象不易被最佳定位并且可需要重定位步骤的情况下，对象的瞬时粘合可以是不被期望的；因此，在本发明的一些实施方案中极短的固化时间可能是不切实际的。在这种情况下，期望生物粘附制剂允许一段时间用于重定位(分离和重邻接)待彼此粘合的对象。该时间的范围(窗口)被称为制剂的可工作时间，如下文进一步讨论。

在本文中应注意，根据本发明的一些实施方案，制剂可保持在多个分离的部分、或溶液中，至少直到所有这些部分被混合为包含结合或伴随其应用和使用的所有成分的单一调和物(at least until all these parts are mixed into a single concoctioncomprising all ingredients in conjunction or concomitant to its applicationand use)。关于生物粘附制剂的多部分制剂、存储工具、制备和应用的详细讨论在下文中来呈现。

当提及多部分生物粘附制剂的粘度时，其本质上涉及制剂的较粘稠部分，即包含明胶、藻酸盐或有或没有生物活性剂或其他添加剂的明胶和藻酸盐的混合物的部分。只要维持其化学组成，即赋予粘度的聚合物的浓度(或水含量)、温度和分子结构，则该粘性部分将基本上保持相似的粘度。可选地，关于粘度涉及在其混合后立即的包含所有成分的制剂(a formulation comprising all ingredients shortly subsequent to theirmixing)。尽管溶解的聚合物对高粘度贡献最大，偶联剂的加入将通过实现不可逆改变粘度的交联改变聚合物的化学组成，基本上与温度和含水量无关。由于实际原因，当本文提及粘度时，是指包含明胶和藻酸盐的制剂部分，而相对于粘性部分，包含偶联剂的部分被认为是较少粘性和小体积。由于相对短的固化时间，使用标准和常用做法和设备测量生物粘附制剂的粘度可能是不切实际的。明胶和藻酸盐是粘度的主要贡献者，而所有其他组分和添加剂都是次要的粘度调节剂。未解决的组分是交联剂和交联促进剂，因为这些试剂负责硬化制剂为固体生物粘附基质，所以其具有对制剂的粘度的直接效应。因此，当测量制剂的粘度时，人们可在加入交联剂和/或交联促进剂之前测量制剂的粘度。安全地假定缺少硬化剂的制剂的粘度与完整制剂的粘度基本上相同。

如下文所讨论的，将生物粘附制剂表征为“可工作时间”，是指在其中所有成分被混合在一起的时间点至其中制剂太粘稠而不能工作的时间点之间的时间段。因此，根据本发明的一些实施方案，报道的生物粘附制剂的粘度在可工作时间期间是有效粘度。

取决于测定方法和其他因素，动力粘度通过各种单位来量化。在本实施方案的上下文中，动力粘度是指以牛顿秒/平方米(N s m^-2或Pa-sec)的单位，其中1Pa-sec等于1千克/米秒(kg m^-1s^-1)并等于10泊(P)。例如，据称20℃下水具有1mPa-sec(0.001Pa-sec)的动力粘度，37℃下血液特征为3-4mPa-sec的粘度，且20℃下蜂蜜为10Pa-sec。

在本发明的上下文中，当提及生物粘附制剂的粘度时，采取没有交联剂和/或交联促进剂的制剂的实际测量的结果，并且视为完整生物粘附制剂的结果。

因此，根据本发明的一些实施方案，本文呈现的制剂特征为以下的至少一个：

范围从1Pa-sec至50Pa-sec的室温粘度(参考在加入偶联剂溶液之前的明胶-藻酸盐溶液，或在混合在一起后立即的包含所有组分的最终生物粘附制剂)；以及

在生理条件下，范围从5秒至30分钟的固化时间。

尽管以Pa-sec单位提供动力粘度的标准，并且其值源自给定环境温度下的特定粘度测量值，本文应注意，动力粘度可由其他单位来表示，并由各种方法和技术来测量，所有这些均可被用于表征任何给定的生物粘附制剂或其部分。例如，虽然室温下测量动力粘度是更简单的，但由于在更高温度，诸如50℃下对混合并制备制剂是更有效的和实用的，因此报告并还考虑比工作温度更高的温度下的生物粘附制剂的动力粘度也可是有用的。可选地，由于例如，大部分操作室被保持在比室温更低的标准温度下，报告并考虑比标准室温更低的温度下的动力粘度可以是更有益的；以及意图在体温应用和使用制剂时，报告并考虑生物粘附制剂在或接近体温下的粘度。

因此，根据本发明的一些实施方案，生物粘附制剂的动力粘度，或包含明胶和藻酸盐的制剂部分的动力粘度，范围为从20℃下1Pa-sec至50Pa-sec，和/或37℃下0.5Pa-sec至25Pa-sec。

根据本发明的一些实施方案，生物粘附制剂的室温动力粘度，或包含明胶和藻酸盐的制剂部分的动力粘度，范围为从1Pa-sec至5Pa-sec、从5Pa-sec至10Pa-sec、从10Pa-sec至15Pa-sec、从15Pa-sec至20Pa-sec、从20Pa-sec至25Pa-sec、从25Pa-sec至30Pa-sec、从30Pa-sec至35Pa-sec、从35Pa-sec至40Pa-sec、从40Pa-sec至45Pa-sec、或从45Pa-sec至50Pa-sec。

如本文使用的，短语“固化时间”描述了在生物粘附制剂形成生物粘附基质期间的时间段，如本文描述的。

在本文中应注意，虽然生物粘附制剂在偶联剂与明胶和/或藻酸盐的一种或两种接触后开始固化，但该偶联反应和交联反应不瞬间跨越制剂的块的整个体积(the entirebulk of the mass of the formulation)。因此，定义术语“固化时间”使得其包含基质形成的所有阶段的整个过程，包括“可工作时间”和“粘合时间”。“可工作时间”是在将制剂的所有成分混合在一起的时刻，与推测由于其固化过程，制剂的粘度太高而不允许制剂工作，即应用、扩散、定位和重定位的时刻之间的时间-窗口，如上文所讨论的。在上文呈现的生物粘附制剂的粘度特性的上下文中，在可工作时间期间粘度是相对的，直到交联普遍并使制剂变得太粘稠。“粘合时间”被定义为从该制剂被施加在对象上的时刻，到彼此粘合的对象被认为在足够强度下粘合使得允许例如，释放任何紧固/紧致工具(如果使用)和/或继续或完成该过程的时刻经过的时间。在一定程度上，取决于制剂、其作为单个或多个部分制剂的使用模式、使用条件和对象的类型和粘合区域，可工作时间和粘合时间可重叠，可分别继续彼此(continue one another respectively)，或可不连续。

根据本发明的一些实施方案，本文呈现的包含混合在一起的所有成分的生物粘附制剂的可工作时间，跨越从5秒至30分钟。取决于制剂的需要和预期用途，可将其设计为展示各种可工作时间，其可跨越至少30秒、至少60秒、至少120秒、至少300秒、至少600秒、至少900秒、或至少1800秒(30分钟)。

根据本发明的一些实施方案，本文呈现的生物粘附制剂的固化时间范围为从5秒至30分钟。取决于制剂的需要和预期性能，可将其设计为展示各种固化时间，其范围可为从5秒至30秒、从5秒至30秒、从5秒至60秒、从5秒至120秒、从10秒至300秒、从30秒至300秒、以及从60秒至1800秒(30分钟)。可选地，在粘附过程不限于时间并且其他参数诸如强度和柔韧性是更重要的，诸如例如装置至患者的皮肤的局部(外部)粘附的情况下，固化时间可比前述值更长，并且范围可为从数秒至多于30分钟，并且为，例如40分钟、50分钟、60分钟、以及甚至120分钟，包括从30分钟至120分钟的任何中间值。

所得的生物粘附基质：

生物粘附基质是在生物粘附制剂中的一些成分之间发生的固化过程的结果，并因此基质包括如本文所讨论的彼此偶联的明胶和藻酸盐，以及任选地变得与基质相关(例如，包埋于其中)的制剂的其他成分。

如上文所讨论的，设计如本文描述的生物粘附制剂以形成相应的生物粘附基质，并因此设计使得生物粘附基质展现期望的性能。根据本发明的一些实施方案，设计如本文描述的生物粘附制剂使得在其固化后，其形成特征为以下的生物粘附基质：如本文所定义的有生命力的生物对象的高粘合强度、生理条件下的最佳挠曲模量、和最佳的可生物降解速率。

如本文所用，措辞“最佳”涉及制剂和/或相应基质在期望的应用下的性能。就这一点而言，应注意，不同应用可需要最佳性能的不同参数，其通常可取决于待粘合的对象的类型、待粘合的对象的维度、粘合区域、需要粘附的程序的条件性质以及取决于对象和程序的其他参数。

虽然各种活体组织和其他活的或无生命对象的粘合强度是生物粘附制剂/基质的高度期望的特性，但本文呈现的生物粘附制剂在粘液/血浆/血液潮湿环境的生理条件下粘附各种对象，诸如有生命力的和无生命力的组织、骨、皮肤、金属、塑料和其他天然以及合成的聚合物质是有意义的能力。

粘合强度可从在对粘合的对象的样品进行的拉伸试验期间创建的应力应变曲线的斜率实验性地来确定，并以力/单位面积(牛顿/平方米(N/m2)或达因/平方厘米)，即帕斯卡(Pa)、兆帕(MPa)或千兆帕斯卡(GPa)的单位来表示。

如本文使用的短语“粘合强度”描述了一对给定材料的粘合对象在其分裂开之前可经历的拉伸应力的最大量。

根据本发明的一些实施方案，由本文呈现的生物粘附制剂得到的生物粘附基质特征为在粘合峰值下范围从约2,000帕斯卡(2MPa)至约60,000帕斯卡(60MPa)的有生命力的生物对象的最大粘合强度。根据一些实施方案，由本文呈现的生物粘附基质展现的有生命力的生物对象的最大粘合强度范围为从2MPa至10MPa、从5MPa至20MPa、从15MPa至30MPa、从20MPa至40MPa、从30MPa至50MPa、或从40MPa至60MPa。

根据本发明的一些实施方案，生物粘附基质的另一种所需特性，是当在生理条件下，特别是潮湿并从环境吸水溶胀时，其在应力和压力下弯曲和挠曲而不从其粘合的对象上分裂或分离的能力的程度。

取决于预期的用途和条件，期望生物粘附基质随着时间并在间歇或连续运动、应力、变形、弯曲、拉伸、压力和磨损下执行(在生理条件下维持其粘合作用)。根据本发明的一些实施方案，基质特征为在生理条件下范围从0.5MPa至200MPa的挠曲强度(模量)。可选地，由本文呈现的生物粘附基质在生理条件下展现的挠曲模量，范围为从0.5MPa至5MPa、从1MPa至10MPa、从5MPa至20MPa、从10MPa至15MPa、从15MPa至20MPa、从20MPa至30MPa、从30MPa至50MPa、从50MPa至100MPa、从75MPa至150MPa、从100MPa至150MPa、或从155MPa至200MPa。

根据本发明的一些实施方案，本文呈现的生物粘附基质是可生物降解的。

为了有效地被用于各种内部和外部的医疗程序中并且特别是内部手术程序中，本文呈现的生物粘附基质还显示了最佳的可生物降解速率，允许其以足够长的时间粘合对象以在崩解之前显示其预期的用途。

如本文使用的术语“生物可降解”和其任何形容词、词形变化和偏差(declination)，是指材料从可检测的固体、半固体、凝胶、粘液或其他情况下局部的形式(localized form)经历化学和/或物理转化为离域化和/或检测不到的形式诸如其任何可溶、可洗、易挥发、可吸收和/或再吸收分解产物或代谢物的特性。由于化学的、生物学的和/或物理因素，诸如，例如固有化学键易变性、酶分解过程、熔融、溶解及其任何组合，可生物降解材料在生理条件下经历此类转化。

取决于生物粘附基质的化学和物理特性和其应用的位置，以及其预期的用途，基质的生物降解的过程可跨越数天至数周至数月。短语“可生物降解速率”在本文中定义为在应用生物粘附制剂与所得生物粘附基质不再作为生物粘附基质存在的时间之间的时间段。“不再存在”意指可归因于原始基质的物质在应用生物粘附制剂的部位处可不再以大量水平被检测到，或在原始部位超过正常水平仍可被检测的其痕量在该部位不可再粘合组织或逗留。

通常，由本文呈现的生物粘附制剂形成的生物粘附基质的粘合强度，在一定程度上，在生理条件下，将开始降解。这种强度的降解由基质的分解引起，其由包括以下的因素的组合实现：化学方法(溶胀、溶解和自发的化学降解)、生物方法(酶促驱动的反应、新的未粘合的细胞和其他组织组分的形成以及粘合的细胞和其他组织组分的死亡)、机械方法(应力、应变和撕裂)等。为简单起见，降解本文呈现的生物粘附基质的粘合强度的因素和方法的集合都包括并统一在短语“可生物降解速率”下。

根据本发明的一些实施方案，生物粘附制剂的预期用途是形成可保持彼此附着的生物对象持续足够长的时间段用于接合、融合或治愈对象的基质。时间段取决于对象和待进行的医疗程序。例如，制剂可被用于形成邻接切口的两个边缘、足够强壮和长以允许切口自我修复并愈合的基质；所述切口可在身体的内部部位或在表面(皮肤和肌肉)上。在另一个实例中，对象之一是一片皮肤且另一对象是无生命的医疗装置，在该情况下，生物粘附基质意图保持固定至皮肤的装置直到其实现其目的或直到基质被代替。

生物粘附基质的可生物降解性可由以下的因素的组合来操作：起始于组成，即聚合物的相对浓度和交联密度、可改变基质的分子结构(更多和多样的交联)的添加剂、生物降解促进剂/增强剂和生物降解抑制剂/抑制器。可被用于操纵降解性的另一个因素是基质的肉眼可见形状和结构，即其表面面积、对周围介质的可及性、治疗的区域的尺寸等。

因此根据本发明的一些实施方案，本文呈现的生物粘附基质的可生物降解速率范围为从约7天至约6个月。在一些情况下，可使降解性周期更短，并且范围为从1周至1个月，包括在其间的任何时间段，诸如从10天至3周。在其他情况下，可使降解性周期更长，例如1-6个月，并且范围为从1个月至2个月，从2个月至3个月或范围为从2个月至6个月。

可被用于确定任何给定生物粘附基质，包括由本文要求保护的生物粘附制剂形成的基质的粘合强度中涉及的时间因素的另一个参数，是粘合强度保留的一半时间，即最大粘合强度达到其值一半的时间段，T1/2。

根据本发明的一些实施方案，T1/2范围为从约1天至约5个月，及其间的任何值。例如，对于短粘附周期应用，T1/2范围为从约1周至约两周，或从约10天至约1个月。对于更长的粘附周期，T1/2范围为从约1个月至约2个月、或从约2个月至约3个月、或从约3个月至约4个月、或从约3个月至约5个月。

在本文中应注意，虽然讨论了最小粘合时间和最佳的可生物降解速率，但本文呈现的生物粘附基质可在其被生物降解之前除去，并且可通过机械和化学手段有意地缩短其粘合时间。

基本成分的浓度：

本发明人已发现，生物粘附制剂和由其形成的基质的以上描述的特性的至少一些可通过应被优化的生物粘附制剂的每种成分的相对浓度来操纵。

根据本发明的一些实施方案，如本文描述的生物粘附制剂包括明胶、藻酸盐和偶联剂，如本文描述的，每种以将赋予制剂本文描述的特性的浓度，和/或以将赋予制剂本文描述的特性的相对含量比率，如下文呈现的。

在本文中应注意，对于是有用的和有效的生物粘附制剂，选择其聚合物的浓度以得到可工作的稠度(主要在粘度方面)。因此，可工作制剂的聚合物的浓度，并且特别是明胶的浓度的范围的高限，不可超过一定的值。超过这些最大范围值的一个或更多个可导致不能实施的制剂。

根据本发明的一些实施方案，在制剂中明胶的浓度为500mg/ml或更低。

根据本发明的一些实施方案，在制剂中的明胶浓度范围为从50mg/ml至500mg/ml。在一些实施方案中，生物粘附制剂中的明胶含量范围为从100mg/ml至500mg/ml、从100mg/ml至400mg/ml、从100mg/ml至300mg/ml、从100mg/ml至200mg/ml、或从50mg/ml至400mg/ml、从50mg/ml至300mg/ml、从50mg/ml至200mg/ml或从50mg/ml至100mg/ml，包括在以上指示的值之间的任何值。

根据本发明的一些实施方案，在制剂中藻酸盐的浓度范围为从5mg/ml至100mg/ml。在一些实施方案中，生物粘附制剂中的藻酸盐含量范围为从10mg/ml至100mg/ml、从10mg/ml至90mg/ml、从10mg/ml至80mg/ml、从10mg/ml至70mg/ml、从10mg/ml至60mg/ml、从10mg/ml至50mg/ml、从10mg/ml至40mg/ml、或从5mg/ml至90mg/ml、从5mg/ml至80mg/ml、从5mg/ml至70mg/ml、从5mg/ml至60mg/ml、从5mg/ml至50mg/ml、从5mg/ml至40mg/ml、从5mg/ml至30mg/ml、从5mg/ml至20mg/ml、或从5mg/ml至10mg/ml，包括在以上指示的值之间的任何值。

根据本发明的一些实施方案，在制剂中偶联剂的浓度范围为从1mg/ml至50mg/ml、从1mg/ml至40mg/ml、从1mg/ml至30mg/ml、从1mg/ml至20mg/ml、或从1mg/ml至10mg/ml，包括在以上指示的值之间的任何值。

如上文讨论的，由于已知某些偶联剂为细胞毒性的或为产生细胞毒性的部分，期望在生物粘附制剂内使用相对低量的偶联剂。另一方面，减少偶联剂在制剂中的量可导致减少由制剂形成的生物粘附基质的粘合强度。本发明人已证明了包含20-40mg/ml或甚至更低量的偶联剂的制剂可被用于提供生物粘附基质，其中粘合强度基本不受影响。

一些示例性生物粘附制剂如下所示，每一种包含指定浓度下的明胶、藻酸盐和偶联剂，表示为制剂的总体积的重量/体积的百分比：

示例性制剂I：100mg/ml明胶、20mg/ml藻酸盐和作为碳化二亚胺类偶联剂的4mg/ml EDC；

示例性制剂II：100mg/ml明胶、40mg/ml藻酸盐和4mg/ml EDC；

示例性制剂III：100mg/ml明胶、60mg/ml藻酸盐和4mg/ml EDC；

示例性制剂IV：100mg/ml明胶、40mg/ml藻酸盐和10mg/ml EDC；

示例性制剂V：150mg/ml明胶、40mg/ml藻酸盐和10mg/ml EDC；

示例性制剂VI：200mg/ml明胶、40mg/ml藻酸盐和10mg/ml EDC；

示例性制剂VII：200mg/ml明胶、40mg/ml藻酸盐和5mg/ml EDC；

示例性制剂VIII：200mg/ml明胶、70mg/ml藻酸盐和35mg/ml EDC；

示例性制剂IX：250mg/ml明胶、40mg/ml藻酸盐和25mg/ml EDC；或

示例性制剂X：200mg/ml明胶、40mg/ml藻酸盐和20mg/ml EDC；或

示例性制剂XI：500mg/ml明胶、10mg/ml藻酸盐和25mg/ml EDC。

在本文中应注意，在本发明的一些实施方案中，偶联剂的浓度可由添加剂的存在而降低，并不会影响该制剂的性能。

例如，生物粘附制剂包括表示为制剂的总体积的重量/体积的以下量的明胶、藻酸盐、偶联剂和交联促进剂：

示例性制剂XII：200mg/ml明胶；40mg/ml藻酸盐、10mg/ml EDC和2mg/ml NHS-酯-类偶联剂(相对于EDC浓度的20％)；

示例性制剂XIII：200mg/ml明胶；40mg/ml藻酸盐、10mg/ml EDC和4mg/ml NHS-酯(相对于EDC浓度的40％)；

示例性制剂XIV：200mg/ml明胶；40mg/ml藻酸盐、15mg/ml EDC和1.5mg/ml NHS-酯(相对于EDC浓度的10％)；

示例性制剂XV：200mg/ml明胶；40mg/ml藻酸盐、15mg/ml EDC和3mg/ml NHS-酯(相对于EDC浓度的20％)；

示例性制剂XVI：250mg/ml明胶；30mg/ml藻酸盐、20mg/ml EDC和4mg/ml NHS-酯(相对于EDC浓度的20％)；

示例性制剂XVII：500mg/ml明胶；10mg/ml藻酸盐、20mg/ml EDC和4mg/ml NHS-酯(相对于EDC浓度的20％)；或

示例性制剂XVIII：300mg/ml明胶；30mg/ml藻酸盐、10mg/ml EDC和1mg/ml NHS-酯(相对于EDC浓度的10％)。

在本文中应注意，在本发明的一些实施方案中，制剂可包括填料，而不影响制剂的性能并且甚至改进制剂的性能，且使得制剂更适合用于更宽范围的应用，诸如硬组织粘附(骨粘附等)。

例如，生物粘附制剂包含以下量的明胶、藻酸盐、偶联剂、任选的交联促进剂以及填料：

示例性制剂XIX：200mg/ml明胶；40mg/ml藻酸盐、20mg/ml EDC和0.25％w/v羟基磷灰石；

示例性制剂XX：200mg/ml明胶；40mg/ml藻酸盐、20mg/ml EDC和0.5％w/vβ-TCP；

示例性制剂XXI：200mg/ml明胶；40mg/ml藻酸盐、10mg/ml EDC和0.5％w/v羟基磷灰石；

示例性制剂XXII：200mg/ml明胶；40mg/ml藻酸盐、10mg/ml EDC和0.125％w/vβ-TCP；

示例性制剂XXIII：200mg/ml明胶；40mg/ml藻酸盐、20mg/ml EDC、2mg/ml NHS-酯(相对于EDC浓度的10％)和0.25％w/v羟基磷灰石；

示例性制剂XXIV：200mg/ml明胶；40mg/ml藻酸盐、20mg/ml EDC、4mg/ml NHS-酯(相对于EDC浓度的20％)和0.5％w/vβ-TCP；

示例性制剂XXV：300mg/ml明胶；30mg/ml藻酸盐、10mg/ml EDC、1mg/ml NHS-酯(相对于EDC浓度的10％)和0.5％w/v羟基磷灰石；或

示例性制剂XXVI：300mg/ml明胶；30mg/ml藻酸盐、10mg/ml EDC、1mg/ml NHS-酯(相对于EDC浓度的10％)和0.125％w/vβ-TCP。

因此，在一些实施方案中，如本文描述的生物粘附制剂包括藻酸盐、明胶、水、和偶联剂，如本文描述的，并且还包括交联促进剂和/或填料，如本文描述的，其中偶联剂的浓度为20mg/ml或更低(例如，15mg/ml、或10mg/ml、或更低)。

任何前述提到的示例性制剂可还包括本文描述的一种或更多种生物活性剂。

在本文中应注意，涵盖了组分浓度的其他组合，其中的一些已在以下的实施例部分被证实。

药物洗脱生物粘附制剂：

根据本发明的一些实施方案，如本文描述的生物粘附制剂还包括一种或更多种生物活性剂。在一些实施方案中，此类制剂设计为在固化后得到药物洗脱生物粘附基质。换言之，固化包含生物活性剂的生物粘附制剂以形成其中掺有生物活性剂的药物洗脱生物粘附基质。在一些实施方案中，形成此类药物洗脱生物粘附基质，使得生物活性剂在基质与生理媒介物接触后从基质上释放。因此，根据本发明的一些实施方案，生物粘附制剂可被用于各种生物粘附应用，如本文所讨论的，而同时用作用于递送生物活性剂的储库和运载物。

在本文中应注意，虽然生物活性剂在制剂中的掺入可影响制剂的特性和所得的生物粘附基质的特性，但该生物粘附制剂及其相应基质被设计为具有上文提到的期望的性质，同时增加洗脱生物活性剂的能力，如下文讨论的。

在本文中还应注意，根据本发明的一些实施方案，不包含生物活性剂的生物粘附制剂及相应基质意图主要使用其生物粘附性质。在此类实施方案中，除了释放生物活性剂的量和速率外，本文描述的有效的生物粘附制剂/基质的所有其他特性和特质，以及主要成分的最佳相对含量，适用于其中不包含生物活性剂的制剂。

如在根据本发明的一些实施方案的生物活性剂和生物粘附制剂/基质的上下文中使用的，术语“掺入的(incorporated)”与以下术语同义使用：诸如“封存的(sequestered)”、“负载的(loaded)”、“包封的(encapsulated)”、“缔合的(associatedwith)”、“填充的(charged)”以及这些术语的任何词形变化，它们全部可互换使用以描述如下文所定义的生物活性剂在制剂/基质中的存在。封存的生物活性剂可经由例如扩散、溶解、洗脱、提取、浸出从基质上洗脱或释放，作为影响基质的润湿、溶胀、溶解、化学分解、降解、生物降解、酶分解及其他过程的任何或组合的结果。还可从基质上洗脱生物活性剂，而对基质的结构没有任何显著变化、或有部分变化。

如本文使用的，短语“生物活性剂”描述了发挥一种或更多种生物学和/或药学活性的分子、化合物、复合物、加合物和/或组合物。因此生物活性剂可被用于，例如，缓解疼痛、预防炎症、预防和/或减少和/或消除感染，促进伤口愈合、促进组织再生、实现肿瘤/转移消除/抑制、实现局部免疫系统抑制，和/或预防、减轻或治疗各种医学状况。

“生物活性剂”、“药物活性剂”、“药物活性材料”、“医药”、“治疗活性剂”、“生物学活性剂”、“治疗剂”、“药”、“药剂”、“药物”和其他相关的术语可在本文互换使用，并且它们全部意图被术语“生物活性剂”所涵盖。

术语“生物活性剂”在本发明的上下文中还包括诊断剂，包括，例如，用于标记、追踪、成像和鉴定各种生物学元件诸如小分子以及大分子、细胞、组织和器官的显色剂、荧光剂、发光剂、磷光剂；以及放射性材料，其可用于放疗和追踪两者，用于破坏有害组织诸如局部区域中的肿瘤/转移瘤，或抑制健康组织的生长，诸如在目前的支架应用中；或作为用于核医学和放射成像中使用的生物标志物。

根据本发明，可单独或组合使用生物活性剂，即在一种生物粘附制剂中可一起使用多于一种类型的生物活性剂，并且因此从生物粘附基质上同时释放。

在一些实施方案中，在制剂中生物活性剂的浓度范围为从所述制剂的总体积的0.1％重量/体积至10％重量/体积，并且在一些实施方案中甚至更多。取决于使用的生物活性剂的性质和生物粘附制剂/基质的预期用途，还预期更高及更低值的生物活性剂的含量。

当在释放或洗脱生物活性剂的上下文中使用术语“生物活性剂”时，意指生物活性剂在其释放后是基本上有效的。

如下文所讨论的，生物活性剂可凭借其自身与一种或更多种基质形成组分和/或偶联剂的反应性，或凭借其本身化学和/或物理性质，对偶联的明胶-藻酸盐基质化学和/或机械性质有影响。因此，应注意，通常，生物活性剂被选择为适合于掺入提供偶联的明胶明胶-藻酸盐生物粘附基质的生物粘附制剂，以使得生物活性剂可以以预期的有效量和释放率从生物粘附基质上洗脱，同时允许预固化生物粘附制剂展示预期的特性，如本文所讨论的，并且同时允许制剂提供展示预期的特性的生物粘附基质，如本文所讨论的。

如以下实施例部分所讨论并示例的，一些生物活性剂可展示一个或更多个官能基团，其可易受在聚合物和偶联剂之间发生的偶联过程的影响，并且因此可影响所得基质的特性。例如，展现羧基基团或伯胺基团的生物活性剂可与由于其针对此类官能基团的反应性而被选择的偶联剂发生反应。在此类情况下，为了维持所得基质的期望的特性，可在成分的类型及其浓度方面将一些调整引入生物粘附制剂。

根据本发明的一些实施方案，生物活性剂可以是，例如，生物大分子或小有机分子。

根据本发明的一些实施方案，生物活性剂是非蛋白物质(non-proteinoussubstance)，即在其结构中具有不超过四个氨基酸残基的物质。

根据本发明的一些实施方案，生物活性剂是非碳水化合物物质(non-carbohydrate substance)，即在其结构中具有不超过四个糖(含氨基糖苷类)部分的物质。

根据本发明的一些实施方案，生物活性剂基本上没有以下官能基团的一种或更多种：羧基、伯胺、羟基、巯基和醛。

如本文使用的术语“生物大分子”，是指天然存在于活的生物体中的聚合生化物质，或生物聚合物。氨基酸和核酸是聚合生物大分子的一些最重要组成部分，因此生物大分子典型地包括聚合的氨基酸、聚合的核酸、聚合的糖、聚合的脂质及其组合的一个或更多个链。大分子可包括可共价地或非共价地彼此附着的几个大分子亚基的复合物。因此，核糖体、细胞器以及甚至完整的病毒可被视为生物大分子。

如本文使用的生物大分子，具有比1000道尔顿(Da)更高，并且可比3000Da更高，比5000Da更高，比10kDa更高以及比50kDa更高的分子量。

可有益地掺入本文描述的生物粘附药物洗脱基质中的生物大分子的代表性实例，包括，但不限于，肽、多肽、蛋白、酶、抗体、寡核苷酸和标记的寡核苷酸、核酸构建体、DNA、RNA、反义、多糖、病毒及其任何组合，以及细胞，包括完整的细胞或其他亚细胞组分和细胞碎片。

如本文中使用的，短语“有机小分子”或“有机小化合物”是指主要由碳和氢，连同以较低存在比率的氮、氧、磷和硫以及其他元素一起组成的小化合物。在本发明的上下文中，关于化合物、试剂或分子的术语“小”，是指比约1000克/摩尔更低的分子量。因此，有机小分子具有比1000Da更低、比500Da更低、比300Da更低、或比100Da更低的分子量。

可有益地掺入本文描述的生物粘附药物洗脱基质中的有机小分子的代表性实例，包括，但不限于，血管发生促进剂、细胞因子、趋化因子、化学引诱剂、化学驱避剂、药物、激动剂、氨基酸、拮抗剂、抗组胺剂、抗生素、抗原、抗抑郁药、抗高血压剂、止痛剂和麻醉剂、抗炎剂、抗氧化剂、抗增殖剂、免疫抑制剂、凝血因子、骨整合剂、抗病毒剂、化疗剂、辅因子、脂肪酸、生长因子、半抗原、激素、抑制剂、配体、糖类、放射性同位素、放射性药物、类固醇、毒素、维生素、矿物质和其任何组合。

适合于在本实施方案的上下文中使用的生物活性剂的代表性实例包括，但不限于，镇痛剂、麻醉剂、抗生素、抗肿瘤和化疗剂、激动剂和拮抗剂药、氨基酸、血管发生促进剂、减食欲药物、抗过敏药、抗关节炎药、抗哮喘药、抗体、抗胆碱能药、抗惊厥药、抗抑郁药、抗糖尿病药、止泻药、抗真菌剂、抗原、抗组胺剂、抗高血压剂、抗炎剂、抗偏头痛药、止恶心药、抗肿瘤药、抗氧化剂、抗震颤麻痹药、抗增殖剂、抗原虫药(antiprotozoans)、止痒剂、抗精神病药、退热药、反义核酸构建体、解痉药、抗病毒剂、胆汁酸、钙通道阻断剂、心血管制剂、细胞、中枢神经系统兴奋剂、化学引诱剂、趋化因子、化学驱避剂、化疗剂、胆固醇、辅因子、避孕药、细胞因子、减充血剂、利尿药、DNA、药物和治疗剂、酶抑制剂、酶、脂肪酸、糖脂类、生长因子、生长激素、止血和抗出血剂、半抗原、激素抑制剂、激素、安眠药、免疫活性剂、免疫抑制剂、抑制剂和配体、标记的寡核苷酸、杀微生物剂、肌肉松弛剂、核酸构建体、寡核苷酸、抗副交感神经药(parasympatholytics)、肽、外周和脑血管扩张剂、磷脂、多糖、蛋白质、精神兴奋剂、放射性同位素、放射性药物、受体激动剂、RNA、糖、皂苷、镇静剂、有机小分子、杀精子剂、类固醇、拟交感神经药、毒素、安定药、疫苗、血管扩张剂、病毒组分、病毒载体、病毒、维生素、以及其任何组合。

生物活性剂可被选择以达到局部或全身应答。生物活性剂可以是适合于以下各种的任何预防剂或治疗剂：局部、肠内和肠外类型的施用途径，包括，但不限于皮下或经皮、真皮内经皮、经粘膜、肌肉内施用和粘膜施用。

根据本发明的一些实施方案，可被包封在生物粘附药物洗脱基质中的一类生物活性剂，是减轻疼痛的镇痛剂类，例如NSAID、COX-2抑制剂、阿片制剂和拟吗啡样物(morphinomimetics)。

根据本发明的一些实施方案，可被掺入生物粘附药物洗脱基质中的另一类生物活性剂，是麻醉剂类。根据本发明的一些实施方案，可被掺入生物粘附药物洗脱基质中的另一类生物活性剂，是促进血管发生的治疗剂类。非限制性实例包括生长因子、细胞因子、趋化因子、类固醇细胞存活和增殖剂。

根据本发明的一些实施方案，特别是在期望组织再生、和涉及植入装置和组织愈合的应用的某些实施方案中，可被掺入生物粘附药物洗脱基质中的另一类生物活性剂，是细胞因子、趋化因子和相关的因子。

免疫抑制药物或试剂，通常在本文中称为免疫抑制剂的非限制性实例，包括糖皮质激素、细胞抑制剂、抗体、作用于亲免素(immunophilin)的药物和其他免疫抑制剂。

止血剂的非限制性实例包括高岭土、蒙脱石和氨甲环酸。

在本文中应注意，高岭土是具有在生物粘附制剂中的有限溶解度的示例性生物活性剂，并因此以干粉的形式加入，且因此，至少在一定程度上，充当生物粘附制剂中的填料。这种生物活性剂和填料的双重功能，可表征由本发明的实施方案包括并随后预期的任何添加剂或生物活性剂。

根据本发明的一些实施方案，可有益地掺入生物粘附药物洗脱基质的另外的生物活性剂，包括细胞毒性因子或细胞周期抑制因子以及有助于干扰细胞增殖的其他试剂。

根据本发明的一些实施方案，可有益地掺入生物粘附药物洗脱基质的另外的生物活性剂，包括遗传治疗剂和蛋白，诸如核酶、反义多核苷酸和编码特定产物的多核苷酸(包括重组核酸)，诸如基因组DNA、cDNA或RNA。多核苷酸可以以“裸的”形式或以与增强多核苷酸吸收和表达的载体系统关联地来提供。这些可包括DNA密实剂(DNA compacting agent)(诸如组蛋白)，非感染性载体(诸如质粒、脂质、脂质体、阳离子聚合物和阳离子脂质)和病毒载体诸如病毒和病毒样颗粒(即，制成作用如病毒的合成颗粒)。载体还可具有附着的肽靶向序列、反义核酸(DNA和RNA)、和包括编码ferry蛋白诸如膜转位序列(“MTS”)的基因序列的DNA嵌合体、代替有缺陷的或不足的内源性分子的tRNA或rRNA以及单纯疱疹病毒-1(“VP22”)。

根据本发明的一些实施方案，可有益地掺入生物粘附药物洗脱基质的另外的生物活性剂，包括可被内源性或外源性控制的基因递送试剂。

根据本发明的一些实施方案，可有益地掺入生物粘附药物洗脱基质的另外的生物活性剂，包括作为二聚体、同型二聚体、异二聚体，或其组合，单独或连同其他分子的骨形态发生蛋白(“BMP”)家族。可选地或另外，可提供能够诱导BMP的上游或下游效应的分子。此类分子包括任何“刺猬(hedgehog)”蛋白或编码其的DNA。

根据本发明的一些实施方案，可有益地掺入生物粘附药物洗脱基质的另外的生物活性剂，包括化学治疗剂。根据本发明的一些实施方案，可有益地掺入生物粘附药物洗脱基质的另外的生物活性剂，包括抗生素试剂。

抗病毒剂可包括核苷膦酸盐/酯和其他核苷类似物、AICAR(5-氨基-4-咪唑羧酰胺核糖核苷酸)类似物、糖酵解途径抑制剂、甘油酯、阴离子聚合物等。

根据本发明的一些实施方案，可有益地掺入生物粘附药物洗脱基质的另外的生物活性剂，包括抗病毒和非病毒载体。

根据本发明的一些实施方案，可有益地掺入生物粘附药物洗脱基质的另外的生物活性剂，包括甾体类抗炎药。根据本发明的一些实施方案，可有益地掺入生物粘附药物洗脱基质的另外的生物活性剂，包括抗氧化剂。

根据本发明的一些实施方案，可有益地掺入生物粘附药物洗脱基质的另外的生物活性剂，包括维生素。

根据本发明的一些实施方案，可有益地掺入生物粘附药物洗脱基质的另外的生物活性剂，包括激素。

根据本发明的一些实施方案，可有益地掺入生物粘附药物洗脱基质的另外的生物活性剂，包括人源(自体或异体)的细胞，包括干细胞，或来自动物来源(异种)，如果需要可将其进行基因工程改造以递送感兴趣的蛋白。

药物释放曲线：

自用作其储库的基质的生物活性剂的释放速率，或药物释放曲线，可通过各种因素，诸如成分在本文描述的生物粘附制剂中的相对浓度来控制。

在本实施方案的上下文中相关的典型的药物递送机制由包含预定的和可耗尽的量的药物的储库和在药物的储库和生理环境之间的界面组成。通常，当储库暴露于生理环境时药物释放在初始时间点开始，并遵循典型扩散控制的动力学，另外的影响由基质的水吸收(溶胀)、崩解和生物降解等实现。

应注意，与在提供其他药物洗脱基质的制剂中使用的合成聚合物，诸如聚乳酸(PLA)和聚乙醇酸(PGA)相比，既不是天然聚合物，也不是偶联产物酰胺键的明胶-藻酸盐偶联的基质不是水可降解的。在活的受试者身体中，该基质将通过还将影响药物释放速率的酶活性降解。

“药物释放曲线”是描述当在感兴趣的特定身体部位测量时作为时间函数的药物(生物活性剂)的瞬时浓度的一般表示，而浓度对时间的斜率表示在任何给定时间点的释放速率。可将药物释放曲线划分为取决速率的周期，由此该速率线性或以指数方式上升或下降，或保持基本恒定。一些典型的探索速率包括突释速率和持续释放速率。

如本文使用的，短语“突释(burst release)”，是与药物进入感兴趣的身体部位的快速释放一致，并且通常与药物的浓度呈指数增长相关，以相对短的时间从零增长至高水平。通常，药物释放曲线的突释部分简短地结束，并且然后逐渐改变为释放曲线中的稳定水平、或缓释部分。

如本文使用的，短语“持续释放(sustained release)”，是指突释部分之后的药物释放曲线的部分，并且通常特征为恒定速率和相对长的持续时间。

因此在释放曲线的突发部分和持续部分之间的主要差异为速率(斜率特性)和持续时间，对于突释为指数性和短的，以及对于持续释放为线性和长的；并且二者在药物施用方案中起到显著作用。在大多数情况下，突释部分和持续释放部分两者的存在是不可避免的，并且源于药物递送机制的化学和热力学性质。

在本发明的实施方案的上下文中，短语“高突释”是药物洗脱生物粘附基质的以下属性，如本文所述，该属性是指在基质暴露于其作用的环境(例如生理环境)的初始阶段期间从基质上释放的药物的量，其中，所述量超过基质中包含的总量的20％，并且初始阶段被认为是从暴露起的最初六个小时。

在本发明的一些实施方案中，“高突释”描述了药物洗脱生物粘附基质的以下属性，如本文所述，其中30％、40％、50％、60％以及甚至更高百分比的生物活性剂(药物)在基质暴露于生理介质的最初6小时期间被释放。预期了在生物活性剂(药物)的20％和100％之间的任何值。

因此，短语“低突释”是指其中小于20％的包含的药物在暴露的最初六小时内被释放的药物洗脱生物粘附基质。

在本发明的一些实施方案中，“低突释”描述了药物洗脱生物粘附基质的以下属性，如本文所述，其中15％、10％、5％以及甚至更低百分比的生物活性剂(药物)在基质暴露于生理介质的最初6小时期间被释放。预期了在生物活性剂(药物)的20％和1％之间的任何值。

通常，并且根据本发明的一些实施方案，至少20％的生物活性剂在制剂/基质与生理介质接触的6小时内被释放至周围的生理介质中。根据本发明的一些其他实施方案，至多20％的生物活性剂在制剂/基质与生理介质接触的6小时内被释放至周围的生理介质中。

生物粘附制剂的制备和基质形成：

本文呈现的包含或不包含生物活性剂的生物粘附制剂，通过将所有组分一起混合为单一调合物来制备，至少从制剂的意义上说，其能够固化。可离体、在体外或原位形成单一调合物，即制剂可以以两种或更多种子制剂的形式被单独保存，或作为一套干粉和预测量的量的溶剂(水)单独保存，如下文所讨论，其通过以下方式中的一种来组合形成单一调合物。

体外意指作为单一调合物的制剂在将制剂应用在待粘合的对象之前，通过将制剂的所有组分混合(例如，在小瓶中)来形成，如这些在本文中被定义、描述和示例的。

原位意指作为单一调合物的制剂通过将一种子制剂应用在一个对象上，并且将另一种子制剂应用在另一个对象上，且在粘附的部位处将对象邻接在一起以形成单一调合物；或通过将一种子制剂应用在对象上并此后将另一种制剂应用在同一对象上来形成。

当应用至活的对象时，体外相应于离体，且原位相应于体内。

在任何可能的情况下，制剂在基本上不能固化的条件下来保存。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了形成生物粘附基质的方法，其通过固化如本文描述的生物粘附制剂实现。

如本文使用的术语“固化”包括主动过程诸如使制剂经历一定条件(例如，加热和/或混合，剪切力，等)，以及包括允许经过固化时间的被动过程。

在一些实施方案中，方法还包括，在固化之前，混合制剂的组分，即，混合本文所述子制剂或用适当的溶剂混合本文所述的粉末。

如上文讨论的，可离体、在体内、体外或原位实现混合。

生物粘附制剂和基质的用途：

如本文讨论的，本文呈现的包含或不包含生物活性剂的生物粘附制剂，被用于形成为药物洗脱或非药物洗脱基质的生物粘附基质，其在许多医疗和辅助医疗应用中是有用的。如以上讨论的，根据本发明的一些实施方案，生物粘附基质，例如，在代替或增强外科缝合线和缝合钉中是有用的。

因此，根据一些实施方案，本文呈现的掺入生物活性剂或不掺入生物活性剂的制剂，被标识为用于将对象彼此粘合，其中这些对象中的至少一个是生物对象，如这些术语在本文中被定义和讨论的。

通常，本文呈现的生物粘附制剂可被用于制造用来粘合对象的产品，所述对象的至少一个是生物对象。

因此，如本文使用的短语“生物对象”，是指动物或植物的任何有生命力的/活的部分，包括单个活的动物样本。活的或有生命力的生物对象或组织被定义为植物或动物的仍保持有生命力或存活并被基本上保持在生理环境中以保持有生命力或存活的任何主要或次要部分。生物对象的非限制性实例包括任何植物或动物、活组织样品、皮肤组织、骨组织、结缔组织、肌肉组织、神经组织和上皮组织。还包括了在器官中做出的切口的边缘，所述器官诸如生物体的任何身体部位中的皮肤、肌肉、内脏器官。

无生命的对象是不可复活的、移植的、增殖或以其他方式显示如医学上定义的生命的任何迹象的对象，并且包括合成的和/或生物来源的对象。这些包括，例如，贴片、骨替换部件、起搏器、接口和通风孔，以及需要粘贴并固定至如本文定义的有生命力的生物对象的任何其他医疗设备。

根据本发明的一些实施方案，无生命的生物对象可部分地或完全地由动物或植物材料和产物制成，或部分地或全部地由合成物质来制成。当设计生物粘附制剂用于在有生命力的生物对象中或上使用时，在本文中应注意，其可如同任何粘合剂或粘合胶被有效地用于粘合生物的或合成的无生命的对象。

在本文中应注意，术语“对象”意在包括相同对象的一个或更多个部件或部分，从而通过使用本文描述的制剂通过粘合组织或器官中的切口的两侧闭合切口，可被认为粘合一个对象(组织或器官)或两个对象(切口的两侧)。

根据一些实施方案，从掺入生物活性剂的生物粘附制剂获得的药物洗脱基质，仅被用于其药物洗脱和药物递送的能力而不论其生物粘附能力。此类基质可用作，例如，药物贮存库，并且可粘附至器官或组织，其中药物的释放是有利的(不在其上粘合另一个对象)。

形成生物粘附基质和粘合对象的方法：

根据本发明的实施方案的一个方面，提供使用本文描述的生物粘附制剂形成本文描述的生物粘附基质的方法，该方法通过固化所述制剂来实现。

根据本发明的一些实施方案，由固化生物粘附制剂形成的包含生物活性剂或不包含生物活性剂的生物粘附基质，在对象上和/或在两个或更多个对象之间形成，其中所述对象中的至少一个是如本文描述的生物对象。

本文描述的生物粘附基质在对象上的形成通过将本文描述的生物粘附制剂应用在所述对象上并固化该制剂来实现。基质在两个或更多个对象之间的形成通过将制剂应用在对象中一个或更多上，例如，在其意图粘合的表面的部分上，并且此后邻接对象来实现。邻接对象意指使每个对象的表面的至少部分接触。

在本发明的一些实施方案中，粘合对象还伴随使用力和/或紧固对象的其他工具，并保持对象至少彼此邻接(阻止粘合的表面分离)，直到制剂固化至对象被粘合并可放开的程度。

因此，提供了至少将两个对象彼此粘合的方法，其通过以下来实现：

将本文呈现的生物粘附制剂应用于对象的至少一个上；以及

邻接所述对象(以在其间形成接触)，任选地同时将所述对象彼此紧固。

应注意，实现邻接的作用以在对象之间形成接触，同时使用紧固以允许制剂固化并在对象之间形成基质，由此将对象彼此粘合。

根据本发明的一些实施方案，本文呈现的生物粘附制剂和基质可被用于在损伤或手术后以及在许多外科手术中保持身体组织在一起，所述外科手术包括但不限于切口闭合、角膜穿孔、外阴切开术、剖腹产情况、唇裂、皮肤和骨移植术、肌腱修复、疝气、甲状腺手术、牙周手术、牙龈切除术、牙植入、口腔溃疡、胃静脉曲张、内脏器官诸如肝和胰的伤口、外部和内部医疗器械的附着和固定，等。

用于存储、制备和应用生物粘附制剂的装置(means)：

如本文中所呈现，根据本发明的一些实施方案的生物粘附制剂由两种或更多种主要聚合物组分和偶联剂组成，所述偶联剂在主要聚合物组分之间形成交联键。由于偶联/交联反应在使聚合物组分与偶联剂接触后发生，这两组的组分，即聚合物和偶联剂，应分开保存直到有必要应用该制剂。因此，应注意，该制剂可以以任何数目的分开的部分来保存，至少直到在其应用和使用前将其混合为包含所有的单一调合物。

因此，根据本发明的一些实施方案，本文呈现的预固化的生物粘附制剂通过使主要包含明胶、藻酸盐和任选的生物活性剂的子制剂A与主要包含一种或更多种偶联剂的子制剂B接触来形成。

可选地，预固化的生物粘附制剂可无限期地作为其每个成分的预测量的量的粉末的干燥混合物保存，所述组分，包括聚合物、偶联剂，各种添加剂和生物活性剂，允许每个可通过在水中溶解来重构。可选地，仅一些成分作为粉末的干燥混合物保存，而其他成分作为单独溶液或粉末保存。应注意，设想生物粘附制剂的长期存储的任何形式，只要阻止偶联/交联反应不受控制地开始。

可选地，根据本发明的一些实施方案，子制剂A和子制剂B分别保存于密封隔室中，每个隔室可用作存储容器，或作为适合于应用本文中呈现的生物粘附制剂的集成敷贴器(integrated applicator)的储库(例如，被配置用于应用糊剂和稠的液体)。

因此，根据本发明的一些实施方案的另一个方面，提供了用于储存、制备和/或应用本文中呈现的预固化的生物粘附制剂的试剂盒，其包括至少两个室，诸如第一隔室和第二隔室，其中第一隔室容纳子制剂A，如上文呈现的，且第二隔室容纳子制剂B。只要这两个隔室都保持密封并在可接受的贮存条件下，生物粘附制剂将不会固化或崩解。

在一些实施方案中，试剂盒包括至少两个隔室，每个包含相应于该特定子制剂的成分，其以特定浓度已预先溶解于溶剂中使得混合两个子制剂导致如本文描述的生物粘附制剂。

可选地，试剂盒包括一个或更多个隔室，每个包含预测量的量的生物粘附制剂的一种或更多种组分的干粉，和包含预测量的量的溶剂的单独隔室，使得混合粉末和溶剂导致了如本文描述的生物粘附制剂。

试剂盒还可包括混合和搅拌工具、碗、敷贴器、新鲜度指示器，防篡改措施和用于用户的说明书印刷品。

试剂盒可包括用于可控地并任选地同步排出每个子制剂的测量的量的装置、敷贴器或分配器，所述子制剂的每个从用作单独的子制剂的盒的单独的隔室分配。

因此，根据本发明的一些实施方案的另一个方面，提供了用于在应用本文呈现的生物粘附制剂中使用的集成双室分配器，其包括装配了具有联合递送口的双桶盒组件，其中具有用于与混合管结合的底座。适合于应用本文呈现的生物粘附制剂的集成敷贴器，可遵循用于两部分化学粘合剂的任何敷贴器的设计，所述化学粘合剂需要在控制并安全的条件下由单独隔室有效地分配两种子制剂。

可被用于混合、分配和应用本文呈现的生物粘附制剂的示例性两部分化学粘合剂敷贴器，被公开于例如美国专利申请号2007/0289996和2011/0248045中，以及美国专利号4,979,942、5,082,147、6,732,887、7,530,808、7,635,343、7,699,803、8,074,843中，其全部通过引用并入本文，如同在本文完全列出。

如本文使用的术语“约”是指±10％。

术语“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(having)”和其词形变化是指“包括但不限于”。

术语“由...组成(consisting of)意指“包括并限于”。

术语“基本上由......组成”意指制剂、组合物、方法、基质或结构可包括另外的成分、步骤和/或部分，但只要另外的成分、步骤和/或部分不实质上改变所要求保护的制剂、组合物、方法、基质或结构的基本和新颖的特性。

如本文使用的，单数形式“一个(a)”，“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代对象，除非上下文另有明确指示。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。贯穿本申请，本发明的各种实施方案可以以范围格式来呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并不应被解释为对本发明的范围的硬性限制。因此，范围的描述应被认为具有具体公开的所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，诸如从1至6的范围的描述应被认为具有具体公开的子范围，诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5、和6。这适用，而不论范围的宽度。

每当本文指示数值范围时，意指包括在指示的范围内的任何列举数字(分数或整数)。短语“范围/范围之间”第一指示数和第二指示数，且“范围/范围从(ranging/rangesbetween)”第一指示数“至”第二指示数在本文可互换使用，并且意指包括第一和第二指示数以及在其间的全部分数和整数。

如本文使用的术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括，但不限于，化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的，或易于从已知的方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。

应理解，为了清楚起见在单独实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征，还可以以组合在单个实施方案中提供。相反，为了简便起见在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征，还可以以单独地或以任何合适的子组合或如适用于本发明的任何其他描述的实施方案来提供。在各种实施方案的上下文中描述的某些特征不应被认为是那些实施方案的必要特征，除非该实施方案没有这些元素是不起作用的。

如上文描绘的以及如以下权利要求部分要求保护的本发明的各种实施方案和各方面在以下实施例中发现实验性支持。

实施例

现参考以下实施例，其连同以上说明书以非限制性方式阐述本发明的一些实施方案。

实施例1

材料和方法

材料

根据本发明的一些实施方案的示例性基本的生物粘附基质，由包含以下成分的示例性生物粘附制剂来制备：

明胶-在本文呈现的实施例中，来自猪皮的A型明胶(90-100布鲁姆)购自Sigma-Aldrich。对于胶粘机理的研究，使用了来自猪皮具有不同布鲁姆数(90-100、175和300)的三种类型的“A型”明胶。

藻酸盐-在本文呈现的实施例中，藻酸钠盐(粘度约250cps，2％(25℃)购自Sigma-Aldrich。对于粘合机理的研究，分别使用了具有100-300cP(0.1-0.3Pa-sec)的低粘度(LV)和大于2,000cP(2Pa-sec)的高粘度(HV)的藻酸钠盐,2％(25℃)。

EDC-N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐购自Sigma-Aldrich。

布比卡因盐酸盐购自Sigma-Aldrich。其是用于外周神经阻滞、浸润、和交感神经、骶管或硬膜外阻滞的局部麻醉剂。

布洛芬钠盐购自Sigma-Aldrich。其-是在疼痛、发热、痛经、骨关节炎、类风湿关节炎和其他风湿性和非风湿性炎性紊乱、和血管性头痛的治疗中使用的常用的非甾体抗炎药。

合成的羟基磷灰石(还称为羟磷灰石，HA)，以粉末的形式)以及以烧结粉末的形式的β-磷酸三钙 β-TCP)购自Sigma-Aldrich,Rehovot,Israel。

生物粘附剂制备：

药物洗脱生物粘附剂制备通常基于在加热板上达到60℃的加热条件下，在蒸馏水中溶解各种量的作为粉末或储备溶液的明胶、藻酸盐和生物活性剂。由于最终溶液的高粘度，搅拌通过搅拌器诸如Fisher’s Vortex Genuine 2^TM搅拌装置来实现。

简言之，将预测量的量的生物活性剂溶解于蒸馏水中。此后将预测量的量的藻酸盐加入至生物活性剂的清澈并透明的均相溶液中。得到亮黄色均匀粘稠的溶液后，将预测量的量的明胶i加入其中以得到明胶-藻酸盐-活性剂混合物，本文中还称为子制剂A。将各种预测量的量的偶联剂EDC溶解在单独的蒸馏水管中以得到子制剂B，刚好在使用生物粘附剂的时间之前，将子制剂B加入至子制剂A中。

未封存任何生物活性剂的原始的生物粘附基质由没有生物活性剂的生物粘附制剂来制备，与以上的程序类似，除了将藻酸盐首先溶解于纯蒸馏水中以外。

粘度测量：

由于生物粘附制剂的初始粘度主要受明胶-藻酸盐溶液的粘度的影响，粘度测量在加入EDC之前来进行。粘度测量使用配备锥和板几何结构(4°锥角、40mm直径、400μm间隙)的控制应力流变仪(型号AR2000，TA Instruments Ltd.)，在37℃的恒定温度和10Hz的恒定剪切速率下来进行以研究在粘合剂的初始粘度和其粘合强度之间的关系。

软组织粘合强度测量：

进行了根据本发明的一些实施方案的各种生物粘附基质的体外软组织粘合强度测量，以检查该生物粘附制剂的生物活性剂的类型和浓度对粘合强度的效应，即将两个软组织样品粘合在一起的能力。

猪皮(购自Kibbutz Lahav,Israel)被用作粘合试验的软组织模型。使用解剖刀将猪皮切成2cm X 2cm正方形片，并且将片保存于-20℃直至使用。在使用时，将猪皮片在空气中解冻，并且将其表皮侧用超级胶水牢固地附着至具有匹配表面积的1cm高度黄铜测试支架上。将测试支架连接至2cm X 0.4cm X 5cm的黄铜把手环。

将0.1ml的子制剂A(明胶-藻酸盐混合物)均匀且平等地分散在具有附着至测试支架的其表皮侧的两个猪皮片的真皮侧上，如上文呈现的。此后，将0.04ml的子制剂B(EDC溶液)与子制剂A在皮肤片的一个上混合，以得到预固化生物粘附制剂，其固化后变成生物粘附基质。随后，将附着至另一片的支架以在两个皮肤片的真皮侧之间建立牢固接触的方式放置在第一支架上。然后将两个支架以1.25N的恒力压在一起，并且在37℃和100％湿度环境下放置在静态培养箱(Heraeus,B12)中30分钟。使用各测试的生物粘附制剂制备五个相同偶联的皮肤样品。

在温育30分钟后，生物粘附基质的粘合强度使用5500Instron UniversalTesting Machine(Instron engineering Corp.)和10N测力传感器在室温下以拉力来测量。通过偶联的皮肤片邻接的两个支架在2mm/min的恒定速度下被拉紧直到实现分离，并且结果以千帕斯卡(KPa)来记录。机械测试过程受到标准测试方法ASTM F-2258-03启发。粘合强度被定义为应力-应变曲线中的最大强度，由Instron Merlin软件测量。

药物洗脱研究：

进行体外释放研究以检查生物粘附组分对以麻醉药物布比卡因和布洛芬的形式的两种类型的生物活性剂的释放动力学的效应。对各制剂进行五次重复。

将0.1ml的测试的子制剂A(明胶-藻酸盐混合物)使用1ml无针头的注射器注射进6mm X 6mm X 3mm矩形硅胶模具中。此后，立即将0.04ml的子制剂B(EDC水溶液)与子制剂A混合以在模具中形成预固化生物粘附制剂(140μl)。在之后数分钟、生物粘附制剂完全固化后，将潮湿的生物粘附基质样品挤压出其硅胶模具，并在化学通风橱中空气干燥。

将空气干燥的生物粘附基质的长方体放入塑料试管中，并将1ml的pH 7下的无菌PBS缓冲液加入至每个试管中，并作为释放介质。将叠氮化钠(0.02％w/v)加入至介质中以防止微生物污染。加入介质后，将试管(内有生物粘附样品)用塑料盖密封，并在37℃下放置于静态培养箱(Heraeus,B12)中14天。

在实验期间的特定时间点，即6小时、1天、2天、3天、7天和14天，从试管中取出整个介质，并用等体积的新鲜的PBS缓冲溶液和0.02％w/v叠氮化钠代替。将取出的介质转移至玻璃HPLC小瓶中并保持在-20℃直至分析。对于药物释放动力学的确定，使用HPLC系统评估在各时间点取出的介质中该药物的浓度。

包含布比卡因的样品的HPLC分析使用配备了设定为在210nm开始的UV 2075正检测器、和反相柱(ACE 5C18、内径d＝4.6mm、长度＝250mm)的Jasco HPLC系统保持在40℃来进行。流动相由PBS(pH 3.3)和乙腈混合物的混合物(72:28％,v/v)组成，以1.5ml/min的流速，用没有梯度的四元梯度泵(PU 2089正)。用自动进样器(AS 2057Plus)注射1-100μl样品。各洗脱峰的面积使用EZstart软件3.1.7版本，使用校准曲线进行整合。

包含布洛芬的样品的HPLC分析使用配备了设定为在220nm开始的UV 2075正检测器、和反相柱(ACE 5C18、内径d＝4.6mm、长度＝250mm)的Jasco HPLC系统保持在40℃来进行。流动相由PBS(pH 3.3)和乙腈混合物的混合物(40:60％,v/v)组成，以2ml/min的流速，用没有梯度的四元梯度泵(PU 2089正)。用自动进样器(AS 2057Plus)注射1-100μl样品。各洗脱峰的面积使用EZstart软件3.1.7版本，使用校准曲线进行整合。

在体外药物洗脱过程已开始后14天，37℃下将生物粘附样品浸入“胰蛋白酶A”溶液中4小时，以溶解样品并提取在最初14天期间不释放的药物。根据上文提到的方案使用一次性滤器装置(Whatman,0.2μm)将溶解的溶液过滤，注入HPLC系统并分析以确定余药的量。

水吸收：

将主要包含明胶和藻酸盐的预固化的生物粘附制剂与EDC混合后两小时，称重固化的生物粘附基质并记录干重W_dry。此后将五毫升的PBS缓冲液(pH 7)加入其中。在37℃和100％湿度下，将具有生物粘附基质样品的板插入至培养箱(Heraeus,B12)0.5小时、1小时、2小时、5小时、24小时和48小时。当指定的时间到期时，将PBS溶液从板中除去，并且称重溶胀的生物粘附基质样品并记录湿重W_wet。根据公式(W_wet-W_dry)X100/W_dry计算水吸收(溶胀)比率。

药物释放速率可受负载药物的水凝胶的溶胀的影响。将空气干燥的无药物的生物粘附长方体置于塑料试管中，并浸泡在1ml药物释放介质(PBSpH 7和0.02％叠氮化钠)中，并在37℃下放置于静态培养箱(Heraeus，B12)中6小时。在浸湿前(W_dry1)、在浸湿6小时后(W_wet)、以及空气干燥浸湿的样品后(W_dry2)，采集样品的重量值。水吸收被计算为(W_wet-W_dry2)X100/W_dry1。

细胞毒性试验：

将成纤维细胞(第14次传代)解冻，并在37℃、湿润气氛和5％CO₂下，培养于具有培养基的75mm²烧瓶中。将细胞用补充了10％胎牛血清、1％L-谷氨酰胺和0.1％青霉素-链霉素-制霉菌素的改良的Eagle培养基进行培养。在70％(在传代16-19次时)汇合时，将细胞使用1ml胰蛋白酶A培养3分钟来分离，将游离的细胞加入至培养基中，并播种于6孔板中。当达到70％汇合时，将培养基替换为2ml的包含10％v/v阿尔玛蓝的培养基温育4小时。此后，从每个孔中采集两个100μL样品，并插入至96孔板中。将板插入用于在分光光度计(Spectramax 340PC384,Molecular Devices)在570nm和600nm下分析。

进行两个实验，首先将生物粘附剂的每个组分分别插入包含4ml培养基的试管中，并温育24小时，且然后将该培养基代替包含阿尔玛蓝的培养基加入至细胞。在第二个实验中，将具有阿尔玛蓝的培养基替换为4ml的新鲜培养基，并且将0.1ml的生物粘附剂加入至培养基，并温育24小时，随后进行使用阿尔玛蓝的另一个读数。

阿尔玛蓝的还原是细胞增殖中变化的指示；因此，将结果与没有组织粘合剂的初始读数进行比较。阿尔玛蓝的吸光度的减少使用制造商的方案来计算，即阿尔玛蓝还原＝(ε₆₀₀A^t ₅₇₀–ε₅₇₀A^t ₆₀₀)/(ε₅₇₀A^c ₆₀₀–ε₆₀₀A^c ₅₇₀)，其中ε₅₇₀和ε₆₀₀分别是氧化的阿尔玛蓝在570nm和600nm处的摩尔消光系数，A^t和A^c分别是测试和对照在570nm和600nm处的吸光度，而对照采集为有阿尔玛蓝但没有任何细胞的培养基。

微观结构表征：

研究了根据本发明的一些实施方案的负载药物的生物粘附基质的微观结构，以表征不同的药物在生物粘附基质中的分散，并检查微观结构对药物释放曲线和粘合强度的效应。为此目的，由420μl根据本发明的实施方案的生物粘附制剂制备的约24X24X3mm的空气干燥的负载药物的生物粘附长方体，经冷冻断裂并使用环境扫描电子显微镜(Quanta 200FEG ESEM)在高真空模式以10kV的加速电压观察其横截面。药物晶体和聚集体的平均直径使用Sigma Scan Pro软件来分析。

硬组织粘合强度测量：

牛股骨(在当地屠宰场购买)的皮质部分被用作硬组织模型，以评估添加至生物粘附制剂的填料对所得的生物粘附基质的粘合强度的效应。

使用“FMB-minor”便携式带锯将股骨样品锯成2X2X0.2cm长方体样本。将样本牢固地附着在具有匹配表面面积的金属测试支架上。

粘合强度的测量系统基于用于如本文呈现的软组织粘附的系统，并且具有相似的尺寸。

将140μl的包含各种浓度的测试的填料的生物粘附制剂均匀地散布在两个股骨样本的暴露的侧面上。然后将样本通过施加7.5N的载量立即彼此连接，并置于37℃和100％湿度环境中。在30分钟后，粘合强度使用5500Instron universal testing machine(InstronEngineering Corp.)和2kN测力传感器在室温下以拉力模式来测量。

股骨关节的两个部分以2mm/分钟的恒定速度被拉紧，直到实现分离。

机械测试过程受到标准测试方法ASTM F-2258-03启发。粘合强度被定义为应力-应变曲线中的最大强度，由Instron Merlin软件测量。

实施例2

背景技术

基于Sung等人的教导[J.Biomed.Materials Res.,46(4),520–530页,1999]制备了制剂，用于与根据本发明的一些实施方案的生物粘附制剂和基质进行比较。简言之，在50℃将由预称重的量的藻酸盐制备的储备溶液溶解于蒸馏水中，且溶液澄清后将预称重的量的明胶加入其中，并搅拌直到溶液变得澄清。所得的混合物包含600mg/ml明胶和30mg/ml藻酸盐。将偶联剂EDC溶解于蒸馏水中，以得到10mg/ml溶液和20mg/ml溶液。

所得制剂的测试如下进行。使用之前立刻，将0.1ml明胶-藻酸盐储备溶液与0.035ml EDC储备溶液混合以得到445mg/ml明胶、22mg/ml藻酸盐和2.6mg/ml EDC的终浓度。该混合物在一片猪皮上来制备，并且此后将第二片皮肤放置在制剂上，且将偶联的皮肤片在0.129kg的压力下放置在潮湿培养箱(100％湿度，37℃)中30分钟。对偶联的皮肤片进行如上文呈现的机械测试方案，并展示了4436±1361Pa的结果。应注意，由于在室温下太迅速凝胶化，所得的制剂难以应用于皮肤片。

在重现由Sung等人报道的制剂的另一个尝试中，由水中840mg/ml明胶和42mg/ml藻酸盐的储备溶液制备了具有600mg/ml明胶、30mg/ml藻酸盐和20mg/ml EDC的终浓度的制剂。此制剂不可能应用，不论偶联剂浓度。

实施例3

粘合强度

进行了若干系列的测量以阐明生物粘附制剂的每个组分对所得生物粘附基质的粘合强度的效应，以千帕(KPa)来表示。明胶、藻酸盐和偶联剂EDC浓度的效应显示于表1、图1和图2中。

表1显示了对四个系列的样品进行的粘合强度测试除以变化的参数的结果，其中藻酸盐在系列1、2和3中不同，而明胶跨越系列1-3不同，且EDC在系列4中不同而明胶和藻酸盐不变。

表1

如在表1、图1和图2中可见，粘合强度随着明胶浓度的增加而增加，且在藻酸盐浓度为约40mg/ml时观察到最高的粘合强度。EDC浓度的增加导致粘合强度的增加。

包含200mg/ml的浓度下的明胶、40mg/ml的浓度下的藻酸盐和20mg/ml的浓度下的EDC的生物粘附制剂被选择代表用于下文呈现的研究的示例性生物粘附制剂。该生物粘附制剂导致展示约10KPa的粘合强度的生物粘附基质，其比Evicel^TM(由Johnson and Johnson生产的纤维蛋白粘合剂，具有如使用上文呈现的系统和方案测量的约2.5KPa的粘合强度)的粘合强度更强了四倍。

时间对所选择的生物粘附制剂的粘合强度的效应示于图3中。

如在图3中可见，粘合强度在最初5小时期间仅略微变化，但在10小时后粘合强度存在显著增加并达到约24KPa。后者可通过皮肤的一些脱水进行解释。该结果显示，本示例性生物粘附基质保持足够的强度至少10小时。

在混合生物粘附制剂的组分后两小时，将所得生物粘附基质的样品浸入水性介质中24小时以评估其水吸收动力学给出溶胀的指示，并且结果示于图4中。

如在图4中可见，水吸收随浸入时间线性地增加，而在最初5小时期间是相对低的。该结果对于组织生物粘附剂应用是期望的。

实施例4

生物活性剂的洗脱

分析根据本发明的一些实施方案的生物粘附制剂的组分对从相应生物粘附基质的各种药物释放曲线的影响，不仅允许设计适合生物粘附剂的特定治疗要求的控释产物，而且还提供对从生物粘附基质的药物释放动力学的原理的见解。

对粘合强度的效应：

检查了两种类型的生物粘附基质的药物洗脱样品：负载布比卡因的生物粘附基质和负载布洛芬的生物粘附基质。包含明胶(200mg/ml)、藻酸盐(40mg/ml)和EDC(20mg/ml)的制剂被选择为示例性生物粘附制剂。测量了包含三种不同药物浓度(载量)1％w/v、2％w/v和3％的基质的以拉力的粘合强度，并且结果示于图5和图6、以及下文的表2中。

表2

如在表2、图5和图6中可见，掺入布比卡因和布洛芬的生物粘附基质显示对其粘合强度的相反效应。尽管布比卡因具有增加生物粘附剂的粘合强度的积极效应，布洛芬则降低粘合强度。

药物释放曲线：

检查了如上文呈现的两种类型的药物洗脱生物粘附基质中的生物粘附制剂的组分和药物含量对药物释放曲线的效应。

选择了包含3％w/v生物活性剂布比卡因或布洛芬的200mg/ml明胶、40mg/ml藻酸盐和20mg/ml EDC的参考生物粘附制剂。通过改变其在制剂中的浓度同时保持其他组分的浓度未改变，检查了生物粘附制剂的各组分对从相应生物粘附基质的释放曲线的效应。

用于测试的浓度范围根据应用制剂的实际能力，从粘度和毒性(特别是有毒的偶联剂)两种类型的方面来确定。

(a)布比卡因释放：

为了检查明胶对布比卡因的释放曲线的效应，测量了由具有两种明胶浓度，100mg/ml和200mg/ml的生物粘附制剂制备的生物粘附基质的释放曲线。获得的数据示于图7中。

如在图7中可见，在预固化的生物粘附制剂中的明胶浓度对布比卡因的释放速率的效应是微弱的；明胶浓度的降低减少了从相应生物粘附基质的药物的突释效应。

为了检查藻酸盐对布比卡因的释放曲线的效应，比较了从三种不同藻酸盐浓度，20mg/ml、40mg/ml和60mg/ml的生物粘附制剂的释放曲线。获得的数据示于图8中。

如在图8中可见，在预固化的生物粘附制剂中藻酸盐浓度的降低增加了从相应生物粘附基质的药物的突释效应。

为了检查EDC对布比卡因的释放曲线的效应，比较了从由包含五种不同EDC浓度，0mg/ml、4mg/ml、10mg/ml、15mg/ml和20mg/ml的预固化的生物粘附制剂制备的生物粘附基质的释放曲线。获得的数据示于图9中。

如在图9中可见，EDC浓度的增加降低了布比卡因的突释效应。

为了检查预固化的生物粘附制剂中药物含量对从相应生物粘附基质的其释放曲线的效应，比较了从包含三种布比卡因浓度，1％w/v、2％w/v和3％w/v的生物粘附制剂得到的基质的布比卡因的释放曲线。获得的数据示于图10中。

如在图10中可见，布比卡因浓度的增加降低了药物的突释效应。

应注意，在由示例性测试的生物粘附制剂制备的所有基质中，约99％的包封的布比卡因在实验的最初3天期间被释放。此外，100％的药物被认为是直到2周后实验结束时被释放的生物活性剂的总量，由于发现了在2周释放后保留在基质中的药物量是可忽略的，考虑布比卡因是从亲水性偶联的明胶-藻酸盐基质上释放的亲水性药物的事实，其是合理的。来自所有研究的样品的突释值示于表3中。

表3

EDC对布比卡因释放的影响的检查表明溶胀和透水性在药物释放机制中的作用。应注意，EDC浓度的增加降低了布比卡因的突释效应。通常，在水凝胶的玻璃化状态，药物的扩散能力可忽略不计，并且当水凝胶被充分水合时，其变成橡胶似的并且药物可扩散出。

对该结果的支持可见于水吸收测试中，其显示了EDC浓度对所得生物粘附基质在释放的最初数小时内的水吸收具有显著影响(参见，图15和下文表5)。由于上述原因，EDC浓度的增加降低了所得生物粘附基质的水吸收。

因为明胶和藻酸盐未化学交联至任何显著程度，并且因此制剂完全溶解，从释放曲线可见，无EDC的生物粘附基质具有100％突释效应。

药物浓度对其释放速率实验的影响，表明释放的扩散可控特性。如从释放曲线可见的，虽然由具有更高浓度的药物的制剂制备的生物粘附基质在突释时间范围内实际释放更大质量的药物，但相对于负载的药物的总量该突释效应仍较小。

水吸收结果(参见，以下实施例5)显示，明胶和藻酸盐两者对生物粘附基质在最初数小时内的溶胀具有类似的效应。明胶和藻酸盐两者的浓度的减少还减少了出于两种可能原因的相应生物粘附基质的水吸收。

应注意，布比卡因和藻酸盐的等电点(pKa)分别是8.1-8.4和3.4-4.4。这意味着在pH 7的释放条件下，布比卡因分子带正电荷且藻酸盐分子带负电荷。因此，静电吸引在布比卡因和藻酸盐之间发生。因此，当增加藻酸盐浓度时，假设布比卡因释放的延迟是作为静电吸引的结果是合理的。

在其侧链中具有胺和羧基基团两者的A型明胶的等电点为7.0-9.0，其意味着如果不是中性，则明胶在pH 7带有正电荷。因此，预期了在明胶链和还带正电荷的布比卡因分子之间的静电斥力，并且可假设当明胶浓度增加时，该斥力增加。除水溶胀外，这还有助于布比卡因的更大突释效应。

生物粘附制剂的所有三个组分(明胶、藻酸盐和EDC)对生物粘附基质中给定浓度的布比卡因的释放曲线的效应的整体检查，显示与明胶和藻酸盐相比EDC对药物释放曲线具有更显著的效应。

(b)布洛芬的释放：

对于根据本发明的一些实施方案的生物粘附基质，测试了生物粘附制剂中的EDC和药物含量对布洛芬的释放动力学的效应。

在实验的时间段内，包封的布洛芬仅一小部分被释放。两个身份不明的峰(一个单峰和一个双峰)在HPLC色谱图中的出现，表明布洛芬分子的一部分与预固化生物粘附制剂中的某些组分反应，以得到布洛芬衍生物。结果，生成布洛芬释放曲线需要规定计算的理论量的负载的药物，基于空气干燥的生物粘附基质样品的重量，作为药物在样品中的100％量。

为了检查EDC对布洛芬的释放曲线的效应，比较了从具有三种不同EDC浓度，10mg/ml、15mg/ml和20mg/ml EDC的生物粘附制剂制备的三种基质的释放曲线。获得的数据示于图11中。

如在图11中可见，EDC浓度在生物粘附制剂中的增加降低了布洛芬从相应基质的突释效应和释放的布洛芬的总效率。

为了检查布洛芬对其释放曲线的效应，三种不同布洛芬浓度，1％w/v、2％w/v和3％w/v布洛芬被用于制备生物粘附制剂。获得的数据示于图12中。

如在图12中可见，布洛芬含量在生物粘附制剂中的增加增加了从相应基质释放的总原始(pristine)布洛芬的效率，同时突释效应最低限度地受到布洛芬浓度的影响。

突释效应(最初六小时)和从所有研究的样品中释放的总纯布洛芬示于表4中。

表4

如以上提及的，鉴于该结果，已假定了布洛芬分子与生物粘附制剂中的某些组分反应以得到布洛芬衍生物。布洛芬在生物粘附制剂中的反应性的原因归因于其羧基基团。

布洛芬的释放曲线的观察结果支持布洛芬和EDC之间的假定的反应。EDC浓度在生物粘附制剂中的增加降低了从相应基质的布洛芬的突释效应，如预期的，而且还降低了原始布洛芬释放的效率。当在药物的恒定浓度下增加制剂中的EDC浓度时，与EDC反应的布洛芬的相对比例同样增加。同样地，由于在恒定浓度的EDC下，与EDC反应的布洛芬的相对比例减少，生物粘附制剂中的布洛芬浓度的增加增加了其释放效率。

实施例5

初始水吸收

检查了根据本发明的一些实施方案的生物粘附制剂中的各种组分的浓度对所得基质在从制备的最初六小时期间的初始水吸收的效应。选择包含200mg/ml明胶、40mg/ml藻酸盐和20mg/ml EDC的生物粘附制剂作为参考制剂。

与药物释放测试类似，用于初始水吸收测试的浓度范围根据依据在明胶和藻酸盐情况下的粘度、或EDC情况下的毒性应用制剂的实际能力来确定。根据这些标准，检查了明胶浓度对包含100mg/ml和200mg/ml明胶的制剂的效应，检查了藻酸盐浓度对包含20mg/ml和40mg/ml藻酸盐的制剂的效应，以及检查了EDC浓度对包含10mg/ml和20mg/ml EDC的制剂的效应，并且结果分别示于图13、图14和图15中。

如在图13、图14和图15中可见，EDC浓度的降低增加了通过生物粘附基质的水吸收，而明胶或藻酸盐浓度在制剂中的降低降低了通过相应生物粘附基质的水吸收。

表5总结了示例性生物粘附基质在最初六小时期间测量的初始水吸收。

表5

实施例6

细胞毒性

在一个实验中，测试了根据本发明的一些实施方案的生物粘附制剂的各组分对细胞毒性的效应。获得的数据示于图16中。

如在图16中可见，24小时后的结果显示了，与对照相比，藻酸盐或明胶是生物相容的并且不会引起任何细胞毒性效应。

在另一个实验中，示例性生物粘附制剂/基质对细胞的生命力的效应通过将细胞暴露于基于200mg/ml或300mg/ml明胶和40mg/ml或30mg/ml藻酸盐和不同EDC浓度(0mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml和20mg/ml)的制剂来证实，并且结果示于图17A、图17B中。

如在图17A、图17B中可见，当EDC的浓度增加时，细胞生命力降低。当将细胞暴露于基于200mg/ml明胶和40mg/ml藻酸盐以及低浓度的EDC(0mg/ml、5mg/ml和10mg/ml)的生物粘附基质时，细胞显示了相对高的生命力(89％-100％)，而在更高EDC浓度(15mg/ml和20mg/ml)下，细胞生命力分别降低至73％和71％。还在与包含生物粘附基质的培养基温育48小时后观察到了此趋势。当将细胞暴露于基于300mg/ml明胶和30mg/ml藻酸盐的生物粘附制剂时，低浓度的EDC(0mg/ml、5mg/ml和10mg/ml)导致了相对高的细胞生命力(88％-96％)，而在更高EDC浓度(15mg/ml和20mg/ml)下，细胞生命力分别降低至76％和71％。通常，可推断，甚至在相对高的EDC浓度下，维持相对高的生命力。

因此，可推断，从根据本发明的一些实施方案的生物粘附制剂得到的生物粘附基质是生物相容的，并且可被安全地使用。

在暴露于1、2和3％w/v布比卡因和布洛芬的水溶液24小时之后，通过测量相对于对照细胞的阿尔玛蓝还原的其阿尔玛蓝还原还检查了成纤维细胞的生命力。获得的数据示于图18A、图18B中。

如在图18A、图18B中可见，对于布比卡因和布洛芬两者，当测试浓度比1％w/v更高时，获得了一些细胞毒性效应。在布比卡因的存在下细胞活力值(对于2％w/v和3％w/v药物分别为67.6％和58.8％)比在布洛芬的存在下获得的细胞活力值(对于2％w/v和3％w/v药物分别为93.5％和79.7％)更低。在本文中应注意，与对照相比，在所有情况下，实现了至少50％细胞活力。在本文中还应注意，与使用负载药物的生物粘附基质的实验相比，由于药物从生物粘附基质逐渐释放超过3天，其不同于本实验中的条件，该测试特征为得到低细胞活力结果的趋势。

实施例7

微观结构表征

根据本发明的一些实施方案，用明胶(200mg/ml)、藻酸盐(40mg/ml)和EDC(20mg/ml)的浓度和预负载了1％w/v布比卡因或布洛芬制备的空气干燥的生物粘附基质样本的大批横截面使用环境扫描电子显微镜(ESEM)进行观察。获得的数据示于图19A、图19B、图19C和图19D中。

如在图19A、图19B、图19C和图19D中可见，无药物参考样品不显示任何相分离，并且展现可能起因于断裂过程的一些裂缝，而负载布比卡因的生物粘附基质的断口组织照片提供药物在生物粘附基质内的分散和结晶的清晰视野。如在图19B、图19C和图19D中可见，布比卡因均匀地分散于基质中并结晶为两层结构：形成纤维状的二级结构的针的主要结构。这种类型的结晶显然将负载布比卡因的生物粘附基质变成一种纤维增强复合材料。

纤维的直径的评价通过测量来自3种不同样本(总计150根纤维)的相同面积的50根纤维的直径来进行。针的直径的评价通过测量3种不同纤维(总计120根针)的40根针/纤维的直径来进行。负载布比卡因的生物粘附基质分别展现11.69±2.49μm和0.49±0.09μm的平均纤维和针直径。不论布比卡因晶体的尺寸，其在基质中的均匀分散指示负载布比卡因的生物粘附基质实际上是一种整体(monolithic)系统，展示对整体装置典型的释放曲线。

还表征了负载布洛芬的生物粘附基质样品的结构。布洛芬在生物粘附基质样品中的存在可在某些区域中被检测到。此类区域的实例显示于图20A、图20B中。

如在图20A、图20B中可见，布洛芬晶体以没有任何二级结构的针状结构随机分布于生物粘附基质中。

不受任何特定理论束缚，由于以相同的方式将其与生物粘附制剂组分混合，并且因为其释放曲线显示了对整体系统典型的随时间而减少的相同的行为，假设布洛芬，类似于布比卡因，也均匀地分散于基质中。

实施例8

包含填料的生物粘附制剂

包含示例性填料，羟基磷灰石(HA)和β-磷酸三钙(β-TCP)的生物粘附制剂的制备基于用于制备无填料的生物粘附制剂的过程，并且通过将各种量的明胶、藻酸盐和填料粉末溶解于蒸馏水中同时加热至60℃来进行。在生物粘附剂的使用之前，立即加入各种量的交联剂(EDC)。包含填料的所有研究的制剂示于以下表6和表7中。

表6显示了用于软组织粘附的包含HA和β-TCP的研究的生物粘附制剂。

表6

表7显示了用于硬组织粘附的包含HA和β-TCP的研究的生物粘附制剂。

表7

实施例9

填料对软组织粘合强度的效应

负载HA和负载β-TCP的生物粘附制剂对软组织的粘合强度在以下各种填料浓度下来测量：0.125％、0.25％和0.5％w/v。由于虽然HA和β-TCP基本上不溶于水溶液，所以选择这些相对低浓度，但是这些填料可仅以最小限度的沉淀被负载在生物粘附水凝胶内。在本研究中使用了明胶(200mg/ml)、藻酸盐(40mg/ml)和EDC(20mg/ml)的浓度。

将粘合强度的结果与无填料制备的生物粘附制剂的粘合强度进行比较。对于各制剂进行了十五次重复，并且结果示于图21A、图21B中。

如在图21A中可见，HA和β-TCP两者的掺入增加了生物粘附基质的粘合强度。在0.25％w/v以及更高的浓度下得到了具有HA的增加的粘合强度。与无填料的相应生物粘附剂的8.4±2.3kPa相比，观察到0.25％w/v的HA浓度的最高粘合强度为18.1±4.0kPa。增加HA浓度至0.5％w/v降低了粘合强度(13.4±1.6kPa)，然而，其仍然比参考制剂的粘合强度更高。如在图21B中还可见，发现所有检查的β-TCP浓度增加了粘合强度，在用其不同浓度制备的样品之间未观察到显著差异。对0.5％w/v的β-TCP浓度测量到最高平均值(15.2±2.6kPa)。

交联剂的相对低浓度有利于生物相容性和减少的细胞毒性的方面。因此，填料对具有减少的浓度的EDC(10mg/ml)的生物粘附制剂的粘合强度的效应同样使用三种相同浓度的填料，即0.125％、0.25％和0.5％w/v)以及同样的聚合物组分明胶(200mg/ml)和藻酸盐(40mg/ml)浓度来研究。对于各制剂进行了十五次重复，并且结果示于图22A、图22B中。

如在图22A中可见，掺入用减少的量的EDC(10mg/ml)制备的负载HA和负载β-TCP的生物粘附制剂具有与具有20mg/ml的EDC浓度的无填料的生物粘附剂的粘合强度相似的粘合强度。发现，包含减少的EDC(10mg/ml)和分别0.5％w/v和0.125％w/v HA或β-TCP的浓度的生物粘附基质具有甚至更高的粘合强度。

使用相同粘合强度系统还测量了商品化纤维蛋白胶Evicel^TM的粘合强度，并且在Evicel^TM(2.5±2.3kPa)和根据本发明的一些实施方案的包含HA和β-TCP的生物粘附基质的粘合强度之间的比较，显示了，与Evicel^TM相比，甚至当EDC浓度减少了一半时，填料的掺入使得能够实现对软组织达到7倍更高的粘合强度。

实施例10

填料对硬组织粘合强度的效应

还检查了根据本发明的一些实施方案的负载HA和负载β-TCP的生物粘附基质在硬组织粘合中的其潜在用途。

将0.25％w/v HA和0.5％w/vβ-TCP加入至根据本发明的一些实施方案的示例性生物粘附制剂中，并且将粘合强度结果与无填料的参考生物粘附制剂比较，聚合物组分的浓度对所有测试保持相同(将EDC浓度设置为20mg/ml)。对于各制剂进行了三次重复，并且结果示于图23中。

如在图23中可见，加入0.25％w/v HA使生物粘附基质的粘合强度从26.6±9.2kPa至71.4±28.2kPa几乎增至三倍，而包含β-TCP的样品不显示相同的效应。

评估了其他生物粘附剂对硬组织的粘附能力，并且发现在相似测试条件下，纤维蛋白和明胶-间苯二酚-甲醛制剂分别显示11和200kPa的离体粘合强度。掺入了HA颗粒的根据本发明的实施方案的生物粘附制剂/基质，展示了对硬组织的粘合强度值比纤维蛋白的高6.5倍(71.4±28.2kPa)，且比明胶-间苯二酚-甲醛粘合剂的低，明胶-间苯二酚-甲醛粘合剂被认为比本文呈现的生物粘附制剂更不生物相容(甲醛比EDC显著更多的细胞毒性)。

实施例11

填料对基质的微观结构的效应

使用ESEM检查了分别包含0.125％和0.5％w/v HA和β-TCP的空气干燥的生物粘附基质的大批横截面。对于所有样品，保持明胶(200mg/ml)、藻酸盐(40mg/ml)和EDC(20mg/ml)的浓度恒定。上文呈现的无填料的生物粘附剂的微观结构分析已显示了在生物粘附制剂的三种基本组分，明胶、藻酸盐和EDC的存在下未发生相分离。负载HA和负载β-TCP的生物粘附制剂的断口组织照片示于图24A、图24B、图24C、图24D、图24E、图24F中。

如在图24A、图24B、图24C、图24D、图24E、图24F中可见，断口组织照片提供对生物粘附基质中的填料的结晶的清晰视野。断口组织照片还显示了，在较低浓度下，HA和β-TCP颗粒不均匀地分散于粘合剂中。更高浓度的填料似乎提供更均匀的分散。

软组织粘合强度实验显示，由于将这些填料加入至生物粘附制剂增加了其粘合强度，HA和β-TCP两者可被认为是有效的加固填料。

由于其控制生物粘附基质中的交联密度，交联剂浓度对粘合强度具有显著的效应。如上文呈现的，将交联剂浓度从20mg/ml至10mg/ml减少一半，导致源自同样制剂的生物粘附基质的粘合强度减少约两倍。将减少EDC(10mg/ml)浓度的负载HA和负载β-TCP的生物粘附基质的粘合强度结果与无填料的参考生物粘附剂(20mg/ml EDC)的粘合强度结果相比，显示，当减少交联剂浓度时，HA和β-TCP两者对粘合强度具有补偿效应。由于EDC被证明具有一定的细胞毒性效应，这种补偿效应还具有临床和医学重要性，因为其使得能够改进粘合剂的生物相容性，而不损害其粘合强度，甚至改进粘合强度。

实施例12

粘附机理

使用本文呈现的生物粘附制剂/基质测试了两种主要的粘附机理：

(1)机械联锁-粘附为粘合剂渗透进粘附物的表面上的孔、凹槽和其他不规则部位的结果。

(2)化学粘附-粘附为粘附剂和粘附物的表面上的分子之间的分子内键(范德华力、离子键、共价键、氢键和/或金属键)的结果。

对大多数粘合剂，粘合机理被认为是机械联锁和化学吸附的组合。两种机理的每个对最终粘合强度的成比例的贡献是可变的，并受到粘合剂类型、表面粗糙度和环境的影响。

在阐明本文呈现的生物粘附制剂/基质的粘合剂机理的尝试中，还研究了明胶、藻酸盐和交联剂的浓度及其粘度对生物粘附剂粘合软组织的能力的效应。因此，根据粘附机理描述这些效应的定性模型示于下文。

所有研究的制剂系列示于表8-10中

表8显示了具有不同EDC浓度和各种明胶-藻酸盐组合的根据本发明的一些实施方案的研究的生物粘附制剂，而“LV”表示低粘度(0.1-0.3Pa-sec)。

表8

表9显示了具有不同明胶布鲁姆数的研究的生物粘附制剂，而“LV”表示低粘度(0.1-0.3Pa-sec)。

表9

表10显示了具有在各种明胶浓度下的不同藻酸盐浓度和粘度的研究的生物粘附制剂，而“LV”表示低粘度(0.1-0.3Pa-sec)且“HV”表示高粘度(多于2Pa-sec)。

表10

离体粘合强度测量如上文对软组织研究描述的进行。

EDC浓度的效应：

EDC对粘合强度的效应通过测量以下两种主要组合的粘合强度来评估：200mg/ml明胶与40mg/ml藻酸盐(Ge-200:Al-40)，和300mg/ml明胶与30mg/ml藻酸盐(Ge-300:Al-30)，具有90-110的明胶布鲁姆数和LV藻酸盐，并以5、10、15和20mg/ml EDC浓度(参见，表8)，并且结果示于图25A、图25B中。

如在图25A、图25B中可见，EDC浓度的增加导致两种明胶-藻酸盐制剂的粘合强度的显著增加。对于Ge-200:Al-40制剂，EDC浓度从5mg/ml增加至20mg/ml将生物粘附剂的粘合强度从3.2±0.8kPa增加至11.5±2.0kPa(图25A)，且对于Ge-300:Al-30制剂，EDC浓度从5mg/ml增加至20mg/ml将生物粘附剂的粘合强度从5.1±1.1kPa增加至13.0±2.7kPa(图25B)。

增加EDC浓度导致更密集的生物黏附交联网络。更密集的网络导致粘合剂的更好的机械性能和更大的粘聚强度，其促进粘附的机械联锁机理。更高的交联密度还可导致撕裂的组织中暴露的官能基团和粘合剂之间的共价键的更高的密度，其促进通过化学吸附机理的粘附。

明胶布鲁姆数的效应：

布鲁姆数可提供从具有已知浓度的溶液形成的凝胶的强度的指示。凝胶越强特征为越高的布鲁姆数。布鲁姆数还反映其成分的平均分子量。明胶布鲁姆数对粘合强度的效应通过测量具有90-110、175和300三种不同明胶布鲁姆数的Ge-200:Al(LV)-40:EDC-20生物粘附剂的粘合强度来检查。还评估了这些生物粘附制剂的每个的非交联的Ge-Al溶液的粘度(参见，表9)。结果示于图26A、图26B中。

如在图26A中可见，增加明胶布鲁姆数导致生物粘附剂的粘合强度的一致和显著减少，从具有90-110的布鲁姆数的明胶的11.5±2.0kPa减少至具有300的布鲁姆数的明胶的6.4±1.6kPa。增加明胶的分子量，即增加布鲁姆数，降低了生物粘附剂的流动性，并还可能降低明胶串(strings)渗透进入软组织的表面上的孔或不规则部位的能力。因此，降低机械联锁对粘附剂与组织的一般粘附效应的贡献，并且粘合强度降低。

当增加明胶布鲁姆数时生物粘附剂的流动性的减少，可在初始粘度结果中发现支持。如在图26B中可见，将明胶布鲁姆数从90-110增加至300导致粘度从12.5Pa-sec显著增加至38.8Pa-sec。

聚合物组分浓度的效应：

基于上文呈现的结果，使用具有90-110的布鲁姆数的明胶检查两种聚合物组分浓度对生物粘附剂的粘合强度的效应。具有200、300和400mg/ml的浓度的明胶和10、20、30和40mg/ml的浓度的LV藻酸盐的生物粘附制剂用20mg/ml的恒定浓度的EDC来检查(参见，表10)。在本文中应注意，对于基于比200mg/ml更高浓度的明胶的生物粘附制剂，30mg/ml是测试的藻酸盐的最高浓度，由于更高藻酸盐浓度导致太粘稠而不能被均匀混合的溶液。结果示于图27A、图27B、图27C中。

如在图27A、图27B、图27C中可见，当使用200mg/ml的明胶浓度时，对于最高和最低藻酸盐浓度两者实现最大粘合强度(对于10和40mg/ml藻酸盐分别是10.3±1.3和11.5±2.0kPa)。

如在图27B、图27C中进一步可见，对具有300和400mg/ml的相对高浓度明胶的生物粘附制剂获得了藻酸盐浓度对粘合强度的不同效应。在具有300mg/ml的明胶浓度的生物粘附制剂中，对测试的30mg/ml最高藻酸盐浓度测量到13.0±2.7kPa的最大粘合强度(图27B)。发现藻酸盐浓度对具有400mg/ml的明胶浓度的生物粘附制剂中的粘合强度具有小的效应(图27C)。此种不同行为可能指示，当明胶浓度相对高时，藻酸盐浓度(其显著小于明胶浓度)对粘合剂的交联密度和3维结构缠结水平具有较小效应，并且因此仅展现对粘合强度的小效应。

藻酸盐的粘度的效应：

藻酸盐的粘度与其链的平均分子量相关。使用了基于200、300和400mg/ml的明胶浓度和10、20和30mg/ml的藻酸盐浓度的制剂。用低粘度(LV藻酸盐)和高粘度(HV)藻酸盐两者测试了各个制剂，并且将EDC浓度保持在20mg/ml。在本文中应注意，30mg/ml HV藻酸盐的溶液太粘稠而不能与浓度高于200mg/ml的明胶均匀混合，且包含40mg/ml HV藻酸盐的生物粘附剂溶液甚至与仅200mg/ml明胶不可均匀混合。检查的制剂示于表10中，并且结果示于图28A、图28B、图28C中。

如在图28A、图28B、图28C中可见，发现基于200mg/ml明胶的HV藻酸盐生物粘附制剂显示与LV藻酸盐的浓度对粘合强度的相似的效应，即，对于本研究中使用的最高和最低HV藻酸盐浓度获得了最高粘合强度(对于10和30mg/ml HV藻酸盐分别是9.8±2.3和8.1±1.4kPa；图28A)。发现藻酸盐的粘度对粘合强度的效应与明胶的粘度(布鲁姆数)对粘合强度的效应相反。使用HV藻酸盐代替LV藻酸盐轻微地改进粘合剂的粘附强度，除了检查的最低藻酸盐浓度(10mg/ml)之外，其中未观察到显著差异。

藻酸盐的粘度对基于具有各种藻酸盐浓度的200mg/ml明胶(90-110布鲁姆数)的制剂的明胶-藻酸盐溶液的总粘度的效应示于图29中。

如在图29中可见，当使用HV藻酸盐代替LV藻酸盐时，将生物粘附制剂前体(明胶-藻酸盐溶液)的粘度增加了5-6倍。然而，这种变化仅使从相似明胶-藻酸盐含量的制剂得到的生物粘附基质的粘合强度中的较少改进成为可能(参见，图28A)。这种现象表明，尽管藻酸盐的粘度强烈影响明胶-藻酸盐溶液的粘度，其对生物粘附剂的强度仅具有较小的效应(图28A)。这可意味着，产生可为不同应用定制的具有相似粘附性质但不同粘度的生物粘附制剂是可能的。

制剂-强度模型：

基于上文呈现的发现，建议定性模型，其描述生物粘附制剂的参数对所得生物粘附基质的粘合强度的效应。此模型的示意图示于图30中。

实施例13

EDC和NHS的组合效应

在根据本发明的一些实施方案的生物粘附制剂中，将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入至明胶与EDC的交联反应中，以改进交联反应效率，降低副反应，并且降低实现有效的交联需要的EDC的量。

设计本研究以确定得到基于明胶和藻酸盐的有效的生物粘附制剂的EDC和NHS的最佳量。以0％、10％、20％、40％和50％的含量测试了NHS(以EDC的量的百分比)，并且结果示于图31中。

如在图31A、图31B中可见，NHS在本文呈现的生物粘附制剂中的掺入得到展示更高粘合强度同时使用较少交联剂EDC的生物粘附基质。

这些实验表明，以加入相对小量的其他交联剂诸如NHS，可显著降低EDC浓度。

实施例14

负载了抗生素药物的生物粘附制剂

克林霉素因其针对革兰氏阳性球菌、革兰氏阳性和革兰氏阴性厌氧菌和某些原生动物的活性而闻名。尽管克林霉素的良好的抗菌谱，但其全身施用与名为伪膜性小肠结肠炎的严重的抗生素相关的并发症有关。因此，局部递送这种药物可潜在地降低全身性并发症的风险。因此，本文呈现的研究旨在调查以生物粘附制剂/基质负载抗生素药物诸如克林霉素的可能性。

如上文所述制备了包含抗生素药物的生物粘附制剂，并且如上文所述测量了所得生物粘附基质的机械特性。根据本发明的一些实施方案的示例性负载克林霉素的生物粘附制剂的粘合强度测量的结果示于图32A、图32B中。

如在图32A、图32B中可见，由于克林霉素不展示羧基或伯胺基团，并且因此其对交联反应是惰性的，其的存在不降低粘合强度而在一定程度上增加了粘合强度。

根据上文呈现的方案还测量了克林霉素的释放曲线。这些研究表明，所有研究的包含各种浓度药物的制剂中，大部分抗生素药物在6小时内从生物粘附基质上释放。

实施例15

负载了止血剂的生物粘附制剂

在本文呈现的生物粘附制剂中掺入止血剂可有益于各种医药应用。因此，研究了从用示例性止血剂高岭土和氨甲环酸制备的生物粘附制剂形成的示例性生物粘附基质的粘合强度，并且结果示于表11中。

对本研究选择的示例性生物粘附制剂和所得生物粘附基质的平均粘合强度示于表11中。

表11

在生物粘附制剂中掺入示例性止血剂高岭土和氨甲环酸的效应示于表12中。

表12

如可见，掺入高岭土增加了两种研究的制剂的粘合强度，而掺入氨甲环酸导致了降低粘合强度。

虽然本发明已结合其具体实施方案被描述，但显然许多替换、修改和变化将对本领域技术人员是明显的。因此，意在涵盖落入所附权利要求的精神和宽范围内的所有此类替换、修改和变化。

在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用以其整体并入本说明书，其程度如同每个单独出版物、专利或专利申请被具体和单独指明通过引用并入的相同程度。此外，本申请中的任何参考文献的引用或标识不应被解释为此类文献可用为本发明的现有技术的承认。在部分标题被使用的范围内，其不应被解释为必然限制。

Claims (12)

1.一种用于制备生物粘附制剂的试剂盒，所述试剂盒包含子制剂A和子制剂B，所述子制剂A包含溶解于水中的明胶和藻酸盐，并且所述子制剂B包含碳化二亚胺，而所述子制剂A与所述子制剂B的组合提供所述生物粘附制剂，所述生物粘附制剂用于在允许经过固化时间后形成生物粘附基质，并且其中在所述组合后：

所述明胶在所述生物粘附制剂中的浓度范围为从100mg/ml至400mg/ml，

所述藻酸盐在所述生物粘附制剂中的浓度范围为从20mg/ml至60mg/ml，并且

所述碳化二亚胺在所述生物粘附制剂中的浓度范围为从5mg/ml至50mg/ml，

以使得在固化前，所述生物粘附制剂的特征为范围从1Pa-sec至50Pa-sec的室温粘度，并且以使得所述固化时间范围为从5秒至30分钟。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述子制剂B中的所述碳化二亚胺溶解于水中。

3.如权利要求1-2中任一项所述的试剂盒，其中所述基质特征为以下中的至少一个：

范围从2,000帕至60,000帕的有生命力的生物对象的粘合强度；

生理条件下范围从0.5Mpa至200MPa的挠曲强度；以及

范围从7天至6个月的生物可降解速率。

4.如权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其中所述明胶在所述制剂中的浓度范围为从200mg/ml至300mg/ml，所述藻酸盐在所述制剂中的浓度范围为从20mg/ml至40mg/ml，并且所述碳化二亚胺在所述制剂中的浓度范围为从10mg/ml至30mg/ml。

5.如权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其中所述子制剂A和/或所述子制剂B还包含交联促进剂。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其中相对于所述碳化二亚胺在所述制剂中的量，所述交联促进剂在所述制剂中的浓度范围为从1％至50％。

7.如权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其中所述子制剂A和/或所述子制剂B还包含填料。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其中所述填料在所述制剂中的浓度范围为从所述制剂的0.1％w/v至1％w/v。

9.如权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其中所述子制剂A和/或所述子制剂B还包含生物活性剂。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其中所述生物活性剂在所述制剂中的浓度范围从所述制剂的总体积的0.1％重量/体积至10％重量/体积。

11.如权利要求1-10中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒为双室分配器的形式，其中所述分配器包含用于容纳并分配所述子制剂A的至少一个室A和用于容纳并分配所述子制剂B的室B。

12.一种双室分配器，所述双室分配器用于应用如权利要求1-11中任一项所述的生物粘附制剂，所述双室分配器包括具有联合递送口的双桶盒组件、用于与混合管结合的底座以及混合管，其中所述双桶盒组件的桶盒A被配置用于分配所述子制剂A，并且所述双桶盒组件的桶盒B被配置用于分配所述子制剂B，以使得在所述分配后，所述子制剂A和所述子制剂B组合从而形成所述生物粘附制剂。