CN107613995A

CN107613995A - 蜂蜜组分

Info

Publication number: CN107613995A
Application number: CN201680030031.9A
Authority: CN
Inventors: 礒滨洋郎; 礒滨洋一郎; 堀江郎; 堀江一郎; 谷央子; 木村友香; 吉松麻衣子; 中塚多惠
Original assignee: YAMADA APIARY CORP; Tokyo University of Science
Current assignee: YAMADA APIARY CORP; Tokyo University of Science; Yamada Bee Co Inc
Priority date: 2015-05-29
Filing date: 2016-05-19
Publication date: 2018-01-19
Anticipated expiration: 2036-05-19
Also published as: CN107613995B; US20180147244A1; EP3305308B1; JP6465299B2; EP3305308A4; JP2016222584A; WO2016194638A1; EP3305308A1; TW201642883A; US11020439B2

Abstract

本发明提供蜂蜜组分，其通过包括下述工序的方法得到：(a)使蜂蜜与吸附材料接触，得到吸附成分的工序；(b)使用有机溶剂洗脱上述吸附成分而得到有机溶剂级分的工序，所述有机溶剂为丙酮、乙酸乙酯或乙醇；和(c)从上述有机溶剂级分中得到蜂蜜组分的工序。

Description

蜂蜜组分

技术领域

本发明涉及蜂蜜组分。

背景技术

已有文献提示蜂蜜针对由儿童感冒引起的咳嗽症状表现出有效性的可能性(非专利文献1)。尽管推测其机理为蜂蜜的甜味等促进唾液或气管液的分泌等，但并未解释清楚(非专利文献2)。

咳嗽是除去气管的异物或分泌物的反射机制之一，由气管的炎症性变化、结构变化或化学性·物理性刺激物的吸入引起。作为咳嗽受体，存在于Aδ-纤维的快速应激性的受体(快速适应受体，rapidly adapting receptor：RARs)和C-纤维受体是已知的，向这些咳嗽受体施加刺激时，通过喉上神经和迷走神经的向心性通路引发咳嗽(非专利文献3)。

镇咳药的种类中，除了中枢性的麻醉性镇咳药及非麻醉性镇咳药以外，还有支气管扩张剂、除痰剂、抗病原微生物、抗过敏剂、抗IgE抗体、类固醇、汉方等末梢性镇咳药。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Ian M.Paul,Therapeutic Options for Acute Cough Due toUpper Respiratory Infections in Children,Lung,190(1),41-44,(2012).

非专利文献2：Ian M.Paul等,Effect of Honey,Dextromethorphan,and NoTreatment on Nocturnal Cough and Sleep Quality for Coughing Children andTheir Parents,Archives of pediatrics adolescent medicine,161(12),1140-1146(2007).

非专利文献3：村木正人等，咳嗽の臨床(咳嗽的临床)，近畿大医誌(近畿大学医学杂志)，第35卷(3、4期)，145～149页，2010

非专利文献4：高滨和夫等，咳‐その多様性と末梢性発現機序(咳嗽‐其多样性及末梢性发生机制)，日薬理誌(日本药理学杂志)，105、41～52页，1995

发明内容

发明所要解决的课题

麻醉性镇咳药由于降低与咳嗽相关的中枢的兴奋，因此效力强，但有恶心、呕吐、呼吸抑制、便秘、困倦、排尿障碍、依赖性、耐药性等副作用，另外，针对气管炎症时的咳嗽的抑制作用弱。此外，非麻醉性镇咳药虽然没有依赖性、呼吸抑制这样的副作用，但有眩晕、口渴、困倦、食欲不振、便秘、心动过速等副作用，且通常效力较弱。末梢性镇咳药在末梢(气管、肺、呼吸肌等)处对传递咳嗽的刺激的向心通路或传递来自中枢的兴奋的远心通路进行截断，但即使进行原因疾病的治疗、改善也不充分的情况亦不少见(非专利文献3、4)。需求开发与现有药物相比有效性及安全性更优异的镇咳药。

本发明的目的在于，提供具有优异的镇咳作用的蜂蜜组分。

用于解决课题的手段

本发明提供通过包括下述工序的方法得到的蜂蜜组分，所述工序为：(a)使蜂蜜与吸附材料接触，得到吸附成分的工序；(b)使用有机溶剂洗脱上述吸附成分而得到有机溶剂级分的工序，所述有机溶剂为丙酮、乙酸乙酯或乙醇；和(c)从上述有机溶剂级分中得到蜂蜜组分的工序。上述蜂蜜组分具有优异的镇咳作用。

要经由(b)工序洗脱的上述吸附成分优选为不被水或甲醇洗脱的成分。由此，能够使得到的蜂蜜组分的镇咳活性更高。另外，上述有机溶剂优选为丙酮。

在(b)工序之前，优选还包括从上述吸附成分中除去被水洗脱的成分的工序。另外，在(b)工序之前，优选还包括从上述吸附成分中除去被甲醇、甲醇水溶液或乙醇水溶液洗脱的成分的工序。

(b)工序优选还包括选自由下述(b-1)工序、(b-2)工序及(b-3)工序组成的组中的至少一道工序。

(b-1)得到以下组分作为上述有机溶剂级分的工序：根据洗脱时间对被上述有机溶剂洗脱的上述吸附成分进行分离，在使用了硅胶的薄层色谱法中，使用己烷/乙酸乙酯的混合比为4/1的溶剂进行展开时，上述组分具有利用茴香醛硫酸试液(喷雾后于105℃加热)显色的Rf值为0.49～0.55的斑点及显色比该斑点更浅的Rf值为0.56～0.62的斑点。

(b-2)得到以下组分作为上述有机溶剂级分的工序：根据洗脱时间对被上述有机溶剂洗脱的上述吸附成分进行分离，在使用了硅胶的薄层色谱法中，使用氯仿/甲醇/乙酸的混合比为9/1/1的溶剂进行展开时，上述组分具有利用碘化铋钾试液显色的Rf值为0及0.54～0.94的斑点。

(b-3)得到以下组分作为上述有机溶剂级分的工序：根据洗脱时间对被上述有机溶剂洗脱的上述吸附成分进行分离，在液相色谱质谱分析法中以下述条件进行测定时，于2.0～4.0分钟的保留时间检测到上述组分，并且，上述组分包含具有m/z438[M+H]及m/z436[M-H]的分子离子峰的峰。

(测定条件)

柱：Acquity UPLC BFH C18(φ2.1×100mm，Waters公司制)

流速：0.4ml/分钟

柱温：40℃

溶剂：5％B(0-0.25分钟)、5-100％B(0.25-10分钟，线性梯度)、100％B(10-12分钟)、5％B(12-15分钟)

A：0.05％甲酸水溶液、B：100％乙腈

进样量：2μl

(b)工序优选还包括(b-4)工序。(b-4)工序为下述工序：利用反相吸附材料进一步对经由(b-2)工序得到的组分进行分离，得到满足下述(1)及(2)中至少一个条件的组分作为上述有机溶剂级分。

(1)在使用了硅胶的薄层色谱法中，使用氯仿/甲醇/乙酸的混合比为9/1/0.3的溶剂进行展开时，上述组分具有利用碘化铋钾试液显色的Rf值为0～0.22的斑点。

(2)在使用了硅胶的薄层色谱法中，使用氯仿/甲醇/水的混合比为1/1/0.3的溶剂进行展开时，上述组分具有利用茚三酮试液(喷雾后于105℃加热)显色的Rf值为选自由0.02～0.09、0.10～0.20及0.30～0.53组成的组中的至少一者的斑点。

另外，本发明提供通过包括下述工序的方法得到的蜂蜜组分，所述工序为：(d)使蜂蜜与酸性吸附材料接触，得到被上述酸性吸附材料吸附的吸附成分的工序；(e)利用碱性水溶液洗脱上述吸附成分，得到碱性水溶液级分的工序；和(f)从上述碱性水溶液级分中得到蜂蜜组分的工序；

或者，提供通过包括下述工序的方法得到的蜂蜜组分，所述工序为：(d’)使蜂蜜与碱性吸附材料接触，得到被上述碱性吸附材料吸附的吸附成分的工序；(e’)利用酸性水溶液洗脱上述吸附成分，得到酸性水溶液级分的工序；和(f’)从上述酸性水溶液级分中得到蜂蜜组分的工序。

另外，本发明提供含有上述蜂蜜组分作为有效成分的类阿片活性剂。另外，本发明提供含有上述蜂蜜组分作为有效成分的镇咳剂或镇痛剂。

本发明还涵盖用于类阿片的活性、镇咳或镇痛用途的蜂蜜组分。另外，本发明还涵盖用于类阿片的活性、镇咳或镇痛用途的含有蜂蜜组分作为有效成分的试剂。另外，本发明还涵盖蜂蜜组分在类阿片活性剂、镇咳剂或镇痛剂的制造中的用途。

上述的本实施方式还涵盖基于类阿片活性的方法、镇咳方法或镇痛方法，上述方法包括将有效量的蜂蜜组分施予至需要上述蜂蜜组分的对象的步骤。

发明效果

通过本发明，可提供具有优异的镇咳作用的蜂蜜组分。

附图说明

[图1]为表示试验例1-1中的咳嗽次数的图。

[图2]为表示试验例1-2中的咳嗽次数的图。

[图3]为表示试验例1-3中的咳嗽次数的图。

[图4]为表示试验例1-4中的咳嗽次数的图。

[图5]为表示试验例1-5中的咳嗽次数的图。

[图6]为表示试验例1-6中的咳嗽次数的图。

[图7]为表示试验例2-1中的咳嗽次数的图。

[图8]为示出了试验例2-2中的薄层色谱图的图。

[图9]为表示试验例2-2中的咳嗽次数的图。

[图10](a)、(b)及(c)分别为示出了试验例2-2的LCMS图谱的图。

[图11]为表示试验例2-3中的咳嗽次数的图。

[图12]为表示试验例3-1中的咳嗽次数的图。

[图13]为表示试验例3-2中的咳嗽次数的图。

[图14]为表示试验例4-1中的咳嗽次数的图。

[图15]为表示试验例5-1中的咳嗽次数的图。

具体实施方式

以下，对本发明的优选实施方式进行说明。但是，本发明不限于以下的实施方式。

本实施方式涉及的蜂蜜组分是利用特定的方法对蜂蜜进行分离得到的，具有高镇咳活性。具体而言，蜂蜜组分通过包括下述工序的方法得到：(a)使蜂蜜与吸附材料接触，将蜂蜜吸附至上述吸附材料而得到吸附成分的工序；(b)使用有机溶剂洗脱上述吸附成分而得到有机溶剂级分的工序，所述有机溶剂为丙酮、乙酸乙酯或乙醇；和(c)从上述有机溶剂级分中得到蜂蜜组分的工序。

(b)工序中使用的乙醇的浓度可以为100％，也可以为99％以上。

(a)工序中的吸附材料可使用通常作为吸附材料用于物质的分离纯化的材料，可举出例如以活性炭、纤维素、二氧化硅、高岭土、硅藻土、膨润土、硅胶、氧化铝、沸石、多孔质玻璃、环糊精等作为材质的吸附材料、合成吸附材料。吸附材料可以为多孔质。合成吸附材料可以是例如芳香族系、葡聚糖衍生物系、甲基丙烯酸酯系等的吸附材料。作为芳香族系吸附材料，优选苯乙烯-二乙烯基苯系吸附材料。作为苯乙烯-二乙烯基苯系吸附材料的市售品，可举出Diaion HP-20、HP-21、SP850(三菱化学公司制)、FPX66、XAD7HP、FPX62(奥加诺株式会社制)等。合成吸附材料可以是酸性阳离子交换树脂、碱性阴离子交换树脂等离子交换树脂。离子交换树脂可应用与后述的酸性吸附材料及碱性吸附材料同样的材料。吸附材料可填充至例如柱中进行使用。

要经由(b)工序洗脱的吸附成分优选为不被水或甲醇洗脱的成分。例如，在(b)工序之前，使用水、甲醇、或甲醇水溶液将(a)工序中得到的吸附成分洗脱，从吸附成分中除去被水、甲醇或甲醇水溶液洗脱的成分，由此能够提高吸附成分中的不被水或甲醇洗脱的成分的比例。作为甲醇水溶液，可使用任意的甲醇浓度的水溶液，例如可使用50％甲醇水溶液。另外，例如，预先将(a)工序中使用的蜂蜜溶解于水中，使其以蜂蜜水溶液的形式与吸附材料接触，由此能够提高吸附成分中的不被水洗脱的成分的比例。通过这些处理，能够更高效地得到镇咳活性高的组分。

另外，要经由(b)工序洗脱的吸附成分可以是不被乙醇水溶液洗脱的成分。例如，在(b)工序之前，预先将(a)工序中得到的吸附成分使用乙醇水溶液洗脱，能够提高吸附成分中的不被水或乙醇水溶液洗脱的成分的比例。乙醇水溶液的浓度可以为例如20～80％，可以为40～60％，也可以为50％。通过这些处理，能够更高效地得到镇咳活性高的组分。

在(b)工序之前，优选包括从吸附成分中除去被水洗脱的成分的工序、从吸附成分中除去被甲醇水溶液洗脱的成分的工序、及从吸附成分中除去被甲醇洗脱的成分的工序，并优选以该顺序包括这3道工序。通过这样的分离方法，能够进一步提高得到的蜂蜜组分的镇咳作用。

将得到的蜂蜜组分用于食品用途的情况下，用于预先将(a)工序中得到的吸附成分洗脱的溶剂优选为水及乙醇，(b)工序中的有机溶剂优选为乙醇。

(b)工序中，优选进一步对被有机溶剂洗脱的吸附成分进行分离，选出镇咳活性更高的组分。吸附成分的分离可根据例如将吸附成分使用有机溶剂洗脱时的洗脱时间进行。

作为从组分中选出镇咳活性高的组分的方法，可使用例如将各组分供于硅胶薄层色谱，以其展开谱图(pattern)作为指标的方法。根据洗脱时间分离得到的吸附成分存在薄层色谱法的展开谱图根据其洗脱时间的不同而不同的趋势，利用展开谱图，可辨别是否为包含目标蜂蜜组分的有机溶剂级分。作为根据洗脱时间对吸附成分进行分离、以薄层色谱法的展开谱图作为指标而得到目标组分的工序，具体而言，可通过例如下述的(b-1)工序或(b-2)工序实施。

(b-1)工序为得到下述组分作为上述有机溶剂级分的工序：根据洗脱时间对被有机溶剂洗脱的吸附成分进行分离，在使用了硅胶的薄层色谱法中，使用己烷/乙酸乙酯的混合比为4/1的溶剂进行展开时，上述组分具有利用茴香醛硫酸试液显色的Rf值为0.49～0.55的斑点(以下也称为斑点A)及显色比斑点A更浅的Rf值为0.56～0.62的斑点(以下也称为斑点B)。

具有上述特征的组分具有更高的镇咳活性。斑点A的Rf值优选为0.51～0.53，斑点B的Rf值优选为0.58～0.60。需要说明的是，作为洗脱时间晚于成为目标的具有高镇咳活性的蜂蜜组分的组分，可得到展现斑点B的显色比斑点A更深的展开谱图的组分。

(b-1)工序中使用的茴香醛硫酸试液可通过将13mL对茴香醛、5mL乙酸及478mL乙醇混合，再滴入18mL浓硫酸来制备。利用茴香醛硫酸试液的染色中，通过在试液的喷雾后于105℃加热，可以确认显色。

(b-2)工序为得到下述组分作为有机溶剂级分的工序：根据洗脱时间对被有机溶剂洗脱的上述吸附成分进行分离，在使用了硅胶的薄层色谱法中，使用氯仿/甲醇/乙酸的混合比为9/1/1的溶剂进行展开时，上述组分具有利用碘化铋钾试液显色的Rf值为0及0.54～0.94的斑点。具有上述特征的组分具有更高的镇咳活性。斑点的Rf值优选为0及0.64～0.84，更优选为0及0.69～0.79，进一步优选为0及0.72～0.76。

(b-2)工序中使用的碘化铋钾试液可通过混合下述试剂来制备：将1.7g次硝酸铋、20mL乙酸及80mL蒸馏水混合制得的混合液(5mL)；将40g碘化钾及100mL蒸馏水混合制得的混合液(5mL)；20mL乙酸；以及70mL蒸馏水。

另外，(b)工序可包括(b-3)工序。(b-3)工序为得到以下组分作为有机溶剂级分的工序：根据洗脱时间对被有机溶剂洗脱的上述吸附成分进行分离，在液相色谱质谱分析法中以后述的条件进行测定时，于2.0～4.0分钟的保留时间检测到上述组分，并且，上述组分包含具有m/z438[M+H]及m/z436[M-H]的分子离子峰的峰。通过以这样的峰作为指标进行分离，能够得到具有高镇咳活性的蜂蜜组分。保留时间优选为2.2～3.4分钟，更优选为2.5～3.1分钟，进一步优选为2.7～2.9分钟。

液相色谱质谱分析可利用例如Waters Micromass Quattro Premium(Waters公司制)实施。液相色谱质谱分析法的测定条件如下所述。

柱：Acquity UPLC BFH C18(φ2.1×100mm，Waters公司制)，流速：0.4ml/分钟，柱温：40℃，溶剂：5％B(0-0.25分钟)，5-100％B(0.25-10分钟，线性梯度)，100％B(10-12分钟)，5％B(12-15分钟)，A：0.05％甲酸水溶液，B：100％乙腈，检测波长：295.8nm，检测质谱：SIR模式：正离子模式m/z(cone)：93.2(10)、239.1(10)、255.4(30)、257.1(30)、438.5(30)、585.3(30)、负离子模式m/z(cone)：112.9(30)、175.0(30)、253.2(30)、255.2(30)、285.6(30)、449.8(30)、577.8(30)

进样量：2μl

(b-1)工序、(b-2)工序及(b-3)工序可实施任一者，也可实施多道工序。通过实施(b-2)工序或(b-3)工序，能够得到较仅实施(b-1)工序的情况而言镇咳活性更高的蜂蜜组分。

(b-4)工序

(b)工序中，优选进一步对(b-2)工序中得到的组分进行分离，选出镇咳活性更高的组分。(b-2)工序中得到的组分的进一步分离可通过例如使用反相吸附材料，将(b-2)工序中得到的组分供于反相色谱等来进行。作为从得到的组分中选出镇咳活性更高的组分的方法，可使用例如将各组分供于硅胶薄层色谱，以其展开谱图作为指标的方法。根据反相色谱的洗脱时间分离得到的组分存在薄层色谱法的展开谱图根据其洗脱时间的不同而不同的趋势，利用展开谱图，可辨别是否为包含目标蜂蜜组分的组分。具体而言，可通过例如下述的(b-4)工序实施。

(b-4)工序为下述工序：利用反相吸附材料进一步对经由(b-2)工序得到的组分进行分离，得到满足下述(1)及(2)中至少一个条件的组分作为上述有机溶剂级分。

(2)在使用了硅胶的薄层色谱法中，使用氯仿/甲醇/水的混合比为1/1/0.3的溶剂进行展开时，上述组分具有利用茚三酮试液显色的Rf值为选自由0.02～0.09、0.10～0.20及0.30～0.53组成的组中的至少一者的斑点。

茚三酮试液可通过例如将0.3g茚三酮、3mL乙酸及100mL正丁醇混合来制备。利用茚三酮试液的染色中，通过在试液的喷雾后于105℃加热，可以确认显色。

反相色谱可通过例如使用ODS(C18)柱、C8柱、C30柱等反相柱的高效液相色谱进行。作为反相的ODS柱的市售品，可举出例如cosmosil 5c-18-AR-II(Nacalai Tesque公司制)、Capcell Pak C18 AQ(资生堂公司制)、Sunfire C18、Atlantis T3(Waters公司制)、inertsill ODS-3(GL Sciences公司制)、TSK gel ODS-100S(TOSOH公司制)、Cadenza CD-C18(Imtakt Corp.制)、Hydrosphere C18、Pro C8、Pro C18(YMC公司制)、Develosil HBODS-UG-3、Develosil HB ODS-HG-3、Develosil HB C30-UG-3(Develosil公司制)等。

对于上述(1)的薄层色谱法展开谱图的斑点而言，Rf值优选为0～0.12，Rf值更优选为0～0.06。对于上述(2)的薄层色谱法展开谱图而言，优选具有Rf值为选自由0.04～0.07、0.10～0.18及0.30～0.53组成的组中的至少一者的斑点，更优选具有Rf值为0.10～0.18的斑点。

(c)工序中，从(b)工序中得到的有机溶剂级分中得到蜂蜜组分。蜂蜜组分可通过例如除去有机溶剂级分中的溶剂而得到。溶剂的除去可通过例如冷冻干燥、加热干燥等进行。

另外，本实施方式涉及的蜂蜜组分还可通过包括下述工序的方法得到：(d)使蜂蜜与酸性吸附材料接触，得到被酸性吸附材料吸附的吸附成分的工序；(e)利用碱性水溶液洗脱吸附成分，得到碱性水溶液级分的工序；和(f)从碱性水溶液中得到蜂蜜组分的工序。可通过该方法得到的蜂蜜组分具有高镇咳活性。

(d)工序具体而言可通过例如使溶解于离子交换水等水中得到的蜂蜜水溶液流过酸性阳离子交换树脂等酸性吸附材料来进行。酸性阳离子交换树脂的离子型可以为例如钙离子型、钠离子型等盐型。酸性阳离子交换树脂可以是强酸性阳离子交换树脂或弱酸性阳离子交换树脂。作为酸性阳离子交换树脂，可使用例如Amberlite 200CTNA(奥加诺株式会社制)、SK1B、SK104、SK110、SK112、PK208、PK212、PK216、PK218、PK220、PK228、UBK530、UBK535、UBK530K、UBK535K、UBK555、WK40、WK10、WK11、WK100(均为三菱化学公司制)等。酸性阳离子交换树脂优选预先使用酸性水溶液及水进行处理。作为用于处理的酸性水溶液，优选例如1M的盐酸等。

作为(e)工序中使用的碱性水溶液，可使用例如氨水等pH8～9的水溶液。碱性水溶液可含有乙醇。要经由(e)工序洗脱的吸附成分优选为不被水洗脱的成分。例如，在(e)工序之前使用水洗脱(d)工序中得到的吸附成分，从吸附成分中除去被水洗脱的成分，由此能够使要经由后续(e)工序洗脱的吸附成分为不被水洗脱的成分。

(f)工序中，蜂蜜组分可通过例如除去碱性水溶液级分中的溶剂而得到。溶剂的除去可通过例如冷冻干燥、加热干燥进行。

另外，本实施方式涉及的蜂蜜组分可通过包括下述工序的方法得到：(d’)使蜂蜜与碱性吸附材料接触，得到被碱性吸附材料吸附的吸附成分的工序；(e’)利用酸性水溶液洗脱吸附成分，得到酸性水溶液级分的工序；和(f’)从酸性水溶液中得到蜂蜜组分的工序。

(d’)工序具体而言可通过例如使溶解于离子交换水等水中得到的蜂蜜水溶液流过碱性阴离子交换树脂等碱性吸附材料来进行。碱性阴离子交换树脂的离子型可以为氯化物离子型等。碱性阴离子交换树脂可以是强碱性阴离子交换树脂或弱碱性阴离子交换树脂。碱性阴离子交换树脂优选为MR型，另外，优选为苯乙烯系。作为碱性阴离子交换树脂，可使用例如Amberlite 2IRA910CT、IRA402BL(奥加诺株式会社制)、SA10A、SA12A、SA11A、NSA100、UBA120(均匀粒径制品)、PA306S、PA308、PA312、PA316、PA318L、HPA25、SA20A、SA21A、PA408、PA412、PA418、WA10、WA20、WA21J、WA30(三菱化学公司制)等。碱性阴离子交换树脂优选预先使用碱性水溶液及水进行处理。作为用于处理的碱性水溶液，优选例如1M的氢氧化钠水溶液等。

蜂蜜水溶液优选调节为碱性(pH8～9)。pH的调节可通过向蜂蜜水溶液中添加氨水等碱性水溶液来进行。

作为(e’)工序中使用的酸性水溶液，可使用例如盐酸、磷酸、乙酸、柠檬酸等pH2～3的水溶液。酸性水溶液可含有乙醇。要经由(e’)工序洗脱的吸附成分优选为不被水洗脱的成分。例如，在(e’)工序之前使用水洗脱(d’)工序中得到的吸附成分，从吸附成分中除去被水洗脱的成分，由此能够使要经由后续(e’)工序洗脱的吸附成分为不被水洗脱的成分。

(f’)工序中，蜂蜜组分可通过例如除去碱性水溶液级分中的溶剂而得到。溶剂的除去可通过例如冷冻干燥、加热干燥进行。

上述(d)工序中，可在使蜂蜜与酸性吸附材料接触前，通过实施与上述(d’)及(e’)工序同样的工序而预先对蜂蜜进行分离。即，(d)工序中，可以在经过使蜂蜜与碱性吸附材料接触而得到被碱性吸附材料吸附的吸附成分的工序、和利用酸性水溶液洗脱吸附成分而得到酸性水溶液级分的工序后，使该酸性水溶性级分与酸性吸附材料接触，从而得到被酸性吸附材料吸附的吸附成分。

反之，上述(d’)工序中，可在使蜂蜜与碱性吸附材料接触前，通过实施与上述(d)及(e)工序同样的工序而预先对蜂蜜进行分离。即，(d’)工序中，可以在经过使蜂蜜与酸性吸附材料接触而得到被酸性吸附材料吸附的吸附成分的工序、和利用碱性水溶液洗脱吸附成分而得到碱性水溶液级分的工序后，使该碱性水溶性级分与碱性吸附材料接触，从而得到被碱性吸附材料吸附的吸附成分。这样，经过与不同种类的吸附材料接触的工序，从而能够得到镇咳活性更高的蜂蜜组分。

本实施方式中使用的蜂蜜的来源不受特别限定，可使用任意的种类的蜂蜜。作为蜂蜜，可举出例如百花蜂蜜、金合欢蜂蜜、荞麦蜂蜜、甘露蜂蜜等。蜂蜜的产地不受特别限定。

本实施方式涉及的蜂蜜组分具有高镇咳活性。具体而言，通过摄取本实施方式涉及的蜂蜜组分，能够预防或抑制咳嗽。因此，本实施方式涉及的蜂蜜组分可作为镇咳剂使用，镇咳剂也可作为咳嗽预防剂或咳嗽抑制剂进行使用。

上述的本实施方式还涵盖用于镇咳的蜂蜜组分。另外，本实施方式还涵盖用于镇咳用途的、含有蜂蜜组分作为有效成分的试剂。另外，本实施方式还涵盖蜂蜜组分在镇咳剂的制造中的用途。

上述的本实施方式还涵盖镇咳方法，上述方法包括将有效量的蜂蜜组分施予至需要上述蜂蜜组分的对象的步骤。可根据蜂蜜组分的分离方法等对施予量进行适宜设定，例如，对于体重为60kg的成人，可以为每日0.01mg～100g以下。对象优选为哺乳动物，更优选为人。

咳嗽通过刺激咳嗽受体而被诱发。可认为咳嗽受体有Aδ纤维的快速适应受体和C-纤维受体。本实施方式涉及的蜂蜜组分如后述的实施例中所示的那样，针对各种各样的因素引起的任意种类的咳嗽均具有镇咳作用。

本实施方式涉及的蜂蜜组分具有类阿片活性。具体而言，本实施方式涉及的蜂蜜组分具有的生理作用的至少一部分如后述的实施例中所示的那样，是经由阿片类受体而发挥的作用(类阿片活性)所导致的。因此，本实施方式涉及的蜂蜜组分可以作为类阿片活性剂使用。

上述的本实施方式还涵盖用于类阿片的活性用途的蜂蜜组分。另外，本实施方式还涵盖用于类阿片的活性用途的、含有蜂蜜组分作为有效成分的试剂。另外，本实施方式还涵盖蜂蜜组分在类阿片活性剂的制造中的用途。

上述的本实施方式还涵盖基于类阿片活性的方法，上述方法包括将有效量的蜂蜜组分施予至需要上述蜂蜜组分的对象的步骤。可根据蜂蜜组分的分离方法等对施予量进行适宜设定，例如，对于体重为60kg的成人，可以为每日0.001mg～100g以下。对象优选为哺乳动物，更优选为人。

对于类阿片活性而言，已知其除了镇咳活性以外，还与镇痛、麻醉、情绪、呼吸、脉动、体温、消化道功能、摄食、免疫、激素(胰岛素、促生长素抑制素等)的分泌调节、电解质的吸取促进、心肌的收缩调节等相关(参考文献：山口重树，“オピオイド鎮痛薬の作用機序(类阿片镇痛药的作用机制)”，Anet，Vol.18，No.3，12-15页，2014，日本特开平6-128287号公报)。因此，本实施方式涉及的含有蜂蜜组分作为有效成分的类阿片活性剂还可以作为例如镇咳剂、镇痛剂、麻醉剂、情绪调节剂、呼吸调节剂、脉动调节剂、体温调节剂、消化道功能调节剂、摄食调节剂、免疫提高剂、激素分泌调节剂、电解质吸取促进剂、心肌收缩调节剂等使用。本实施方式涉及的蜂蜜组分尤其优选作为镇咳剂或镇痛剂使用。

本实施方式涉及的类阿片活性剂、镇咳剂、镇痛剂、其他的上述试剂可以仅含有作为有效成分的蜂蜜组分，只要不损害镇咳效果、镇痛效果等上述生理作用，则也可以含有溶剂及其他的成分。作为其他的成分，例如，可举出药学上允许的添加剂(赋形剂、粘合材料、润滑剂、崩解剂、乳化剂、表面活性剂、基剂、助溶剂、悬浮剂等)、作为食品而允许的成分(例如，矿物质类、维生素类、类黄酮类、醌类、多酚类、氨基酸、核酸、必需脂肪酸、清凉剂、粘合剂、甜味剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、香料、稳定剂、防腐剂、缓释调节剂、表面活性剂、溶解剂、湿润剂)。

本实施方式涉及的类阿片活性剂、镇咳剂、镇痛剂、其他的上述试剂中含有的蜂蜜组分的比例只要为可得到本发明的效果的范围即可，可根据最终形态等进行适宜调节，可以例如以总量计为0.000001～100质量％的范围。

本实施方式涉及的蜂蜜组分、类阿片活性剂、镇咳剂、镇痛剂、其他的上述试剂可以是固体、液体、糊剂等任意的形状，也可以是片剂(包括无包衣片、糖衣片、泡腾片、薄膜衣片、咀嚼片、锭剂等)、胶囊剂、丸剂、粉末剂(散剂)、细粒剂、颗粒剂、液剂、悬浊液、乳浊液、糖浆、糊剂、注射剂(包括在使用时配合到蒸馏水或氨基酸输注液或电解质输注液等输注液中而制备成液剂的情况)等剂型。对于以上各种制剂而言，例如，可通过将作为有效成分的蜂蜜组分与需要的其他成分混合并成型为上述剂型而制备。

本实施方式涉及的蜂蜜组分可作为医药品及食品本身来使用，也可添加在医药品及食品中而进行使用。作为食品，优选为突出了食品的第三功能(即，调节身体状况的功能)的食品。作为调节身体状况的功能，例如，可举出镇咳功能、镇痛功能、麻醉功能、情绪调节功能、呼吸调节功能、脉动调节功能、体温调节功能、消化道功能调节功能、摄食调节功能、免疫提高功能、激素分泌调节功能、电解质的吸取促进功能、心肌的收缩调节功能等。作为突出了食品的第三功能的食品，可举出例如健康食品、功能性食品、营养辅助食品、补充剂及特定保健用食品。

由本实施方式涉及的蜂蜜组分组成的医药品或食品、或者包含本实施方式涉及的蜂蜜组分的医药品或食品可以用于下述用途：镇咳用途、镇痛用途、麻醉用途、情绪调节用途、呼吸调节用途、脉动调节用途、体温调节用途、消化道功能调节用途、摄食调节用途、免疫提高用途、激素分泌调节用途、电解质的吸取促进用途、心肌的收缩调节用途等。另外，上述医药品或食品也可以附有以下内容的标示：镇咳、镇痛、具有麻醉作用、调节情绪、调节呼吸、调节脉动、调节体温、调节消化道功能、调节摄食、提高免疫、调节激素分泌、促进电解质的吸取、调节心肌的收缩等。

将本实施方式涉及的蜂蜜组分添加至食品(例如，健康食品、功能性食品、营养辅助食品或特定保健用食品)中而进行使用的情况下，食品的形态不受特别限定，可以为例如饮料类(咖啡、果汁、茶饮料等清凉饮料、乳饮料、乳酸菌饮料、酸奶饮料、碳酸饮料等)；涂抹酱类(卡士达酱(custard cream)等)；糊类(果泥等)；西点类(巧克力、面包圈、馅饼(pie)、泡芙、口香糖、果冻(jelly)、糖果、曲奇、蛋糕、布丁等)；日式点心类(糯米团、年糕、有馅面点(日文：饅頭)、长崎式蜂蜜蛋糕(日文：カステラ)、Anmitsu式甜点、羊羹等)；冰点类(冰淇淋、冰棒、冰霜(sherbet)等)；食品类(咖喱、牛肉饭、杂烩粥、味噌汤、汤、肉酱(meatsauce)、意大利面、腌菜、果酱等)；调味料类(调味汁、拌饭调味料(日文：ふりかけ)、鲜味调味料、汤料等)。

添加有本实施方式涉及的蜂蜜组分的医药品或食品的制法不受特别限定，可以基于适当的已知方法进行。例如，可以通过向医药品或食品的制造工序中的中间产品或最终产品中混合本实施方式涉及的蜂蜜组分等方式，来获得用于上述用途的医药品或食品。

实施例

以下，基于实施例对本发明的实施方式具体地进行说明。本发明不限于以下的实施例。

[试验例1]

对各种蜂蜜针对由各种刺激诱发咳嗽的豚鼠的作用进行了研究。

(试验例1-1.柠檬酸刺激)

为了研究蜂蜜针对经由δ纤维的快速适应受体(RARs)的咳嗽的作用，对蜂蜜针对使用刺激RARs的柠檬酸诱发的咳嗽的镇咳作用进行了调查。

以每1kg豚鼠体重为1g蜂蜜的比例(以下记为1g/kg等)，向正常豚鼠胃内施予罗马尼亚产金合欢蜂蜜或日本产荞麦蜂蜜。各蜂蜜以溶解于水中的形态进行胃内施予。在施予30分钟后喷雾柠檬酸(0.1M)5分钟，计数自刚刚开始喷雾后30分钟期间的咳嗽反射的次数。作为对照，除了使用水或右美沙芬(DM)水溶液(DM 100mg/kg)代替蜂蜜水溶液以外，通过与上述同样的方法利用柠檬酸诱发咳嗽，计数咳嗽反射的次数。将结果示于图1。通过1g/kg的金合欢蜂蜜或荞麦蜂蜜的施予，与仅施予水时相比，咳嗽的次数显著减少。

(试验例1-2.辣椒素刺激)

使用经由C-纤维诱发咳嗽的辣椒素，对蜂蜜的镇咳作用进行了调查。向正常豚鼠胃内施予金合欢蜂蜜水溶液(蜂蜜比例为0.1g/kg、0.3g/kg或1g/kg)。在施予30分钟后喷雾辣椒素(10^-5M)5分钟，计数之后30分钟期间的咳嗽反射的次数。作为对照，使用了水或DM水溶液(100mg/kg)代替蜂蜜水溶液。将结果示于图2。通过1g/kg的金合欢蜂蜜的施予，呈现了与DM(100mg/kg)几乎等同的镇咳效果。另外，显示出蜂蜜的镇咳作用为浓度依赖性的结果。

(试验例1-3.烟草烟雾刺激)

使用向豚鼠的气管内施予烟草烟雾提取液(CSE)1周而诱导了气管炎症的豚鼠，仅使用金合欢蜂蜜作为蜂蜜，除此以外，通过与上述试验例1-1同样的方法，利用柠檬酸刺激诱发豚鼠咳嗽，对蜂蜜的镇咳作用进行了调查。将结果示于图3。同时也示出了未进行CSE施予的健康豚鼠的咳嗽次数。通过1g/kg的金合欢蜂蜜的施予，呈现了与DM(100mg/kg)几乎等同的镇咳效果。

(试验例1-4.二氧化硫刺激)

使用暴露于二氧化硫的豚鼠(已知其呈现黏液储留亢进、该敏感性的亢进及嗜中性粒细胞浸润之类的亚急性气管炎症特征性病症)，对蜂蜜针对由柠檬酸刺激诱发的咳嗽的作用进行了调查。使用暴露于二氧化硫1周的豚鼠，除了使蜂蜜施予比例为0.1g/kg、0.3g/kg或1g/kg以外，通过与上述试验例1-1同样的方法，利用柠檬酸刺激诱发豚鼠咳嗽，对蜂蜜的镇咳作用进行了调查。将结果示于图4。通过1g/kg的施予，金合欢蜂蜜及荞麦蜂蜜呈现了与DM(100mg/kg)几乎等同的镇咳效果。

(试验例1-5.卵清白蛋白)

为了研究针对以咳嗽气喘、特应性咳嗽等为代表的嗜酸性粒细胞性炎症时的咳嗽的作用，利用卵清白蛋白(OVA)致敏来制备支气管哮喘模型，与上述试验例1-1同样地利用柠檬酸刺激诱发咳嗽，对蜂蜜的镇咳作用进行了调查。作为支气管哮喘模型，经由左耳廓皮下施予OVA，仅使用过敏性反应为阳性的个体进行试验。将结果示于图5。通过1g/kg的金合欢蜂蜜的施予，呈现了较DM(100mg/kg)而言更高的镇咳效果。

(试验例1-6)

向正常豚鼠分别胃内施予甘露蜂蜜(0.8g/kg)及金合欢蜂蜜(1g/kg)。各蜂蜜以溶解于水中的形态进行胃内施予。与试验例1-1同样地，在施予30分钟后喷雾柠檬酸(0.1M)5分钟，计数自刚刚开始喷雾后30分钟期间的咳嗽反射的次数。作为对照，使用了水代替蜂蜜水溶液。将结果示于图6。确认到甘露蜂蜜具有与金合欢蜂蜜等同的镇咳活性。

[试验例2]

(试验例2-1)

量取100.00g金合欢蜂蜜，溶解于2L水中制备蜂蜜水溶液。使蜂蜜水溶液缓缓流过填充有Diaion HP-20(三菱化学公司制)的柱(φ5×31cm，500mL)5次，回收未吸附成分作为水级分。在上述柱中，分别依次流过2L的50％甲醇水溶液、甲醇、丙酮，作为50％甲醇级分(16.86g)、甲醇级分(98.33mg)、丙酮级分(52.03mg)而回收(括弧内表示各级分中的除去溶剂后的蜂蜜组分的量，以下同样)。将水级分冷冻干燥并测量重量，结果，水级分中的除水以外的蜂蜜组分量为73.1g。

将溶解于水中的各蜂蜜组分以相当于1g/kg蜂蜜的量胃内施予至正常豚鼠。在施予30分钟后喷雾柠檬酸(0.1M)5分钟，计数自刚刚开始喷雾后30分钟期间的咳嗽反射的次数。作为对照，使用了水或DM水溶液(0.3mg/kg DM)代替蜂蜜组分水溶液。将结果示于图7(平均±标准偏差，n＝5～6，＊＊＊：p＜0.0001(相对于对照))。确认到0.52mg/kg的丙酮级分具有相当于0.3mg/kg的DM的明确的镇咳效果。与分离前的蜂蜜比较，丙酮级分中的蜂蜜组分的比活性为1,923倍。

(试验例2-2)

量取200.00g金合欢蜂蜜，将其溶解于4L水中制备蜂蜜水溶液。使蜂蜜水溶液缓缓流过填充有Diaion HP-20的柱(φ5×31cm，500mL)5次后，使分别为4L的50％甲醇水溶液、甲醇依次流过该柱，作为50％甲醇级分(30.54g)、甲醇级分(41.56mg)而回收。进而在上述柱中流过4L丙酮，按照各洗脱时间来分取丙酮级分。

针对得到的各丙酮级分中的蜂蜜组分实施薄层色谱分析。使用Silica Gel60F254平板(0.5mm)，将10mg各试样溶解于1mL丙酮中，进行点样。使用己烷/乙酸乙酯的混合比为4/1的溶剂进行展开，干燥后，在平板上喷雾茴香醛硫酸试液，于105℃加热使其显色。茴香醛硫酸试液使用将13mL对茴香醛、5mL乙酸及478mL乙醇混合后滴入浓硫酸18mL而制得的试液。蜂蜜组分的展开谱图分成3种，因此，各自按洗脱时间依次设为丙酮级分1(27.8mg)、丙酮级分2(51.4mg)、丙酮级分3(9.89mg)。将丙酮级分整体及丙酮级分1～3的展开结果示于图8。丙酮级分1的特征为：至少具有Rf值为0.08、0.47、0.52、0.59的斑点，且Rf值为0.59的斑点显色比0.52的斑点更浅。丙酮级分2的特征为：至少具有Rf值为0.52及0.59的斑点，Rf值为0.59的斑点显色最深。丙酮级分3的特征为条带(lane)整体的显色浅。

对于丙酮级分1～3，将从各级分中除去溶剂得到的蜂蜜组分溶解于水中，向正常豚鼠胃内施予相当于1g/kg蜂蜜的量的各组分。在施予30分钟后喷雾柠檬酸(0.1M)5分钟，计数自刚刚开始喷雾后30分钟期间的咳嗽反射的次数。作为对照，使用了水代替蜂蜜组分水溶液。将结果示于图9。确认到丙酮级分1(0.14mg/kg)具有高镇咳活性。与分离前的蜂蜜比较，丙酮级分1中的蜂蜜组分的比活性为7,143倍。

对于甲醇级分及丙酮级分1、2，在下述条件下，利用LCMS(Waters MictomassQuattro Premium(Waters公司制))进行分析。柱使用了Acquity UPLC BFH C18(φ2.1×100mm，Waters公司制)。流动相使用0.05％甲酸水溶液(A)、100％乙腈(B)，梯度为5％B(0-0.25分钟)、5-100％B(0.25-10分钟，线性梯度)、100％B(10-12分钟)、5％B(12-15分钟)。进样量为2μl，流速为0.4ml/分钟，柱温为40℃，于UV295.8nm进行检测。另外，利用下述条件检测分子离子峰。

MS检测法：SIR

模式：正离子模式m/z(cone)：93.2(10)、239.1(10)、255.4(30)、257.1(30)、438.5(30)、585.3(30)，负离子模式m/z(cone)：112.9(30)、175.0(30)、253.2(30)、255.2(30)、285.6(30)、449.8(30)、577.8(30)

将针对各级分得到的图谱示于图10(a)、图10(b)、及图10(c)。仅镇咳活性高的丙酮级分1于2.8分钟的保留时间具有295.8nm的紫外线吸收，且包含具有m/z438[M+H]及m/z436[M-H]的分子离子峰的峰。另外，丙酮级分1及丙酮级分2中含有较多的保留时间为5.7分钟的柯因。

(试验例2-3)

量取200.00g金合欢蜂蜜，与上述试验例2-2同样地，使蜂蜜水溶液缓缓流过填充有Diaion HP-20的柱5次后，使分别为4L的50％甲醇水溶液、甲醇依次流过该柱。进而在上述柱中流过4L丙酮，自洗脱时间早的级分开始依次回收10瓶(各100mL)，继而回收3瓶(各1000mL)。将得到的级分分别设为丙酮级分1-1～1-10、丙酮级分2(50.59mg)、丙酮级分3(5.09mg)、丙酮级分4(3.48mg)。针对丙酮级分1-1～1-10，除去溶剂而得到各蜂蜜组分。

针对从丙酮级分1-1～1-10中得到的蜂蜜组分进行薄层色谱分析。使用SilicaGel60F254平板(0.5mm)，将10mg各试样溶解于1mL丙酮中，各点样2次。使用氯仿/甲醇/乙酸的混合比为9/1/1的溶剂进行展开，干燥后，在平板上喷雾碘化铋钾试液使其显色。碘化铋钾试液使用了通过混合下述试剂制得的试液：将1.7g次硝酸铋、20mL乙酸及80mL蒸馏水混合制得的混合液(5mL)；将40g碘化钾及100mL蒸馏水混合制得的混合液(5mL)；20mL乙酸；以及70mL蒸馏水。关于各试样，将确认到显色的斑点的Rf值示于表1。丙酮级分1-7、1-8、1-9、1-10具有Rf值为0、0.74的斑点。丙酮级分1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6具有Rf值为0.74的斑点，但原点(Rf值0)处不具有斑点。之后的研究中，将展现相同趋势的展开谱图的丙酮级分1-1～1-6这6种级分(丙酮级分1-1-6(1.82mg))、及1-7～1-10这4种级分(丙酮级分1-7-10(21.72mg))合并进行使用。

[表1]

将从丙酮级分1-1-6、1-7-10、及丙酮级分1-1～1-10的混合物(丙酮级分1)中得到的各蜂蜜组分以相当于2g/kg蜂蜜的量分别胃内施予至正常豚鼠，通过与试验例2-2同样的方法对镇咳作用进行调查。作为对照，使用了水或DM水溶液(100mg/kg DM)代替蜂蜜组分水溶液。将结果示于图11(＊：p＜0.01)。确认到丙酮级分1-7-10(0.217mg/kg)具有高镇咳活性。与分离前的蜂蜜比较，丙酮级分1-7-10中的蜂蜜组分的比活性为4,630倍。另外，与试验例2-2同样地进行LCMS分析时，丙酮级分1-7-10于2.8小时的保留时间具有295.8nm的紫外线吸收，且包含具有m/z438[M+H]及m/z436[M-H]的分子离子峰的峰，但丙酮级分1-1-6未包含该峰。

(试验例2-4)

量取200.00g金合欢蜂蜜，将其溶解于4L水中制备蜂蜜水溶液。使蜂蜜水溶液缓缓流过填充有Diaion HP-20的柱(φ5×31cm，500mL)5次后，流过4L的50％乙醇。进而，在该柱中流过4L乙醇，每次2L地依次回收后，流过4L丙酮，每次回收1L，分别作为50％乙醇级分(34.24g)、乙醇级分1(23.14mg)、乙醇级分2(12.71mg)、丙酮级分1(16.86mg)、丙酮级分2(26.82mg)、丙酮级分3-4(6.79mg)而回收。

将从所得各级分中除去溶剂得到的蜂蜜组分溶解于水中，向正常豚鼠分别胃内施予相当于1g/kg蜂蜜的量的各蜂蜜组分，在施予30分钟后喷雾柠檬酸(0.1M)5分钟，计数自刚刚开始喷雾后30分钟期间的咳嗽反射的次数。对于乙醇级分2(0.62mg/kg)及丙酮级分1(0.07mg/kg)而言，镇咳效果虽比DM水溶液(100mg/kg)弱，但确认到了其镇咳效果(图中未示出)。

[试验例3]

(试验例3-1)

使用16.96mg上述试验例2中得到的丙酮级分1-7-10，进行HPLC分取。柱使用了Cosmosil 5C-18-AR-II(φ20mm×250mm，Nacalai Tesque)。流动相使用0.1％TFA水溶液(A)和乙腈(B)，梯度为50％B(0-5分钟)、50-100％B(5-55分钟，线性梯度)、100％B(55-65分钟)、50％B(65-75分钟)。流速为10ml/分钟，柱温为40℃，进样量为50μl，于UV245nm进行检测。分别回收保留时间为0～25分钟(HPLC级分1，1.71mg)、25～54分钟(HPLC级分2，3.88mg)、54分钟(HPLC级分3，1.84mg)、54～75分钟(HPLC级分4，4.89mg)的级分。

针对得到的级分，利用2种方法进行薄层色谱分析。使用Silica Gel60F254平板(0.5mm)，将10mg各试样溶解于1mL丙酮中，各点样1次。作为第一种方法，使用氯仿/甲醇/乙酸的混合比为9/1/0.3的溶剂进行展开，干燥后，与试验例2-3同样地在平板上喷雾碘化铋钾试液使其显色。关于各试样，将确认到显色的斑点的Rf值示于表2。将关于丙酮级分1的结果一并示出。HPLC级分1中，于Rf值0～0.03及0.56确认到显色的斑点。HPLC级分2及3中，未观察到Rf值为0～0.03的斑点。

[表2]

作为第二种方法，将与上述同样地点上了试样的平板，使用氯仿/甲醇/水的混合比为1/1/0.3的溶剂进行展开，干燥后，在平板上喷雾茚三酮试剂，于105℃加热使其显色。关于各试样，将确认到显色的斑点的Rf值示于表3。HPLC级分1中，确认到Rf值为0.06、0.44、0.47及0.62的显色斑点。

[表3]

将从HPLC级分1～4、及试验例2-3的丙酮级分1-7-10中得到的各蜂蜜组分分别以相当于2g/kg蜂蜜的量胃内施予至正常豚鼠，通过与试验例2-2同样的方法对镇咳作用进行了考察。作为对照，使用了水代替蜂蜜组分水溶液。将结果示于图12。确认到HPLC级分1(0.017mg/kg)具有高镇咳活性。与分离前的蜂蜜比较，HPLC级分1中的蜂蜜组分的比活性为58,824倍。另外，与试验例2同样地进行LCMS分析时，HPLC级分1于2.8分钟的保留时间具有295.8nm的紫外线吸收，且包含具有m/z438[M+H]及m/z436[M-H]的分子离子峰的峰。

(试验例3-2)

使用14.56mg试验例2-3中得到的丙酮级分1-7-10，除了变更分取的保留时间以外，以与试验例3-1同样的条件进行HPLC分取。回收保留时间为0～4分钟(HPLC级分1’，0.29mg)、4～9分钟(HPLC级分2’，1.73mg)、9～12分钟(HPLC级分3’，0.32mg)、12～19分钟(HPLC级分4’，0.91mg)、20分钟(HPLC级分5’，0.70mg)、20～23分钟(HPLC级分6’，1.27mg)、23～26分钟(HPLC级分7’，0.79mg)的级分。

针对得到的级分进行薄层色谱分析。使用Silica Gel60F254平板(0.5mm)，将10mg各试样溶解于1mL丙酮中，各点样2次。使用氯仿/甲醇/水的混合比为1/1/0.3的溶剂进行展开，干燥后，在平板上喷雾与试验例3-1中所使用的茚三酮试剂同样的试剂，于105℃加热使其显色。关于各试样，将确认到显色的斑点的Rf值示于表4。HPLC级分1’中，确认到Rf值为0.05、0.12及0.51的显色斑点。

[表4]

将从HPLC级分1’～7’中得到的各蜂蜜组分以相当于2g/kg蜂蜜的量分别胃内施予至正常豚鼠，通过与试验例2-2同样的方法对镇咳作用进行了调查。作为对照，使用了水代替蜂蜜组分水溶液。将结果示于图13。确认到HPLC级分1’(0.0029mg/kg)具有高镇咳活性。与分离前的蜂蜜比较，HPLC级分1’中的蜂蜜组分的比活性为322828倍。

[试验例4]

(试验例4-1)

使用55mL的0.2M氨水及80mL水将90.00g金合欢蜂蜜稀释，制备pH9的蜂蜜水溶液，使其流过填充有使用1M氢氧化钠水溶液及水处理后的强碱性阴离子交换树脂(II型IRA910CT CL，φ3×13cm，90mL，奥加诺株式会社制)的柱。分别使离子交换水(1080mL)及1M盐酸(360mL)依次流过该柱。回收1M盐酸级分，使其流过填充有使用1M盐酸及水处理后的强酸性阳离子交换树脂(200CTNA，φ2×15.5cm，45mL，奥加诺株式会社制)的柱。在该柱中分别依次流过离子交换水(180mL)及1M氨水(180mL)，回收1M氨水级分(30.76mg)。针对相当于1g/kg蜂蜜的量的所得各级分，通过与试验例2-2同样的方法对镇咳作用进行了调查，结果，确认到1M氨水级分具有强镇咳活性(图14)。与分离前的蜂蜜比较，1M氨水级分中的蜂蜜组分的比活性为3,030倍。

针对试验例4-1中得到的1M氨水级分，在与试验例2-2同样的条件下进行LCMS分析。1M氨水级分于2.8分钟的保留时间具有295.8nm的紫外线吸收，且包含具有m/z438[M+H]及m/z436[M-H]的分子离子峰的峰。

(试验例4-2)

将金合欢蜂蜜40.00g使用离子交换水(60mL)稀释，制备pH4的蜂蜜水溶液，使其流过填充有使用1M盐酸及水处理后的强酸性阳离子交换树脂(200CTNA，φ2×14.5cm，43mL，奥加诺株式会社制)。分别使离子交换水(344mL)、0.5M氨水(172mL)及1M氨水(172mL)依次流过该柱，回收0.5M氨水级分(1.94mg)及1M氨水级分(62.5mg)。针对相当于1g/kg蜂蜜的量的所得各级分，通过与试验例2-2同样的方法对镇咳作用进行了调查，结果，确认到2种级分均具有强镇咳活性(图中未示出)。

[试验例5]

(试验例5-1)

为了研究蜂蜜的镇咳作用是否经由阿片类受体，针对纳洛酮对于蜂蜜的镇咳作用的影响进行了考察。

使用暴露于二氧化硫的豚鼠，利用柠檬酸(0.1M)诱发咳嗽。将该豚鼠分成下述组来测定咳嗽次数：胃内施予金合欢蜂蜜(1g/kg)或试验例2-1中得到的丙酮级分(0.7mg/kg)的组；在向腹腔内施予纳洛酮(0.3mg/kg)30分钟后，胃内施予金合欢蜂蜜(1g/kg)或上述丙酮级分(0.7mg/kg)的组；及仅施予了水的组(对照)。结果，与对照相比，施予了蜂蜜或丙酮级分的组发生咳嗽的次数显著减少。另一方面，在施予纳洛酮后施予了蜂蜜或丙酮级分的组中，咳嗽次数与对照为相同程度(图15)。

(试验例5-2)

除了将蜂蜜(1g/kg)或丙酮级分(0.7mg/kg)替换为试验例3-2中得到的HPLC级分1’(0.0029mg/kg)以外，通过与试验例5-1同样的方法，针对纳洛酮对于镇咳作用的影响进行了考察。结果，在向腹腔内施予纳洛酮(0.3mg/kg)30分钟后胃内施予HPLC级分1’的组中，确认到镇咳作用与未合用纳洛酮时相比减弱的趋势(图中未示出)。

由于蜂蜜的镇咳作用因作为阿片类受体拮抗剂的纳洛酮的腹腔内施予而消失，因此表明蜂蜜的镇咳作用的至少一部分经由阿片类受体而发挥作用。

Claims

1.蜂蜜组分，其通过包括下述工序的方法得到：

(a)使蜂蜜与吸附材料接触，得到吸附成分的工序；

(b)使用有机溶剂洗脱所述吸附成分而得到有机溶剂级分的工序，所述有机溶剂为丙酮、乙酸乙酯或乙醇；和

(c)从所述有机溶剂级分中得到蜂蜜组分的工序。

2.如权利要求1所述的蜂蜜组分，其中，要经由(b)工序洗脱的所述吸附成分为不被水或甲醇洗脱的成分。

3.如权利要求1或2所述的蜂蜜组分，其中，所述有机溶剂为丙酮。

4.如权利要求1～3中任一项所述的蜂蜜组分，其中，在(b)工序之前，还包括从所述吸附成分中除去被水洗脱的成分的工序。

5.如权利要求1～4中任一项所述的蜂蜜组分，其中，在(b)工序之前，还包括从所述吸附成分中除去被甲醇、甲醇水溶液或乙醇水溶液洗脱的成分的工序。

6.如权利要求1～5中任一项所述的蜂蜜组分，其中，(b)工序还包括选自由(b-1)工序、(b-2)工序及(b-3)工序组成的组中的至少一道工序，

(b-1)得到以下组分作为所述有机溶剂级分的工序：根据洗脱时间对被所述有机溶剂洗脱的所述吸附成分进行分离，在使用了硅胶的薄层色谱法中，使用己烷/乙酸乙酯的混合比为4/1的溶剂进行展开时，所述组分具有利用茴香醛硫酸试液显色的Rf值为0.49～0.55的斑点及显色比该斑点更浅的Rf值为0.56～0.62的斑点；

(b-2)得到以下组分作为所述有机溶剂级分的工序：根据洗脱时间对被所述有机溶剂洗脱的所述吸附成分进行分离，在使用了硅胶的薄层色谱法中，使用氯仿/甲醇/乙酸的混合比为9/1/1的溶剂进行展开时，所述组分具有利用碘化铋钾试液显色的Rf值为0及0.54～0.94的斑点；

(b-3)得到以下组分作为所述有机溶剂级分的工序：根据洗脱时间对被所述有机溶剂洗脱的所述吸附成分进行分离，在液相色谱质谱分析法中以下述条件进行测定时，于2.0～4.0分钟的保留时间检测到所述组分，并且，所述组分包含具有m/z438[M+H]及m/z436[M-H]的分子离子峰的峰，

测定条件如下所示，

柱：Acquity UPLC BFH C18(φ2.1×100mm，Waters公司制)

流速：0.4ml/分钟

柱温：40℃

A：0.05％甲酸水溶液、B：100％乙腈

进样量：2μl。

7.如权利要求6所述的蜂蜜组分，其中，(b)工序还包括下述工序：

(b-4)利用反相吸附材料进一步对经由(b-2)工序得到的组分进行分离，得到满足下述(1)及(2)中至少一个条件的组分作为所述有机溶剂级分的工序，

(1)在使用了硅胶的薄层色谱法中，使用氯仿/甲醇/乙酸的混合比为9/1/0.3的溶剂进行展开时，所述组分具有利用碘化铋钾试液显色的Rf值为0～0.22的斑点；

(2)在使用了硅胶的薄层色谱法中，使用氯仿/甲醇/水的混合比为1/1/0.3的溶剂进行展开时，所述组分具有利用茚三酮试液显色的Rf值为选自由0.02～0.09、0.10～0.20及0.30～0.53组成的组中的至少一者的斑点。

8.蜂蜜组分，其通过包括下述工序的方法得到：

(d)使蜂蜜与酸性吸附材料接触，得到被所述酸性吸附材料吸附的吸附成分的工序；

(e)利用碱性水溶液洗脱所述吸附成分，得到碱性水溶液级分的工序；和

(f)从所述碱性水溶液级分中得到蜂蜜组分的工序，

或者，所述蜂蜜组分通过包括下述工序的方法得到：

(d’)使蜂蜜与碱性吸附材料接触，得到被所述碱性吸附材料吸附的吸附成分的工序；

(e’)利用酸性水溶液洗脱所述吸附成分，得到酸性水溶液级分的工序；和

(f’)从所述酸性水溶液级分中得到蜂蜜组分的工序。

9.类阿片活性剂，其含有权利要求1～8中任一项所述的蜂蜜组分作为有效成分。

10.镇咳剂或镇痛剂，其含有权利要求1～8中任一项所述的蜂蜜组分作为有效成分。