CN106573086A - 生物组织粘合组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

提供了生物组织粘合组合物。所述生物组织粘合组合物包含一种或多种接枝有至少一个儿茶酚片段并包含至少一个可交联官能团的大分子；用于交联所述至少一个儿茶酚片段的第一交联剂，其中所述第一交联剂包含多价金属离子或由多价金属离子组成；用于共价交联所述至少一个可交联官能团的第二交联剂，其中所述一种或多种大分子通过以下而交联：(a)所述至少一个儿茶酚片段与所述多价金属离子之间的络合物形成，和(b)所述至少一个可交联官能团与所述第二交联剂之间的共价结合。还提供了生物组织粘合组合物的制备方法和工作原理。

Description

生物组织粘合组合物及其制备方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年7月16日递交的新加坡专利申请No.10201404115P的优先权权益，该申请的内容通过引用整体并入本文中用于所有目的。

技术领域

各种实施方式涉及生物组织粘合组合物及制备生物组织粘合组合物的方法。

背景

乳腺癌占女性所有癌症的约23％，并且是世界上最常见的恶性肿瘤。通过手术移除受影响的乳腺组织的乳房切除术是常用的治疗选择。血清肿形成是指手术后体内流体的积累，其是常见的并发症。

乳房切除术之后血清肿形成的发生率可达最高53％，并且可引起许多并发症，包括感染、皮瓣坏死和伤口愈合延迟，这给患者带来了巨大的痛苦。人们认为皮肤和相邻组织之间的死腔导致血清肿形成。

防止血清肿形成的常规方法包括在手术部位缝上皮瓣和放置引流管。这些方法中的每一种都存在限制。例如，缝合方法可有效封闭辅助性死腔(auxiliary dead space)，但可能在防止横断(transaction)渗漏方面表现不佳。

放置引流管由于其侵入性质而展示细菌侵入途径，并且可容易导致深度伤口感染。此外，使用负压引流可增加皮瓣坏死和周围神经损伤的可能性。使用组织粘合剂胶合皮瓣和相邻组织，以物理封闭用于血清肿形成的辅助性死腔，被视为防止血清肿形成的有效策略。

目前可用的组织粘合剂(例如纤维蛋白胶、氰基丙烯酸酯粘合剂或基于戊二醛的粘合剂)已成功用于止血和开放/皮肤伤口封闭。然而，对于大面积体内使用(例如血清肿预防)而言，仍然没有合适的组织粘合剂。

对于大面积体内应用而言理想的组织粘合剂应当：(1)安全且无毒，(2)可快速交联，并且(3)在生理潮湿环境中长期有效。例如，由于纤维蛋白胶(纤维蛋白原和凝血酶)的组分来自血液，所以使用纤维蛋白胶必然存在血液介导的病原体传播的风险。作为另一个实例，基于氰基丙烯酸酯或戊二醛的粘合剂已展示出急性毒性和/或慢性毒性。

已研发出了许多粘合剂、密封剂和止血剂并得到了美国食品和药物管理局(FDA)的批准，如表1中所示。

表1：FDA批准的组织粘合剂、密封剂和止血剂

列出的所有物质均可商购，并且已用于手术。然而，没有一种产品能够用于大面积体内应用，例如血清肿预防，尽管纤维蛋白胶和Bioglue曾被视为有希望的候选物。

纤维蛋白胶含有纤维蛋白原和凝血酶，它们都来自血液并且具有感染污染的风险。由于纤维蛋白胶的结合强度弱并快速降解，其目前应用是在手术期间或之后控制出血。Bioglue由牛血清白蛋白和10％戊二醛组成。最近的研究显示，戊二醛在体内的使用与一些疾病(例如癌症和白血病)有关。

表2中提供了粘合剂、密封剂和止血剂的其它实例，其中存在限制，例如合成复杂和固化时间长。

表2：粘合剂、密封剂和止血剂的其它实例

鉴于上述，存在对克服或至少减轻一个或多个上述问题的经改良生物组织粘合剂的需要。

概述

在第一方面，提供了生物组织粘合组合物。所述生物组织粘合组合物包含

(i)胶合大分子单体，其包含一种或多种接枝有至少一个儿茶酚片段并包含至少一个可交联官能团的大分子；

(ii)用于交联所述至少一个儿茶酚片段的第一交联剂，其中所述第一交联剂包含多价金属离子或由多价金属离子组成；和

(iii)用于共价交联所述至少一个可交联官能团的第二交联剂，其中所述一种或多种大分子通过以下而交联：(a)所述至少一个儿茶酚片段与所述多价金属离子之间的络合物形成，和(b)所述至少一个可交联官能团与所述第二交联剂之间的共价结合。

在第二方面，提供了制备生物组织粘合组合物的方法。所述方法包括

a)提供胶合大分子单体和第二交联剂的混合物，所述胶合大分子单体包含一种或多种接枝有至少一个儿茶酚片段并包含至少一个可交联官能团的大分子，所述第二交联剂用于共价交联所述至少一个可交联官能团；并

b)向所述混合物中加入用于交联所述至少一个儿茶酚片段的第一交联剂，其中所述第一交联剂包含多价金属离子或由多价金属离子组成，以通过所述至少一个儿茶酚片段与所述多价金属离子之间的络合物形成而交联所述一种或多种大分子。

在第三方面，提供了通过根据第二方面的方法制备的生物组织粘合组合物。

在第四方面，提供了用于粘合生物组织的试剂盒。所述试剂盒包含

a)胶合大分子单体，其包含一种或多种接枝有至少一个儿茶酚片段并包含至少一个可交联官能团的大分子；

b)用于交联所述至少一个儿茶酚片段的第一交联剂，其中所述第一交联剂包含多价金属离子或由多价金属离子组成；和

c)用于共价交联所述至少一个可交联官能团的第二交联剂。

在第五方面，提供了粘合生物组织的方法。所述方法包括

a)将胶合大分子单体与第二交联剂的混合物涂覆在第一生物组织上以形成覆盖层，所述胶合大分子单体包含一种或多种接枝有至少一个儿茶酚片段并包含至少一个可交联官能团的大分子，所述第二交联剂用于共价交联所述至少一个可交联官能团；

b)将用于交联所述至少一个儿茶酚片段的第一交联剂添加到所述覆盖层上，所述第一交联剂包含多价金属离子或由多价金属离子组成；

c)使第二生物组织与所得覆盖层接触；并

d)向所述第一生物组织和所述第二生物组织之一或二者施加压力以使所述第一生物组织与所述第二生物组织粘合。

在第六方面，提供了根据第一方面的或者通过根据第二方面的方法制备的生物组织粘合组合物作为用于医学和兽医应用的组织粘合剂和密封剂，在血清肿预防、创伤封闭、补充或替换内部手术程序中的缝线或卡钉、肠吻合、血管吻合、组织修复、眼科手术、药物递送、预防手术后粘连、和/或组织植入中的用途。

附图简介

当结合非限制性实例和附图考虑时，参考详细描述能更好地理解本发明，其中：

图1是描述利用双交联概念制造的新组织粘合剂的工作原理的示意图，其中(a)，儿茶酚接枝的胶合大分子单体与快速交联剂(第一交联剂)通过离子-儿茶酚络合快速交联，同时，儿茶酚基团通过非共价相互作用结合到组织表面，因此这两种组织瞬间胶合在一起；(b)一段时间(几小时)后，胶合大分子单体还与长效交联剂(第二交联剂)交联；且(c)尽管快速交联剂通过体内蛋白质的络合而逐渐损失，但由于与长效交联剂形成的胶合大分子单体的共价交联，组织粘合剂仍然起作用。

图2显示了(A)明胶-多巴胺缀合物的合成方案；(B)(i)明胶溶液(10％，g/mL)和(ii)明胶-多巴胺溶液(10％，g/mL)的UV-可见光谱；和(C)(a)多巴胺、(b)明胶和(c)明胶-多巴胺的¹H NMR谱；(星号标记的)亚甲基的特征质子化学位移通过穿过(a)、(b)和(c)的垂直虚线以及(c)处的箭头示出。

图3是组织粘合剂形成中典型的明胶-多巴胺胶合大分子单体的(a)第一交联和(b)第二交联的示意图。

图4显示了描述明胶-多巴胺胶合大分子单体在(a)干燥泡沫和(b)粘性溶液(15％，g/mL)中的性质的照片。在37℃下孵育(c)0小时、(d)3小时和(e)24小时后，在含0.5％(v/v)胎牛血清的模拟体液(SBF)中，不含京尼平的Fe³⁺单交联水凝胶((c)、(d)和(e)中的左侧样品)或含京尼平的Fe³⁺单交联水凝胶((c)、(d)和(e)中的右侧样品)，和预制双交联水凝胶((c)、(d)和(e)中的中间样品)的外观变化。在(c)、(d)和(e)中，顶行是底行中相应管的倒置管。

图5显示了这样的图表，所述图表显示了：对于(a)HDFs(人皮肤成纤维细胞)和(b)PCCs(猪软骨细胞)，利用分别含有100％(提取物100，(ii))、50％(提取物50，(iii))和25％(提取物25，(iv))的初始提取物溶液的培养溶液，和牛血清白蛋白-戊二醛组织粘合剂的提取溶液(BioGlue，正对照，(i))以及不含任何提取溶液的纯培养基(纯培养基，负对照，(v))的细胞生长。

图6显示了(a)组织培养塑料(tissue culture plastic，TCP)和(b)双交联组织粘合剂上的粘合HDFs的相差图像。(c)是描述HDFs在双交联组织粘合剂上的增殖的图。

图7显示了双交联组织粘合剂、Fe³⁺单交联水凝胶(明胶-多巴胺+Fe³⁺)和胶合大分子单体(明胶-多巴胺)溶液的弹性模量(G′)和粘性模量(G″)作为频率(赫兹)的函数的图。

图8是根据实施方式的这种双交联组织粘合剂的操作过程的示意图，其中(A)将明胶-多巴胺胶合大分子单体(15％，g/mL)和京尼平(Genipin)(0.5％，g/mL)的混合溶液涂覆在组织表面；(B)在工作区添加FeCl₃溶液(100mM)滴，快速形成粘性水凝胶；(C)将两块猪皮的工作区重叠，轻轻按压约5-10秒后粘合两个组织的表面；(D)在37℃下2小时后获得了络合-共价双交联组织粘合剂，其中组织粘合剂在那时变成蓝色。

图9描绘了(a)(i)双交联胶合、(ii)快速胶合和(iii)长期胶合这些不同条件下组织粘合剂的代表性应力-应变曲线；和(b)搭接剪切强度试验的代表性图像。

图10是显示(a)软骨胶合和(b)(猪皮)胶原层胶合之后粘合剂的代表性应力-应变曲线的图。

图11是显示在胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)溶液中，作为孵育时间的函数的双交联组织粘合剂的降解的图。

图12显示了：(a)在裸鼠中植入双交联组织粘合剂之后，分别在第4天、第14天和第28天提取的样品(含有鼠皮)的总体视图；(b)粘合剂在体内的降解；(c)-(e)植入(c)4天、(d)14天和(e)28天之后，紧邻组织粘合剂的组织切片的H&E染色，其中粘合剂用星号标记。(c)、(d)和(e)中的比例尺表示100μm。

详细描述

在第一方面，各种实施方式涉及生物组织粘合组合物。本文公开的生物组织粘合组合物利用络合-共价双交联原理构建。包含一种或多种接枝有至少一个儿茶酚片段并且包含至少一个可交联官能团的大分子的胶合大分子单体可以通过金属离子-儿茶酚络合，与包含多价金属离子或由多价金属离子组成的第一交联剂快速交联，随后可交联官能团与第二交联剂共价结合，所述第二交联剂可以是长效交联剂。通过金属离子-儿茶酚络合的快速交联可以提供生物组织粘合组合物的初始稳定性，并允许可交联官能团和第二交联剂之间形成更稳定共价结合的时间。这样做时，可以获得生物组织粘合组合物在生理条件下的长期有效性。此外，利用偶联化学形成儿茶酚接枝的胶合大分子单体(例如本文公开的明胶-多巴胺缀合物)允许将儿茶酚基团的接枝度控制在宽范围内。

有利地，由于原料(例如明胶和壳聚糖)便宜且丰富，因此本文公开的生物组织粘合组合物的制备是便宜的。此外，儿茶酚接枝胶合大分子单体可在一步反应中获得，而不需要特殊条件例如高温、高真空和/或高压或特殊设备。生物组织粘合组合物的易于使用使得其可用于临床应用。本文公开的生物组织粘合组合物还展示出相对高的粘合力，并且是细胞相容的，如本文通过体外实验的结果所证明的那样。

考虑到上述情况，本文使用的术语“生物组织粘合组合物”是指可用于使生物组织连接或结合在一起的制剂。术语“生物组织”是指由连接在一起的相关细胞形成的结构，其中所述细胞与细胞间物质共同作用以实现特定功能并/或形成人、动物、植物、细菌、真菌或病毒结构的结构材料之一，包括结缔组织、上皮组织、肌肉组织和神经组织。生物组织的实例包括但不限于消化器官、血管、心脏、肺、尿道、食管的组织，膀胱组织，骨组织，脑组织，乳腺组织和隔膜组织。

生物组织粘合组合物包含胶合大分子单体，所述胶合大分子单体包含一种或多种接枝有至少一个儿茶酚片段并包含至少一个可交联官能团的大分子。术语“大分子(macromolecules)”(在本文中另外称为“聚合物”或“大分子单体(macromer)”)是指由连接在一起的多个小结构单元组成的任何大有机分子。一种或多种大分子可以是天然大分子和/或合成大分子，这意味着其可以是天然存在的或(例如通过化学合成)人工产生的。

天然存在的大分子是指可在自然界中发现的聚合物或大分子单体。天然存在的大分子的实例包括但不限于多糖、糖胺聚糖、蛋白质及其混合物。

多糖是可以水解成两个或更多个单糖分子的碳水化合物。它们可以含有重复碳水化合物(即糖单元)骨架。多糖的实例包括但不限于藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖、葡聚糖、淀粉和结冷胶。

糖胺聚糖是含有氨基糖作为组分的多糖。氨基酸是含有至少一个羧基(-COOH)和一个氨基(NH₂)的分子。侧链存在于氨基酸分子上，其可影响氨基酸的性质，例如极性和酸-碱性质。侧链的大小可以从甘氨酸中的氢原子变化到苯丙氨酸中的苯基。氨基酸的其它实例包括天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸、色氨酸以及任何非标准氨基酸(例如硒代半胱氨酸、羊毛硫氨酸、2-氨基异丁酸、脱氢丙氨酸或γ-氨基丁酸)；或氨基酸衍生物，例如5-羟色氨或L-二羟基苯丙氨酸。因此，蛋白质分子由这些氨基酸的长链形成，每个氨基酸通过共价肽(-CONH-)键与其邻位相连。

糖胺聚糖的实例包括但不限于透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸葡聚糖、硫酸肝素、肝素、葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、半乳糖、半乳糖胺和葡糖胺。

本文所用的术语“多肽”通常是指多于100个氨基酸单体的单链氨基酸聚合物。肽通常是指长达约25至50个氨基酸的氨基酸二聚体(二肽)、寡聚体(寡肽)，和长约2至100个氨基酸的短聚合物。本文使用的术语“蛋白质”通常是指可以非共价或共价(通过二硫键)彼此缔合的一条或多条多肽链的3D结构。蛋白质的实例包括但不限于胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白、骨质(sklerotin)、丝心蛋白、酶、血红蛋白、血清白蛋白抗体、凝血酶雌激素、肾上腺素、胰岛素、生长激素、类固醇激素和甲状腺激素。

在各种实施方式中，一种或多种大分子包含天然大分子单体或由天然大分子单体组成。

或者，大分子可以人工产生。人造大分子的实例包括但不限于乙交酯、丙交酯的聚合物和寡聚物，聚乳酸，α-羟基酸(包括乳酸和乙醇酸)的聚酯，例如聚(α-羟基)酸包括聚乙醇酸，聚DL-乳酸，聚-L-乳酸，和DL-丙交酯与乙交酯的三元共聚物，ε-己内酯和与聚酯共聚的ε-己内酯，聚内酯和聚己内酯包括聚(ε-己内酯)、聚(δ-己内酯)和聚(γ-丁内酯)；聚酸酐，聚原酸酯，其它羟基酸，聚二恶烷酮，胶原-甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)，聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(PHEMA)，和在体内作为代谢物存在或无毒的其它可生物降解聚合物。上面列出的人造大分子的实例也是可生物降解的。

在各种实施方式中，一种或多种大分子选自氨基官能化的多糖、聚氨基酸及其组合。

在一些实施方式中、一种或多种大分子选自明胶、牛血清白蛋白(BSA)、壳聚糖、聚乙烯亚胺、透明质酸、葡聚糖、聚(天冬氨酸)、聚(谷氨酸)及其组合。

在特定实施方式中，一种或多种大分子包含明胶或由明胶组成。本文所用的术语“明胶”是指源自胶原的蛋白物质。在本发明的上下文中，“明胶”还指等同物质，例如明胶的合成类似物。通常，明胶可以归类为碱性明胶、酸性明胶或酶促明胶。碱性明胶可以通过用碱(例如氢氧化钠或氢氧化钙)处理胶原获得。酸性明胶可以通过用酸(例如盐酸)处理胶原获得。酶促明胶可以通过用酶(例如水解酶)处理胶原获得。因为明胶可以是水凝胶形式，所以影响本文提到的水凝胶的降解性能的因素也可适用于明胶。

一种或多种大分子接枝有至少一个儿茶酚片段并且包含至少一个可交联官能团。有利地，大分子不含有毒性组分，例如现有技术的生物组织粘合剂中存在的醛基和/或氰基。

儿茶酚是指三种异构苯二醇的邻位异构体，并且具有以下结构

含有儿茶酚基团的大分子的天然来源包括海洋贻贝分泌的蛋白胶。有利地，蛋白胶是生物相容的并且具有优异的湿粘合能力。儿茶酚基团能够与几乎所有种类的表面相互作用。特别地，当儿茶酚基团氧化成醌时，蛋白质胶具有对生物表面的强粘附性。此外，儿茶酚基团能够与多价金属离子(例如Cu²⁺、Zn²⁺、Al³⁺和Fe³⁺)快速形成络合物，从而导致快速交联。

在各种实施方式中，接枝有至少一个儿茶酚片段的一种或多种大分子可通过使一种或多种大分子与选自多巴胺、氢化咖啡酸、二羟基苯丙氨酸、3，4-二羟基氢化肉桂酸及其组合的含儿茶酚化合物反应而获得。

在一些实施方式中，含儿茶酚化合物是多巴胺。多巴胺是指儿茶酚胺神经递质或激素，其通常具有下式：

接枝有至少一个儿茶酚片段的一种或多种大分子可另外称为缀合物。在本文中使用时，术语“缀合物”是指这样的分子，所述分子由两个或多个(任选地通过联结基团)结合在一起形成单一共价结构的片段组成。例如，片段之间的结合可以通过直接化学键进行，例如在明胶-多巴胺缀合物的情况下，其中不使用联结基团。多巴胺通过明胶的羧基和多巴胺的氨基之间的缀合反应直接接枝到明胶。

例如，明胶-多巴胺缀合物可以通过使用本领域技术人员已知的标准1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NCO)化学反应使多巴胺的胺基与明胶的羧基偶联而形成。有利地，可通过控制偶联化学反应获得宽范围的儿茶酚基团接枝度。

缀合物的其它实例可包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)-多巴胺缀合物、壳聚糖-3，4-二羟基氢肉桂酸缀合物、明胶-3，4-二羟基氢肉桂酸缀合物及其组合。

生物组织粘合组合物中明胶的含量可以通过本领域技术人员已知的Arnow’s方法测定。在各种实施方式中，生物组织粘合组合物中明胶的量可以在约80wt％至约99.9wt％，例如约82wt％至约99.9wt％、约88wt％至约99.9wt％、约92wt％至约99.9wt％、约80wt％至约95wt％、约80wt％至约92wt％、约80wt％至约90wt％、约80wt％至约85wt％、约85wt％至约95wt％或约83wt％至约93wt％的范围内。

如上所述，胶合大分子单体中的儿茶酚片段可以与第一交联剂中存在的多价金属离子(例如通过形成金属离子-儿茶酚络合物而)快速交联。同时，儿茶酚片段可以与生物组织表面的表面形成抗湿键(moisture resistant bond)。一种或多种大分子中儿茶酚片段的量可以在约0.1％至约20％(w/w)的范围内。例如，一种或多种大分子中的儿茶酚片段的量可以在约1％至约20％(w/w)、约5％至约20％(w/w)、约10％至约20％(w/w)、约15％至约20％(w/w)、约0.1％至约15％(w/w)、约0.1％至约10％(w/w)、约0.1％至约5％(w/w)、约5％至约15％(w/w)或约8％至约18％(w/w)的范围内。

大分子可以具有大于10000g/mol的数均分子量。可以通过将样品的重量除以组成其的分子数来获得数均分子量。例如，大分子可以具有大于约15000g/mol、约30000g/mol、约50000g/mol、约80000g/mol或约100000g/mol的数均分子量，例如在约10000g/mol至约100000g/mol、约10000g/mol至约80000g/mol、约10000g/mol至约50000g/mol、约10000g/mol至约30000g/mol、约20000g/mol至约80000g/mol、约30000g/mol至约60000g/mol或约20000g/mol至约50000g/mol的范围内的值。

所述一种或多种大分子通过以下而交联：(a)至少一个儿茶酚片段和第一交联剂中存在的多价金属离子之间的络合物形成，和(b)至少一个可交联官能团与第二交联剂的共价结合。

在本文中使用时，术语“交联”是指在大分子之间形成键或互连。交联的实例包括物理交联和化学交联。

物理交联可例如通过络合、氢键、去溶剂化、范德华相互作用或疏水相互作用发生。另一方面，化学交联是指聚合物链之间通过化学键合，例如但不限于共价结合、离子键合或亲和相互作用(例如配体/受体相互作用、抗体/抗原相互作用等)的相互作用。

在各种实施方式中，一种或多种大分子首先通过至少一个儿茶酚片段和第一交联剂中存在的多价金属离子之间形成络合物而交联。用于交联至少一个儿茶酚片段的第一交联剂可包含多价金属离子或由多价金属离子组成。本文所用的术语“多价金属离子”是指具有至少两价的金属离子。例如，多价金属离子可以是二价金属离子例如Cu²⁺或Zn²⁺，或三价金属离子例如Al³⁺、Fe³⁺或Cr³⁺。因此，第一交联剂可以是含金属盐的水性溶液，例如FeCl₃、CuCl₂、CuSO₄、Zn(NO₃)₂、ZnSO₄，仅举几个例子。

在各种实施方式中，多价金属离子是过渡金属离子。过渡金属的实例包括但不限于钪(Sc)、钛(Ti)、钒(V)、铬(Cr)、锰(Mn)、铁(Fe)、钴(Co)、镍(Ni)、铜(Cu)、锌(Zn)及其合金。

在一些实施方式中，多价金属离子选自Cu²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Cr³⁺及其组合。在特定实施方式中，多价金属离子包含Fe³⁺或由Fe³⁺组成。

在各种实施方式中，在大分子的至少一个儿茶酚片段和多价金属离子之间形成络合物。如上所述，至少一个儿茶酚片段和多价金属离子之间的络合物形成可迅速发生以提供生物组织粘合组合物的初始稳定性。这样做允许在大分子中存在的可交联官能团和第二交联剂之间形成更稳定的共价键。络合物形成可导致大分子通过多价金属离子交联以形成三维网络。在各种实施方式中，通过配位络合形成金属离子-儿茶酚络合物，例如图3(a)中所示，用于第一交联。

除了上述之外，一种或多种大分子还通过至少一个可交联官能团与第二交联剂共价结合而交联。所述至少一个可交联官能团可以是能够与第二交联剂化学反应形成共价键的片段。至少一个可交联官能团和第二交联剂之间的共价键形成可发生在接枝在一种或多种大分子上的至少一个儿茶酚片段与第一交联剂中存在的多价金属离子之间的络合物形成之后。

用于共价交联所述至少一个可交联官能团的第二交联剂可包括能够与所述一种或多种大分子缓慢反应的化合物。合适第二交联剂的选择可取决于大分子上存在的可交联官能团。例如，京尼平和聚酯蛋白可仅作用于氨基。在这种实施方式中，至少一个可交联基团可包含氨基或由氨基组成。

在各种实施方式中，至少一个可交联官能团是亲核官能团。例如，至少一个可交联官能团可以选自氨基、巯基及其组合。对于这些可交联官能团，第二交联剂可以是包含至少一个α，β-不饱和羰基或α，β-不饱和磺酰基的大分子。合适第二交联剂的实例包括明胶-丙烯酸酯、透明质酸-丙烯酸酯、聚(乙二醇)-丙烯酸酯和/或聚(乙二醇)乙烯基砜。

在各种实施方式中，第二交联剂包含京尼平或由京尼平组成。京尼平源自栀子花(gardenia jasminoides)的果实，其是生物相容的。它具有以下通式

京尼平能够通过其自身和含伯胺基团的大分子之间的共价结合而交联所述大分子。在特定实施方式中，第二交联剂选自京尼平、聚京尼平(polygenipin)、京尼平接枝分子及其组合。

至少一个可交联官能团与第二交联剂共价结合所需的时间可因存在的可交联官能团和/或使用的第二交联剂而异。例如，明胶-多巴胺缀合物与京尼平的交联可发生持续约2小时的时间。

在第二方面，各种实施方式涉及制备生物组织粘合组合物的方法。所述方法包括：提供胶合大分子单体和第二交联剂的混合物，所述胶合大分子单体包含一种或多种接枝有至少一个儿茶酚片段并包含至少一个可交联官能团的大分子，所述第二交联剂用于共价交联所述至少一个可交联官能团。

在各种实施方式中，提供混合物包括：将包含一种或多种大分子和第二交联剂的固体掺和物溶解在水性溶液中。在一些实施方式中，提供混合物包括：将包含第二交联剂的水性溶液加入包含一种或多种大分子的水性溶液中。上文已经讨论了大分子和第二交联剂的实例。如上所述，大分子不含毒性组分例如醛基和/或氰基。

混合物中大分子的浓度可以在约10％w/v至约50％w/v的范围内。例如，混合物中大分子的浓度可以在约15％w/v至约50％w/v、约20％w/v至约50％w/v、约25％w/v至约50％w/v、约30％w/v至约50％w/v、约35％w/v至约50％w/v、约10％w/v至约45％w/v、约10％w/v至约40％w/v、约10％w/v至约35％w/v、约10％w/v至约30％w/v、约20％w/v至约40％％w/v、或约15％w/v至约35％w/v的范围内。

混合物中第二交联剂的浓度可以在约2mM至约40mM，例如约10mM至约40mM、约15mM至约40mM、约20mM至约40mM、约25mM至约40mM、约30mM至约40mM、约2mM至约30mM、约2mM至约25mM、约2mM至约20mM、约10mM至约30mM、或约15mM至约35mM的范围内。

所述方法包括：向混合物中加入用于交联至少一个儿茶酚片段的第一交联剂，其中所述第一交联剂包含多价金属离子或由多价金属离子组成，以通过所述至少一个儿茶酚片段与所述多价金属离子之间的络合物形成而交联一种或多种大分子。

第一交联剂和多价金属离子的实例已在上文讨论过。例如，多价金属离子可以是过渡金属离子。在各种实施方式中，多价金属离子选自Cu²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Cr³⁺及其组合。在特定实施方式中，多价金属离子包含Fe³⁺或由Fe³⁺组成。

生物组织粘合组合物中多价金属离子的浓度可以在约5mM至约50mM的范围内。例如，生物组织粘合组合物中多价金属离子的浓度可以在约10mM至约50mM、约15mM至约50mM、约25mM至约50mM、约35mM至约50、约5mM至约40mM、约5mM至约30mM、约5mM至约20mM、约15mM至约30mM或约20mM至约40mM的范围内。

在一些实施方式中，可以通过将混合物涂敷在生物组织上以形成涂覆层来提供混合物，所述混合物包含接枝有至少一个儿茶酚片段并包含至少一个可交联官能团的一种或多种大分子，和用于共价交联所述至少一个可交联的官能团的第二交联剂。可以通过以下方式将包含多价金属离子的第一交联剂添加到混合物中：将液滴形式的包含多价金属离子的溶液分配在所述覆盖层上。或者，可以使用分配第一交联剂的其它合适方法，例如喷涂。

在第三方面，各种实施方式涉及通过根据第二方面的方法制备的生物组织粘合剂。

在另一方面，各种实施方式涉及用于粘合生物组织的试剂盒。所述试剂盒包含：胶合大分子单体，其包含一种或多种接枝有至少一个儿茶酚片段并包含至少一个可交联官能团的大分子；用于交联所述至少一个儿茶酚片段的第一交联剂，其中所述第一交联剂包含多价金属离子或由多价金属离子组成；和用于共价交联所述至少一种可交联官能团的第二交联剂。

如上所述，使用者可将包含一种或多种大分子的胶合大分子单体和第二交联剂涂覆在生物组织上以形成覆盖层，随后向混合物中添加第一交联剂。这样做时，可以形成根据本文所公开实施方式的生物组织粘合组合物。

在替代性实施方式中，一种或多种大分子和第二交联剂可作为混合物存在于试剂盒中。

在第五方面，各种实施方式涉及粘合生物组织的方法。所述方法包括：将胶合大分子单体与第二交联剂的混合物涂覆在第一生物组织上以形成覆盖层，所述胶合大分子单体包含一种或多种接枝有至少一个儿茶酚片段并包含至少一个可交联官能团的大分子，所述第二交联剂用于共价交联所述至少一个可交联官能团。然后将包含多价金属离子或由多价金属离子组成的第一交联剂添加到所述覆盖层上。这样做时，获得了生物组织粘合组合物。使第二生物组织与所得覆盖层接触，并向第一生物组织和第二生物组织之一或二者施加压力以使第一生物组织与第二生物组织粘合。

在一些实施方式中，可以将包含多价金属离子的第一交联剂添加到第二生物组织中，而不是将包含多价金属离子的第一交联剂添加到覆盖层上。可以使第二生物组织与第一生物组织接触，使得含多价金属离子的第一交联剂与覆盖层接触以形成生物组织粘合剂。可以向第一生物组织和第二生物组织之一或二者施加压力以使第一生物组织与第二生物组织粘合。

在另一方面，各种实施方式涉及根据第一方面的或通过根据第二方面的方法制备的生物组织粘合组合物作为用于医学和兽医应用的组织粘合剂和密封剂，在血清肿预防、创伤封闭、补充或替换内部手术程序中的缝线或卡钉、肠吻合、血管吻合、组织修复、眼科手术、药物递送、预防手术后粘连、和/或组织植入中的用途。

例如，组织粘合组合物可用于在组织植入中胶合组织，例如软骨胶、骨胶、(心脏)肌肉胶和脂肪胶。

下文将参照附图更充分地描述本发明，其中示出了本发明的示例性实施方式。然而，本发明可以体现为许多不同的形式，并且不应被解释为限于本文所述的示例性实施方式。相反，提供这些实施方式以使本公开完全且充分，并向本领域技术人员充分传达本发明的范围。在附图中，为了清楚起见，可扩大层和区域的长度和尺寸。

在本文中使用时，术语“和/或”包括一个或多个相关所列项的任何和所有组合。本文说明性描述的本发明可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包括”、“包括”、“含有”等应被广泛地且非限制性地理解。另外，本文中使用的术语和表述作为描述性而非限制性术语使用，并且这些术语和表述的使用不意图排除所示和所述特征或其部分的任何等同物，而是承认在所要求保护的本发明范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，虽然本发明已经通过优选实施方式和任选特征被具体公开，但是本领域技术人员可以对本文公开的本发明进行修改和变化，并且这样的修改和变化被视为在本发明的范围内。

本文已以宽泛、概括性的方式描述了本发明。落入该概括性公开内容中的每一较窄的种类和亚类也形成本发明的一部分。这包括本发明的概括性描述，其带有从该类中除去任何主题的附带条件或否定限制，而不管所排除的材料是否在本文中被具体描述。

其它实施方式在以下权利要求和非限制性实施例内。此外，当本发明的特征或方面以马库什组描述时，本领域技术人员会意识到，本发明因此也针对该马库什组的任何单独成员或成员的亚组进行描述。

实验部分

用于大面积体内应用的理想组织粘合剂应当在生理环境(其中充满组织流体)中：(1)安全且无毒，(2)可快速交联，(3)长期有效且(4)可生物降解。

在本文公开的各种实施方式中，通过形成(1)明胶-多巴胺缀合物(含有儿茶酚基团)-作为典型的胶合大分子单体，(2)Fe³⁺-作为典型的快速交联剂；和(3)京尼平-作为典型的长效交联剂来设计和开发新的不含醛的双交联生物组织粘合组合物。

明胶-多巴胺胶合大分子单体可通过儿茶酚-Fe³⁺络合与Fe³⁺快速交联；但单独的这种单交联在存在血清蛋白的生理条件下可能不稳定。明胶-多巴胺胶合大分子单体也可以通过单独的京尼平共价交联，但这种单交联过程可能需要太长时间(约几小时)。因此，单独使用Fe³⁺或京尼平不能满足在生理条件下可快速交联和长期有效的要求。

在一个实例中，胶合大分子单体和长效交联剂可以混合在一起并以固体形式储存，而快速交联剂可以以固体形式单独储存。例如，可将明胶-多巴胺缀合物(或其它胶合大分子单体)和京尼平(或其它长效交联剂)的固体混合物溶解在生理盐水溶液中；明胶-多巴胺缀合物(或其它胶合大分子单体)和京尼平(或其它长效交联剂)的浓度分别为10％-50％(w/v，g/mL)和2-40mM。可将含多价金属离子(例如Cu²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Fe³⁺和Cr³⁺)的快速交联剂溶解在生理盐水溶液中以得到500mM溶液。可以利用棉签将明胶-多巴胺缀合物和京尼平的混合溶液涂在组织表面上，随后利用注射器将多价金属离子溶液(终浓度为5-50mM)滴在组织表面(涂覆有明胶-多巴胺缀合物和京尼平的混合溶液)上，然后组织表面可在轻压约10秒之后粘合。

在另一个实例中，可以将三种组分溶解在以下组成的生理盐水溶液中然后分别储存：10％-50％(g/mL)胶合大分子单体、500mM长效交联剂、500mM快速交联剂。例如，可以利用注射器将京尼平(或其它长效交联剂)溶液添加到明胶-多巴胺缀合物(或其它胶化大分子单体)溶液中，从而得到2-40mM京尼平(或其它长效交联剂)溶液。可以利用棉签将这种混合溶液涂在组织表面上，随后利用注射器将多价金属离子溶液(终浓度为5-50mM)滴在组织表面(涂覆有明胶-多巴胺缀合物和京尼平的混合溶液)上，然后组织表面可在轻压约10秒之后粘合。

在另一个实例中，使用所述组织粘合组合物涂覆活体组织上的解剖位点的方法可包括以下步骤：向所述位点涂覆a)包含胶合大分子单体和持久交联剂的混合溶液；随后b)将快速交联剂滴在所述位点上；然后c)在所述位点上轻压约10秒。

通过设计和开发本文公开的双交联组织粘合剂，可以解决上述问题，并且所述组织粘合剂能够满足体内应用的所有要求例如血清肿预防。

有利地，作为胶合骨架的儿茶酚接枝大分子单体可以是不含任何有毒组分(特别是任何醛基或氰基)的天然或合成的生物/大分子。使用新的双交联原理设计和制造组织粘合剂，其中它整合了快速交联(通过快速的离子-儿茶酚络合)和长期有效性(通过共价交联)这些特性。新的组织粘合剂不具有急性毒性或慢性毒性，从而使其适用于体内应用，例如乳房切除术后的血清肿预防。

实施例1：合成明胶-多巴胺胶合大分子单体

通过乙基-二甲基氨基丙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)偶联化学反应来合成明胶-多巴胺胶合大分子单体(图2(A))。简而言之，在60℃下将明胶(2.0g，来自猪皮的A型)溶解在100mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。向溶液中加入EDC(0.5g)和NHS(0.3g)并将混合溶液的pH值调节至6.0。搅拌30分钟后，加入1.0g多巴胺，并在37℃下将反应溶液的pH值保持在5.0至6.0持续24小时。反应后，将溶液在酸化去离子水中透析1天并在去离子水中透析5小时，然后冻干。利用UV光谱(图2(B))和¹H NMR光谱(图2(C))表征所得的明胶-多巴胺缀合物。使用Amow’s方法(Arnow，J.Biol.Chem.1937，118：531-537)测定的明胶-多巴胺缀合物中儿茶酚基团的含量为3.7μg/mg。

实施例2：粘合剂的性质

明胶-多巴胺胶合大分子单体的总体概况如图4(a)中所示，其呈固体形式时无粘性。这种胶合大分子单体可以溶解在盐水中形成粘性溶液，如图4(b)中所示。可将长效交联剂(例如京尼平)加入胶合大分子单体溶液中，然后使用。明胶-多巴胺胶合大分子单体可以通过形成Fe³⁺-儿茶酚络合物而与Fe³⁺快速(在数秒内)交联，并且还与京尼平共价交联(图3(a)和3(b))。将混合溶液涂覆在组织表面上之后，胶合大分子单体中的儿茶酚片段能够与表面结合，然后在添加FeCl₃后通过儿茶酚-Fe³⁺络合而快速交联。这种单交联水凝胶为浅黄色。在37℃下2小时后将获得络合-共价双交联组织粘合剂，同时组织粘合剂变成蓝色(图8A-D)。

实施例3：Fe ³⁺ 单交联水凝胶的稳定性

通过形成离子-儿茶酚络合物，明胶-多巴胺胶合大分子单体可与多价金属离子(例如Cu²⁺、Zn²⁺、Al³⁺和Fe³⁺)快速(在数秒内)交联，然而，基于本文进行的研究，离子-儿茶酚络合物在即使含痕量蛋白质的溶液中也不稳定。如下所述评价Fe³⁺-儿茶酚络合物的稳定性。

发明人研究了利用单一儿茶酚-Fe³⁺络合交联制备的粘性水凝胶的稳定性。将70μL明胶-多巴胺溶液(15％，g/mL)转移到模具中。加入10μLFeCl₃溶液之后，明胶-多巴胺溶液在数秒内迅速胶凝形成粘性水凝胶。将粘性水凝胶移入FBS溶液(0.5％，g/mL)中。如图4(c)-(e)中所示，棕色的单一络合交联水凝胶在浸泡3小时后完好，但在24小时后分解且液体变为浅黄色。这种单一的Fe³⁺交联粘合剂具有迅速胶凝的优点，但不能实现长期有效性。

通过添加能够交联含伯胺基团的大分子的长效(共价)交联剂，例如京尼平，发明人已显示：Fe³⁺单交联水凝胶的稳定性得到改善。

在进行的其它试验中，在含0.5％(v/v)胎牛血清(FBS，PAA Laboratories)的模拟体液(SBF)溶液中研究Fe³⁺单交联水凝胶(通过Fe³⁺-儿茶酚络合)和双交联水凝胶(通过Fe^{3 +}-儿茶酚络合和京尼平-胶合大分子单体共价交联)的稳定性。同时，在SBF溶液中研究明胶-多巴胺与京尼平的共价交联。

简而言之，向1.5ml离心管中的50μL胶合大分子单体溶液中加入5μL100mM FeCl₃溶液之后，迅速形成了Fe³⁺单交联粘性水凝胶。为了制备双交联水凝胶，首先将京尼平溶液(10％，g/mL)加入胶合大分子单体溶液中以产生含0.5％(g/mL)京尼平的混合溶液。将混合溶液(50μL)转移到1.5ml离心管中，然后加入5μL FeCl₃溶液(100mM)。将含京尼平的粘性水凝胶置于37℃的潮湿培养箱中2小时。当胶合大分子单体与京尼平共价交联时，可观察到蓝色颜料。

在京尼平存在的情况下，明胶溶液的胶凝时间为约2小时；可以通过优化条件(例如加入辅助交联剂，例如聚赖氨酸，和调节京尼平的浓度)将该时间缩短至35分钟。然而，这种缩短的时间仍然太长，而不能用作临床应用中合适的组织粘合剂。虽然这种交联反应耗时，但所产生的共价交联粘合剂在生理环境中稳定且可提供长期有效性。

此外，为了评价Fe³⁺单交联水凝胶中共价交联的形成，在1.5ml离心管中利用50μL含京尼平(0.5％，g/mL)的胶合大分子单体溶液(15％，g/mL)制备Fe³⁺单交联水凝胶。随后，将0.8mL补充有0.5％(v/v)胎牛血清(FBS，PAA Laboratories)的模拟体液(SBF)加入三个管中，并在37℃孵育。观察作为孵育时间的函数的含有或者不含京尼平的Fe³⁺单交联水凝胶，和双交联水凝胶的外观变化，以及SBF溶液的颜色，其显示于图4(c)、4(d)和4(e)中。

如图4(c)、4(d)和4(e)中所示，Fe³⁺单交联水凝胶和双交联水凝胶分别为棕色和深蓝色，SBF溶液几乎无色。浸泡3小时后，单交联水凝胶完好，但其颜色变浅。同时，介质变成非常浅的棕色。双交联水凝胶发展成深蓝色，同时SDF溶液变成蓝色。有趣的是，在Fe³⁺单交联水凝胶和SBF溶液的表面上观察到了稀薄的蓝色颜料，此外SDF溶液也变成蓝色。孵育24小时后，不含京尼平的Fe³⁺单交联水凝胶完全溶解，而含京尼平的Fe³⁺单交联水凝胶保持完好并从棕色完全分级(fully graded)到深蓝色。通过3小时的浸泡，SDF溶液的颜色变得比相应样本的颜色深。这些结果表明：Fe³⁺单交联组织粘合剂具有迅速胶凝的优点，但不能实现在体内长期有效；然而，显著地，双交联组织粘合剂不仅逐渐形成(即使浸在SDF溶液中也是如此)，而且在体内条件下保持稳定。

实施例4：双交联组织粘合剂的细胞相容性

分别使用猪软骨细胞(PCCs)和人皮肤成纤维细胞(HDFs)作为模型细胞，详细研究了双交联组织粘合剂的细胞相容性。

首先，通过使用牛血清白蛋白-戊二醛组织粘合剂(称为BioGlue)的提取溶液和不含任何提取溶液的纯培养基(称为纯培养基)分别作为正对照和负对照来评价这种双交联组织粘合剂的提取溶液的细胞毒性。

简而言之，在每个15mL离心管中，由1.0mL胶合大分子单体溶液制备双交联组织粘合剂。类似地，根据报道的方法由0.8mL牛血清白蛋白溶液(45％，g/mL)和0.2mL戊二醛溶液(10％，v/v)合成牛血清白蛋白-戊二醛组织粘合剂。将5mL用于PCCs和HDFs培养的培养基分别装入管中，并在4℃下保持7天。分别通过0.22μm滤器过滤这些提取溶液。将双交联组织粘合剂的提取溶液用相应的培养基稀释，以使稀释物分别含有100％、50％和25％体积百分比的初始提取溶液，并称为提取物100、提取物50和提取物25。

将PCCs和HDFs分别以3×10³个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并在200μL相应的纯培养基中培养24小时。此后，分别用提取溶液稀释物和对照溶液替换培养基，每隔一天更换一次。在预定的时间点，进行MTT试验。简而言之，用180μL新鲜DMEM和20μL 5mg/mL MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑)的混合溶液替换培养溶液。将板在37℃下孵育4小时，然后移除培养基，并加入200μL DMSO以溶解甲臜晶体。使用酶标仪在570nm波长下测量光密度(OD)值。

如图5(a)中的OD值所示，从第1天到第3天和第5天，所有HDFs均显示出显著增殖。然而，在每个时间点，使用100％初始提取溶液(提取物100)培养的HDFs展示出比使用BioGlue和纯培养基培养的HDFs更高的细胞存活率。令人惊讶的是，在含双交联组织粘合剂的提取溶液的溶液中培养的HDFs的细胞存活率显示出随着初始提取溶液含量的降低而下降的趋势。

参考图5(b)，使用提取物100、提取物50和提取物25培养的PCCs的细胞存活率从第1天到第3天显示出上升趋势，从第3天到第5天显著上升，并且其在任何时间点均显著高于使用BioGlue培养的PCCs的细胞存活率。此外，在第5天时，使用提取物100、提取物50和提取物25培养的PCCs的细胞存活率显著高于使用纯培养基培养的PCCs的细胞存活率。这些结果表明：这种双交联组织粘合剂的提取溶液不抑制细胞生长，甚至能够增强细胞增殖。

为了进一步评估双交联组织粘合剂的细胞相容性，通过HDFs的单层培养物研究在新鲜制备的双交联组织粘合剂上的细胞粘附和增殖。简而言之，在96孔板中，由40μL胶合大分子单体溶液制备双交联组织粘合剂。将细胞悬浮物以3×10³个细胞/孔的密度接种在双交联组织粘合剂的顶部，并在37℃下在5％CO₂气氛中孵育。如上所述利用MTT试验测定细胞增殖。培养一天后，在显微镜下拍摄照片。

如图6(b)中所示，成纤维细胞在双交联组织粘合剂上显示出与在组织培养塑料(TCP)上相当的粘附和铺展(图6(a))。此外，培养5天后，HDFs的细胞存活率在统计学上提高(图6(c))，这通过OD值增大得以证明。这些结果进一步证明了这种双交联组织粘合剂的细胞相容性。

在体外评价这种双交联组织粘合剂的血液相容性。简而言之，从健康志愿者中抽取约5ml全血至预先装有肝素钠的注射器中。将在圆柱形模具(直径6.5mm)中由200μL胶合大分子单体溶液合成的双交联组织粘合剂和双交联组织粘合剂的上述提取溶液(200μL)分别转移到每个15mL离心管中的4mL 0.9％氯化钠(NaCl)中。向每个管中加入200μL全血，并在37℃孵育60分钟。通过将0.2ml全血分别加入4mL去离子水和0.9％NaCl中来产生正对照和负对照。以1500rpm离心样品5分钟。使用酶标仪在545nm波长下测量上清液的OD值。如下计算溶血：

溶血(％)＝(样品的OD-负对照的OD(-))/(正对照的OD(+)-负对照的OD(-))×100％

表3血红细胞的溶血

样品	OD值	溶血(％)
			0.9％NaCl	0.136±0.002	-ve对照
水	1.341±0.011	+ve对照
			组织粘合剂	0.142±0.003	0.498±0.273
提取溶液	0.144±0.003	0.677±0.292

如表3中所示，新鲜制备的双交联组织粘合剂及其提取溶液的溶血均少于1％，完全在生物材料的5％允许限度内，从而指示这种双交联组织粘合剂的血液相容性。

使用配备有20mm直径不锈钢平行板几何结构的流变仪(TA Instruments，型号AR2000ex)来测定胶合大分子单体(明胶-多巴胺)溶液、Fe³⁺单交联水凝胶和双交联组织粘合剂的粘弹性性能。在流变试验之前新制备双交联粘合剂样品。对于Fe³⁺单交联水凝胶(称为明胶-多巴胺+Fe³⁺)，一加入FeCl₃溶液就记录数据。将操作温度保持在37℃。

为了确保在线性粘弹性范围内的流变学测量，在频率扫描之前进行动态应变扫描，应变被测定为5％。通过在0.01Hz和1.0Hz之间进行频率扫描来测量弹性模量(G′)和粘性模量(G″)。

如图7中所示，“明胶-多巴胺+Fe³⁺”样本的G′和G″的快速增加指示胶合大分子单体可以与Fe³⁺在数秒内交联。此外，当胶合大分子单体与京尼平共价交联时，G′和G″进一步增加。

实施例5：粘合试验

通过搭接剪切强度试验(lap shear strength test)，使用配备有100N测力传感器(load cell)的Instron机械检测仪(型号5543)来测定粘合力。

考虑到与人皮肤的生物相似性，使用新鲜猪皮作为被粘物而无需任何纯化以模拟临床条件。图8中示出了典型的操作过程。如图9(b)中所示，以1.0mm/min的拉伸速率进行粘合试验，并通过将最大负载除以重叠面积计算粘合(剪切)强度。

在不同条件下进行这种双交联组织粘合剂的粘合试验。简而言之，将含京尼平(0.5％，g/mL)的胶合大分子单体溶液(15％，g/mL)涂覆到每块湿润猪皮的脂肪层(内部)，然后加入FeCl₃溶液(100mM)滴。用手指将工作区域轻压在一起持续约5秒。随后，进行粘合试验以得到被称为“快速胶合”强度的粘合强度。将利用上述方法制备的样品置于37℃的潮湿培养箱中2小时以完成胶合大分子单体与京尼平的第二交联，然后进行粘合试验以得到“双交联胶合”强度。在旋转振荡器(80rpm)上，将双交联后的样品浸在含0.5％(v/v)FBS的SBF中24小时，然后进行粘合试验以得到被称为“长期胶合”强度的粘合强度。此外，利用双交联组织粘合剂胶合猪皮的胶原层(外侧)和新鲜猪关节软骨，然后进行粘合试验，粘合强度被分别称为“胶原层胶合”强度和“软骨胶合”强度。

表4不同条件下组织粘合剂的粘合强度

如表4、图9和图10中所示，发明人详细进行了这种双交联组织粘合剂的粘合试验。组织粘合剂展示出对于血清肿预防和许多其它体内应用而言足够的粘合强度。

实施例6：降解试验

首先在体外研究双交联组织粘合剂的降解。简而言之，称量来自圆柱形模具(直径6.5mm)中的150μL胶合大分子单体溶液的合成双交联组织粘合剂样品(W₀)。将20个样品置于含10mL用DMEM(Gibco)稀释一倍的胰蛋白酶-EDTA溶液(25200，Life Technologies)的50mL离心管中，并在37℃下在旋转振荡器(150rpm)上孵育。在预定的时间点，取出三个样品并擦拭表面上的溶液，然后称重(W_t)。如下确定组织粘合剂的剩余重量百分率：

剩余重量(％)＝W_t/W₀×100％

如图11中所示，双交联组织粘合剂在胰蛋白酶溶液中展示出降解能力。

检验双交联组织粘合剂的体内生物相容性和降解性。所有动物实验均在由Institutional Animal Care and Use Committees，SingHealth，Singapore批准的指南下进行。将来自圆柱形模具(直径5mm)中的60μL上述胶合大分子单体溶液的新鲜制备的双交联组织粘合剂皮下植入NC_r裸鼠中。每只动物接受四个样品，每个时间点处死一只动物。将样品小心地从周围组织上切下，然后干燥并称重。将第4天的样品的重量定义为初始重量(W₀)，并称量第14天和第28天的样品(W_t)。组织粘合剂的剩余重量百分率被计算为：剩余重量(％)＝W_t/W₀×100％。为了进行组织学评价，将被组织包围的样品在4％多聚甲醛中在4℃固定3天，然后包埋在石蜡中。使用苏木精和曙红(H&E)对切片(厚度为6μm)进行染色以分析炎症和纤维化的程度。

如图12(a)和12(b)中所示，组织粘合剂也在体内逐渐降解，在植入后的第4天和第14天观察到了轻度炎症，但是在第28天未检测到这些组织反应。此外，在28天的植入期间，没有观察到胶原沉积。

根据各种实施方式的用于粘合生物组织的试剂盒可以包括三种组分：儿茶酚接枝胶合大分子单体溶液、快速交联剂溶液和长效交联剂溶液。本文公开的组织粘合剂非常易于使用。例如，使用者可首先将长效交联剂溶液添加到胶合大分子单体溶液中，并且可将混合物涂覆在第一组织表面上。这之后可以在混合物上添加快速交联剂。可以通过以下方式进行第二组织与第一组织的粘合：在涂覆生物组织粘合剂的区域处使第一组织与第二组织接触，并对第一和第二组织之一或二者上施加轻微的压力。

总之，本发明人通过EDC/NHS偶联化学反应合成了含儿茶酚基团的明胶-多巴胺胶合大分子单体，并成功开发了含有快速交联剂Fe³⁺和长效交联剂京尼平的络合-共价双交联组织粘合剂。Fe³⁺和京尼平在这种新组织粘合剂的粘合过程中各自起作用。Fe³⁺能够在数秒内快速交联明胶-多巴胺胶合大分子单体并稳定几个小时；同时，明胶-多巴胺与京尼平的共价交联正在进行，这需要约两小时。虽然在京尼平存在的情况下，可以通过优化条件(例如加入辅助交联剂(例如聚赖氨酸)和调节京尼平的浓度)将明胶溶液的胶凝时间缩短至35分钟，但其仍然太长，而不能用作临床应用中可用的组织粘合剂。虽然这种交联反应耗时，但所产生的共价交联在生理环境中稳定且长期有效。

本文公开的新双交联组织粘合剂组合了Fe³⁺-儿茶酚络合交联(快速且牢固的湿粘合)和共价交联(稳定)的特性。制备该组织粘合剂的方法可以容易地按比例扩大，因此其可以商业化而无需大的修改。评价细胞相容性和粘合强度，由体外实验获得的结果表明：本文公开的生物组织粘合剂在临床应用中是有希望的组织粘合剂，对于体内应用尤其如此，如大鼠乳房切除术血清肿模型所展示的那样。

本文公开的新组织粘合剂具有一些优点。首先，制备成本便宜并且可以按比例放大。原材料(例如明胶和壳聚糖)丰富且廉价。例如，儿茶酚接枝胶合大分子单体可在一步反应中获得，而不使用特殊的加工条件例如高温、高真空、高压和/或特定催化剂以及特殊设备。其次，使用该组织粘合剂非常容易且方便，从而使得其可用于临床应用。通常，可将长效交联剂(例如京尼平)加入到儿茶酚接枝胶合大分子单体溶液中，并且可将混合溶液涂覆在组织表面上。可将含多价离子(例如FeCl₃和ZnCl₂)的溶液滴在每个表面上，并轻压约10秒。

第三，根据在体外获得的结果，本文公开的组织粘合剂展示出相对高的粘合力并且是细胞相容的。第四，该组织粘合剂无毒、易于储存和运输。例如，该组织粘合剂的儿茶酚接枝大分子、快速交联剂和长效交联剂不是违禁品、无毒，并且可以在-4℃下储存几个月。

本文公开的组织粘合剂可以由医疗材料公司采用，最终使用者可以是外科医生。该组织粘合剂可商业化并在临床上用于体内应用，例如手术(例如乳房切除术和淋巴结清除术)后的血清肿预防，以允许患者更好且更快地恢复。

虽然已参照本发明的示例性实施方式具体示出和描述了本发明，但本领域普通技术人员应该理解，在不脱离由所附权利要求限定的本发明的精神和范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。

Claims (43)

1.生物组织粘合组合物，所述组合物包含

(i)胶合大分子单体，其包含一种或多种接枝有至少一个儿茶酚片段并包含至少一个可交联官能团的大分子；

(ii)用于交联所述至少一个儿茶酚片段的第一交联剂，其中所述第一交联剂包含多价金属离子或由多价金属离子组成；和

(iii)用于共价交联所述至少一个可交联官能团的第二交联剂，

其中所述一种或多种大分子通过以下而交联：(a)所述至少一个儿茶酚片段与所述多价金属离子之间的络合物形成，和(b)所述至少一个可交联官能团与所述第二交联剂之间的共价结合。

2.根据权利要求1所述的生物组织粘合组合物，其中所述一种或多种大分子不含醛基和/或氰基。

3.根据权利要求1或2所述的生物组织粘合组合物，其中所述一种或多种大分子选自氨基官能化多糖、聚氨基酸及其组合。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的生物组织粘合组合物，其中所述一种或多种大分子选自明胶、牛血清蛋白(BSA)、壳聚糖、聚乙烯亚胺、透明质酸、右旋糖酐、聚(天冬氨酸)、聚(谷氨酸)及其组合。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的生物组织粘合组合物，其中所述一种或多种大分子包含明胶或由明胶组成。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的生物组织粘合组合物，其中所述一种或多种大分子包含天然大分子单体或由天然大分子单体组成。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的生物组织粘合组合物，其中所述一种或多种接枝有至少一个儿茶酚片段的大分子能够通过使一种或多种大分子与含儿茶酚的化合物反应得到，所述含儿茶酚的化合物选自多巴胺、氢化咖啡酸、二羟基苯丙氨酸、3，4-二羟基氢化肉桂酸及其组合。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的生物组织粘合组合物，其中所述一种或多种大分子中儿茶酚片段的量在约0.1％(w/w)至约20％(w/w)的范围内。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的生物组织粘合组合物，其中所述多价金属离子为过渡金属离子。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的生物组织粘合组合物，其中所述多价金属离子选自Cu²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Cr³⁺及其组合。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的生物组织粘合组合物，其中所述多价金属离子包含Fe³⁺或由Fe³⁺组成。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的生物组织粘合组合物，其中所述第二交联剂包含接枝有至少一个α，β-不饱和羰基或α，β-不饱和磺酰基的大分子或由接枝有至少一个α，β-不饱和羰基或α，β-不饱和磺酰基的大分子组成。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的生物组织粘合组合物，其中所述至少一个可交联官能团为亲核官能团。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的生物组织粘合组合物，其中所述至少一个可交联官能团选自氨基、巯基及其组合。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的生物组织粘合组合物，其中所述至少一个可交联官能团包含氨基或由氨基组成。

16.根据权利要求15所述的生物组织粘合组合物，其中所述第二交联剂选自京尼平、聚京尼平、京尼平接枝分子及其组合。

17.制备生物组织粘合组合物的方法，所述方法包括

a)提供胶合大分子单体和第二交联剂的混合物，所述胶合大分子单体包含一种或多种接枝有至少一个儿茶酚片段并包含至少一个可交联官能团的大分子，所述第二交联剂用于共价交联所述至少一个可交联官能团；并

b)向所述混合物中加入用于交联所述至少一个儿茶酚片段的第一交联剂，其中所述第一交联剂包含多价金属离子或由多价金属离子组成，以通过所述至少一个儿茶酚片段与所述多价金属离子之间的络合物形成而交联所述一种或多种大分子。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述一种或多种大分子不含醛基和/或氰基。

19.根据权利要求17或18所述的方法，其中提供所述混合物包括：将包含所述一种或多种大分子和所述第二交联剂的固体掺和物溶解在水性溶液中。

20.根据权利要求17或18所述的方法，其中提供所述混合物包括：向包含所述一种或多种大分子的水性溶液中加入包含所述第二交联剂的水性溶液。

21.根据权利要求17-20中任一项所述的方法，其中所述混合物中大分子的浓度在约10％w/v至约50％w/v的范围内。

22.根据权利要求17-21中任一项所述的方法，其中所述混合物中所述第二交联剂的浓度在约2mM至约40mM的范围内。

23.根据权利要求17-22中任一项所述的方法，其中所述一种或多种大分子选自氨基官能化多糖、聚氨基酸及其组合。

24.根据权利要求17-23中任一项所述的方法，其中所述一种或多种大分子选自明胶、牛血清蛋白(BSA)、壳聚糖、聚乙烯亚胺、透明质酸、右旋糖酐、聚(天冬氨酸)、聚(谷氨酸)及其组合。

25.根据权利要求17-24中任一项所述的方法，其中所述一种或多种大分子包含明胶或由明胶组成。

26.根据权利要求17-25中任一项所述的方法，其中所述一种或多种大分子包含天然大分子单体或由天然大分子单体组成。

27.根据权利要求17-26中任一项所述的方法，其中所述一种或多种接枝有至少一个儿茶酚片段的大分子能够通过使一种或多种大分子与含儿茶酚的化合物反应得到，所述含儿茶酚的化合物选自多巴胺、氢化咖啡酸、二羟基苯丙氨酸、3，4-二羟基氢化肉桂酸及其组合。

28.根据权利要求17-27中任一项所述的方法，其中所述一种或多种大分子中儿茶酚片段的量在约0.1％(w/w)至约20％(w/w)的范围内。

29.根据权利要求17-28中任一项所述的方法，其中所述第二交联剂包含接枝有至少一个α，β-不饱和羰基或α，β-不饱和磺酰基的大分子或由接枝有至少一个α，β-不饱和羰基或α，β-不饱和磺酰基的大分子组成。

30.根据权利要求17-29中任一项所述的方法，其中所述至少一个可交联官能团为亲核官能团。

31.根据权利要求17-30中任一项所述的方法，其中所述至少一个可交联官能团选自氨基、巯基及其组合。

32.根据权利要求17-31中任一项所述的方法，其中所述至少一个可交联官能团包含氨基或由氨基组成。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述第二交联剂选自京尼平、聚京尼平、京尼平接枝分子及其组合。

34.根据权利要求17-33中任一项所述的方法，其中所述生物组织粘合组合物中多价金属离子的浓度在约5mM至约50mM的范围内。

35.根据权利要求17-34中任一项所述的方法，其中所述多价金属离子为过渡金属离子。

36.根据权利要求17-35中任一项所述的方法，其中所述多价金属离子选自Cu²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Cr³⁺及其组合。

37.根据权利要求17-36中任一项所述的方法，其中所述多价金属离子包含Fe³⁺或由Fe³⁺组成。

38.根据权利要求17-37中任一项所述的方法，其中提供所述混合物包括：将所述混合物涂覆在生物组织上以形成覆盖层。

39.根据权利要求38所述的方法，其中向所述混合物中加入所述第一交联剂包括：将液滴形式的包含所述第一交联剂的溶液分配在所述覆盖层上。

40.根据权利要求17-39中任一项所述的方法制备的生物组织粘合组合物。

41.用于粘合生物组织的试剂盒，所述试剂盒包含

a)胶合大分子单体，其包含一种或多种接枝有至少一个儿茶酚片段并包含至少一个可交联官能团的大分子；

b)用于交联所述至少一个儿茶酚片段的第一交联剂，其中所述第一交联剂包含多价金属离子或由多价金属离子组成；和

c)用于共价交联所述至少一个可交联官能团的第二交联剂。

42.粘合生物组织的方法，所述方法包括

a)将胶合大分子单体与第二交联剂的混合物涂覆在第一生物组织上以形成覆盖层，所述胶合大分子单体包含一种或多种接枝有至少一个儿茶酚片段并包含至少一个可交联官能团的大分子，所述第二交联剂用于共价交联所述至少一个可交联官能团；

b)将用于交联所述至少一个儿茶酚片段的第一交联剂添加到所述覆盖层上，所述第一交联剂包含多价金属离子或由多价金属离子组成；

c)使第二生物组织与所得覆盖层接触；并

d)向所述第一生物组织和所述第二生物组织之一或二者施加压力以使所述第一生物组织与所述第二生物组织粘合。

43.根据权利要求1-16中任一项所述的或者通过根据权利要求17-39中任一项所述的方法制备的生物组织粘合组合物作为用于医学和兽医应用的组织粘合剂和密封剂，在血清肿预防、创伤封闭、补充或替换内部手术程序中的缝线或卡钉、肠吻合、血管吻合、组织修复、眼科手术、药物递送、预防手术后粘连、和/或组织植入中的用途。