CN107595826A

CN107595826A - 一种急性心衰动物模型及其在测定药物效价中的应用

Info

Publication number: CN107595826A
Application number: CN201710630256.4A
Authority: CN
Inventors: 王伽伯; 张定堃; 肖小河; 赵志浩
Original assignee: 302th Hospital of PLA
Current assignee: 302th Hospital of PLA
Priority date: 2017-07-28
Filing date: 2017-07-28
Publication date: 2018-01-19
Anticipated expiration: 2037-07-28
Also published as: CN107595826B

Abstract

本申请公开了一种用造模液制得的急性心衰动物模型，所述造模液为盐酸普罗帕酮与尼莫酮的混合溶液。该急性心衰动物模型具有起效快、稳定性好且可靠性高的特点。本申请还公开了该急性心衰动物模型在评价药物的强心效价或筛选强心活性成分中的用途。

Description

一种急性心衰动物模型及其在测定药物效价中的应用

技术领域

本申请涉及造模技术，尤指一种用造模液制得的急性心衰动物模型及其在测定药物强心活性效价或筛选强心活性组分中的应用。

背景技术

以附子为代表的乌头类中药具有明确的强心活性，被历代医家誉为“回阳救逆第一品药”、“药中四维”，广泛用于各种原因引起的急、慢性心衰的治疗。以附子为主要药物制成的现代中药制剂参附注射液、芪苈强心胶囊等，更是被国外严格的RCT试验证实临床疗效优于常规西药治疗方法，不但显著提高治疗效果，还能改善病人生活质量。因此，科学评价附子的强心活性，对于确保附子的临床疗效至关重要。

目前，关于附子的强心活性评价方法，主要有两类途径：一是直接测定强心成分的含量，二是在生物体上直接测定强心活性。然而，关于附子强心的物质基础，尚存在明显争议。以《中药药理学》教材为代表，认为水溶性生物碱，如去甲乌药碱、去甲猪毛菜碱、氯化甲基多巴胺为其强心成分；也有学者认为水溶性的尿嘧啶及附子苷也是强心成分；但这些成分含量极其微弱，分离及含量测定均较为困难。此外，尚有相当部分学者认为乌头碱类生物碱及其水解产物等脂溶性生物碱具有强心效果，上世纪末出版的权威著作《中华本草》也支持该论点；《中国药典》2010年版、2015年版也以单酯型生物碱苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱及苯甲酰次乌头原碱作为质量控制指标。然而，单酯型生物碱的强心作用缺乏直接、明确的药效学文献支撑。鉴于此，采用《中国药典》的标准评价附子的强心作用存在明显的不足。尽管采用高效液相技术、液质联用技术测定上述各类水溶性、脂溶性成分已不存在技术难题，但这些成分作用强度不同、作用靶点与机制不同、量效关系不明，而强心活性并非各种成分含量的测定结果的简单加和，如何整体、综合表征药物真实活性，是本领域一直存在的一个技术问题。

在化学评价与真实活性关联分析存在困难的条件下，采用生物评价方法则是更为可行、更加准确的途径。目前，强心效果的评价载体主要包括心肌细胞、离体心脏、在体心代细胞，分离、纯化、培养脏等方法。心肌细胞主要源于乳鼠，也有通过人源干细胞定向诱导分化得到的诱导多能干细胞(iPS细胞，induced pluripotent stem cells)；培养好的心肌细胞可以通过观察心肌搏动次数与幅度评价细胞的强心效果。但心肌细胞来源存在一定的技术难度，且细胞收率低，细胞状态不稳定，不易达到系统定量评价的要求。离体心脏主要来源于离体蛙心或蟾蜍，心肌灌流实验技术难度相对较低，但实验结果受供试品溶液所含离子浓度的影响较大，加之缺乏在体神经体液调节能力，实验结果的证据力明显不足。因此，采用基于整体动物在体心脏为载体的研究模型更为真实、准确、可靠。

成功的动物模型是科学评价药物强心效果的关键。尤其是急性心衰动物模型的制得具有造模时间短、疗效评估快的特点。目前，制得大鼠急性心衰模型，最常用的药物包括单独的戊巴比妥钠、尼莫地平、盐酸普罗帕酮等。然而，这些单独的造模药物均无法获得稳定、可靠的动物模型。

因此，亟需开发一种适合于乌头类中药的强心生物活性效价的测定的可靠且稳定的动物模型及基于此动物模型测定与计算乌头类中药强心生物活性效价的方法。

发明内容

发明人在研究中发现，戊巴比妥钠是中枢抑制剂，可作为催眠与麻醉药；但该药易引起心率失常，且容易抑制呼吸中枢，在造模过程中对剂量的控制要求较高，常常需要呼吸机配合使用；发明人在预试过程中也发现，2％戊巴比妥钠静脉注射1.0-1.2ml即可使大鼠左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)下降40％以上，但动物容易因呼吸抑制而突然死亡，死亡率高，死亡前征兆不明显。尼莫地平注射液是中枢降压药，为钙离子通道阻断剂，也有文献采用该药制得心衰模型，但发明人预试发现，尼莫地平有一定降低心肌收缩功能的效果，但很难将大鼠左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)下降一半以上，造模效果不理想。盐酸普罗帕酮注射液临床常用于阵发性室性心动过速的治疗，为钠离子通道阻断剂，能显著降低心率；预试发现，盐酸普罗帕酮降低心肌收缩力的作用较强，能在短时间内快速地使心功能下降一半以上，但该药存在一定问题，一是注射剂量过大易使动物死亡，二是造模停止后，心功能容易部分自发性恢复，干扰对药物疗效的判断。

为了解决上述技术问题，本申请提供了一种稳定可靠的急性心衰动物模型及其在评价强心类药物的强心效价或筛选强心活性成分中的应用。

为了达到本申请目的，本申请提供了一种用造模液制得的急性心衰动物模型，所述造模液为盐酸普罗帕酮与尼莫酮的混合溶液。

在以上或其他实施方式中，所述动物可以为大鼠、小鼠、家兔或犬。

在以上或其他实施方式中，所述动物可以为大鼠。

在以上或其他实施方式中，所述造模液可以为规格10ml：35mg的盐酸普罗帕酮注射液与规格50ml：10mg的尼莫酮注射液的体积比1：1-1.5的混合溶液。需要说明的是，规格10ml：35mg的盐酸普罗帕酮注射液与规格50ml：10mg的尼莫酮注射液均为普通的市售产品。

在以上或其他实施方式中，所述造模液可以为规格10ml：35mg的盐酸普罗帕酮注射液与规格50ml：10mg的尼莫酮注射液的体积比1：1的混合溶液。

另一方面，本申请提供以上或其他实施方式中所述的急性心衰动物模型在评价药物的强心效价或筛选强心活性成分中的用途。

又一方面，本申请提供一种评价药物的强心效价的方法，所述方法包括：

获得如以上或其他实施方式中所述的急性心衰动物模型；

向被造模的动物施用对照品溶液，检测给药后的左心室内压的最大上升速率+dp/dtmax，计算+dp/dtmax在15min内的RD恢复程度，作为强心效价的评价指标，计算公式如下：

公式中，(+dp/dt_max)₀为造模前的左心室内压最大上升速率，(+dp/dt_max)₁₅为恢复期第15分钟时的左心室内压最大上升速率；

向另外的被造模的动物施用药物供试品溶液，检测给药后的+dp/dtmax，计算+dp/dtmax在15min内的RD恢复程度，作为强心效价的评价指标，计算公式如下：

根据如下公式计算药物供试品的强心效价U_D：

其中U_S为对照品的强心效价。

在以上或其他实施方式中，所述对照品可以为西地兰注射液，且将1支装的0.4mg的对照西地兰注射液的强心效价U_S定义为1000U。

在以上或其他实施方式中，所述药物可以为乌头类中药。

在以上或其他实施方式中，所述药物可以选自黑顺片、白附片、蒸附片、炮天雄、炒附片、刨附片、炮附子、生附片、淡附片、黄附片、临江片(其是江西地区附子的一种特殊饮片形式)、挂附片、煨附片、盐附子、附子精标饮片、黑顺片精准饮片、黑顺片精制饮片、黑顺片配方颗粒、淡附片配方颗粒、川乌及其炮制品、草乌及其炮制品、参附注射液、参附强心丸、四逆汤、四逆汤配方颗粒中的一种。

在以上或其他实施方式中，所述药物可以为乌头类中药的药物组分，从而根据强心效价筛选强心组分。

在以上或其他实施方式中，当所述药物为乌头类中药片时，所述药物供试品溶液可以通过如下的方法来制备：

称取中药片，按以g计的中药片的重量与ml计的水的体积比为1：10的量添加水，回流煎煮3次，每次1小时，合并滤液，滤液在5000转/min下离心10min，收集上清液，添加水使得以ml计的最终溶液的体积为以g计的中药片的重量的30倍，即得。

本领域技术人员将理解的是，乌头类中药片的供试品溶液的制备也可以根据本领域已知的其他提取方法来制备。

本申请的技术方案实现了对附子饮片强心效价的直观、科学、准确、可靠、可重复的评价；并且，对于控制乌头类药物的质量、建立筛选强心物质的基础、建立减毒存效的炮制方法以及保障临床用药的有效性与可控性，具有重要意义，表现出非常好的实用性。

本申请的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本申请而了解。本申请的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

附图说明

附图用来提供对本申请技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请的技术方案，并不构成对本申请技术方案的限制。

图1为左心室插管手术过程及装置；

图2分别显示正常大鼠左心室内压(A)和心衰大鼠左心室内压(B)；

图3显示急性心衰大鼠+dp/dtmax的趋势图；

图4分别显示盐酸普罗帕酮单独造模对大鼠+dp/dtmax、LVEDP及HR的影响(A，B，C)以及尼莫酮单独造模对大鼠+dp/dtmax、LVEDP及HR的影响(D，E，F)；

图5分别显示盐酸普罗帕酮与尼莫酮注射液的1:1混合物对大鼠+dp/dtmax、LVEDP及HR的影响(A，B，C)，盐酸普罗帕酮与尼莫酮注射液的1:1.25混合物对大鼠+dp/dtmax、LVEDP及HR的影响(D，E，F)，以及盐酸普罗帕酮与尼莫酮注射液的1:1.5混合物对大鼠+dp/dtmax、LVEDP及HR的影响(G，H，I)；

图6分别显示模型组/生理盐水(A)、西地兰注射液(B)、黑顺片水煎液(C)及参附注射液(D)给药对心衰大鼠+dp/dtmax的影响；

图7显示煎煮次数对心衰大鼠+dp/dtmax的影响；

图8显示煎煮时间对心衰大鼠+dp/dtmax的影响；

图9分别显示生附片(A)、炮天雄(B)、白附片(C)、黑顺片(D)、炒附片(E)、蒸附片(F)、炮附子(G)、刨附片(H)与精标饮片(I)给药对心衰大鼠+dp/dtmax的影响；

图10分别显示乌头碱(A)、新乌头碱(B)、次乌头碱(C)、苯甲酰乌头原碱(D)、苯甲酰新乌头原碱(E)、苯甲酰次乌头原碱(F)、乌头原碱(G)、尼奥林(H)、附子灵(I)、宋果灵(J)、塔拉乌头胺(K)、去甲乌药碱(L)、去甲猪毛菜碱(M)给药对心衰大鼠+dp/dtmax的影响。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将结合附图对本申请的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。

实施例1：大鼠急性心衰模型造模剂的筛选

试药：盐酸普罗帕酮注射液，规格10ml：35mg，国药准字H44020249，广州白云山明兴制药有限公司；尼莫酮(尼莫地平注射液)，浓度50ml:10mg，Bayer Schering Pharma，产品批号BXG2EV1；肝素钠注射液，规格2ml：12500单位，国药准字H32022088，常州千红生化制药股份有限公司，产品批号090916；乌来糖(氨基甲酸乙酯)，化学纯，纯度≥98％，国药集团化学试剂有限公司；参附注射液，国药准字Z51020664，雅安三九药业有限公司；去乙酰毛花苷注射液(西地兰注射液)，国药准字H31021178，上海旭东海普药业有限公司；生理盐水，规格500ml：4.5g，国药准字H13023200，石家庄四药有限公司。

动物：SD大鼠，SPF级，雄性，6-10周龄，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，动物许可证号：No.SCXK-(A)2012-0004。动物饲养温度为20±0.5℃，湿度55±5％。

仪器：RM6240BD型多道生理信号采集处理系统记录仪(成都仪器厂)；无阻尼动脉导管、静脉插管、压力换能器、心电图导联；Sartorius-BS110S千分之一分析天平、十万分之一分析天平(德国赛多利斯公司)；文氏钳、眼科剪、弯镊、直镊、持针器、大鼠动脉夹、三通阀、手术缝合线、10ml注射器、圆底烧瓶；BYZ-810T注射泵(长沙比扬医疗器械有限公司)；ZDHW中兴调温电热套(北京中兴伟业仪器有限公司)；HC-3018R高速冷冻离心机(安徽中科中捷科学仪器有限公司)。

左心室插管手术方法：采用20％乌来糖生理盐水溶液(8ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定四肢，于颈部正中线纵向切开皮肤。分离左侧颈外静脉，大鼠动脉夹夹闭近心端，用眼科剪在静脉开口，打开动脉夹，向近心端方向插入静脉插管用于给予造模液或对照品溶液或药物供试品溶液，并用缝合线结扎固定。用文氏钳在呼吸肌正中偏右位置分离右侧颈总动脉约2cm，手术线结扎远心端，动脉夹夹闭近心端，经颈动脉朝近心端方向插入已注满肝素钠生理盐水(250单位/ml)的无阻尼动脉导管(无阻尼动脉导管是指该导管的阻尼系数可忽略，因为动脉导管的阻尼系数越小，表面越光滑，心室插管越容易、越顺畅。实验发现，无阻尼导管的使用是确保整个操作很重要的技巧)，松紧度应以不漏血且导管又能自由进出为度。轻轻松开动脉夹，左手将导管插入，当感到导管随心脏搏动明显时，放慢插管速度，此时可观察到动脉血在导管中小幅跳动，示波器显示明显的动脉压(动脉压波上沿一般高于90mmHg，下沿在50-80mmHg)，此时，导管已插入4cm左右。当显示器上的波形由血压波变为下沿达0mmHg附近具有明显舒张期而峰顶平坦的波形时，表明导管已插入左心室；通常会感到穿越主动脉瓣的力量变化，导管中的动脉血跳动幅度明显加大。再送入导管约0.2-0.3cm，若波形保持不变，则将导管固定于颈总动脉上。所有信号均同步记录在四通道生理记录仪上。实验前，须采用血压计对压力换能器定标校正。测定收集左心室内压前，扭转三通阀，关闭动脉导管，使换能器与大气联通，快速零点校正，即可记录数据。左心室插管过程及装置见图1。

评价指标的选择：左心室内压的最大上升速率(+dp/dtmax)为金指标，辅助观察心率(HR)、舒张压(LVEDP)的变化。正常大鼠的左心室内压波下沿一般为-3～-1mmHg，上沿一般为90～180mmHg，心率一般为320～400次/min；造成心力衰竭模型后，舒张压抬高，波下沿升高至2mmHg以上，波上沿降低至70mmHg，心率减慢(可慢至50次/min)，波间距变大。正常大鼠与心衰大鼠的左心室内压的示意图如图2所示。一般地，以+dp/dtmax下降40％以上认为造模成功；但在试验过程中发现，轻度急性心衰易恢复，故本申请以+dp/dtmax下降50％为造模成功标准。

造模效果与强心效果的评价参数：在线监测急性心衰大鼠+dp/dtmax的变化，其+dp/dtmax数值曲线会经历以下3个阶段：造模期、稳定期及恢复期(见图3)。在造模期，在插管手术后，通过静脉插管给予造模液后，其+dp/dtmax会快速大幅下降，当下降幅度超过50％时，停止给予造模液。进入观察期后，观察5min内+dp/dtmax数值是否明显上升；若上升幅度超过5％，则需再次给予少量造模药，再次观察，直至5min内数值稳定；若不明显上升，则可认为模型制造成功。给予强心药后，+dp/dtmax数值会立即上升，即进入恢复期。连续给药至少15min，观察+dp/dtmax数值随给药时间(剂量)的变化规律。

在三个不同的作用阶段，可采用以下参数评价。在造模期，采用造模液用量评价，其数值可直接从恒速泵中读出，也可用注射速度乘以造模时间计算得到。在稳定期，可采用稳定5min后的上升率评价，其数值为稳定期第5min时的+dp/dtmax数值与第0分钟数值的比值。在恢复期，观察15min内+dp/dtmax的恢复情况，计算15min内最大的恢复率(Maximumrestoration ratio,RRmax/％)与恢复程度(Restoration degree,RD/％)。上述参数的计算公式如下：

公式中，(+dp/dt_max)₀为造模前的左心室内压最大上升速率且其是在插管后但在给予造模液之前测的，(+dp/dt_max)_i为稳定5min后的初始左心室内压最大上升速率，(+dp/dt_max)₁₅为恢复期第15分钟时的左心室内压最大上升速率，(+dp/dt_max)_max为恢复期15分钟内的左心室内压最大上升速率的最大值。

造模条件研究：选取240±20g的雄性大鼠，考察造模药物种类对大鼠心衰程度及恢复程度的影响。按照上述方法麻醉、手术，以10ml/h速度分别通过静脉插管脉注射盐酸普罗帕酮、尼莫地平、及两者不同比例(它们相应的注射液的体积比1:1，1:1.25，1:1.5)的混合物，观察给药剂量对+dp/dtmax、LVEDP、HR的影响，筛选出最佳的造模剂类别。

盐酸普罗帕酮与尼莫酮注射液单独给予与混合给予的造模效果的比较：以+dp/dtmax为评价指标，从使+dp/dtmax下降50％的造模剂用量及稳定5min后的上升率为评价指标，比较各种造模条件的稳定性，结果见表1。盐酸普罗帕酮与尼莫酮注射液单独造模对心功能影响的代表性图谱见图4。由结果可知，注射盐酸普罗帕酮注射液后，+dp/dtmax数值快速下降，在第7min左右时，+dp/dtmax由6000mmHg/s下降到3000mmHg/s以下，但此后停止注射后，该数值又陆续上升，6min后上升幅度达30％，采用该方法造模不稳定，+dp/dtmax易上升，无法可靠稳定地用于强心效果的评价。同样地，注射盐酸普罗帕酮注射液后，舒张压开始上升，从-3mmHg上升到7mmHg作用，当停止给造模药后，又快速下降至0mmHg左右；而心率与+dp/dtmax的变化规律类似，也呈现出造模下降，停药上升的趋势。当造模药改为尼莫酮后，发现+dp/dtmax数值从7000mmHg左右下降到5000mmHg左右后，就很难再继续下降，一直造模给药21min，仍然不能使+dp/dtmax下降一半，无法达到造模要求。综上分析，盐酸普罗帕酮的造模特点是“剂量小、造模快、易恢复”，这可能与Na⁺通道是快通道有关，即阻断快，但恢复也快；而尼莫地平的造模特点是“剂量大、造模慢、恢复慢”，且难以达到造模要求，这可能与Ca²⁺是慢通道有关，即阻断慢，但恢复也慢。

因此，从图4可以看出，盐酸普罗帕酮具有降低心肌收缩功能、效果好、见效快，但效果不稳定、心肌收缩功能容易恢复反跳等不足，而尼莫酮(尼莫地平)具有降低心肌收缩功能效果稳定持久，但降低幅度小的不足。因此，两者单独使用制得的急性心衰模型效果均不可靠，考虑将两者联用，做进一步造模条件摸索。

表1盐酸普罗帕酮与尼莫酮对+dp/dtmax的影响(n＝5)

－表示未测出使+dp/dtmax下降一半的剂量，与盐酸普罗帕酮单独i.v.比较，*p<0.05，与尼莫酮单独i.v.比较，★p<0.05

盐酸普罗帕酮与尼莫酮注射液的混合液造模对心功能影响的代表性图谱见图5。由结果可知，采用混合液造模，既能快速使+dp/dtmax下降，又能在一定程度上抑制该数值的上升，显著优于单一造模剂的应用。此外，两者比例不同，造模效果也有差异。当两者以1:1混合时，造模最快，且造模效果相对最稳定；当两者的比例增大时，造模剂用量逐渐加大，但造模效果也并未随尼莫酮用量的增加而更加稳定。综上研究，当盐酸普罗帕酮与尼莫酮以1:1混合静注时，制得急性心衰的效果最好。

确定大鼠急性心衰模型的制造条件：取230-250g的雄性SD大鼠，20％乌拉坦腹腔注射麻醉，如上所述地进行插管手术，分别从颈外静脉插管造模给药，颈总动脉插管联通多导生理记录仪，记录血流动力学参数。正常大鼠的平均+dp/dtmax在6000-8000mmHg/s，心率在350-450次/min。采用恒速泵从静脉推注盐酸普罗帕酮注射液与尼莫酮注射液的1:1混合溶液，推注速度10ml/h，推注时间6-7min，推注剂量1.0-1.2ml；此时+dp/dtmax下降约50％(或更多)。稳定5min，观察+dp/dtmax是否上升，若无上升趋势，即造模成功。采用4ml/h的流速静脉注射给药，观察+dp/dtmax在15min内的最大上升幅度RRmax与恢复程度RD，作为强心作用的评价指标。上述模型为乌头类中药强心生物活性的评价提供了可靠性好、证据力强、实时动态监测心功能的研究载体。

实施例2：阳性药的选择及效价定义

为了验证模型是否能用于附子强心效果的评价，分别以4ml/h速度通过静脉插管注射西地兰注射液、参附注射液及附子水煎液约1-1.2ml。西地兰注射液为生理盐水稀释10倍后给药，参附注射液为原浓度给药，附子水煎液为20g黑顺片加水200ml煎煮1h后，5000转/min离心10min后取上清液，给药。

阳性药对急性心衰大鼠的强心效果见图6。由图6可知，稳定5min后仅静脉注射生理盐水，大鼠+dp/dtmax变化不大，未见明显的上升。而静脉注射西地兰注射液、黑顺片水煎液及参附注射液后，+dp/dtmax在1min内立即开始上升，且伴随注射时间的延长与注射量的增加，表现出明显的上升。西地兰注射液是经典的强心药，作用快，临床上用于心力衰竭病人的治疗具有确切疗效，也是强心动物实验中常用的阳性药。静脉注射西地兰后，+dp/dtmax上升，可知制得的急性心衰模型能用于附子强心作用的评价。此外，由于黑顺片水煎液及参附注射液与西地兰注射液表现出相似的作用规律，可以判定附子汤剂及其制剂也具有明确的强心作用。

从阳性药的标准属性与质量稳定性来看，西地兰为单一化合物制剂，质量波动小，批次一致性好；而参附注射液与附子水煎液尽管都有强心活性，但由于是天然产物，批次间质量波动大；因此，西地兰更适合作为阳性标准物质。

目前，每支西地兰注射液的体积为2ml，含药量为0.4mg，定义0.4mg西地兰的强心效价为1000U。大量重复实验测定表明，西地兰注射液经生理盐水稀释10倍后以4ml/h的速度静注15min(总给药量为20μg)，心衰大鼠的+dp/dtmax的RD能恢复66.3-73.6％，因此，认定大鼠心功能恢复70％(即RDs为70％)时的强心效价Us为50U。

实施例3：供试品制备方法的考察

以临床广泛应用的黑顺片为模式药物，考察供试品制备方法对强心效果的影响。采用单因素实验设计，考察煎煮次数(1次、2次、3次)与煎煮时间(0.5h、1h、2h、4h、8h)对强心效果的影响。标准的煎煮方法为：“取黑顺片20g置于圆底烧瓶中，加纯水200ml(含少量浸泡液)，电热套回流煎煮(加热功率100W)，提取完毕后，放冷，收集滤液，加纯水补充至200ml。滤液离心滤过(5000转/min离心10min)，收集上清液，即得。”

煎煮次数与煎煮时间对急性心衰大鼠的强心效果见表2，代表性图谱见图7与图8。考察煎煮次数对强心效果的影响发现，以整个过程的恢复程度RD为评价指标，Levene检验，p＝0.310>0.05，方差齐，采用LSD检验，与第一煎比较，第三煎有显著差异，第二煎无差异。即黑顺片第一煎与第二煎均有较强的强心效果，两者并无明显差异；而第三煎强心效果则明显减弱，但其效果相当于第一煎的50％-70％，应予以保留。因此，从强心效果来看，黑顺片煎煮3次较为合理。

考察煎煮时间对强心效果的影响发现，以RD为评价指标，Levene检验，p＝0.145>0.05，方差齐；与煎煮0.5h比较，煎煮1、2、4、8h均能增加心衰大鼠恢复程度。但煎煮1h后，各组数据无明显差异，强心效果未明显增加。因此，从强心效果来看，黑顺片应煎煮1h较为合理，久煎并未显著增加强心作用。

表2不同提取工艺对心衰大鼠+dp/dtmax的影响(n＝5)

与第一煎RD比较，^#p<0.05；与煎煮0.5h RD比较，^☆p<0.05；与煎煮1h RD比较，*p<0.05

采用已建立的模型，比较了煎煮次数与煎煮时间对强心效果的影响。结果发现黑顺片煎煮3次，每次1h时，强心效果较为理想，延长煎煮时间，强心效果并未明显增加。

因此，优选供试品制备方法为：取附子饮片，按以g计的中药片的重量与ml计的水的体积比为1：10的量添加水，回流煎煮3次，每次1小时，合并滤液，滤液在5000转/min下离心10min，收集上清液，加水定容至30倍的溶媒体积(即添加水使得以ml计的溶液的体积为以g计的中药片的重量的30倍)，即得。

实施例4：九种附子炮制品的强心活性效价的测定

药物：黑顺片、生附片、炮天雄、蒸附片、刨附片、炒附片、白附片、炮附子均于2014年7-10月采购于四川江油中坝附子科技有限公司。精标饮片，自制，制备方法见下表。上述炮制品的制备方法见表3。

表3附子各炮制品的炮制工艺

分别取生附片、黑顺片、白附片、蒸附片、炒附片、炮天雄、刨附片、炮附子、精标饮片(自制)，如实施例3中所述的优选方法制备供试品，比较强心活性。

九种附子炮制品对急性心衰大鼠的强心作用见表4，代表性图谱见图9。由结果可知，不同的炮制品强心作用存在一定差异。采用SPSS22.0统计软件单因素方差分析对各组结果进行分析，以整个过程的恢复程度RD为评价指标，Levene检验，p＝0.943>0.05，方差齐，采用LSD检验；发现与生附片比较，其他8种饮片的恢复程度均小于生附片。从RD来看，生附片与精标饮片作用较强，而炮附子、刨附片、炮天雄作用偏弱，该结果与本领域的传统经验认识结果相类似

9种附子饮片的强心效价UD计算公式如下：

公式中，RD_D为心衰大鼠颈静脉注射附子提取液后的RD数值，RD_S为心衰大鼠颈静脉注射西地兰后的RD数值。

带入数值Us＝50、RDs＝70％后，

U_D＝71.4×RD_D

由于按照4ml/h的速度注射15min，实际注射体积为1ml，而注射药物浓度为生药浓度的1/30g/ml，因此可计算出药材的最终效价UF。

U_F＝30×U_D

表4不同附子炮制品对心衰大鼠+dp/dtmax的影响与强心效价计算(n＝5)

与生附片RD比较，^#p<0.05

实施例5：13种强心化合物的筛选评价

用生理盐水分别配制5.35μg/ml新乌头碱溶液、5.5μg/ml乌头碱溶液、5μg/ml次乌头碱溶液、1.048mg/ml苯甲酰新乌头原碱、1.056mg/ml苯甲酰乌头原碱、1.000mg/ml苯甲酰次乌头原碱、136μg/ml乌头原碱、133μg/ml尼奥林、103mg/ml附子灵、89.5mg/ml宋果灵、50μg/ml塔拉乌头胺、50μg/ml去甲乌药碱、50μg/ml去甲猪毛菜碱的对照品溶液，考察各成分对急性心衰大鼠强心活性的影响。

附子中13种单体对心衰大鼠的强心效果的代表性图谱见图10。由结果可知，对于心衰大鼠分别静脉注射乌头碱等13种单体，结果发现去甲乌药碱与去甲猪毛菜碱为附子中强心主要成分，乌头碱、新乌头碱、次乌头碱及其水解产物苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和醇胺类乌头原碱均无明显的强心作用，水溶性较好的酯性生物碱尼奥林、附子灵、宋果灵及塔拉乌头胺也无明显的强心作用；尤其是给予属于双酯型生物碱的乌头碱、新乌头碱、次乌头碱后，+dp/dtmax还出现了下降趋势，即双酯型生物碱不但不具备强心作用，还可能进一步损伤心功能，该实验结论与文献《附子对心血管系统双向作用和物质基础的探讨及未来(五)》的记载一致。

虽然本申请所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本申请而采用的实施方式，并非用以限定本申请。任何本申请所属领域内的技术人员，在不脱离本申请所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本申请的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。

Claims

1.一种用造模液制得的急性心衰动物模型，其特征在于，所述造模液为盐酸普罗帕酮与尼莫酮的混合溶液。

2.根据权利要求1所述的急性心衰动物模型，其中所述动物为大鼠、小鼠、家兔或犬，优选地所述动物为大鼠。

3.根据权利要求1或2所述的急性心衰动物模型，其中所述造模液为规格10ml：35mg的盐酸普罗帕酮注射液与规格50ml：10mg的尼莫酮注射液的体积比为1：1-1.5的混合溶液，优选体积比为1:1的混合溶液。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的急性心衰动物模型在评价药物的强心效价或筛选强心活性成分中的应用。

5.一种评价药物的强心效价的方法，其特征在于，所述方法包括：

获得如权利要求1-3中任一项所述的急性心衰动物模型；

<mrow> <msub> <mi>RD</mi> <mi>S</mi> </msub> <mo>=</mo> <mfrac> <msub> <mrow> <mo>(</mo> <mo>+</mo> <mi>d</mi> <mi>p</mi> <mo>/</mo> <msub> <mi>dt</mi> <mrow> <mi>m</mi> <mi>a</mi> <mi>x</mi> </mrow> </msub> <mo>)</mo> </mrow> <mn>15</mn> </msub> <msub> <mrow> <mo>(</mo> <mo>+</mo> <mi>d</mi> <mi>p</mi> <mo>/</mo> <msub> <mi>dt</mi> <mrow> <mi>m</mi> <mi>a</mi> <mi>x</mi> </mrow> </msub> <mo>)</mo> </mrow> <mn>0</mn> </msub> </mfrac> <mo>&times;</mo> <mn>100</mn> <mi>%</mi> </mrow>

<mrow> <msub> <mi>RD</mi> <mi>D</mi> </msub> <mo>=</mo> <mfrac> <msub> <mrow> <mo>(</mo> <mo>+</mo> <mi>d</mi> <mi>p</mi> <mo>/</mo> <msub> <mi>dt</mi> <mrow> <mi>m</mi> <mi>a</mi> <mi>x</mi> </mrow> </msub> <mo>)</mo> </mrow> <mn>15</mn> </msub> <msub> <mrow> <mo>(</mo> <mo>+</mo> <mi>d</mi> <mi>p</mi> <mo>/</mo> <msub> <mi>dt</mi> <mrow> <mi>m</mi> <mi>a</mi> <mi>x</mi> </mrow> </msub> <mo>)</mo> </mrow> <mn>0</mn> </msub> </mfrac> <mo>&times;</mo> <mn>100</mn> <mi>%</mi> </mrow>

根据如下公式计算药物供试品的强心效价U_D：

<mrow> <msub> <mi>U</mi> <mi>D</mi> </msub> <mo>=</mo> <mfrac> <mrow> <msub> <mi>RD</mi> <mi>D</mi> </msub> </mrow> <mrow> <msub> <mi>RD</mi> <mi>S</mi> </msub> </mrow> </mfrac> <mo>&times;</mo> <msub> <mi>U</mi> <mi>S</mi> </msub> </mrow>

其中U_S为对照品的强心效价。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述对照品为西地兰注射液，且将1支装的0.4mg的对照西地兰注射液的强心效价U_S定义为1000U。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述药物为乌头类中药。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述药物选自黑顺片、白附片、蒸附片、炮天雄、炒附片、刨附片、炮附子、生附片、淡附片、黄附片、临江片、挂附片、煨附片、盐附子、附子精标饮片、黑顺片精准饮片、黑顺片精制饮片、黑顺片配方颗粒、淡附片配方颗粒、川乌及其炮制品、草乌及其炮制品、参附注射液、参附强心丸、四逆汤、四逆汤配方颗粒中的一种。

9.根据权利要求5所述的方法，其中，所述药物为乌头类中药的药物组分，从而根据强心效价筛选强心组分。

10.根据权利要求7所述的方法，其中，当所述药物为乌头类中药片时，所述药物供试品溶液通过如下的方法来制备：