CN107614688A

CN107614688A - 产生苄基异喹啉生物碱(bia)前体的微生物及其制备和使用方法

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Publication number: CN107614688A
Application number: CN201680030359.0A
Authority: CN
Inventors: 克里斯蒂娜·D·斯默克; 凯瑟琳·托德利; 伊西斯·特伦查德
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 2015-05-04
Filing date: 2016-05-04
Publication date: 2018-01-19
Anticipated expiration: 2036-05-04
Also published as: HK1246353A1; US20210017524A1; WO2016179296A1; US20180163212A1; CN107614688B; US20190055567A1; US10752903B2; US10519453B2; CA2983419A1; EP3292203A1; EP3292203A4

Abstract

本文提供了用于产生苄基异喹啉生物碱产物的方法和工程化酵母细胞。一种方法包括向反应器提供工程化酵母细胞和原料。在所述反应器中，通过将所述工程化酵母细胞培养一段时间使所述工程化酵母细胞发酵，以产生包含BIA产物和细胞材料的溶液。所述溶液包含不超过一种类别的选自以下组的分子：原小檗碱、吗啡喃、异帕威碱、阿朴啡和苄基异喹啉。此外，使用至少一个分离单元将所述BIA产物与所述细胞材料分离以提供包含所述BIA产物的产物流。

Description

产生苄基异喹啉生物碱(BIA)前体的微生物及其制备和使用方法

政府权利

本发明是在由国家科学基金会颁发的1066100号合同和国家卫生研究院颁发的DAT007886A号合同所给予的政府支持下完成。政府享有本发明的某些权利。

相关申请的交叉引用

根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2015年5月4日提交的美国临时专利申请第62/156,701号的申请日的优先权，所述申请的公开内容通过引用并入本文。

此外，本申请涉及：美国专利申请第14/211,611号，现已公布为US 2014-0273109，该申请于2014年3月14日提交，并具有代理人档案号STAN-1018；PCT申请第PCT/US2014/027833号，现已公布为WO2014/143744，该申请于2014年3月14日提交，并具有代理人档案号STAN-1018WO；以及PCT申请第PCT/US2014/063738号，该申请于2014年11月3日提交，并具有代理人档案号STAN-1078WO，这些申请的公开内容通过引用并入本文。

发明背景

苄基异喹啉生物碱(BIA)是来自植物和其它生物体的一大群次生代谢物。这些分子在人体中具有治疗作用，包括从吗啡和可待因的已知的镇痛和止咳性质到针对黄连素和血根碱等分子观察到的对抗癌症和感染的新型活性。供应所有这些BIA分子以使得它们可供研究人员和医师使用是令人感兴趣的。合成反应的数目和对选择性立体化学的要求意味着BIA的化学合成是低产率的并且不是用于大规模生产的可行手段。相反，对于广泛使用的可待因和吗啡药物，鸦片罂粟(Papaver somniferum)已经作为生产作物繁殖和发育。适用作药物和药物前体的吗啡生物合成中的中间体不会积累，因为植物代谢演化为使产生最终阿片类物质的途径的通量最大化。即使对于终产物代谢物像吗啡，积累也仅发生在芽组织和维管组织中的特化细胞内，并且需要在提取过程中对收获的植物材料进行严苛的化学处理，这样可以产生按干重计少于2％的吗啡。因此，用于制备BIA的方法是令人感兴趣的。

发明内容

提供了被改造来产生目标苄基异喹啉生物碱(BIA)如去甲乌药碱(NC)和全去甲劳丹碱(NL)的宿主细胞。目标BIA可以包括BIA前体、BIA和BIA修饰。所述宿主细胞可以具有选自以下的一种或多种修饰：酶基因中的反馈抑制减轻突变；生物合成酶基因的转录调节修饰；酶的失活突变；以及异源编码序列。还提供了使用所述宿主细胞产生目标BIA的方法以及在本发明的方法中使用的组合物(例如试剂盒、系统等)。

本发明的一个方面提供了一种形成含有苄基异喹啉生物碱(BIA)产物的产物流的方法。所述方法包括向间歇式反应器提供工程化酵母细胞和包含营养物和水的原料，所述工程化酵母细胞具有选自由以下所组成的组的至少一种修饰：在所述细胞中天然存在的生物合成酶基因中的反馈抑制减轻突变；在所述细胞中天然存在的生物合成酶基因的转录调节修饰；以及在所述细胞中天然存在的酶的失活突变。另外，所述方法包括，在间歇式反应器中，通过将工程化酵母细胞培养至少约5分钟的时间使工程化酵母细胞发酵，以产生包含BIA产物和细胞材料的溶液。所述方法还包括使用至少一个分离单元将BIA产物与细胞材料分离以提供包含BIA产物的所述产物流。

另一方面，本发明提供了一种形成含有BIA产物的产物流的方法。所述方法包括向反应器提供工程化酵母细胞和包含营养物和水的原料。所述方法还包括，在反应器中，通过将工程化酵母细胞培养至少约5分钟(例如，5分钟或更长)的时间使工程化酵母细胞发酵，以产生包含细胞材料和BIA产物的溶液，其中所述溶液包含不超过一种类别的选自原小檗碱、吗啡喃、异帕威碱(isopavine)、阿朴啡(aporphine)和双苄基异喹啉的组的分子。此外，所述方法还包括使用至少一个分离单元将BIA产物与细胞材料分离以提供包含BIA产物的产物流。

本发明的另一方面提供一种产生苄基异喹啉生物碱(BIA)产物的工程化酵母细胞，所述工程化酵母细胞具有选自由以下所组成的组的至少一种修饰：在所述细胞中天然存在的生物合成酶基因中的反馈抑制减轻突变；在所述细胞中天然存在的生物合成酶基因的转录调节修饰；以及在所述细胞中天然存在的酶的失活突变。所述工程化酵母细胞包含编码选自6OMT、CNMT、CYP80B1、CPR和4'OMT的组的至少一种酶的至少一种异源编码序列。在一些实例中，所述工程化酵母细胞包含编码选自6OMT、CNMT、CYP80B1、CPR和4'OMT的组的酶的多个异源编码序列。在一些实例中，异源编码序列可以被可操作地连接。可操作地连接的异源编码序列可以在产生特定苄基异喹啉生物碱产物的相同途径内。

本发明的另一方面提供一种包含苄基异喹啉生物碱产物的化合物，所述苄基异喹啉生物碱产物被表征为选自由1-苄基异喹啉、原小檗碱、吗啡喃、异帕威碱、阿朴啡和双苄基异喹啉组成的组的至多两个类别的部分。该化合物的剩余组分不含有可检测量的非选自1-苄基异喹啉、原小檗碱、吗啡喃、异帕威碱、阿朴啡和双苄基异喹啉的类别的分子。

在本发明的另一方面，提供了治疗剂。所述治疗剂包含苄基异喹啉生物碱产物。所述治疗剂不含可检测量的选自由可待因-O(6)-甲基醚、8,14-二羟基-7,8-二氢可待因酮和四氢蒂巴因组成的组的杂质。

附图简述

结合附图阅读下面的详细描述可以最充分地理解本发明。要强调的是，按照惯例，附图的各种特征不是按比例绘制的。相反地，为了清楚起见，各种特征的尺寸被任意地扩大或缩小。附图中包括以下图式。

图1说明了从葡萄糖到酪氨酸和其它BIA前体分子的生物合成途径。

图2说明了ZWF1敲除和TKL1过表达对戊糖磷酸途径(PPP)的影响。A：天然PPP通量；B：修饰型PPP通量。

图3说明了NC(A)和NL(B)从前体分子的合成。

图4说明了四种遗传修饰对在不同的进料酪氨酸下的NC产生的影响。

图5示出了具有遗传修饰组合的菌株的NC产生。

图6示出了在醛氧化还原酶(ALD)/醇脱氢酶(ADH)基因敲除菌株中的NL产生的水平。

图7说明了体内L-DOPA脱羧酶(DODC)酶的活性。被DNA转化以表达鸦片罂粟酪氨酸/DOPA脱羧酶的酵母菌株可以在体内将L-DOPA转化为多巴胺。

图8示出了在饲喂100mM多巴胺和不同浓度酪氨酸的酵母菌株中的去甲乌药碱产生(NC)。

图9示出了在饲喂100mM多巴胺和没有酪氨酸的多种工程化酵母菌株中的NC产生。

图10示出了在额外整合有L-DOPA脱羧酶PpDODC的工程化酵母菌株(CSY980)中NC从多巴胺或L-DOPA的产生。

图11说明了包括使用伴有共底物四氢生物喋呤(BH4)的哺乳动物酪氨酸羟化酶(TyrH)进行酪氨酸羟化作用的生物合成方案。

图12示出了由酵母细胞表达的酪氨酸羟化酶将酪氨酸转化为L-DOPA：(A)LC-MS色谱图证实了在共底物BH4的存在下酪氨酸转化为L-DOPA；和(B)裂解物样品中的L-DOPA离子碎裂。

图13示出了酪氨酸羟化酶与BH4生物合成酶的共表达允许酪氨酸转化为L-DOPA。

图14说明了经由(A)NC和(B)NL的从BIA前体分子直至牛心果碱(reticuline)的生物合成途径。

图15示出了在工程化酵母菌株的液体培养物中从L-DOPA产生NC衍生的BIA前体分子(包括N-甲基乌药碱(B：m/z碎裂模式))的LC-MS分析(A：离子计数)。

图16示出了在工程化酵母菌株的液体培养物中从糖产生(A)NC和(B)牛心果碱的LC-MS分析(离子计数)。

图17示出了(A)培养基组成和(B)麦芽糊精和淀粉酶浓度对在工程化酵母菌株的液体培养物中从糖产生牛心果碱的影响。

图18示出了ADH和ALD酶的失活突变对在工程化酵母菌株的液体培养物中从糖产生牛心果碱的影响。

定义

在更详细地描述示例性实施方案之前，阐述以下定义以说明和确定描述中所使用的术语的含义和范围。

除非另有规定，否则本文所使用的所有技术和科技术语具有如本发明所属技术领域的一般技术人员通常所理解的相同含义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGYAND MOLECULAR BIOLOGY，第2版，John Wiley and Sons,New York(1994)以及Hale&Markham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,N.Y.(1991)为技术人员提供本文中使用的许多术语的通用含义。然而，为了清楚和便于参考，某些术语的定义如下。

应当注意，如本文中和随附权利要求书中所使用，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数的指示对象，除非上下文另有明确说明。例如，术语“引物”是指一个或多个引物，即单个引物和多个引物。另外要注意的是，拟定的权利要求不包括任何可选要素。因此，本声明旨在作为使用与叙述权利要求要素有关的“只是”、“仅仅”等排他性术语或使用“否定性”限制的先行基础。

如本文中所使用，术语“测定”、“测量”、“评估”和“分析”可互换使用并且包括定量和定性测定。

如本文中所用，术语“多肽”是指任何长度的氨基酸聚合形式，包括长度为2-50个氨基酸的肽和长度大于50个氨基酸的多肽。术语‘多肽’和‘蛋白质’在本文中可互换使用。术语“多肽”包括编码和非编码氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸的聚合物；以及具有修饰的肽骨架的多肽，其中常规骨架已被非天然存在的或合成的骨架替代。多肽可以具有任何适宜的长度，例如2个或更多个氨基酸，例如4个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、20个或更多个氨基酸、50个或更多个氨基酸、100个或更多个氨基酸、300个或更多个氨基酸，例如最多500个或1000个或更多个氨基酸。“肽”可以具有2个或更多个氨基酸，例如4个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、20个或更多个氨基酸，例如至多50个氨基酸。在一些实施方案中，肽的长度为5至30个氨基酸。

如本文中所使用，术语“分离的”是指目标部分与在纯化之前结合该目标部分的其它组分至少60％分离，至少75％分离，至少90％分离，至少95％分离，至少98％分离，甚至至少99％分离。

如本文中所使用，术语“编码”是指编码多肽序列的核酸序列，其中多肽序列或其部分含有来自由核酸序列编码的多肽的3个或更多个氨基酸(例如5个或更多个、8个或更多个、10个或更多个、15个或更多个或20个或更多个氨基酸)的氨基酸序列。该术语还包括可用由序列编码的多肽进行免疫识别的多肽序列。

“载体”能够将基因序列转移到靶细胞中。如本文中所使用，术语“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”可互换使用来表示能够指导目标基因的表达并且可以将基因序列转移到靶细胞中的任何核酸构建体，所述转移是通过所述载体的全部或部分的基因组整合或所述载体作为染色体外元件的短暂或可遗传的维持来完成。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及整合载体。

“表达盒”包括能够指导目标基因/编码序列表达的任何核酸构建体，其可操作地连接到表达盒的启动子。这样的盒被构建至“载体”、“载体构建体”、“表达载体”或“基因转移载体”中，以将表达盒转移到靶细胞中。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体。

“多个”包含至少2个成员。在某些情况下，多个可以具有10个或更多个，例如100个或更多个、1000个或更多个、10,000个或更多个、100,000或更多个、10⁶个或更多个、10⁷个或更多个、10⁸个或更多个或10⁹个或更多个成员。

数值范围包括限定该范围的数字。

本文描述的方法包括多个步骤。每个步骤可以根据需要在步骤之间经过预定量的时间后进行。如此，执行每个步骤所间隔的时间可以是1秒或更久、10秒或更久、30秒或更久、60秒或更久、5分钟或更久、10分钟或更久、60分钟或更久，并且包括5小时或更久。在某些实施方案中，每个后续步骤在前一步骤完成之后立即进行。在其它实施方案中，可以在完成前一步骤后的培养或等待时间(例如几分钟至整夜等待时间)之后执行下一步骤。

术语的其它定义可以在整个说明书中出现。

具体实施方式

提供了被改造来产生目标苄基异喹啉生物碱(BIA)如去甲乌药碱(NC)和全去甲劳丹碱(NL)的宿主细胞。所述宿主细胞可以具有选自以下的一种或多种工程修饰：酶基因中的反馈抑制减轻突变；生物合成酶基因的转录调节修饰；酶的失活突变；以及异源编码序列。还提供了使用所述宿主细胞产生目标BIA的方法以及在本发明的方法中使用的组合物(例如试剂盒、系统等)。

在更详细地描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定实施方案，并且因此可以变化。还应该理解，本文所使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，而无意具有限制性，因为本发明的范围将仅受所附权利要求书限制。

在提供值的范围的情况下，应当理解，所述范围的上限与下限之间的各中间值(精确至下限的单位的十分之一，除非上下文另外清楚地指示)以及在所陈述的范围内的任何其它陈述值或中间值涵盖于本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在这些较小范围内并且也涵盖于本发明内，从属于所述范围内的任何特定排除的限值。在所述范围包括所述限值中的一者或两者的情况下，本发明还包括排除那些所包括的限值中的任一者或两者的范围。

在本文中以由术语“约”开头的数值提供了某些范围。术语“约”在本文中被用来准确地指示其后面的确切数字以及与此术语后面的数字接近或近似的数字。在确定数值是否接近或近似具体列举的数值时，接近或近似的未列举数值可以是在其出现的上下文中提供与具体列举的数值实质等同的数值。

除非另有规定，否则本文所使用的所有技术和科技术语具有如本发明所属技术领域的一般技术人员通常所理解的相同含义。虽然类似或等同于本文所描述的那些方法和材料的任何方法和材料也可以用于实践或测试本发明，但现在描述代表性的说明性方法和材料。

本说明书中所引用的所有公布和专利均通过引用并入本文中，就如同每一个公布或专利被特定地和个别地指示为通过引用并入，并且通过引用并入本文中以公开和描述与所引用的公布有关的方法和/或材料。任何公布的引用是为了其在提交日期之前的公开内容，而不应被解释为承认本发明无权由于先前发明而先于这些出版物。另外，所提供的出版物的日期可以不同于实际出版日期，这可能需要单独确认。

本领域技术人员在阅读本公开时将明白的是，本文中所描述和说明的各个实施方案具有离散的组分和特征，这些组分和特征可以容易地与任何其它若干实施方案的特征分离或组合而不偏离本发明的范围或精神。任何所陈述的方法均以所陈述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序进行。

在进一步描述本发明中，首先更详细地描述目标BIA前体、BIA和BIA修饰，接着描述用于产生这些的宿主细胞。接着，综述其中使用宿主细胞的目标方法。还描述了可用于本发明的实践方法的试剂盒。

苄基异喹啉生物碱(BIA)前体

如上所述，提供了产生苄基异喹啉生物碱前体(BIA前体)的宿主细胞。BIA前体可以是产生目标BIA(例如，如本文所述)的合成途径中的任何中间体或前体化合物(例如，如本文所述)。在一些情况下，BIA前体具有可以被表征为BIA或其衍生物的结构。在某些情况下，BIA前体具有可被表征为BIA片段的结构。在一些情况下，BIA前身是早期BIA。如本文中所用，“早期BIA”意指在细胞中目标BIA的合成期间的早期中间体，其中早期BIA由宿主细胞从宿主细胞原料或简单的起始化合物产生。在一些情况下，早期BIA是由主题宿主细胞仅从宿主细胞原料(例如，碳和营养源)产生的BIA中间体，而不需要向细胞中添加起始化合物。术语早期BIA可以指目标BIA终产物的前体，无论早期BIA本身是否可以被表征为苄基异喹啉生物碱。

在一些情况下，BIA前体是早期BIA，例如前牛心果碱苄基异喹啉生物碱。因此，提供了产生前牛心果碱苄基异喹啉生物碱(前牛心果碱BIA)的宿主细胞。牛心果碱是通过细胞工程努力合成下游BIA以产生最终产物如阿片类产物期间的重要分支点中间体。主题宿主细胞可以从可用于生产牛心果碱和下游BIA终产物的简单且廉价的起始材料产生BIA前体。

如本文中所用，术语“前牛心果碱苄基异喹啉生物碱”、“前牛心果碱BIA”和“前牛心果碱BIA前体”可互换使用，并且是指牛心果碱的生物合成前体，无论牛心果碱前体本身的结构是否被表征为苄基异喹啉生物碱。术语前牛心果碱BIA意在包括可以产生牛心果碱的宿主细胞生物合成途径的任何方便成员的生物合成前体、其中间体和代谢物。在一些情况下，前牛心果碱BIA包括苄基异喹啉生物碱片段，例如苄基片段、喹啉片段或其前体或衍生物。在某些情况下，前牛心果碱BIA具有可以被表征为苄基异喹啉生物碱或其衍生物的结构。

目标BIA前体包括但不限于去甲乌药碱(NC)和全去甲劳丹碱(NL)，以及NC和NL前体，例如酪氨酸、酪胺、4-羟基苯乙醛(4-HPA)、4-羟基苯丙酮酸(4-HPPA)、L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)、3,4-二羟基苯乙醛(3,4-DHPA)和多巴胺。在一些实施方案中，一种或多种BIA前体是3,4-二羟基苯乙醛(3,4-DHPA)和多巴胺。在某些情况下，一种或多种BIA前体是4-羟基苯基乙醛(4-HPA)和多巴胺。图3A和3B分别说明了通过Pictet-Spengler缩合反应从前体分子合成NC和NL，其中所述反应可以自然发生或可以被任何方便的酶催化。

BIA前体的合成途径可以在宿主细胞中产生，并且可以从任何方便的起始化合物或材料开始。图1说明了从葡萄糖开始的BIA前体的目标合成途径。起始材料可以是非天然存在的，或者起始材料可以天然存在于宿主细胞中。基于存在于宿主细胞中的合成途径，可以使用任何方便的化合物和材料作为起始材料。起始材料的来源可以是宿主细胞本身，例如酪氨酸，或者起始材料可以从外部来源添加或补充到宿主细胞中。因此，在一些情况下，起始化合物是指从不是生长原料或细胞生长培养基的一部分的外部来源添加到宿主细胞中的细胞合成途径中的化合物。目标起始化合物包括但不限于多巴胺、4-HPA、4-HPPA以及图1中所示的任何化合物。例如，如果宿主细胞在液体培养物中生长，则细胞培养基可以补充起始材料，其被转运至细胞中并被细胞转化成所需产物。目标起始材料包括但不限于廉价的原料和简单的前体分子。在一些情况下，宿主细胞利用包含简单碳源的原料作为起始材料，其被宿主细胞利用以产生细胞合成途径中的化合物。宿主细胞生长原料可以包括一种或多种组分，例如碳源(如纤维素、淀粉、游离糖)和氮源如铵盐或廉价氨基酸。在一些情况下，可用作起始材料的生长原料可以源自可持续来源，例如生长在边缘土地上的生物质，包括柳枝稷和藻类，或来自其它工业或农业活动的生物质废物。

苄基异喹啉生物碱(BIA)

如上所述，提供了产生目标苄基异喹啉生物碱(BIA)的宿主细胞。在一些实施方案中，本发明的工程菌株将提供用于产生多种结构类别的目标苄基异喹啉生物碱和其修饰的平台，所述结构类别包括但不限于苄基异喹啉、原小檗碱、原阿片碱、苯并菲啶、原吗啡喃(promorphinan)、吗啡喃、断裂小檗碱(secoberberine)、苯酞异喹啉、阿朴啡、双苄基异喹啉等。这些类别中的每一个意在包括可以产生所述类别的成员的宿主细胞生物合成途径的任何方便成员的生物合成前体、其中间体和代谢物。下文给出了这些结构类别中的每一个的非限制性化合物实例。在一些实施方案中，给定实例的结构本身可以被或不被表征为苄基异喹啉生物碱。本发明的化学实体旨在包括所有可能的异构体，包括单一对映体、外消旋混合物、光学纯形式、非对映体混合物和中间体混合物。

苄基异喹啉可以包括但不限于：去甲乌药碱、全去甲劳丹碱、乌药碱、3'-羟基乌药碱、4'-O-甲基全去甲劳丹碱、4'-O-甲基劳丹碱、N-甲基去甲乌药碱、劳丹碱、N-甲基乌药碱、3'-羟基-N-甲基乌药碱、牛心果碱、去甲牛心果碱、罂粟碱、劳丹宁(laudanine)、劳丹素(laudanosine)、四氢罂粟碱、1,2-二氢罂粟碱和东罂粟灵(orientaline)。

原小檗碱可以包括但不限于：斯氏紫堇碱(scoulerine)、碎叶紫堇碱(cheilanthifoline)、刺罂粟碱(stylopine)、南丁宁碱(nandinine)、药根碱(jatrorrhizine)、千金藤啶碱(stepholidine)、离木明碱(discretamine)、顺式-N-甲基刺罂粟碱、四氢非洲防己碱、巴马汀(palmatine)、四氢巴马汀、非洲防己碱(columbamine)、四氢小檗碱、N-甲基四氢小檗碱、1-羟基四氢小檗碱、小檗碱、N-甲基-左旋蛇果黄堇碱(N-methyl-ophiocarpine)、1,13-二羟基-N-甲基四氢小檗碱和1-羟基-10-O-乙酰基-N-甲基四氢小檗碱。

原阿片碱可以包括但不限于原阿片碱、6-羟基原阿片碱、别隐品碱(allocryptopine)、隐品碱、隐掌叶防己碱(muramine)和黄唐松草星碱(thalictricine)。

苯并菲啶可以包括但不限于二氢血根碱(dihydrosanguinarine)、血根碱、dihydrocheilirubine、cheilirubine、二氢马卡平(dihydromarcapine)、马卡平(marcapine)和白屈菜赤碱(chelerythrine)。

原吗啡喃可以包括但不限于沙罗泰里啶(salutaridine)、沙罗泰里啶醇(salutaridinol)和沙罗泰里啶醇-7-O-乙酸酯。

吗啡喃可以包括但不限于：蒂巴因(thebaine)、可待因酮、可待因、吗啡、吗啡酮、东罂粟碱(oripavine)、尼奥平酮(neopinone)、尼奥平(neopine)、新吗啡、氢可酮、二氢可待因、14-羟可待因酮、羟考酮、14-羟基可待因、吗啡酮、氢吗啡酮、二氢吗啡、二氢埃托啡、乙基吗啡、埃托啡(etorphine)、麦托朋(metopon)、丁丙诺啡(buprenorphine)、福尔可定(pholcodine)、异可待因(heterocodeine)和羟吗啡酮。

断裂小檗碱可以包括但不限于4'-O-去甲基马克朗特醛(macrantaldehyde)、4'-O-去甲基罂粟奥辛(papaveroxine)、4'-O-去甲基-3-O-乙酰罂粟奥辛和3-O-乙酰罂粟奥辛。

苯酞异喹啉可以包括但不限于那可托灵半缩醛(narcotolinehemiacetal)、那可汀半缩醛(narcotinehemiacetal)、那可托灵(narcotoline)和诺斯卡品(noscapine)。

阿朴啡可以包括但不限于木兰花碱(magnoflorine)、紫堇块茎碱(corytuberine)、阿朴吗啡、波尔定碱(boldine)、异波尔定碱、异蒂巴因、异紫堇块茎碱和加奥芬(glaufine)。

双苄基异喹啉可以包括但不限于黄芦木碱(berbamunine)、guattgaumerine、北豆根碱(dauricine)和莲心碱(liensinine)。

可以由本发明的工程菌株产生的其它化合物可以包括但不限于丽春花碱(rhoeadine)、帕威碱(pavine)、异帕威碱和枯拉灵(cularine)。

在某些实施方案中，本发明的工程菌株可以提供用于产生与四氢生物喋呤合成相关的化合物的平台，所述化合物包括但不限于三磷酸二氢新喋呤、6-丙酮酰四氢喋呤、5,6,7,8-四氢生物喋呤、7,8-二氢生物蝶呤、四氢生物蝶呤4a-甲醇胺、醌型二氢生物蝶呤和生物蝶呤。

宿主细胞

如上所概述，本发明的一个方面是产生一种或多种目标BIA的宿主细胞。在主题宿主细胞和方法中可以使用任何方便的细胞。在一些情况下，宿主细胞是非植物细胞。在一些情况下，宿主细胞可以被表征为微生物细胞。在某些情况下，宿主细胞是昆虫细胞、哺乳动物细胞、细菌细胞或酵母细胞。任何方便类型的宿主细胞都可以用于制备产生主题BIA的细胞，参见例如US2008/0176754(现已公开为美国专利第8,975,063号)、US2014/0273109(代理人档案号STAN-1018)和WO2014/143744(代理人档案号STAN-1018WO)，这些文献的公开内容通过引用整体并入。目标宿主细胞包括但不限于细菌细胞，例如枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；昆虫细胞如黑腹果蝇S2和草地贪夜蛾Sf9细胞；以及酵母细胞如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母和巴斯德毕赤酵母细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是酵母细胞或大肠杆菌细胞。在一些情况下，宿主细胞是酵母细胞。在一些情况下，宿主细胞来自被工程改造来产生目标BIA的酵母菌株。描述在US2008/0176754(现已公开为美国专利第8,975,063号)、US2014/0273109(代理人档案号STAN-1018)和WO2014/143744(代理人档案号STAN-1018WO)中的任何宿主细胞可以被改造来在主题细胞和方法中使用。在某些实施方案中，酵母细胞可以是酿酒酵母(S.cerevisiae)菌种。在某些实施方案中，酵母细胞可以是粟酒裂殖酵母菌种。在某些实施方案中，酵母细胞可以是巴斯德毕赤酵母菌种。酵母作为宿主细胞是受关注的，因为涉及一些目标生物合成途径的细胞色素P450蛋白能够适当地折叠到内质网膜中，从而维持它们的活性。适用于本发明的目标酵母菌株包括但不限于CEN.PK(基因型：MATa/α ura3-52/ura3-52 trp1-289/trp1-289leu2-3_112/leu2-3_112his3Δ1/his3Δ1MAL2-8C/MAL2-8C SUC2/SUC2)、S288C、W303、D273-10B、X2180、A364A、∑1278B、AB972、SK1和FL100。在某些情况下，酵母菌株是S288C(MATα；SUC2mal mel gal2CUP1flo1flo8-1hap1)、BY4741(MATα；his3Δ1；leu2Δ0；met15Δ0；ura3Δ0)、BY4742(MATα；his3Δ1；leu2Δ0；lys2Δ0；ura3Δ0)、BY4743(MATa/MATα；his3Δ1/his3Δ1；leu2Δ0/leu2Δ0；met15Δ0/MET15；LYS2/lys2Δ0；ura3Δ0/ura3Δ0)以及WAT11或W(R)中的任何一个，WAT11或W(R)是W303-B菌株(MATa；ade2-1；his3-11、-15；leu2-3,-112；ura3-1；canR；cyr+)的衍生物，分别表达拟南芥(Arabidopsis thaliana)NADPH-P450还原酶ATR1和酵母NADPH-P450还原酶CPR1。在另一个实施方案中，酵母细胞是W303α(MATα；his3-11,15trp1-1 leu2-3 ura3-1 ade2-1)。其它目标酵母菌株的身份和基因型可见于EUROSCARF(web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/col_index.html)。

宿主细胞可以被工程改造为包括用于产生目标BIA的一个或多个修饰(例如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个或甚至更多个修饰)。在一些情况下，修饰意指遗传修饰，例如基因或其片段的突变、添加或缺失，或基因或其片段的转录调节。在一些情况下，所述一个或多个(例如两个或更多个、三个或更多个或四个或更多个)修饰选自：在细胞中天然存在的生物合成酶基因中的反馈抑制减轻突变；在细胞中天然存在的生物合成酶基因的转录调节修饰；在细胞中天然存在的酶的失活突变；和编码酶的异源编码序列。包括一个或多个修饰的细胞可以被称为修饰细胞。

修饰细胞可以过量产生一种或多种前体BIA、BIA或修饰型BIA分子。过量产生意指所述细胞相对于对照细胞(例如，未修饰的细胞)具有改善或增加的目标BIA分子的产生。改善或增加的产生意指在对照没有BIA前体产生的情况下产生一些量的目标BIA，以及在对照具有一些目标BIA产生的情况下增加约10％或更多，例如约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多，例如2倍或更多倍，例如5倍或更多倍，包括10倍或更多倍。

在一些情况下，相对于缺少一个或多个修饰(例如，如本文所述的修饰)的对照宿主细胞，宿主细胞能够产生增加量的去甲乌药碱。在某些情况下，相对于对照宿主细胞，去甲乌药碱的增加量为约10％或更多，例如约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多、2倍或更多、5倍或更多或甚至10倍或更多。

在一些情况下，相对于缺少一个或多个修饰(例如，如本文所述的修饰)的对照宿主细胞，宿主细胞能够产生增加量的全去甲劳丹碱。在某些情况下，相对于对照宿主细胞，全去甲劳丹碱的增加量为约10％或更多，例如约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多、2倍或更多、5倍或更多或甚至10倍或更多。

在一些实施方案中，宿主细胞能够从起始化合物如酪氨酸产生10％或更高产率的去甲乌药碱，例如从起始化合物产生20％或更高、30％或更高、40％或更高、50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高或甚至90％或更高产率的去甲乌药碱。

在一些实施方案中，宿主细胞能够从起始化合物如酪氨酸产生10％或更高产率的全去甲劳丹碱，例如从起始化合物产生20％或更高、30％或更高、40％或更高、50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高或甚至90％或更高产率的全去甲劳丹碱。

在一些实施方案中，宿主细胞过量产生选自由酪氨酸、4-羟基苯乙醛(4-HPA)、L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)、3,4-二羟基苯乙醛(3,4-DHPA)和多巴胺组成的组的一种或多种目标BIA分子。

所述一个或多个修饰的任何方便的组合可以包括在主题宿主细胞中。在一些情况下，包括两种或更多种(如两种或更多种、三种或更多种或四种或更多种)不同类型的修饰。在某些情况下，主题细胞中包括相同类型修饰的两个或更多个(例如三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个或甚至更多个)不同的修饰。

在宿主细胞的一些实施方案中，当细胞包括编码一种或多种酶的一个或多个异源编码序列时，其包括选自由以下所组成的组的至少一种其它修饰：在细胞中天然存在的生物合成酶基因的反馈抑制减轻突变，在细胞中天然存在的生物合成酶基因的转录调节修饰；和在细胞中天然存在的酶的失活突变。在宿主细胞的某些实施方案中，当细胞包括在细胞中天然存在的一种或多种生物合成酶基因的一个或多个反馈抑制减轻突变时，其包括选自由以下所组成的组的至少一种其它修饰：在细胞中天然存在的生物合成酶基因的转录调节修饰；在细胞中天然存在的酶的失活突变；和编码酶的异源编码序列。在宿主细胞的一些实施方案中，当细胞包括在细胞中天然存在的一种或多种生物合成酶基因的一个或多个转录调节修饰时，其包括选自由以下所组成的组的至少一种其它修饰：在细胞中天然存在的生物合成酶基因的反馈抑制减轻突变；在细胞中天然存在的酶的失活突变；和编码酶的异源编码序列。在宿主细胞的某些实例中，当细胞包括在细胞中天然存在的一种或多种酶的一个或多个失活突变时，其包括选自由以下所组成的组的至少一种其它修饰：在细胞中天然存在的生物合成酶基因的反馈抑制减轻突变；在细胞中天然存在的生物合成酶基因的转录调节修饰；和编码酶的异源编码序列。

在宿主细胞的某些实施方案中，细胞包括在细胞中天然存在的一种或多种生物合成酶基因的一个或多个反馈抑制减轻突变；以及在细胞中天然存在的一种或多种生物合成酶基因的一个或多个转录调节修饰。在宿主细胞的某些实施方案中，细胞包括在细胞中天然存在的一种或多种生物合成酶基因的一个或多个反馈抑制减轻突变；以及在细胞中天然存在的酶的一个或多个失活突变。在宿主细胞的某些实施方案中，细胞包括在细胞中天然存在的一种或多种生物合成酶基因的一个或多个反馈抑制减轻突变；以及一个或多个异源编码序列。在一些实施方案中，宿主细胞包括一个或多个修饰(例如，如本文所述)，所述修饰包括表1中所述的一个或多个目标基因。

反馈抑制减轻突变

在一些情况下，宿主细胞是在所述细胞的一种或多种生物合成酶基因中包含一个或多个反馈抑制减轻突变(例如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个或甚至更多个)的细胞。在一些情况下，一种或多种生物合成酶基因是细胞中天然存在的(例如，存在于未修饰的细胞中)。如本文中所用，术语“反馈抑制减轻突变”是指缓和宿主细胞的反馈抑制控制机制的突变。反馈抑制是细胞的控制机制，其中当受调控化合物累积到一定水平时，该化合物的合成途径中的酶被抑制，从而平衡该化合物在细胞中的量。在一些情况下，一个或多个反馈抑制减轻突变存在于在图1或图2的合成途径中描述的酶中。减轻反馈抑制的突变使目标细胞中受调控酶的抑制相对于对照细胞减少，并且提供水平提高的受调控化合物或其下游生物合成产物。在一些情况下，减轻受调控酶的抑制意指抑制的IC₅₀增加2倍或更多倍，例如3倍或更多倍、5倍或更多倍、10倍或更多倍、30倍或更多倍、100倍或更多倍、300倍或更多倍、1000倍或更多倍或甚至更多倍。提高的水平意指为对照细胞中的受调控化合物或其下游产物的水平的110％或更多，例如120％或更多、130％或更多、140％或更多、150％或更多、160％或更多、170％或更多、180％或更多、190％或更多、200％或更多的水平，例如为对照细胞中的受调控化合物或其下游产物的水平的至少3倍或更多倍、至少5倍或更多倍、至少10倍或更多倍或甚至更多倍的水平。

涉及调控BIA前体水平的各种反馈抑制控制机制和天然存在于宿主细胞中的生物合成酶可以被作为宿主细胞中的减轻目标。宿主细胞可以包括在细胞中天然存在的一种或多种生物合成酶基因的一个或多个反馈抑制减轻突变。突变可以位于宿主细胞中天然存在的任何方便的生物合成酶基因中，其中所述生物合成酶经受调节控制。在一些实施方案中，所述一种或多种生物合成酶基因编码选自3-脱氧-d-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合酶和分支酸变位酶的一种或多种酶。在一些实施方案中，所述一种或多种生物合成酶基因编码3-脱氧-d-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合酶。在一些情况下，所述一种或多种生物合成酶基因编码分支酸变位酶。在某些情况下，一个或多个反馈抑制减轻突变存在于选自ARO4和ARO7的生物合成酶基因中。在某些情况下，一个或多个反馈抑制减轻突变存在于ARO4生物合成酶基因中。在某些情况下，一个或多个反馈抑制减轻突变存在于ARO7生物合成酶基因中。在一些实施方案中，宿主细胞包括在一种或多种生物合成酶基因(例如表1中所述那些基因之一)中的一个或多个反馈抑制减轻突变。

可以使用任何方便数量和类型的突变来减缓反馈抑制控制机制。如本文中所用，术语“突变”是指相对于参考序列或基序的氨基酸残基或核苷酸残基的缺失、插入或取代。突变可以作为原始基因座处的天然基因的定向突变并入。在一些情况下，突变可以作为在单独基因座处作为遗传整合引入的基因的额外拷贝或作为附加型载体如2μ或着丝粒质粒上的额外拷贝并入。在某些情况下，酶的反馈抑制型拷贝处在天然细胞转录调控下。在一些情况下，通过将酶的反馈抑制型拷贝置于合成启动子的控制下在蛋白质表达的工程化组成型或动态调控的情况下引入所述拷贝。

在某些实施方案中，一个或多个反馈抑制减轻突变存在于ARO4基因中。目标ARO4突变包括但不限于用亮氨酸取代位置229处的赖氨酸残基、用赖氨酸残基取代位置166处的谷氨酰胺残基，或由Hartmann M等人((2003)Proc.Nat'l Acad.Sci.U S A 100(3):862-867)或Fukuda等人((1992)J Ferment Bioeng 74(2):117-119)描述的突变。在一些情况下，用于赋予反馈抑制的突变选自酶突变体的诱变文库。此类选择的实例包括用过量酪氨酸拯救培养基中的o-氟-D,L-苯丙氨酸的生长或aro3突变酵母菌株的生长，如由Fukuda等人((1990)Breeding of Brewing Yeast Producing a Large Amount of Beta-Phenylethyl Alcohol and Beta-Phenylethyl Acetate.Agr Biol Chem Tokyo 54(1):269-271)所述。

目标ARO7突变包括但不限于用异亮氨酸取代位置226处的苏氨酸残基，如由Schmidheini等人((1989),J Bacteriol 171(3):1245-1253)所述；以及选自微生物分支酸变位酶突变体的诱变文库的赋予反馈抑制的其它突变。此类选择的实例包括在没有外部饲喂的酪氨酸下针对表达异源酪氨酸酶(1.9)的菌株中的5-甲基色氨酸敏感性或增加的黑色素产生的分析。

在某些实施方案中，本发明的宿主细胞可以包含在宿主细胞中天然存在的一种或多种生物合成酶基因中的1个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个或甚至15个或更多个反馈抑制减轻突变，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个反馈抑制减轻突变。

转录调节修饰

宿主细胞可以包含细胞的一种或多种生物合成酶基因的一个或多个转录调节修饰(如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个或甚至更多个修饰)。在一些情况下，一种或多种生物合成酶基因是细胞中天然存在的。细胞的任何方便的生物合成酶基因可以被当作转录调节的目标。转录调节意指相对于对照细胞(例如，未修饰的细胞)，修饰型细胞中的目标基因的表达被调节，例如增加或减少、增强或抑制。在一些情况下，目标基因的转录调节包括增加或增强表达。增加或增强表达意指相较于对照(即在未经修饰的相同细胞中的表达)，目标基因的表达水平增加2倍或更多倍，例如5倍或更多倍且有时增加25倍、50倍或100倍或更多倍，并且在某些实施方案中增加300倍或更多倍或更高(例如，通过使用任何方便的基因表达分析)。或者，在细胞中的目标基因的表达低到不可检测的情况下，如果将表达增加至可检测的水平，则认为目标基因的表达水平增加。在某些情况下，目标基因的转录调节包括减少或抑制表达。减少或抑制表达意指相较于对照，目标基因的表达水平降低2倍或更多倍，例如5倍或更多倍且有时增加25倍、50倍或100倍或更多倍，并且在某些实施方案中增加300倍或更多倍或更高。在一些情况下，表达减少到不可检测的水平。可以适用于主题宿主细胞的目标宿主细胞过程的修饰描述于Smolke等人的美国公开第20140273109(14/211,611)号中，所述文献的公开内容通过引用整体并入本文。

任何方便的生物合成酶基因都可以接受转录调节，并且包括但不限于图1中所述的那些生物合成酶，例如ARO3、ARO4、ARO1、ARO7、TYR1、TYR、TyrH、DODC、MAO、ARO10、ARO9和TKL。在一些情况下，一种或多种生物合成酶基因选自ARO10、ARO9和TKL。在一些情况下，一种或多种生物合成酶基因是ARO10。在某些情况下，一种或多种生物合成酶基因是ARO9。在一些实施方案中，一种或多种生物合成酶基因是TKL。在一些实施方案中，宿主细胞包含一种或多种基因(例如表1中所述那些基因之一)的一个或多个转录调节修饰。在一些实施方案中，宿主细胞包含一种或多种基因(例如图1和图2中的一者的合成途径中描述的那些基因之一)的一个或多个转录调节修饰。

在一些实施方案中，转录调节修饰包括用强启动子取代一种或多种生物合成酶基因的天然启动子或在强启动子的控制下表达所述一种或多种基因的额外拷贝。驱动目标基因表达的启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子，条件是所述启动子在宿主细胞中可以是活性的。目标基因可以从其天然启动子表达，或者可以使用非天然启动子。虽然不是必需的，但是此类启动子在使用它们的宿主中应该是中等到高强度的。启动子可以是受调控的或组成型的。在一些实施方案中，使用不受葡萄糖阻抑的或者在培养基中存在葡萄糖时仅受轻微阻抑的启动子。存在众多适合的启动子，其实例包括糖酵解基因的启动子，如枯草杆菌tsr基因的启动子(编码果糖二磷酸醛缩酶)或来自酿酒酵母的GAPDH启动子(编码甘油醛-磷酸脱氢酶)(Bitter G.A.,Meth.Enzymol.152:673 684(1987))。其它目标强启动子包括但不限于面包酵母的ADHI启动子(Ruohonen L.等人，J.Biotechnol.39:193 203(1995))；磷酸饥饿诱导型启动子，如酵母的PHO5启动子(Hinnen,A.等人，Yeast GeneticEngineering,Barr，P.J.等人编辑，Butterworths(1989))；来自地衣芽孢杆菌的碱性磷酸酶启动子(Lee.J.W.K.等人，J.Gen.Microbiol.137:1127 1133(1991))；GPD1和TEF1。目标酵母启动子包括但不限于：诱导型启动子如Gal1-10、Gal1、GalL、GalS；阻抑型启动子Met25、tetO；以及组成型启动子，如甘油醛3-磷酸脱氢酶启动子(GPD)、醇脱氢酶启动子(ADH)、翻译延伸因子-1-α启动子(TEF)、细胞色素c-氧化酶启动子(CYC1)、MRP7启动子等。在某些情况下，强启动子是GPD1。在某些情况下，强启动子是TEF1。含有可由激素(如糖皮质激素、类固醇和甲状腺激素)诱导的启动子的自主复制酵母表达载体也是已知的并且包括但不限于，糖皮质激素反应元件(GRE)和甲状腺激素反应元件(TRE)，参见例如在美国专利第7,045,290号中描述的那些启动子。可以使用含有组成型或诱导型启动子如α因子、醇氧化酶和PGH的载体。此外，任何启动子/增强子组合(根据真核启动子数据库EPDB)也可以用于驱动目标基因的表达。应当理解，可以选择任何方便的宿主细胞特异性启动子，例如大肠杆菌。在一些情况下，启动子选择可以用于优化转录，并且因此优化酶水平，从而使生产最大化，同时使能量资源最小化。

失活突变

宿主细胞可以包含所述细胞的酶的一个或多个失活突变(如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个或甚至更多)。包含一个或多个失活突变可以修饰宿主细胞的合成途径的通量以增加目标BIA前体或产生所述BIA前体的所需酶或前体的水平。在一些情况下，一个或多个失活突变是针对细胞中天然存在的酶。图2说明了天然戊糖磷酸途径(PPP)通量和修饰型PPP通量，其中修饰型PPP通量涉及ZWF1酶的失活。如本文中所用，“失活突变”意指细胞的基因或调控DNA序列的一个或多个突变，其中所述突变使由目标基因表达的蛋白质的生物活性失活。在一些情况下，所述基因是细胞中天然存在的。在一些情况下，所述基因编码失活的酶，并且是由宿主细胞产生的目标BIA的合成途径的一部分或连接至所述合成途径。在一些情况下，失活突变位于控制目标基因的调控DNA序列中。在某些情况下，失活突变是针对基因的启动子。可以使用任何方便的突变(例如，如本文所述)使目标基因或调控DNA序列失活。“失活的”或“失活”意指相对于由未突变的对照基因表达的对照蛋白质，由突变基因表达的蛋白质的生物活性降低10％或更多，如20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、97％或更多或99％或更多。在一些情况下，蛋白质是一种酶，且失活突变降低该酶的活性。

在一些实施方案中，细胞包含在所述细胞中天然存在的酶的失活突变。失活可以针对任何方便的酶进行。目标酶包括但不限于在图1和图2中描述的那些酶，它们在宿主细胞的合成途径中的作用倾向于降低目标BIA的水平。在一些情况下，酶具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性。在某些实施方案中，包含失活突变的酶是ZWF1(参见例如图2)。在一些情况下，酶具有醇脱氢酶活性。在一些实施方案中，包含失活突变的酶选自ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7和SFA1。在某些实施方案中，包含失活突变的酶是ADH2。在某些实施方案中，包含失活突变的酶是ADH3。在某些实施方案中，包含失活突变的酶是ADH4。在某些实施方案中，包含失活突变的酶是ADH5。在某些实施方案中，包含失活突变的酶是ADH6。在某些实施方案中，包含失活突变的酶是ADH7。在一些情况下，酶具有醛氧化还原酶活性。在某些实施方案中，包含失活突变的酶选自ALD2、ALD3、ALD4、ALD5和ALD6。在某些实施方案中，包含失活突变的酶是ALD2。在某些实施方案中，包含失活突变的酶是ALD3。在某些实施方案中，包含失活突变的酶是ALD4。在某些实施方案中，包含失活突变的酶是ALD5。在某些实施方案中，包含失活突变的酶是ALD6。在一些实施方案中，宿主细胞包括表1中所述的一种或多种基因的一个或多个失活突变。

异源编码序列

在一些情况下，宿主细胞是含有一个或多个异源编码序列(例如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个或甚至更多个)的细胞，其编码能够使宿主细胞产生所需的目标BIA(例如，如本文所述)的活性。如本文中所用，术语“异源编码序列”用于表示编码或最终编码通常不存在于宿主生物体中并且可以在适当的条件下在宿主细胞中表达的肽或蛋白质或其等效氨基酸序列(例如酶)的任何多核苷酸。因而，"异源编码序列"包括通常存在于宿主细胞中的编码序列的多个拷贝，以使得所述细胞表达通常不存在于所述细胞中的编码序列的额外拷贝。异源编码序列可以是RNA或其任何类型，例如mRNA；DNA或其任何类型，例如cDNA；或RNA/DNA的杂合体。目标编码序列包括但不限于包含编码序列、内含子、启动子区、3'-UTR和增强子区等特征的全长转录单位。

在实例中，工程化宿主细胞包含多个异源编码序列，每一个编码酶。在一些实例中，由多个异源编码序列编码的多个酶可以彼此不同。在一些实例中，由多个异源编码序列编码的多个酶中的一些可以彼此不同，并且由多个异源编码序列编码的多个酶中的一些可以是重复的拷贝。

在一些实例中，异源编码序列可以被可操作地连接。可操作地连接的异源编码序列可以在产生特定苄基异喹啉生物碱产物的相同途径内。在一些实例中，可操作地连接的异源编码序列可以沿着产生特定的苄基异喹啉生物碱产物的途径直接连续排列。在一些实例中，可操作地连接的异源编码序列可以在由多个异源编码序列编码的一个或多个酶之间具有一个或多个天然酶。在一些实例中，异源编码序列可以在由多个异源编码序列编码的一个或多个酶之间具有一个或多个异源酶。在一些实例中，异源编码序列可以在由多个异源编码序列编码的一个或多个酶之间具有一个或多个非天然酶。

在一些实施方案中，宿主细胞包括去甲乌药碱(NC)合酶活性。任何方便的NC合酶均可用于主题宿主细胞。目标NC合酶包括但不限于如表1中所述的酶，如EC 4.2.1.78。在某些实施方案中，宿主细胞包括NC合酶或其活性片段的异源编码序列。在一些情况下，宿主细胞包含将酪氨酸转化为L-DOPA的一种或多种酶或其活性片段的一个或多个异源编码序列。在某些情况下，所述一种或多种酶选自细菌酪氨酸酶、真核酪氨酸酶(例如，EC 1.14.18.1)和酪氨酸羟化酶(例如，EC 1.14.16.2)。在一些情况下，宿主细胞包含将L-DOPA转化为多巴胺的一种或多种酶或其活性片段(例如，EC 4.1.1.28)的一个或多个异源编码序列。

在某些实施方案中，所述细胞包含将多巴胺转化为3,4-DHPA的一种或多种酶或其活性片段的一个或多个异源编码序列。在某些情况下，所述一种或多种酶是单胺氧化酶(MAO)(例如，EC 1.4.3.4)。一个或多个异源编码序列可以衍生自任何方便的物种(例如，如本文中所述)。在一些情况下，一个或多个异源编码序列可以衍生自表1中所述的物种。在一些情况下，一个或多个异源编码序列存在于选自表1中所述的那些的基因或酶中。

在一些情况下，一个或多个异源编码序列包括整合在编码天然ARO10的基因组位点处的MAO编码序列。在某些情况下，一个或多个异源编码序列包括可操作地连接到诱导型启动子的MAO编码序列。在一些实施方案中，诱导型启动子是包括靶向于调节ARO10基因的启动子的DNA结合蛋白的诱导系统的一部分。在一些实施方案中，宿主细胞包含在表1的基因中描述的一种或多种酶或其活性片段的一个或多个异源编码序列。

如本文中所用，术语“异源编码序列”还包括肽或酶的编码部分(即肽或酶的cDNA或mRNA序列)和全长转录单位的编码部分(即包含内含子和外含子的基因)，以及编码酶或编码其等效氨基酸序列的“密码子优化的”序列、截短序列或其它形式的改变的序列，条件是所述等效氨基酸序列产生功能蛋白质。此类等效氨基酸序列可以缺失一个或多个氨基酸，所述缺失是在N端、C端或内部。设想了截短形式，只要它们具有本文所指示的催化能力。还设想了两种或更多种酶的融合以促进途径中代谢物的转移，条件是催化活性得以维持。

可操作的片段、突变体或截短形式可以通过建模和/或筛选来鉴别。这可以通过分步删除例如蛋白质的N端、C端或内部区域，接着分析所得衍生物相较于原始序列的针对所需反应的活性来实现。如果讨论中的衍生物在这种能力方面可操作，则认为所述衍生物构成适当酶的等效衍生物。

本发明的方面还涉及编码与各种酶的天然氨基酸序列等效的氨基酸序列的异源编码序列。"等效"的氨基酸序列被定义为与特定氨基酸序列不相同，而是包含至少一些氨基酸变化(缺失、取代、翻转、插入等)的氨基酸序列，当用于所需目的时，与特定氨基酸序列的类似活性相比，所述变化不会实质上影响蛋白质的生物活性。在脱羧酶的实例中，生物活性是指其催化活性。等效序列还意图包括已被工程化和/或进化为具有与原始氨基酸序列不同的特性的那些序列。目标易突变性质包括催化活性、底物特异性、选择性、稳定性、溶解性、定位等。在某些实施方案中，“等效”氨基酸序列在氨基酸水平下与特定氨基酸序列具有至少80％-99％的同一性，在一些情况下，在氨基酸水平下具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％和更高的同一性，且在某些情况下具有至少95％、96％、97％、98％和99％的同一性。在一些情况下，氨基酸序列可以是相同的，但改变DNA序列，例如用于优化宿主生物体的密码子使用。

宿主细胞还可以被修饰为具有一个或多个遗传改变以适应异源编码序列。天然宿主基因组的改变包括但不限于修饰基因组以减少或消除可能干扰所需途径的特定蛋白质的表达。此类天然蛋白质的存在可以将所述途径的中间体或最终产物中的一种迅速转化成代谢物或在所需途径中不可用的其它化合物。因此，如果天然酶的活性被降低或完全不存在，则所产生的中间体将可以更容易并入所需产物中。

在其中消除蛋白质的表达可能令人感兴趣的一些情况下，改变发生在参与多效性药物反应的蛋白质中，所述蛋白质包括但不限于ATP结合盒(ABC)转运体、多药耐药性(MDR)泵和相关转录因子。这些蛋白质参与将BIA分子输出至培养基中，因此缺失控制化合物输出至培养基中，从而使得它们更可用于并入所需产物中。在一些实施方案中，目标宿主细胞基因缺失包括与未折叠蛋白质反应和内质网(ER)增殖相关的基因。此类基因缺失可以导致BIA产生的改善。细胞色素P450的表达可以诱导未折叠蛋白质反应并且可以引起ER增殖。与这些应激反应相关的基因的缺失可以控制或减少宿主细胞的总体负担并且改善途径表现。遗传改变还可以包括修饰内源基因的启动子以增加内源基因的表达和/或引入额外的拷贝。这种遗传改变的实例包括构建/使用过度表达内源性酵母NADPH-P450还原酶CPR1的菌株以增加异源P450酶的活性。此外，还可以过度表达直接参与中间体代谢物合成的内源酶，如ARO8、ARO9和ARO10。

目标异源编码序列包括但不限于编码通常负责植物中BIA和前体的产生的酶的序列(野生型或等效序列)。在一些情况下，异源序列编码的酶可以是BIA途径中的任何酶，并且可以来自任何方便的来源。可以基于所需产物选择由异源编码序列编码的用于特定合成途径的酶的选择和数目。在某些实施方案中，本发明的宿主细胞可以包括1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、或甚至15个或更多个异源编码序列，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个异源编码序列。

在一些情况下，由异源编码序列编码的多肽序列如GENBANK中所记录。目标酶包括但不限于本文所述的那些酶和表1中所示的酶。宿主细胞可以包括来自任何来源的列出的酶的任何组合。除非另有说明，否则表1中的登录号是指GenBank。一些登录号是指酵母属基因组数据库(SGD)，其可在万维网上从www.yeastgenome.org获得。

在一些实施方案中，通过将一种或多种酶定位至细胞中的隔室对宿主细胞(例如，酵母菌株)进行工程改造以选择性产生目标BIA。在一些情况下，酶可以位于宿主细胞中，以使得由所述酶产生的化合物自发重排，或在与可将所述化合物转化成非所需代谢物的定位酶相遇之前由另一种酶转化成所需代谢物。可以选择两种酶之间的空间距离以防止其中一种酶直接作用于化合物而产生非所需的代谢物，并且限制非所需的最终产物(例如，非所需的阿片类副产物)的产生。在某些实施方案中，本文所述的任何酶(单独地或与第二酶一起)可以被定位至宿主细胞中的任何方便的隔室，包括但不限于细胞器、内质网、高尔基体、液泡、细胞核、质膜或周质。在一些实施方案中，宿主细胞包括一种或多种包含定位标签的酶。可以使用任何方便的标签。在一些情况下，定位标签是附接在酶的N端和/或C端上的肽序列。

可以使用任何方便的方法将标签附接到酶上。在一些情况下，定位标签衍生自内源性酵母蛋白。此类标签可以提供到达各种酵母细胞器的途径，这些细胞器包括但不限于内质网(ER)、线粒体(MT)、质膜(PM)和液泡(V)。在某些实施方案中，标签是ER路径选择标签(例如，ER1)。在某些实施方案中，标签是液泡标签(例如，V1)。在某些实施方案中，标签是质膜标签(例如P1)。在某些情况下，标签包含或源自尾部锚定类别的蛋白质内的跨膜结构域。在一些实施方案中，定位标签将酶定位在细胞器的外侧。在某些实施方案中，定位标签将酶定位在细胞器的内部。

在一些情况下，每种类型的酶的表达通过额外的基因拷贝(即，多个拷贝)增加，这增加中间体累积和/或目标BIA产生。本发明的实施方案包括通过同时表达单个或多个酶的多个物种变体，宿主细胞中的BIA前体产生增加。在一些情况下，单个或多个酶的额外的基因拷贝被包括在宿主细胞中。可以使用任何方便的方法，包括针对宿主细胞中的一种酶的异源编码序列的多个拷贝。

在一些实施方案中，宿主细胞包含针对一种酶的异源编码序列的多个拷贝，例如2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个或甚至10个或更多个拷贝。在某些实施方案中，宿主细胞包含针对一种或多种酶的异源编码序列的多个拷贝，如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种酶等的多个拷贝。在一些情况下，针对一种酶的异源编码序列的多个拷贝源自两种或更多种相较于宿主细胞不同的源生物体。例如，宿主细胞可以包含一个异源编码序列的多个拷贝，其中每个拷贝源自不同的源生物体。因此，每个拷贝可以基于由异源编码序列编码的目标酶的种间差异包含显式序列中的一些变化。

在宿主细胞的一些实施方案中，异源编码序列来自选自由以下组成的组的源生物体：鸦片罂粟(P.somniferum)、黄唐松草(T.flavum)和日本黄连(C.japonica)。在一些情况下，源生物体是鸦片罂粟、花菱草(E.californica)、日本黄连、黄唐松草、匍枝小檗(Berberis stolonifer)、黄唐松草亚种glaucum、黄连(Coptis chinensis)、唐松草属物种(Thalictrum spp)、黄连属物种(Coptis spp)、罂粟属物种(Papaver spp)、金花小檗(Berberis wilsonae)、墨西哥刺罂粟(A.mexicana)或小檗属物种(Berberis spp)。在某些情况下，异源编码序列来自选自鸦片罂粟、黄唐松草和日本黄连的源生物体。在一些实施方案中，宿主细胞包括来自表1中所述的一种或多种源生物体的异源编码序列。

可以对工程化宿主细胞的培养基进行采样并监测目标BIA的产生。可以使用任何方便的方法观察和测量目标BIA。目标方法包括但不限于LC-MS方法(例如，如本文所述)，其中通过与已知量的标准化合物比较来分析目标样品。身份可以例如通过m/z和MS/MS碎裂模式确认，并且化合物的定量或测量可以经由已知保留时间的LC迹线峰和/或参考已知量的化合物标准品的对应LC-MS分析进行的EIC MS峰分析来实现。

方法

流程步骤

如上所汇总，本发明的方面包括制备目标苄基异喹啉生物碱(BIA)的方法。因而，本发明的方面包括在功能性地表达一种或多种宿主细胞修饰(例如，如本文所述)的条件下培养宿主细胞，以使得所述细胞将目标起始化合物转化成目标产物BIA或其前体(例如，前牛心果碱BIA)。还提供以下方法，所述方法包括在适于蛋白质产生的条件下培养宿主细胞以使得一个或多个异源编码序列进行功能性地表达并且将目标起始化合物转化成目标产物BIA。在一些情况下，所述方法是一种制备苄基异喹啉生物碱(BIA)的方法，其包括：培养宿主细胞(例如，如本文所述)；将起始化合物添加至细胞培养物中；以及从细胞培养物回收BIA。在所述方法的一些实施方案中，起始化合物、BIA产物和宿主细胞由表1的条目之一描述。

发酵培养基可以含有合适的碳底物。适于实施本公开的方法的碳源可以包括多种含碳底物。合适的底物可以包括但不限于单糖(例如葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖)、寡糖(例如乳糖、蔗糖、棉子糖)、多糖(例如淀粉、纤维素)或其组合。在一些情况下，可以使用来自可再生原料的未纯化混合物(例如玉米浆、甜菜糖蜜、大麦麦芽)。在一些情况下，碳底物可以是一碳底物(例如甲醇、二氧化碳)或二碳底物(例如乙醇)。在其它情况下，可以使用其它含碳化合物，例如甲胺、葡糖胺和氨基酸。

培养宿主细胞的任何方便的方法可用于产生目标BIA前体和下游BIA。所采用的具体方案可以例如根据宿主细胞、异源编码序列、所需目标BIA前体和下游BIA而变化。细胞可以存在于任何适宜的环境中，如其中细胞能够表达一种或多种功能性异源酶的环境。如本文中所用，体外简单地意指活细胞的外部，而与细胞的位置无关。如本文所用，术语体内指示活细胞的内部，而与细胞的位置无关。在一些实施方案中，在有利于酶表达的条件下以及用可允许体内产生BIA前体和下游BIA的适当底物培养细胞。在一些实施方案中，从宿主提取功能性酶以用于在体外条件下产生BIA。在一些情况下，宿主细胞被放回至多细胞宿主生物体中。宿主细胞处于任何生长期，包括但不限于稳定期和对数生长期等。此外，培养物本身可以是连续培养物或它们可以是分批培养物。

细胞可以在20-40℃的温度下在合适的发酵培养基中生长。细胞可以在以任何方便的速度(例如，200rpm)振荡下生长。细胞可以在合适的pH下生长。用于发酵的合适pH范围可以在pH 5-9之间。发酵可以在需氧、厌氧或微氧条件下进行。可以使用任何合适的培养基。合适的生长培养基可以包括但不限于常见的商业制备的培养基，例如合成限定型(SD)基本培养基或富含酵母提取物蛋白胨葡萄糖(YEPD)的培养基。可以使用适合于微生物的任何其它富集型、限定型或合成型生长培养基。

细胞可以在基本上任何尺寸和形状的容器中进行培养。适用于实施本公开的方法的容器的实例可以包括但不限于多孔摇动板、试管、烧瓶(有挡板和无挡板)和生物反应器。培养物的体积可以在10微升至大于10,000升之间。

可以包括向生长培养基中添加试剂，已知这样会以产生生物碱所需要的方式调节代谢。在一个非限制性实例中，可将环腺苷2'3'-单磷酸加入到生长培养基中以调节分解代谢物阻抑。

可以使用针对特定细胞类型的任何方便的细胞培养条件。在某些实施方案中，包含一种或多种修饰的宿主细胞在标准或容易优化的条件下用标准细胞培养基和补充物进行培养。当不需要用于质粒维持的选择性压力时，标准生长培养基可以包含20g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨和20g/L右旋糖(YPD)。含有质粒的宿主细胞在含有1.7g/L酵母基础氮源、5g/L硫酸铵、20g/L右旋糖并且补充有生长和选择所需的适当氨基酸的合成完全(SC)培养基中生长。可用于诱导型酶表达的替代碳源包括但不限于蔗糖、棉子糖和半乳糖。在实验室中将细胞在任何方便的温度(例如，30℃)下伴随任何方便速率(例如，200rpm)的振荡生长于容器中，例如，在1-1000mL或更大体积的试管或烧瓶中。

培养体积可以按比例增大以用于在较大发酵容器中生长，例如作为工业过程的一部分。工业发酵过程可以在封闭分批、补料分批或连续恒化器条件下，或以任何合适的发酵模式进行。在一些情况下，细胞可以被固定在作为完全细胞催化剂的底物上，并经受用于产生生物碱的发酵条件。

分批发酵是封闭式系统，其中培养基的组成在发酵开始时设定并且在发酵过程中不改变。在发酵开始时将所需生物体接种到培养基中。在一些情况下，分批发酵是在对系统进行改变的情况下进行，以控制诸如pH和氧浓度(但不是碳)的因素。在这种发酵系统中，系统的生物量和代谢物组成在发酵过程中不断变化。细胞通常经历停滞期，然后进入对数期(高生长速率)，然后进入静止期(生长速率降低或停止)，并且最终进入死亡期(如果不进行处理)。

补料分批发酵类似于分批发酵，不同的是在发酵过程中将底物间歇地加入系统中。补料分批系统是用于减少分解代谢物阻抑对宿主细胞代谢的影响，以及希望在生长培养基中具有有限量的底物的其它情况。

连续发酵是一种开放系统，其中将成分确定的发酵培养基连续地添加到生物反应器中，并且将等量的发酵培养基从容器中连续地移出以进行处理。通常操作连续发酵系统以维持稳态生长条件，以使得由于去除培养基所导致的细胞损失必须通过发酵中的生长速率来平衡。连续发酵通常在其中细胞处于恒定的高细胞密度的条件下操作。连续发酵允许调节影响靶产物浓度和/或细胞生长的一种或多种因素。

液体培养基可以包括但不限于具有上述添加组分的富集或合成限定型培养基。培养基组分可以溶解在水中并通过加热、压力、过滤、辐射、化学品或其任何组合来灭菌。可以分别制备几种培养基组分并灭菌，然后在发酵容器中组合。培养基可以被缓冲以帮助在整个发酵过程中保持恒定的pH。

可以在发酵过程中监测或控制包括温度、溶解氧、pH、搅拌、通气速率和细胞密度的工艺参数。例如，可以通过浸在培养基中的温度探针监测发酵过程的温度。可以通过调节夹套温度将培养温度控制在设定点。水可以在外部冷却器中冷却，然后流入生物反应器控制塔，并在维持容器中的设定点温度所需的温度下循环至夹套中。

另外，可以在发酵过程中监测气体流动参数。例如，气体可以通过喷射器流入培养基中。适用于本公开的方法的气体可以包括压缩空气、氧气和氮气。气体流动可以具有固定速率或被调节以维持溶解氧设定点。

还可以监测培养基的pH。在实施例中，可以通过浸在容器内的培养基中的pH探针监测pH。如果pH控制有效，则pH可以通过酸和碱泵进行调节，所述泵将每种溶液以所需速率添加到培养基中。用于控制pH的酸溶液可以是硫酸或盐酸。用于控制pH的碱溶液可以是氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铵。

此外，可以通过浸在培养基中的溶解氧探针监测培养基中的溶解氧。如果溶解氧调节有效，可以通过增加或降低搅拌速度来调节氧水平。还可以通过增加或降低气体流速来调节溶解氧水平。气体可以是压缩空气、氧气或氮气。

还可以在发酵过程中监测搅拌速度。在实施例中，搅拌器马达可以驱动搅拌器。搅拌器速度可以在整个发酵期间被设定为一致转速，或者可以进行动态调节以维持设定的溶解氧水平。

此外，可以在发酵过程中监测浊度。在实施例中，可以使用浊度探针测量细胞密度。或者，可以通过从生物反应器中取样并在分光光度计中进行分析来测量细胞密度。此外，可以通过无菌取样装置每隔一段时间从生物反应器中取出样品。可以针对样品分析由宿主细胞产生的生物碱。还可以分析样品中的其它代谢物和糖、培养基组分的消耗或细胞的密度。

在另一个实施例中，可以在发酵过程期间监测原料参数。具体地说，可以使用外部泵将包含糖和其它碳源、营养物和辅因子的原料添加到发酵中。还可以在发酵过程中加入其它组分，包括但不限于消泡剂、盐、螯合剂、表面活性剂和有机液体。

用于优化宿主细胞中的异源多核苷酸表达的任何方便的密码子优化技术可以适用于主题宿主细胞和方法，参见例如，Gustafsson,C等人(2004)Trends Biotechnol,22,346-353，该文献通过引用整体并入)。

本发明方法还可以包括向细胞培养物中添加起始化合物。任何方便的添加方法可以适用于本发明的方法。细胞培养物可以补充有足够量的目标起始材料(例如，如本文所述)，例如mM至μΜ量，如约1-5mM之间的起始化合物。应该了解，所添加的起始材料的量、添加时间安排和速率、添加的材料的形式等可以根据多种因素而变化。可以添加纯净的起始材料或将起始材料预先溶解于适合的溶剂(例如，细胞培养基、水或有机溶剂)中。可以添加浓缩形式(例如，超过所需浓度的10倍)的起始材料以使在添加时细胞培养基的稀释最小化。起始材料可以分一个或多个批次添加，或通过在长时间(例如，数小时或数天)内连续添加而添加。

从发酵培养基中分离产物的方法

主题方法还可以包括从细胞培养物回收目标BIA。任何方便的分离和隔离方法(例如，色谱方法或沉淀方法)均可适于在主题方法中使用，以从细胞培养物回收目标BIA。过滤方法可以用于分离细胞培养物中的可溶性部分与不溶性部分。在一些情况下，液相色谱方法(例如，反相HPLC、尺寸排阻、正相色谱法)可以用于使目标BIA与细胞培养物中的其它可溶性组分分离。在一些情况下，萃取方法(例如，湿法萃取、基于pH的纯化等)可以用于使目标BIA与细胞培养物中的其它组分分离。

可以使用本领域中已知的方法从发酵培养基中分离产生的生物碱。在发酵之后(或在某些情况下，在发酵期间)可以立即执行许多回收步骤以初步回收所需产物。通过这些步骤，生物碱(例如，BIA)可以与细胞、细胞碎片和废物分离，而其它营养物、糖和有机分子可以保留在废培养基中。所述过程可以用于产生富含BIA的产物。

在一个实例中，通过向间歇式反应器提供工程化酵母细胞以及包含营养物和水的原料形成含有苄基异喹啉生物碱(BIA)产物的产物流。所述工程化酵母细胞可以具有选自由以下所组成的组的至少一种修饰：在所述细胞中天然存在的生物合成酶基因中的反馈抑制减轻突变；在所述细胞中天然存在的生物合成酶基因的转录调节修饰；以及在所述细胞中天然存在的酶的失活突变。当工程化酵母细胞处于间歇式反应器内时，工程化酵母细胞可以进行发酵。具体地说，工程化酵母细胞可以通过将工程化酵母细胞培养至少约5分钟的时间进行发酵，以产生包含BIA产物和细胞材料的溶液。一旦工程化酵母细胞已经进行发酵，可以使用至少一个分离单元将BIA产物与细胞材料分离以提供包含BIA产物的产物流。具体地说，产物流可以包含BIA产物以及另外的组分，例如澄清的酵母培养基。另外，BIA产物可以包含一种或多种目标BIA，例如一种或多种BIA化合物。

可以使用不同的方法从包含目标BIA的生物反应器介质中移除细胞。在实施例中，可以通过随时间推移的沉降移除细胞。这种沉降过程可以通过冷却或通过添加澄清剂如硅石来加速。废培养基可以从反应器的顶部被虹吸出，或者可以将细胞从反应器的底部倾出。或者，可以通过用过滤器、膜或其它多孔材料过滤来移除细胞。还可以通过离心(例如，通过连续流动离心)或通过使用连续提取器移除细胞。

如果一些有价值的目标BIA存在于细胞内，则可以使细胞透化或裂解，并且可以通过上述任何方法去除细胞碎片。用于使细胞透化的试剂可以包括但不限于有机溶剂(例如DMSO)或盐(例如乙酸锂)。细胞的裂解方法可以包括添加表面活性剂如十二烷基硫酸钠，或通过珠磨或超声处理机械破碎。

可以通过添加与水性培养基不混溶的有机液体，以液-液萃取方法从澄清的废培养基中提取目标BIA。合适的有机液体的实例包括但不限于肉豆蔻酸异丙酯、乙酸乙酯、氯仿、乙酸丁酯、甲基异丁基酮、油酸甲酯、甲苯、油醇、丁酸乙酯。加入的有机液体可以少至水性介质体积的10％或高达其100％。

在一些情况下，可以在发酵开始时或在发酵期间的任何时间加入有机液体。该萃取发酵过程可以通过将BIA前体或BIA连续移出至有机相中来增加宿主细胞中的目标BIA的产量。

搅拌可能导致有机相与水性培养基形成乳液。促进两相分离成不同层的方法可以包括但不限于加入破乳剂或成核剂，或调节pH。还可以对乳液进行离心以分离两相，例如，通过连续锥板离心。

或者，可以将有机相与水性培养基隔离，以使其可以在萃取后被物理移除。例如，可以将溶剂包封在膜中。

在实施例中，可以使用吸附方法从发酵培养基中提取目标BIA。具体地说，可以通过添加树脂如 XAD4或通过吸附去除BIA的另一种试剂从澄清的废培养基中提取目标BIA。然后可以使用有机溶剂从树脂释离目标BIA。合适的有机溶剂的实例包括但不限于甲醇、乙醇、乙酸乙酯或丙酮。

还可以使用过滤从发酵培养基中提取目标BIA。在高pH下，目标BIA可以在生物反应器中形成结晶状沉淀物。可以通过用过滤器、膜或其它多孔材料过滤直接移除该沉淀物。还可以通过离心和/或倾析收集沉淀物。

上述提取方法可以在原位(在生物反应器中)或非原位(例如，在外部回路中，介质通过所述回路流出生物反应器并接触萃取剂，然后再循环回到容器中)进行。或者，所述提取方法可以在发酵终止后使用从生物反应器容器中去除的澄清培养基进行。

从生物碱富集溶液纯化产物的方法

随后的纯化步骤可以包括使用本领域中已知的方法处理发酵后的富含BIA前体或BIA的产物，以回收高纯度的个别目标产物种类。

在一个实例中，可以将萃取在有机相中的BIA前体或BIA转移到水溶液中。在一些情况下，可以通过加热和/或真空来蒸发有机溶剂，并可以将所得粉末溶解在具有合适pH的水溶液中。在另一个实例中，可以通过添加促进将BIA前体或BIA萃取到水相中的合适pH下的水溶液从有机相中提取BIA前体或BIA。然后可以通过倾析、离心或另一种方法移除水相。

可以进一步处理含有BIA前体或BIA的溶液以除去金属，例如通过用合适的螯合剂进行处理。可以进一步处理含有BIA前体或BIA的溶液以通过沉淀去除其它杂质如蛋白质和DNA。在一个实例中，用合适的沉淀剂如乙醇、甲醇、丙酮或异丙醇处理含有BIA前体或BIA的溶液。在一个替代性实例中，DNA和蛋白质可以通过透析或通过将较小的生物碱与污染性生物大分子分离的其它尺寸排阻方法来去除。

在另外的实例中，可以通过使用本领域中已知的方法进行连续交叉流过滤，将含有BIA前体、BIA或修饰型BIA的溶液提取至高纯度。

如果溶液含有BIA前体或BIA的混合物，则可以使用本领域中已知的方法对其进行酸碱处理，以产生目标种类的个别BIA。在此过程中，调节水溶液的pH以使个别BIA前体或BIA在其各自的pKa下沉淀。

对于高纯度、小规模的制备，可以通过液相色谱法在单一步骤中纯化BIA前体或BIA。

酵母衍生的生物碱API与植物衍生的API的比较

澄清的酵母培养基(CYCM)可以含有多种杂质。澄清的酵母培养基可以通过真空和/或热来脱水以产生富含生物碱的粉末。该产物类似于罂粟草浓缩物(CPS)或鸦片，它们从鸦片种植国家出口并被API制造商购买。就本发明的目的而言，CPS是任何类型的纯化植物提取物的代表性实例，其中所需的生物碱产物可以从所述提取物最终进一步纯化。表2和表3突出了这两种产物中的杂质，其可以特异于CYCM或CPS或可以存在于两者中。通过分析未知来源的产物中的这些杂质的子集，本领域技术人员可以确定所述产物源自酵母产生宿主还是植物产生宿主。

API级药物成分是高度纯化的分子。因此，可以指示API的植物或酵母来源的杂质(例如表2和3中列出的那些)可能不存在于所述产物的API阶段。实际上，衍生自本发明酵母菌株的许多API产物可能在很大程度上与传统植物衍生的API无法区分。然而，在一些情况下，常规生物碱化合物可以使用化学合成方法进行化学修饰，所述化学合成方法在需要这种化学修饰的植物产物中可能显示为化学杂质。例如，化学衍生化通常可以导致与化学合成过程相关的一组杂质。在某些情况下，这些修饰可以在酵母生产平台中以生物方式进行，从而避免与化学衍生相关的一些杂质存在于酵母衍生的产物中。具体来说，来自化学衍生产物的这些杂质可以存在于使用化学合成方法产生的API产物中，但是可能不存在使用酵母衍生产物产生的API产物中。或者，如果将酵母衍生的产物与化学衍生产物混合，则最终的杂质可以存在，但是含量将比仅包含或主要包含化学衍生产物的API中的预期量少。在这个实例中，通过分析API产物中的这些杂质的子集，本领域技术人员可以确定所述产物源自酵母产生宿主还是传统的化学衍生途径。

可以存在于化学衍生的吗啡喃API但不在生物合成的API中的杂质的非限制性实例包括API可待因中的可待因-O(6)-甲基醚杂质；API羟考酮中的8,14-二羟基-7,8-二氢可待因酮；和API氢可酮中的四氢蒂巴因。可待因-O(6)-甲基醚可以通过吗啡的化学过甲基化形成。API羟考酮中的8,14-二羟基-7,8-二氢可待因酮可以通过蒂巴因的化学过氧化形成。此外，API氢可酮中的四氢蒂巴因可以通过蒂巴因的化学过度还原形成。

然而，在通过化学合成方法对酵母衍生化合物和植物衍生化合物进行化学修饰的情况下，可以预期与化学合成过程相关的相同杂质存在于在产物中。在这种情况下，可以如上所述分析起始材料(例如，CYCM或CPS)。

宿主细胞的工程化方法

还包括出于产生目标BIA或其前体的目的使宿主细胞工程化的方法。将DNA插入宿主细胞中可以使用任何方便的方法来实现。所述方法被用来将异源编码序列插入宿主细胞中，以使得宿主细胞功能性地表达酶并且将目标起始化合物转化成目标产物BIA。

在主题宿主细胞和方法中可以使用任何方便的启动子。驱动异源编码序列表达的启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子，条件是所述启动子在宿主细胞中是活性的。异源编码序列可以从其天然启动子表达，或者可以使用非天然启动子。此类启动子在使用它们的宿主中可以是低到高强度的。启动子可以是受调控的或组成型的。在某些实施方案中，使用不受葡萄糖阻抑的或者在培养基中存在葡萄糖时仅受轻微阻抑的启动子。目标启动子包括但不限于：糖酵解基因的启动子，如枯草杆菌tsr基因的启动子(编码果糖二磷酸醛缩酶基因的启动子区)或来自酵母酿酒酵母基因的编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的启动子(GPD、GAPDH或TDH3)；面包酵母的ADH1启动子；磷酸饥饿诱导型启动子，如酵母的PHO5启动子；来自地衣芽孢杆菌的碱性磷酸酶启动子；酵母诱导型启动子，如Gal1-10、Gal1、GalL、GalS；阻抑型启动子Met25、tetO；以及组成型启动子，如甘油醛3-磷酸脱氢酶启动子(GPD)、醇脱氢酶启动子(ADH)、翻译延伸因子-1-α启动子(TEF)、细胞色素c-氧化酶启动子(CYC1)、MRP7启动子等。还可以使用含有可由激素(如糖皮质激素、类固醇和甲状腺激素)诱导的启动子的自主复制酵母表达载体并且包括但不限于，糖皮质激素反应元件(GRE)和甲状腺激素反应元件(TRE)。这些和其它实例描述于美国专利第7,045,290号中，所述专利通过引用并入，包括其中引用的参考文献。可以使用含有组成型或诱导型启动子如α因子、醇氧化酶和PGH的其它载体。此外，任何启动子/增强子组合(根据真核启动子数据库EPDB)也可以用于驱动基因的表达。任何方便的适当启动子可以被选择用于宿主细胞，例如大肠杆菌。还可以使用启动子选择来优化转录，并且因此优化酶水平，从而使生产最大化，同时使能量资源最小化。

任何方便的载体都可以用于主题宿主细胞和方法中。目标载体包括用于酵母和其它细胞中的载体。酵母载体的类型可以被分成4种一般类别：整合型载体(YIp)、自主复制高拷贝数载体(YEp或2μ质粒)、自主复制低拷贝数载体(YCp或着丝粒质粒)以及用于克隆大片段的载体(YAC)。经由任何方便的转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。

效用

本发明的宿主细胞和方法(例如，如上文所述)适用于多种应用。目标应用包括但不限于研究应用和治疗应用。本发明的方法适用于多种不同的应用，包括其中BIA的产生令人感兴趣的任何方便的应用。

主题宿主细胞和方法适用于各种治疗应用。目标治疗应用包括其中制备包含BIA的药物产品令人感兴趣的那些应用。本文所述的宿主细胞产生苄基异喹啉生物碱前体(BIA前体)和目标BIA。牛心果碱是包括进行工程化努力以产生最终产物如阿片类产物的BIA合成期间的重要分支点中间体。主题宿主细胞可以用于从简单且廉价的起始材料产生BIA前体，所述起始材料可以适用于产生目标BIA(包括牛心果碱和BIA终产物)。因此，主题宿主细胞可用于提供具有治疗活性的BIA或其前体。

在一些情况下，所述宿主细胞和方法适用于产生商业规模量的BIA或其前体，其中这些化合物的化学合成是低产率的，而不是用于大规模生产的可行手段。在某些情况下，所述宿主细胞和方法用于发酵设施中，所述发酵设施将包括例如5,000-200,000升容量的生物反应器(发酵器)，从而允许快速产生用于治疗产物的目标BIA或其前体。此类应用可以包括从可发酵碳源如纤维素、淀粉和游离糖大规模产生目标BIA。

主题宿主细胞和方法适用于各种研究应用。主题宿主细胞和方法可以用于分析各种酶对多种目标BIA或其前体的生物合成途径的作用。此外，宿主细胞可以被工程化以产生BIA或其前体，所述BIA或其前体适用于测试在尚未证实的治疗功能方面的目标生物活性。在一些情况下，使宿主细胞工程化以包含编码多种酶的多种异源编码序列阐明针对目标BIA或其前体的高产率生物合成途径。在某些情况下，研究应用包括产生目标治疗分子的前体，所述前体随后可以进一步被化学修饰或衍生化以产生所需产物或用于筛选出增加的目标治疗活性。在一些情况下，宿主细胞菌株被用于筛选这类途径中的目标酶活性，这可以导致经由在这些菌株中产生的BIA代谢物的转化发现酶。

主题宿主细胞和方法可以被用作植物特化代谢物的生产平台。主题宿主细胞和方法可以被用作用于药物库开发以及植物酶发现的平台。例如，主题宿主细胞和方法可以适用于通过采用酵母菌株产生令人感兴趣的支架分子(如原阿片碱)并且通过组合生物合成或通过化学手段将化合物结构进一步功能化来开发基于天然产物的药物库。通过以这种方式产生药物库，任何潜在药物命中已经与易于大规模培养和生产的生产宿主相关。作为另一个实例，这些主题宿主细胞和方法可以适用于植物酶发现。主题宿主细胞提供限定代谢物的干净背景以表达植物EST库来鉴别新的酶活性。主题宿主细胞和方法提供用于酵母中的植物酶的功能表达和活性增加的表达方法和培养条件。

试剂盒和系统

本发明的方面还包括试剂盒和系统，其中所述试剂盒和系统可以包括在本发明的方法中使用的一种或多种组分，例如，如本文所述的宿主细胞、起始化合物、异源编码序列、载体、培养基等。在一些实施方案中，主题试剂盒包括宿主细胞(例如，如本文所述)以及一种或多种选自以下的组分：起始化合物、异源编码序列和/或包含所述异源编码序列的载体、载体、生长原料、适合用于表达系统的组分(例如，细胞、克隆载体、多克隆位点(MCS)、双向启动子、内部核糖体进入位点(IRES)等)以及培养基。

可以在试剂盒中提供本文所述的任何组分，例如，包含一种或多种修饰的宿主细胞、起始化合物、培养基等。适合用于制备和使用异源编码序列的多种组分、克隆载体和表达系统可以适用于主题试剂盒中。试剂盒还可以包括管、缓冲剂等以及使用说明书。根据需要，试剂盒中的各种试剂组分可以存在于不同的容器中，或所述组分中的一些或全部可以在单一容器中被预先组合成试剂混合物。

还提供了用于产生目标BIA的系统，其中所述系统可以包括包含一种或多种修饰(例如，如本文所述)的工程化宿主细胞、起始化合物、培养基、发酵器和发酵设备(例如，适用于维持宿主细胞的生长条件的装置)、取样和监测设备和组件等。适合用于酵母细胞的大规模发酵的各种组分可以适用于主题系统中。

在一些情况下，所述系统包括用于工程化宿主细胞的大规模发酵以及监测和纯化由发酵的宿主细胞产生的BIA化合物的组件。在某些实施方案中，在其中发酵器中的工程化宿主细胞产生一种或多种所需BIA产物或其前体的条件下将一种或多种起始化合物(例如，如本文所述)添加至所述系统中。在一些情况下，宿主细胞产生目标BIA前体(例如，如本文所述)。在某些情况下，目标BIA产物是阿片类产物，如可待因、尼奥平、吗啡、新吗啡、氢可酮、羟考酮、氢吗啡酮、二氢可待因、14-羟基可待因或二氢吗啡。

在一些情况下，所述系统包括用于监测和/或分析由主题宿主细胞产生的一种或多种BIA化合物或其前体的装置。例如，如本文所述的LC-MS分析系统、色谱系统或其中可以分析样品并与标准品进行比较的任何方便的系统(例如，如本文所述)。可以通过取样和分析在发酵之前和期间的任何方便的时间监测发酵培养基。当起始化合物完全转化为目标BIA产物或前体时，可以停止发酵并且可以进行BIA产物的纯化。因此，在一些情况下，主题系统包括适用于从其中产生目标BIA产物或前体的宿主细胞培养基纯化所述BIA产物或前体的纯化组件。所述纯化组件可以包括可用于纯化发酵所产生的BIA产物或前体的任何方便的方法，包括但不限于硅胶色谱法、反相色谱法、离子交换色谱法、HIC色谱法、尺寸排阻色谱法、液相萃取和pH提取方法。在一些情况下，本系统用于在将一种或多种起始化合物输入系统后生产和分离目标BIA发酵产物。

提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供如何创作和使用本发明的完整公开内容和说明，而并不意欲限制本发明人看待其发明的范围，也不意欲表示以下实验是所进行的全部或仅有的实验。已经做出努力来确保关于所用数字(例如，量、温度等)的精确度，但应该考虑到一些实验误差和偏差。除非另外指出，否则份数是重量份，分子量是重量平均分子量，温度是摄氏度并且压力是大气压或接近大气压。

实验

实施例1

一系列特定的遗传修饰提供酿酒酵母中的生物合成过程，以用于从简单廉价的原料或前体分子产生BIA。描述了用于构建能够从非BIA前体或简单的原料产生早期BIA分子去甲乌药碱(NC)和全去甲劳丹碱(NL)的新颖菌株的方法。NC从未被报道为微生物合成的产物并且是所有已知BIA分子的天然前体。还描述了用于操纵酵母生物合成途径的调控以及用于优化芳香族氨基酸和相关BIA前体的产生的方法。

A.过度产生酪氨酸和相关BIA前体的酵母菌株

出于增加BIA前体分子的细胞内浓度的目的，开发了具有提高的芳香族氨基酸生物合成途径通量的酿酒酵母菌株，所述BIA前体分子包括酪氨酸、4-羟基苯乙醛(4-HPA)、L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)、3,4-二羟基苯乙醛(3,4-DHPA)和多巴胺。这些菌株组合对酵母菌株的遗传修饰以总体上增加从中心代谢到芳香族氨基酸合成的碳通量，并且包括引入关键异源酶以用于产生非酵母天然产生的BIA前体分子。采用了包括以下各项的遗传修饰：将反馈抑制减轻突变引入编码天然生物合成酶的基因中；调整天然生物合成酶的转录调节；删除编码使前体分子偏离预期途径的酶的基因；以及引入用于将天然内源性分子转化成非天然BIA前体分子的异源酶。

具体描述：

1.1)工程菌株中的生物合成途径并入天然酵母基因ARO4的反馈抑制减轻突变(1.1.1)，ARO4单独或组合编码3-脱氧-d-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合酶。这种突变(ARO4^FBR)作为在原始基因座处的天然基因的定向突变、作为在单独基因座处以遗传整合方式引入的额外拷贝或作为附加型载体如2μ或着丝粒质粒上的额外拷贝并入。FBR是指反馈抗性突变体和突变。DAHP合酶的反馈抑制型拷贝处在天然酵母转录调控下或通过将所述反馈抑制型拷贝置于合成启动子的控制下在蛋白质表达的工程化组成型或动态调控的情况下引入。

1.1.1)ARO4^FBR突变可以包括例如用亮氨酸取代位置229处的赖氨酸残基(参见例如，Hartmann M等人(2003)Evolution of feedback-inhibited beta/alpha barrelisoenzymes by gene duplication and a single mutation.Proc Natl Acad Sci U S A100(3):862-867)、用赖氨酸残基取代位置166处的谷氨酰胺残基(参见例如，Fukuda K等人(1992)Feedback-Insensitive Mutation of 3-Deoxy-D-Arabino-Hepturosonate-7-Phosphate Synthase Caused by a Single Nucleotide Substitution ofAro4Structural Gene in Saccharomyces-Cerevisiae.J Ferment Bioeng 74(2):117-119)或选自微生物DHAP合酶突变体的诱变文库的赋予反馈抑制的其它突变。此类选择的实例包括用过量酪氨酸拯救培养基上的o-氟-D,L-苯丙氨酸的生长(参见例如，Fukuda等人(1990)Breeding of Brewing Yeast Producing a Large Amount of Beta-PhenylethylAlcohol and Beta-Phenylethyl Acetate.Agr Biol Chem Tokyo 54(1):269-271)或aro3突变酵母菌株的生长。

1.2)工程菌株中的生物合成途径并入天然酵母基因ARO7的反馈抑制减轻突变(1.2.1)，ARO7编码分支酸变位酶。这种突变(ARO7^FBR)作为在原始基因座处的天然基因的定向突变、作为在单独基因座处以遗传整合方式引入的额外拷贝或作为附加型载体如2μ或着丝粒质粒上的额外拷贝并入。分支酸变位酶的反馈抑制型拷贝处在天然酵母转录调控下或通过将所述反馈抑制型拷贝置于合成启动子的控制下在蛋白质表达的工程化组成型或动态调控的情况下引入。

1.2.1)ARO7^FBR突变等位基因可以包括例如用异亮氨酸取代位置226处的苏氨酸残基(参见例如，Schmidheini等人(1989)A Single Point Mutation Results in aConstitutively Activated and Feedback-Resistant Chorismate Mutase ofSaccharomyces-Cerevisiae.J Bacteriol 171(3):1245-1253)或选自微生物分支酸变位酶突变体的诱变文库的赋予反馈抑制的其它突变。此类选择的实例包括在没有外部饲喂的酪氨酸下针对表达异源酪氨酸酶(1.9)的菌株中的5-甲基色氨酸敏感性或增加的黑色素产生的分析。

1.3)工程菌株中的生物合成途径引入用于过度表达天然酵母基因ARO10的强启动子元件(如GPD1、TEF1等)，所述基因编码具有羟基苯丙酮酸脱羧酶活性的酶。这种遗传修饰作为在原始基因座处的天然启动子DNA序列的定向交换、作为在单独基因座处以遗传整合方式引入的处在新转录调控下的基因的额外拷贝或作为附加型载体如2μ或着丝粒质粒上的额外拷贝并入。

1.4)工程菌株中的生物合成途径引入用于过度表达天然酵母基因ARO9的强启动子元件(如GPD1、TEF1等)，所述基因编码具有羟基苯丙酮酸/谷氨酸转氨酶活性的酶。这种遗传修饰作为在原始基因座处的天然启动子DNA序列的定向交换、作为在单独基因座处以遗传整合方式引入的处在新转录调控下的基因的额外拷贝或作为附加型载体如2μ或着丝粒质粒上的额外拷贝并入。

1.5)工程菌株中的生物合成途径引入用于过度表达天然酵母基因TKL的强启动子元件(如GPD1、TEF1等)，所述基因编码具有转酮醇酶活性的酶。这种遗传修饰作为在原始基因座处的天然启动子DNA序列的定向交换、作为在单独基因座处以遗传整合方式引入的处在新转录调控下的基因的额外拷贝或作为附加型载体如2μ或着丝粒质粒上的额外拷贝并入。

1.6)通过并入天然酵母基因ZWF1的缺失或失活突变来改善工程菌株中的生物合成途径，所述基因编码具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的酶。

1.7)通过并入已知天然醇脱氢酶(如由基因ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7或SFA1编码的酶)的一个或多个缺失或失活突变来改善工程菌株中的生物合成途径。

1.8)通过并入已知天然醛氧化还原酶(如ALD2、ALD3、ALD4、ALD5或ALD6)的一个或多个缺失或失活突变来改善工程菌株中的生物合成途径。

1.9)生物合成途径并入用于将酪氨酸转化为L-DOPA的异源酶。所述酶可以来自几种类别之一，包括但不限于细菌酪氨酸酶、真核酪氨酸酶和酪氨酸羟化酶(表1)。所述酶的基因作为遗传整合并入或并入在游离型载体如2μ或着丝粒质粒上。这种产生L-DOPA的酶是通过将酶置于合成启动子的控制下在蛋白质表达的工程化组成型或动态调控的情况下引入。

1.9.1)在使用酪氨酸羟化酶将酪氨酸转化为L-DOPA的生物合成途径中，编码蝶呤辅因子四氢生物蝶呤(BH4)及其衍生物的合成和再循环酶的基因的额外表达被并入工程菌株中以支持酪氨酸羟化酶的活性。这些酶包括GTP环化水解酶、6-丙酮酰基-四氢蝶呤合酶、墨蝶呤还原酶、4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶以及醌型二氢蝶啶还原酶(表1)。这些酶的基因作为遗传整合并入或并入在游离型载体如2μ或着丝粒质粒上。这些BH4合成和再循环酶是通过将酶置于合成启动子的控制下在蛋白质表达的工程化组成型或动态调控的情况下引入。

1.10)生物合成途径并入用于使L-DOPA脱羧而产生多巴胺的异源酶。具有这种活性的酶由来自各种生物体(包括细菌、植物和哺乳动物)的基因编码。实例包括恶臭假单胞菌DOPA脱羧酶(PpDODC)、褐家鼠DOPA脱羧酶(RnDODC)和鸦片罂粟酪氨酸/DOPA脱羧酶(PsTYDC)(表1)。所述酶的基因作为遗传整合并入或并入在游离型载体如2μ或着丝粒质粒上。这种产生多巴胺的酶是通过将酶置于合成启动子的控制下在蛋白质表达的工程化组成型或动态调控的情况下引入。

1.11)产生3,4-DHPA的生物合成途径并入用于将多巴胺氧化成3,4-DHPA的异源酶。可用于菌株中的编码这种酶的基因的实例包括人单胺氧化酶A(hMAOA)、大肠杆菌单胺氧化酶(EcMAO)和藤黄微球菌单胺氧化酶(MlMAO)(表1)。所述酶的基因作为遗传整合并入或并入在游离型载体如2μ或着丝粒质粒上。这种产生3,4-DHPA的酶是通过将酶置于合成启动子的控制下在蛋白质表达的工程化组成型或动态调控的情况下引入。

1.11.1)用于产生NC的菌株需要多巴胺和4-HPA，而用于产生NL的菌株需要多巴胺和3,4-DHPA，而不需要4-HPA。用于将产生NC的菌株转化成产生NL的菌株的特异性修饰是将MAO基因整合至编码天然酵母基因ARO10的基因座处的酵母基因组中。这组合负责将酪氨酸生物合成前体转化成4-HPA的天然酵母酶的缺失与能够将多巴胺转化成3,4-DHPA的酶的引入。

1.11.2)用在诱导型启动子的控制下表达MAO酶(1.11)的基因构建酵母菌株。当所述菌株在诱导物的存在下生长时，其可以催化多巴胺转化成3,4-DHPA，而在诱导物不存在时，所述菌株仅产生4-HPA。

1.11.2.1)用诱导型MAO表达(1.11.2)构建酵母菌株，其中诱导系统还包含靶向于调控ARO10基因的启动子(1.3)的DNA结合蛋白。控制ARO10的合成启动子因此在控制MAO基因的启动子被活化时受阻抑，并且ARO10仅在MAO基因不具有转录活性时表达。这种系统允许构建仅有条件地产生NC或NL的前体的单一菌株。

B.产生NC的酵母菌株

开发了用于在酵母中产生BIA分子NC的方法并且所述方法展示用于NC的微生物合成的第一系统。使用本文所述的工程菌株，产生NC并且针对其自身价值进行累积或与其它异源酶的生物合成途径组合以用于下游BIA的完全合成。

具体描述：

2.1)酵母菌株在液体培养物中生长至高细胞浓度，然后在含有高浓度多巴胺的限定型培养基中稀释至中等浓度(通过光密度或OD测量)。培养基成分只需要满足菌株生长条件；使用各种生长原料(例如，不同的糖、氮源)。由这些酵母菌株产生的NC被酵母细胞分泌，并且在废培养基中是可测量的。通过细胞裂解和从裂解物中提取，回收细胞中保留的额外NC。

2.2)含有如(1.1-1.8)中所述的修饰的各种组合的酵母菌株从在如上所述(2.1)的进料多巴胺分析中在未修饰的菌株中的可测量值大幅提高NC产生。在其中酵母培养基中没有细胞外酪氨酸可利用的条件下，所描述的修饰(1.1-1.8)允许从饲喂的多巴胺产生NC；在这些条件下，未被修饰的酵母菌株的NC产生通常是不可检测的。

2.3)当添加到培养基中的额外BIA前体是L-DOPA而不是多巴胺时，当含有如(1.10)所述的修饰并且如(2.1)所述生长时，产生NC的酵母菌株。

2.3.1)如(2.3)中所述的含有如(1.1-1.8)中所述的修饰的各种组合的酵母菌株大幅提高NC的产生。

2.4)当含有用于将酪氨酸转化为多巴胺的异源酶(1.9、1.10)以及上述各种修饰(1.1-1.8)的组合并在没有补充酪氨酸、L-DOPA或多巴胺的培养基中生长时产生NC的酵母菌株。该具体实例构成菌株从简单的碳源和氮源完全合成NC。

2.5)将酵母菌株如上所述(2.1-2.4)进行修饰和培养(2.1-2.4)，其中生物合成途径包括并入异源酶NCS或NCS酶的截短型，以用于立体定向催化用于产生S-NC的多巴胺和4-HPA的缩合反应。这种酶可以源于几种植物之一，如鸦片罂粟、日本黄连和黄唐松草(表1)。所述酶的基因作为遗传整合并入或并入在游离型载体如2μ或着丝粒质粒上。这种产生S-NC的酶是通过将酶置于合成启动子的控制下在蛋白质表达的工程化组成型或动态调控的情况下引入。最终产生的NC将是其中偏向S立体异构体的对映体混合物。

2.6)将酵母菌株如上所述(2.1-2.5)进行修饰和培养，其中生物合成途径包括并入异源酶去甲乌药碱6-O-甲基转移酶(6OMT)以用于催化产生乌药碱的反应。6OMT可以源于几种植物之一，如鸦片罂粟、日本黄连和黄唐松草(表1)。

2.7)将酵母菌株如上所述(2.1-2.5)进行修饰和培养，其中生物合成途径包括并入异源酶6OMT和乌药碱N-甲基转移酶(CNMT)以用于催化产生乌药碱和N-甲基乌药碱的反应。CNMT可以源于几种植物之一，如鸦片罂粟、日本黄连和黄唐松草(表1)。

2.8)将酵母菌株如上所述(2.1-2.5)进行修饰和培养，其中生物合成途径包括并入异源酶6OMT、CNMT、CYP80B1和细胞色素P450还原酶(CPR)以用于催化产生乌药碱、N-甲基乌药碱和3’羟基-N-甲基乌药碱的反应。CYP80B1可以源于几种植物之一，如鸦片罂粟或花菱草(表1)。

2.9)将酵母菌株如上所述(2.1-2.5)进行修饰和培养，其中生物合成途径包括并入异源酶6OMT、CNMT、CYP80B1、CPR和3’羟基-N-甲基乌药碱4’-O-甲基转移酶(4’OMT)以用于催化产生乌药碱、N-甲基乌药碱、3’羟基-N-甲基乌药碱和牛心果碱的反应。4’OMT可以源于几种植物之一，如鸦片罂粟、日本黄连和黄唐松草(表1)。

C.产生NL的酵母菌株

开发了从酵母产生BIA分子NL的方法。使用本文所述的工程菌株，产生NL并且针对其自身价值进行累积或与其它异源酶的生物合成途径组合以用于下游BIA的完全合成。

具体描述：

3.1)如(2.1)所述在液体培养物中生长含有如(1.11、1.11.1-1.11.2、1.11.2.1)中所述的修饰的酵母菌株，以产生NL。

3.2)含有如(1.7、1.8)中所述的基因缺失的各种组合的酵母菌株从在如上所述(3.1)的进料多巴胺分析中在未修饰的菌株中的可测量值提高NL产生。

3.3)当添加到培养基中的额外BIA前体是L-DOPA而不是多巴胺时，当含有如(1.10、1.11、1.11.1-1.11.2、1.11.2.1)所述的修饰并且如(3.1)所述生长时，产生NL的酵母菌株。

3.3.1)含有(1.7、1.8)中所述的基因缺失的组合的如(3.3)中所述的酵母菌株提高NL的产生。

3.4)使在含有用于将酪氨酸转化为多巴胺(1.9、1.10)以及将多巴胺转化为3,4-DHPA(1.11)的异源酶以及上述各种修饰(1.1-1.8、1.11.1)的组合时产生NL的酵母菌株生长在没有补充酪氨酸、L-DOPA或多巴胺的培养基中。该具体实例构成菌株从简单的碳源和氮源完全合成NL。

3.5)将酵母菌株如上所述(3.1-3.4)进行修饰和培养(3.1-3.4)，其中生物合成途径包括并入异源酶NCS或NCS酶的截短型(表1)，以用于立体定向催化用于产生S-NL的多巴胺和3,4-DHPA的缩合反应。这种酶可以源于几种植物之一，如鸦片罂粟、日本黄连和黄唐松草(表1)。所述酶的基因作为遗传整合并入或并入在游离型载体如2μ或着丝粒质粒上。这种产生S-NL的酶是通过将酶置于合成启动子的控制下在蛋白质表达的工程化组成型或动态调控的情况下引入。最终产生的NC是其中偏向S立体异构体的对映体混合物。

3.6)将酵母菌株如上所述(3.1-3.5)进行修饰和培养，其中生物合成途径包括并入异源酶去甲乌药碱6-O-甲基转移酶(6OMT)以用于催化产生3’-羟基乌药碱的反应。6OMT可以源于几种植物之一，如鸦片罂粟、日本黄连和黄唐松草(表1)。

3.7)将酵母菌株如上所述(3.1-3.5)进行修饰和培养，其中生物合成途径包括并入异源酶乌药碱N-甲基转移酶(CNMT)以用于催化产生劳丹碱的反应。CNMT可以源于几种植物之一，如鸦片罂粟、日本黄连和黄唐松草(表1)。

3.8)将酵母菌株如上所述(3.1-3.5)进行修饰和培养，其中生物合成途径包括并入异源酶6OMT和CNMT以用于催化产生3’羟基乌药碱、劳丹碱、和3’羟基-N-甲基乌药碱的反应。

3.9)将酵母菌株如上所述(3.1-3.5)进行修饰和培养，其中生物合成途径包括并入异源酶3’羟基-N-甲基乌药碱4’-O-甲基转移酶(4’OMT)以用于催化产生4’-O-甲基全去甲劳丹碱的反应。4’OMT可以源于几种植物之一，如鸦片罂粟、日本黄连和黄唐松草(表1)。

3.10)将酵母菌株如上所述(3.1-3.5)进行修饰和培养，其中生物合成途径包括并入异源酶6OMT和4’OMT以用于催化产生3’羟基乌药碱、4’-O-甲基全去甲劳丹碱和去甲牛心果碱的反应。

3.11)将酵母菌株如上所述(3.1-3.5)进行修饰和培养，其中生物合成途径包括并入异源酶CNMT和4’OMT以用于催化产生4’-O-甲基全去甲劳丹碱、劳丹碱和4’-O-甲基劳丹碱的反应。

3.12)将酵母菌株如上所述(3.1-3.5)进行修饰和培养，其中生物合成途径包括并入异源酶6OMT、CNMT和4’OMT以用于催化产生3’羟基乌药碱、劳丹碱、4’-O-甲基全去甲劳丹碱、去甲牛心果碱、3’羟基-N-甲基乌药碱、4’-O-甲基劳丹碱和牛心果碱的反应。

实施例2

从发酵到纯化至API的处理方法

在发酵的最后阶段，将有机液体乙酸乙酯以培养液体积的20％添加到培养基中。此时，还可以增加培养基的pH以支持将BIA萃取到有机乙酸乙酯相中。来自搅拌器和喷射器的搅拌导致不混溶的乙酸乙酯与水性介质形成乳液。发酵完成后，关闭搅拌器和喷射器，以使水相和有机相分离。可以加入破乳剂或其它化学试剂以促进分离成两个不同的相。细胞沉降到反应器的底部并形成第三层。通过倾析分离这三个层。弃去细胞和水性培养基相。利用热和真空处理含有BIA前体或含BIA的有机相以除去乙酸乙酯。将含有BIA前体或BIA的所得粉末溶解在酸化水中。通过交叉流过滤将溶液纯化，以得到仅由吗啡喃生物碱组成的溶液。然后对溶液进行几轮酸碱提取，以根据其在已知pH值下的不同溶解度移出个别吗啡喃生物碱。通过过滤来移除吗啡喃生物碱(例如，硫酸可待因)的每种沉淀物，并且可以进一步进行产物精整以得到API级产物。

实施例3

从发酵到纯化至API的处理方法

将发酵液离心以除去细胞和颗粒物。通过在kabay工艺(GB406,107)中用于从水性罂粟草提取物中提取BIA的类似方法来处理剩余的水性澄清培养基。由于发酵过程，澄清培养基可能是酸性的。如果不是，则通过加入硫酸酸化所述培养基。通过施加真空或热将生物碱浓缩在澄清培养基中。用乙醇处理溶液以使杂质(包括蛋白质和DNA)沉淀。进一步的处理包括几轮酸碱提取，并且可以包括添加有机溶剂以助于将不同的BIA种类萃取到第二相中。

实施例4

改变培养基以改善BIA产生

通过改变培养基组成来提高来自工程化酵母菌株的BIA产生滴度。例如，培养基类型可以在培养基底物(例如酵母蛋白胨、酵母基础氮源)、碳源(例如葡萄糖、麦芽糊精)和氮源(例如氨基酸、硫酸铵、尿素)方面变化。在不同的培养条件下培养产生牛心果碱的酵母菌株(如2.9中所述)，并在生长于30C下达72小时后分析牛心果碱的产生。在YNB、具有3AGU/L的2％麦芽糊精、硫酸铵和所有氨基酸中观察到最高的牛心果碱产生(图17A)。麦芽糊精是可以被淀粉酶分解的葡萄糖聚合物。当麦芽糊精被用作酵母培养基中的碳源时，添加淀粉酶产生葡萄糖的缓慢释放，从而模仿补料分批发酵条件。高浓度的淀粉酶导致更快的葡萄糖释放，并且实际上为更快的葡萄糖进料速率。在这个实例中，葡萄糖的进料速率影响产物滴度(图17B)。数据显示在包含4％麦芽糊精和3AGU/L的培养基中具有最高的牛心果碱滴度。

图1：酪氨酸和BIA前体分子的生物合成

示意图示出了从葡萄糖到酪氨酸和其它BIA前体的生物合成途径。存在于天然酵母代谢中的芳香族氨基酸中间体用黑色书写。内源性酵母酶用灰色书写(除了TYR、TyrH、DODC和MAO)。异源酶包括TYR、TyrH、DODC和MAO。如(1.1、1.2)中所述，由ARO4和ARO7编码的野生型酵母酶被酪氨酸变构抑制，此处用灰色虚线表示。如图所示，虽然基因TKL1和ZWF1(在1.5和1.6中的作为目标)参与戊糖磷酸途径，但在该图中没有明确地详述戊糖磷酸途径和糖酵解中的各个步骤。

图2：ZWF1敲除和TKL1过表达对戊糖磷酸途径(PPP)的影响

示意图详细说明了当葡萄糖是主要碳源时，对TKL1(1.5)和ZWF1(1.6)的修饰如何影响酵母中的戊糖磷酸途径的总碳流量。图A表示野生型碳流；图B表示修饰型菌株中碳流的相对变化。

图3A：从前体分子合成NC

通过Pictet-Spengler缩合反应从一分子多巴胺和一分子4-HPA合成NC。该反应可以自发地发生，产生R-和S-NC的外消旋混合物。该反应可以另外由植物酶NCS催化，以产生S-NC。

图3B：从前体分子合成NL

通过Pictet-Spengler缩合反应从一分子多巴胺和一分子3,4-DHPA合成NL。该反应可以自发地发生，产生R-和S-NL的外消旋混合物。虽然NCS的天然产物是NC，但该酶已被证明可催化S-NL的立体定向产生(参见例如Rueffer等人(1981)(S)-NorlaudanosolineSynthase-the 1st Enzyme in the Benzylisoquinoline Biosynthetic-Pathway.FebsLett 129(1):5-9)。

通过LC-MS分析进行BIA分子的测量，其中观察到NC产生(m/z＝+272，19.2min保留时间)和NL产生(m/z＝+288，18.9min保留时间)，并且离子MS2碎裂符合标准和公布的检测方法(参见例如Schmidt等人(2007)Poppy alkaloid profiling by electrospray tandemmass spectrometry and electrospray FT-ICR mass spectrometry after[ring-13C6]-tyramine feeding.Phytochemistry 68(2):189-202)。

图4：四种遗传修饰对在不同的进料酪氨酸下的NC产生的影响

在具有靶向遗传修饰的菌株中，展示在几种进料酪氨酸浓度(包括没有进料酪氨酸)下的NC产生。将野生型菌株CEN.PK2与赋予以下四种遗传变化(如1.1至1.4中所述)之一的构建体整合：通过P_TEF1的启动子置换过度表达ARO10、通过用P_TEF1启动子替换过度表达ARO9、ARO4^FBR等位基因的染色体整合和ARO7^FBR等位基因的染色体整合。当单独并入时，只有P_TEF1-ARO10和ARO4^FBR增加NC的产生。尽管这两种修饰在所有酪氨酸浓度下都增加NC的产生，但在无进料酪氨酸下，ARO^FBR整合菌株具有最显著的改善。

图5：利用遗传修饰组合的NC产生

如上所述的一些遗传修饰(1.5、1.6)仅在与整合ARO4^FBR突变体(1.1)组合的情况下提高NC产生。该图示出了用单一遗传修饰工程改造的四种菌株：P_TEF1-ARO10(1.3)、P_GPD-TKL1(1.5)、ZWF1敲除(1.6)和ARO4^FBR(1.1)；以及用遗传修饰组合构建的三种菌株：菌株A(P_GPD-TKL1，ARO4^FBR)、菌株B(ZWF1敲除，ARO4^FBR)和菌株C(P_GPD-TKL1，ZWF1敲除，ARO4^FBR)。示出了归一化为WT菌株的NC产生，其中菌株C显示出增加五倍的NC产生。

图6：在ALD/ADH敲除菌株中的NL产生

通过缺失在2μ质粒上表达人MAOA(1.11)并在含有多巴胺的培养基中生长的菌株中的竞争性酵母酶(1.7、1.8)来改善NL产生。以在废培养基中测量的归一化为WT(具有hMAO，但没有缺失)的滴度示出NL产生。产生的改善多达WT NL产生的十倍。

图7：体内DODC酶的活性

被DNA转化以表达鸦片罂粟酪氨酸/DOPA脱羧酶的酵母菌株可以在体内将L-DOPA转化为多巴胺。携带2μ质粒的菌株在选择性培养基中生长，然后反稀释到含有L-DOPA的培养基中。然后测量废物培养基中的L-DOPA(保留时间4.8分钟，m/z＝+198)和多巴胺(保留时间4.2分钟，m/z＝+154)的浓度。

图8

如(2.1)中所述，在不同酪氨酸浓度下，在多种野生型酵母实验室菌株中产生NC。具体地说，将各酵母菌株接种到单独的液体培养物中并生长过夜至OD₆₀₀～10，然后在不含酪氨酸的YNB基本培养基中反稀释至OD₆₀₀～1并生长3小时。将100μl各培养物混合到含有100mM多巴胺和不同浓度酪氨酸的400μl YNB培养基中；每个菌株在每种培养基条件下以一式三份的样品方式生长。在检测峰上的m/z+272离子计数的LC-MS仪器上从培养上清液测量NC滴度，如参考文献中所述(参见例如Schmidt等人(2007)Poppy alkaloid profiling byelectrospray tandem mass spectrometry and electrospray FT-ICR massspectrometry after[ring-13C6]-tyramine feeding.Phytochemistry 68(2):189-202)。将每个峰的面积进行积分以计算每个样品中NC的相对数量，并将结果归一化为含有0mg/L酪氨酸的CEN.PK2酵母培养物中的离子计数面积。

图9

如(2.1)中所述，在多种工程化酵母菌株中，在100mM进料多巴胺和没有酪氨酸的情况下产生NC。这些数据是在与图5中的那些实验不同的实验中生成的。工程菌株CSY1031-1044包含(1.1-1.6)中描述的遗传修饰的组合；每个菌株名称下面的标签指示哪些修饰被并入每个菌株中。菌株CSY1043含有对酵母天然代谢的四种遗传修饰，并且展现出相对于野生型酵母菌株CEN.PK2增加最多的NC滴度。

图10

黑色菱形是如(2.1)中所述的NC产生，灰色圆圈是如(2.3)中所述的NC产生。此处的NC是在额外整合有L-DOPA脱羧酶PpDODC(1.10)的工程化酵母菌株(CSY1042)中产生。在不同的液体培养物中，该酵母菌株生长在含有不同浓度多巴胺的YNB基本培养基(黑色菱形)和含有L-DOPA的YNB基本培养基(灰色圆圈；不加多巴胺的培养物)中。黑色实线表示测量的NC与进料多巴胺之间的关系的线性回归。沿针对多巴胺进料样品的回归线绘制针对L-DOPA进料样品的峰面积测量结果，以显示L-DOPA进料培养物的“等效进料多巴胺”量。将L-DOPA培养基混合以达到10mM L-DOPA的目标浓度，然而L-DOPA在该浓度下不完全溶解，并且估计溶解的L-DOPA的有效浓度为约6mM。基于两种L-DOPA进料的酵母培养物的平均NC滴度，“等效进料多巴胺”浓度为约50mM或进料L-DOPA浓度的8倍(用灰色虚线表示)。

图11

哺乳动物酪氨酸羟化酶(TyrH)能够使酪氨酸羟化，但其活性依赖于共底物四氢生物喋呤(BH4)，如(1.9.1)中所述。在TyrH催化酪氨酸形成L-DOPA期间，分子氧被分裂并转移至酪氨酸和BH4上，如反应1所示。BH4被氧化成BH4-4α-甲醇胺(4αOH-BH4)。在酵母中表达两种异源酶，以从叶酸合成途径中间体三磷酸二氢新喋呤合成BH4。首先，6-丙酮酰四氢蝶呤合酶(PTPS)将二氢新喋呤转化为PTP(反应2)，其然后被墨蝶呤还原酶(SepR，反应3)还原为BH4。两种酶负责BH4从其4α-甲醇胺形式再生。首先，蝶呤-4a-甲醇胺脱水酶(PCD)催化失水反应以形成二氢生物蝶呤(反应4)。然后通过醌型二氢蝶啶还原酶(QDHPR，反应5)将二氢生物蝶呤还原成四氢生物蝶呤。

图12

由酵母细胞表达的酪氨酸羟化酶将酪氨酸转化为L-DOPA。用携带人酪氨酸羟化酶(hTH2)和大鼠酪氨酸羟化酶(RnTyrH)的质粒转化的酵母菌株在液体培养基中生长，然后在含有酪氨酸和共底物BH4的缓冲液中裂解。在30℃下培养6小时后，通过LC-MS测量裂解物混合物中的L-DOPA。(A)LC-MS色谱图证实了酪氨酸转化为L-DOPA依赖于共底物BH4的存在。(B)+198m/z离子峰的碎裂进一步证实了裂解物样品中存在L-DOPA。参见例如，Lv等人(2010)LC-MS-MS Simultaneous Determination of L-Dopa and its prodrug n-PentylHydrochloride in Rat Plasma.Chromatographia,72(3/4),239-243)。

图13

酪氨酸羟化酶与BH4生物合成酶的共表达使酵母细胞裂解物中的酪氨酸能够转化为L-DOPA。与表达大鼠酪氨酸羟化酶(RnTyrH)和大鼠墨蝶呤还原酶(RnSepR)的构建体整合的工程化酵母菌株在液体培养基中生长，然后在含有酪氨酸、NADPH和BH4生物合成前体墨蝶呤的缓冲液中裂解。TyrH和BH4生物合成基因的共表达在不存在BH4但存在BH4前体墨蝶呤的情况下提供酪氨酸羟化酶的活性。

图14

用于从酪氨酸合成BIA前体和前牛心果碱BIA直至牛心果碱的生物合成途径。(A)经由NC的从酪氨酸到牛心果碱的生物合成途径。(B)经由NL的从酪氨酸到牛心果碱的生物合成途径(描绘包括可以产生的各种甲基化中间体)。^*请注意，虽然TyrH被描绘为催化L-酪氨酸转化为L-DOPA，但其它酶(包括酪氨酸酶)可用于如本说明书中所述来执行该步骤。

图15

工程化酵母菌株在液体培养物中从L-DOPA产生NC衍生的BIA分子。将PpDODC的拷贝整合到工程化酵母菌株CSY1039(如图9所述)中，以用于从L-DOPA产生NC(图A，底部色谱图)。接着，将鸦片罂粟6-O-甲基转移酶(Ps6OMT)基因的拷贝整合到该酵母菌株中，以使得能够从L-DOPA产生乌药碱(图A，中间色谱图)。最后，将Ps6OMT和鸦片罂粟乌药碱-N-甲基转移酶(PsCNMT)基因的拷贝都整合到含有PpDODC基因的CSY1039酵母菌株中，以使得能够从L-DOPA生产N-甲基乌药碱(图A，顶部色谱图)。NC和乌药碱测量均符合化学标准品的色谱图。通过将+300m/z离子峰的碎裂模式与公开文献中的模式进行匹配，进一步证实了N-甲基乌药碱的产生(图B)。(参见例如，Schmidt等人(2007)Poppy alkaloid profiling byelectrospray tandem mass spectrometry and electrospray FT-ICR massspectrometry after[ring-13C6]-tyramine feeding.Phytochemistry 68(2):189-202)。

图16

工程化酵母菌株在液体培养物中从糖产生去甲乌药碱(如(2.5)中所述)和牛心果碱(如(2.9)中所述)。(A)使用MRM模式的LC-MS/MS检测从272m/z转变至107m/z的去甲乌药碱。虚线描绘去甲乌药碱标准品。灰线显示在工程化酵母菌株中的去甲乌药碱产生。所述菌株包含以下修饰：ARO4^FBR、ZWF1敲除、GPD-TKL1启动子置换；并且表达下列异源基因：野生型褐家鼠酪氨酸羟化酶(RnTyrH；从低拷贝质粒表达)、PpDODC(整合到染色体中)以及BH₄生物合成和再循环基因(RnPTPS、RnSepR、RnPCD、RnQDHPR；整合到染色体中)。黑线描绘了在如针对灰线所描述并且还共表达黄唐松草去甲乌药碱合酶(TfNCS；从低拷贝质粒表达)的相同菌株中的去甲乌药碱产生。(B)使用MRM模式的LC-MS/MS检测从330m/z转变至137m/z的牛心果碱。虚线描绘牛心果碱标准品。黑线示出了被进一步工程改造来表达Ps6OMT、PsCNMT、EcCYP80B1、PsCPR、Ps4'OMT和日本黄连去甲乌药碱合酶(CjNCS；整合到染色体中)的(A，灰线)中所描述的菌株中的牛心果碱产生。

图17

培养基组成对产生BIA产物的影响。被工程改造来从糖产生牛心果碱的酵母菌株(如(2.9)中所述)在液体培养物中的各种培养基条件下生长。使用MRM模式的LC-MS/MS检测在30C下生长72小时的菌株的生长培养基中的从330m/z转变至137m/z的牛心果碱。(A)酵母菌株YA8在各种培养基条件下的牛心果碱产生。YPD，酵母蛋白胨右旋糖；YNB，酵母基础氮源。(B)两种产生牛心果碱的酵母菌株YA8和YA22在不同的麦芽糊精浓度和淀粉酶浓度下的牛心果碱滴度优化。AGU，淀粉葡糖苷酶单位。

图18

ADH和ALD酶中的失活突变对产生BIA产物的影响。将ADH和ALD酶中的失活突变的组合并入经过工程化以产生牛心果碱的酵母菌株(如在(2.9)中所述)中。具有失活突变的酶可以包括下列各项的任何组合：ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7、ALD2、ALD3、ALD4、ALD5或ALD6。在一些情况下，细胞将包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或更多个失活突变。在某些情况下，含有失活突变的酶将是ADH2、ADH5、ADH6和ALD4。在某些情况下，含有失活突变的酶将是ADH2、ADH5、ADH6、ALD2和ALD3。在一些情况下，多个ADH和ALD失活突变将增加BIA产物滴度。四种酶(ADH2、ADH5、ADH6、ALD4)和五种酶(ADH2、ADH5、ADH6、ALD2、ALD3)中的失活突变的组合增加牛心果碱从产生牛心果碱的酵母菌株(YA8)的产生。被工程改造来从糖产生牛心果碱的酵母菌株(如(2.9)中所述)在液体培养物中以及30C下生长72小时。使用MRM模式的LC-MS/MS检测生长培养基中的从330m/z转变至137m/z的牛心果碱。

尽管有附加条款，但公开内容还由以下条款限定：

1.一种形成含有苄基异喹啉生物碱产物的产物流的方法，所述方法包括：

(a)向间歇式反应器提供工程化酵母细胞以及包含营养物和水的原料，所述工程化酵母细胞具有导致相对于非工程化酵母细胞过度产生酪氨酸的至少一种修饰，其中所述至少一种修饰选自由以下组成的组：生物合成酶基因的反馈抑制减轻突变和酶的失活突变；

(b)在所述间歇式反应器中，通过将所述工程化酵母细胞培养至少约5分钟的时间使所述工程化酵母细胞发酵，以产生包含所述苄基异喹啉生物碱产物和细胞材料的溶液；和

(c)使用至少一个分离单元将所述苄基异喹啉生物碱产物与所述细胞材料分离以提供包含所述苄基异喹啉生物碱产物的产物流。

2.根据条款1所述的方法，其中所述工程化酵母细胞包含编码3-脱氧-d-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸合酶的一种或多种生物合成酶基因中的一个或多个反馈抑制减轻突变。

3.根据条款2所述的方法，其中所述一个或多个反馈抑制减轻突变存在于所述3-脱氧-d-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸合酶基因中。

4.根据条款1所述的方法，其中所述工程化酵母细胞包含编码分支酸变位酶的一种或多种生物合成酶基因中的一个或多个反馈抑制减轻突变。

5.根据条款4所述的方法，其中所述一个或多个反馈抑制减轻突变存在于所述分支酸变位酶基因中。

6.根据条款1所述的方法，其中所述工程化酵母细胞进一步包含生物合成酶基因中的至少一种转录调节修饰。

7.根据条款1所述的方法，其中所述间歇式反应器的至少一个工艺参数是可修改的，以改变所得的苄基异喹啉生物碱产物组成。

8.根据条款7所述的方法，其中所述可修改的至少一个工艺参数包括溶解氧、pH、搅拌速度、通气速率和细胞密度中的至少一个。

9.根据条款1所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物包含苄基异喹啉生物碱前体。

10.根据条款9所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱前体选自由去甲乌药碱、全去甲劳丹碱、酪氨酸、酪胺、4-羟基苯乙醛、4-羟基苯丙酮酸、L-3,4-二羟基苯丙氨酸、3,4-二羟基苯乙醛和多巴胺组成的组。

11.根据条款1所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物包含苄基异喹啉生物碱。

12.根据条款11所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱具有选自由以下组成的组的结构类别：苄基异喹啉、原小檗碱、原阿片碱、苯并菲啶、原吗啡喃、吗啡喃、断裂小檗碱、苯酞异喹啉、阿朴啡和双苄基异喹啉。

13.根据条款12所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱是选自由以下组成的组的苄基异喹啉：乌药碱、3'-羟基乌药碱、4'-O-甲基全去甲劳丹碱、4'-O-甲基劳丹碱、N-甲基去甲乌药碱、劳丹碱、N-甲基乌药碱、3'-羟基-N-甲基乌药碱、牛心果碱、去甲牛心果碱、罂粟碱、劳丹宁、劳丹素、四氢罂粟碱、1,2-二氢罂粟碱和东罂粟灵。

14.根据条款12所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱是选自由以下组成的组的原小檗碱：斯氏紫堇碱、碎叶紫堇碱、刺罂粟碱、南丁宁碱、药根碱、千金藤啶碱、离木明碱、顺式-N-甲基刺罂粟碱、四氢非洲防己碱、巴马汀、四氢巴马汀、非洲防己碱、四氢小檗碱、N-甲基四氢小檗碱、1-羟基四氢小檗碱、小檗碱、N-甲基-左旋蛇果黄堇碱、1,13-二羟基-N-甲基四氢小檗碱和1-羟基-10-O-乙酰基-N-甲基四氢小檗碱。

15.根据条款12所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱是选自由以下组成的组的原阿片碱：原阿片碱、6-羟基原阿片碱、别隐品碱、隐品碱、隐掌叶防己碱和黄唐松草星碱。

16.根据条款12所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱是选自由以下组成的组的苯并菲啶：二氢血根碱、血根碱、dihydrocheilirubine、cheilirubine、二氢马卡平、马卡平和白屈菜赤碱。

17.根据条款12所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱是选自由以下组成的组的原吗啡喃：沙罗泰里啶、沙罗泰里啶醇和沙罗泰里啶醇-7-O-乙酸酯。

18.根据条款12所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱是选自由以下组成的组的吗啡喃：蒂巴因、可待因酮、可待因、吗啡、吗啡酮、东罂粟碱、尼奥平酮、尼奥平、新吗啡、氢可酮、二氢可待因、14-羟可待因酮、羟考酮、14-羟基可待因、吗啡酮、氢吗啡酮、二氢吗啡、二氢埃托啡、乙基吗啡、埃托啡、麦托朋、丁丙诺啡、福尔可定、异可待因和羟吗啡酮。

19.根据条款12所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱是选自由以下组成的断裂小檗碱：4'-O-去甲基马克朗特醛、4'-O-去甲基罂粟奥辛、4'-O-去甲基-3-O-乙酰罂粟奥辛和3-O-乙酰罂粟奥辛。

20.根据条款12所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱是选自由以下组成的组的苯酞异喹啉：那可托灵半缩醛、那可汀半缩醛、那可托灵和诺斯卡品。

21.根据条款12所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱是选自由以下组成的组的阿朴啡：木兰花碱、紫堇块茎碱、阿朴吗啡、波尔定碱、异波尔定碱、异蒂巴因、异紫堇块茎碱和加奥芬。

22.根据条款12所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱是选自由以下组成的组的双苄基异喹啉：黄芦木碱、guattgaumerine、北豆根碱和莲心碱。

23.一种形成含有苄基异喹啉生物碱产物的产物流的方法，所述方法包括：

(a)向反应器提供工程化酵母细胞以及包含营养物和水的原料；

(b)在所述反应器中，通过将所述工程化酵母细胞培养至少约5分钟的时间使所述工程化酵母细胞发酵，以产生包含细胞材料和所述苄基异喹啉生物碱产物的溶液，其中所述溶液包含不超过一种类别的选自原小檗碱、吗啡喃、异帕威碱、阿朴啡和双苄基异喹啉的组的分子；和

24.根据条款23所述的方法，其中所述工程化酵母细胞具有导致相对于非工程化酵母细胞过度产生酪氨酸的至少一种修饰，其中所述至少一种修饰选自由以下组成的组：生物合成酶基因的反馈抑制减轻突变和酶的失活突变。

25.根据条款24所述的方法，其中所述工程化酵母细胞进一步包含生物合成酶基因中的至少一种转录调节修饰。

26.根据条款23所述的方法，其中所述产物流不包含多于5ppm的选自以下各项的组的分子：木质素、色素、类黄酮、类菲、乳胶、核酮糖二磷酸羧化酶、袂康酸、假吗啡、那碎因、蒂巴酚和花粉。

27.根据条款26所述的方法，其中所述产物流不包含多于5ppm的罂粟酸。

28.根据条款23所述的方法，其中所述产物流不包含可检测量的选自由杀虫剂、杀真菌剂或除草剂组成的组的物质。

29.根据条款23所述的方法，其中通过液-液萃取从所述产物流回收所述苄基异喹啉生物碱产物。

30.根据条款29所述的方法，其中在发酵过程完成后立即回收所述苄基异喹啉生物碱产物。

31.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述工程化酵母细胞包含两个或更多个异源编码序列，其中所述两个或更多个异源编码序列编码参与将酪氨酸转化为所述苄基异喹啉生物碱产物的代谢途径的至少第一酶和第二酶，其中所述第一酶和第二酶沿所述代谢途径可操作地连接。

32.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述工程化酵母细胞包含三个异源编码序列，其中所述三个异源编码序列编码参与将酪氨酸转化为所述苄基异喹啉生物碱产物的代谢途径的第一酶、第二酶和第三酶，其中所述第一酶、第二酶和第三酶沿所述代谢途径可操作地连接。

33.一种产生苄基异喹啉生物碱产物的工程化酵母细胞，所述工程化酵母细胞具有导致相对于非工程化酵母细胞过度产生酪氨酸的至少一种修饰，其中所述至少一种修饰选自由以下组成的组：生物合成酶基因的反馈抑制减轻突变和酶的失活突变，

其中所述工程化酵母细胞包含编码选自酪氨酸羟化酶、L-DOPA脱羧酶和去甲乌药碱合酶的组的至少一种酶的至少一种异源编码序列。

34.根据条款33所述的工程化酵母细胞，其中所述工程化酵母细胞进一步包含编码选自以下各项的组的至少一种酶的至少一种异源编码序列：去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶和4’-O-甲基转移酶。

35.根据条款34所述的工程化酵母细胞，其中所述苄基异喹啉生物碱产物包含下列中的至少一种：乌药碱、N-甲基乌药碱、3'-羟基-N-甲基乌药碱、3'-羟基乌药碱、劳丹碱、4’-O-甲基劳丹碱、去甲牛心果碱和牛心果碱。

36.一种形成含有苄基异喹啉生物碱产物的产物流的方法，所述方法包括：

(a)向间歇式反应器提供工程化非植物细胞以及包含营养物和水的原料，所述工程化非植物细胞具有导致相对于非工程化非植物细胞过度产生酪氨酸的至少一种修饰，其中所述至少一种修饰选自由以下组成的组：生物合成酶基因的反馈抑制减轻突变和酶的失活突变；

(b)在所述间歇式反应器中，通过将所述工程化非植物细胞培养至少约5分钟的时间使所述工程化非植物细胞发酵，以产生包含所述苄基异喹啉生物碱产物和细胞材料的溶液；和

37.根据条款36所述的方法，其中所述工程化非植物细胞包含编码3-脱氧-d-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸合酶的一种或多种生物合成酶基因中的一个或多个反馈抑制减轻突变。

38.根据条款37所述的方法，其中所述一个或多个反馈抑制减轻突变存在于所述3-脱氧-d-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸合酶基因中。

39.根据条款36所述的方法，其中所述工程化非植物细胞包含编码分支酸变位酶的一种或多种生物合成酶基因中的一个或多个反馈抑制减轻突变。

40.根据条款39所述的方法，其中所述一个或多个反馈抑制减轻突变存在于所述分支酸变位酶基因中。

41.根据条款36所述的方法，其中所述工程化非植物细胞进一步包含生物合成酶基因中的至少一种转录调节修饰。

42.根据条款36所述的方法，其中所述间歇式反应器的至少一个工艺参数是可修改的，以改变所得的苄基异喹啉生物碱产物组成。

43.根据条款42所述的方法，其中所述可修改的至少一个工艺参数包括溶解氧、pH、搅拌速度、通气速率和细胞密度中的至少一个。

44.根据条款36所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物包含苄基异喹啉生物碱前体。

45.根据条款44所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱前体选自由去甲乌药碱、全去甲劳丹碱、酪氨酸、酪胺、4-羟基苯乙醛、4-羟基苯丙酮酸、L-3,4-二羟基苯丙氨酸、3,4-二羟基苯乙醛和多巴胺组成的组。

46.根据条款36所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物包含苄基异喹啉生物碱。

47.根据条款46所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱具有选自由以下组成的组的结构类别：苄基异喹啉、原小檗碱、原阿片碱、苯并菲啶、原吗啡喃、吗啡喃、断裂小檗碱、苯酞异喹啉、阿朴啡和双苄基异喹啉。

48.根据条款47所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱是选自由以下组成的组的苄基异喹啉：乌药碱、3'-羟基乌药碱、4'-O-甲基全去甲劳丹碱、4'-O-甲基劳丹碱、N-甲基去甲乌药碱、劳丹碱、N-甲基乌药碱、3'-羟基-N-甲基乌药碱、牛心果碱、去甲牛心果碱、罂粟碱、劳丹宁、劳丹素、四氢罂粟碱、1,2-二氢罂粟碱和东罂粟灵。

49.根据条款47所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱是选自由以下组成的组的原小檗碱：斯氏紫堇碱、碎叶紫堇碱、刺罂粟碱、南丁宁碱、药根碱、千金藤啶碱、离木明碱、顺式-N-甲基刺罂粟碱、四氢非洲防己碱、巴马汀、四氢巴马汀、非洲防己碱、四氢小檗碱、N-甲基四氢小檗碱、1-羟基四氢小檗碱、小檗碱、N-甲基-左旋蛇果黄堇碱、1,13-二羟基-N-甲基四氢小檗碱和1-羟基-10-O-乙酰基-N-甲基四氢小檗碱。

50.根据条款47所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱是选自由以下组成的组的原阿片碱：原阿片碱、6-羟基原阿片碱、别隐品碱、隐品碱、隐掌叶防己碱和黄唐松草星碱。

51.根据条款47所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱是选自由以下组成的组的苯并菲啶：二氢血根碱、血根碱、dihydrocheilirubine、cheilirubine、二氢马卡平、马卡平和白屈菜赤碱。

52.根据条款47所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱是选自由以下组成的组的原吗啡喃：沙罗泰里啶、沙罗泰里啶醇和沙罗泰里啶醇-7-O-乙酸酯。

53.根据条款47所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱是选自由以下组成的组的吗啡喃：蒂巴因、可待因酮、可待因、吗啡、吗啡酮、东罂粟碱、尼奥平酮、尼奥平、新吗啡、氢可酮、二氢可待因、14-羟可待因酮、羟考酮、14-羟基可待因、吗啡酮、氢吗啡酮、二氢吗啡、二氢埃托啡、乙基吗啡、埃托啡、麦托朋、丁丙诺啡、福尔可定、异可待因和羟吗啡酮。

54.根据条款47所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱是选自由以下组成的断裂小檗碱：4'-O-去甲基马克朗特醛、4'-O-去甲基罂粟奥辛、4'-O-去甲基-3-O-乙酰罂粟奥辛和3-O-乙酰罂粟奥辛。

55.根据条款47所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱是选自由以下组成的组的苯酞异喹啉：那可托灵半缩醛、那可汀半缩醛、那可托灵和诺斯卡品。

56.根据条款47所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱是选自由以下组成的组的阿朴啡：木兰花碱、紫堇块茎碱、阿朴吗啡、波尔定碱、异波尔定碱、异蒂巴因、异紫堇块茎碱和加奥芬。

57.根据条款47所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱是选自由以下组成的组的双苄基异喹啉：黄芦木碱、guattgaumerine、北豆根碱和莲心碱。

58.一种形成含有苄基异喹啉生物碱产物的产物流的方法，所述方法包括：

(a)向反应器提供工程化非植物细胞以及包含营养物和水的原料；

(b)在所述反应器中，通过将所述工程化非植物细胞培养至少约5分钟的时间使所述工程化非植物细胞发酵，以产生包含细胞材料和所述苄基异喹啉生物碱产物的溶液，其中所述溶液包含不超过一种类别的选自原小檗碱、吗啡喃、异帕威碱、阿朴啡和双苄基异喹啉的组的分子；和

59.根据条款58所述的方法，其中所述工程化非植物细胞具有导致相对于非工程化非植物细胞过度产生酪氨酸的至少一种修饰，其中所述至少一种修饰选自由以下组成的组：生物合成酶基因的反馈抑制减轻突变和酶的失活突变。

60.根据条款59所述的方法，其中所述工程化非植物细胞进一步包含生物合成酶基因中的至少一种转录调节修饰。

61.根据条款58所述的方法，其中所述产物流不包含多于5ppm的选自以下各项的组的分子：木质素、色素、类黄酮、类菲、乳胶、核酮糖二磷酸羧化酶、袂康酸、假吗啡、那碎因、蒂巴酚和花粉。

62.根据条款61所述的方法，其中所述产物流不包含多于5ppm的罂粟酸。

63.根据条款58所述的方法，其中所述产物流不包含可检测量的选自由杀虫剂、杀真菌剂或除草剂组成的组的物质。

64.根据条款58所述的方法，其中通过液-液萃取从所述产物流回收所述苄基异喹啉生物碱产物。

65.根据条款64所述的方法，其中在发酵过程完成后立即回收所述苄基异喹啉生物碱产物。

66.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述工程化非植物细胞包含两个或更多个异源编码序列，其中所述两个或更多个异源编码序列编码参与将酪氨酸转化为所述苄基异喹啉生物碱产物的代谢途径的至少第一酶和第二酶，其中所述第一酶和第二酶沿所述代谢途径可操作地连接。

67.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述工程化非植物细胞包含三个异源编码序列，其中所述三个异源编码序列编码参与将酪氨酸转化为所述苄基异喹啉生物碱产物的代谢途径的第一酶、第二酶和第三酶，其中所述第一酶、第二酶和第三酶沿所述代谢途径可操作地连接。

68.一种产生苄基异喹啉生物碱产物的工程化非植物细胞，所述工程化非植物细胞具有导致相对于非工程化非植物细胞过度产生酪氨酸的至少一种修饰，其中所述至少一种修饰选自由以下组成的组：生物合成酶基因的反馈抑制减轻突变和酶的失活突变，

其中所述工程化非植物细胞包含编码选自酪氨酸羟化酶、L-DOPA脱羧酶和去甲乌药碱合酶的组的至少一种酶的至少一种异源编码序列。

69.根据条款68所述的工程化非植物细胞，其中所述工程化非植物细胞进一步包含编码选自以下各项的组的至少一种酶的至少一种异源编码序列：去甲乌药碱6-O-甲基转移酶、乌药碱-N-甲基转移酶、细胞色素P450 80B1、细胞色素P450还原酶和4’-O-甲基转移酶。

70.根据条款69所述的工程化非植物细胞，其中所述苄基异喹啉生物碱产物包含下列中的至少一种：乌药碱、N-甲基乌药碱、3'-羟基-N-甲基乌药碱、3'-羟基乌药碱、劳丹碱、4’-O-甲基劳丹碱、去甲牛心果碱和牛心果碱。

71.根据前述条款中任一项所述的工程化非植物细胞，其中所述工程化非植物细胞包含两个或更多个异源编码序列，其中所述两个或更多个异源编码序列编码参与将酪氨酸转化为所述苄基异喹啉生物碱产物的代谢途径的至少第一酶和第二酶，其中所述第一酶和第二酶沿所述代谢途径可操作地连接。

72.根据前述条款中任一项所述的工程化非植物细胞，其中所述工程化非植物细胞包含三个异源编码序列，其中所述三个异源编码序列编码参与将酪氨酸转化为所述苄基异喹啉生物碱产物的代谢途径的第一酶、第二酶和第三酶，其中所述第一酶、第二酶和第三酶沿所述代谢途径可操作地连接。

73.一种化合物，其包含：

苄基异喹啉生物碱产物，所述苄基异喹啉生物碱产物被表征为选自由1-苄基异喹啉、原小檗碱、吗啡喃、异帕威碱、阿朴啡和双苄基异喹啉组成的组的至多两个类别的部分，

其中所述化合物的剩余组分不包含可检测量的非选自1-苄基异喹啉、原小檗碱、吗啡喃、异帕威碱、阿朴啡和双苄基异喹啉的类别的分子。

74.根据条款73所述的化合物，其中所述苄基异喹啉生物碱产物被表征为具有可检测量的选自由1-苄基异喹啉、原小檗碱、吗啡喃、异帕威碱、阿朴啡和双苄基异喹啉组成的组的至多一个类别。

75.根据条款73所述的化合物，其中所述苄基异喹啉生物碱产物被表征为1-苄基异喹啉类别的部分以及选自由原小檗碱、吗啡喃、异帕威碱、阿朴啡和双苄基异喹啉组成的组的至多一个类别的部分。

76.一种治疗剂，其包含：

苄基异喹啉生物碱产物，

其中所述治疗剂不含可检测量的选自由可待因-O(6)-甲基醚、8,14-二羟基-7,8-二氢可待因酮和四氢蒂巴因组成的组的杂质。

77.根据条款23至32中任一项所述的方法，其中所述溶液不包含可检测量的选自以下各项的组的分子：原小檗碱、吗啡喃、异帕威碱、阿朴啡和双苄基异喹啉，且其中所述溶液包含苯酞异喹啉类别的分子。

78.根据条款23至32中任一项所述的方法，其中所述溶液包含原小檗碱类别的分子，且其中所述溶液进一步包含苯酞异喹啉类别的分子。

79.根据条款58至67中任一项所述的方法，其中所述溶液不包含可检测量的选自以下各项的组的分子：原小檗碱、吗啡喃、异帕威碱、阿朴啡和双苄基异喹啉，且其中所述溶液包含苯酞异喹啉类别的分子。

80.根据条款58至67中任一项所述的方法，其中所述溶液包含原小檗碱类别的分子，且其中所述溶液进一步包含苯酞异喹啉类别的分子。

81.根据条款73至75中任一项所述的化合物，其中所述苄基异喹啉生物碱产物不被分类为是选自由1-苄基异喹啉、原小檗碱、吗啡喃、异帕威碱、阿朴啡和双苄基异喹啉组成的组的类别的部分，且其中所述苄基异喹啉生物碱产物被分类为是苯酞异喹啉生物碱类别的部分。

82.根据条款73至75中任一项所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物被分类为是原小檗碱类别和苯酞异喹啉生物碱类别的部分。

83.根据条款73至75中任一项所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物被分类为是1-苄基异喹啉类别、原小檗碱类别和苯酞异喹啉生物碱类别的部分。

虽然为了清楚理解的目的，已经通过说明和示例的方式对本发明进行了一些详细的描述，但根据本发明的教导，对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，在不脱离所附权利要求书的精神或范围的情况下可以对其进行某些改变和修改。

因此，前面仅仅说明了本发明的原理。应当理解，本领域技术人员将能够设计出各种配置，所述配置尽管没有在本文中明确描述或示出，但体现本发明的原理并且包括在其精神和范围内。此外，本文所述的所有示例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理以及本发明人为促进本领域而贡献的概念，并且应当被解释为不这些具体叙述的示例和条件。此外，本文中所有叙述本发明的原理、方面和实施方案的所有陈述以及其具体实施例旨在涵盖其结构和功能等效物。此外，意图是这样的等效物包括当前已知的等效物和将来开发的等效物，即，所开发的执行相同功能的任何元件，而不管其结构如何。因此，本发明的范围无意限于本文中所示和所述的示例性实施方案。相反地，本发明的范围和精神由所附权利要求体现。

Claims

2.一种形成含有苄基异喹啉生物碱产物的产物流的方法，所述方法包括：

(b)在所述反应器中，通过将所述工程化非植物细胞培养至少约5分钟的时间使所述工程化非植物细胞发酵，以产生包含细胞材料和所述苄基异喹啉生物碱产物的溶液，其中所述溶液包含不超过一种类别的选自以下组的分子：原小檗碱、吗啡喃、异帕威碱、阿朴啡和双苄基异喹啉；和

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述工程化非植物细胞是工程化酵母细胞。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述工程化酵母细胞包含编码3-脱氧-d-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸合酶的一种或多种生物合成酶基因中的一个或多个反馈抑制减轻突变。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述一个或多个反馈抑制减轻突变存在于所述3-脱氧-d-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸合酶基因中。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述工程化酵母细胞包含编码分支酸变位酶的一种或多种生物合成酶基因中的一个或多个反馈抑制减轻突变。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述一个或多个反馈抑制减轻突变存在于所述分支酸变位酶基因中。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述工程化酵母细胞进一步包含生物合成酶基因中的至少一种转录调节修饰。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述间歇式反应器的至少一个工艺参数是可修改的，以改变所得的苄基异喹啉生物碱产物组成，其中所述可修改的至少一个工艺参数包括溶解氧、pH、搅拌速度、通气速率和细胞密度中的至少一个。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物选自以下组：去甲乌药碱、全去甲劳丹碱、酪氨酸、酪胺、4-羟基苯乙醛、4-羟基苯丙酮酸、L-3,4-二羟基苯丙氨酸、3,4-二羟基苯乙醛和多巴胺。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述苄基异喹啉生物碱产物是具有选自以下组的结构类别的苄基异喹啉生物碱：苄基异喹啉、原小檗碱、原阿片碱、苯并菲啶、原吗啡喃、吗啡喃、断裂小檗碱、苯酞异喹啉、阿朴啡和双苄基异喹啉。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述产物流不包含多于5ppm的选自以下组的分子：木质素、色素、类黄酮、类菲、乳胶、核酮糖二磷酸羧化酶、袂康酸、假吗啡、那碎因、蒂巴酚和花粉。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述产物流不包含可检测量的选自由杀虫剂、杀真菌剂或除草剂组成的组的物质。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述工程化酵母细胞包含两个或更多个异源编码序列，其中所述两个或更多个异源编码序列编码参与将酪氨酸转化为所述苄基异喹啉生物碱产物的代谢途径的至少第一酶和第二酶，其中所述第一酶和第二酶沿所述代谢途径可操作地连接。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述工程化酵母细胞包含三个异源编码序列，其中所述三个异源编码序列编码参与将酪氨酸转化为所述苄基异喹啉生物碱产物的代谢途径的第一酶、第二酶和第三酶，其中所述第一酶、第二酶和第三酶沿所述代谢途径可操作地连接。