CN107589189A - 一种氟甲喹的手性对映体的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种氟甲喹的手性对映体的检测方法，该检测方法可以实现氟甲喹手性对映体的拆分，且该方法既可应用于沉积物的检测，也可应用于河或池塘水的检测。在1.0μg/L至200μg/L的浓度范围呈现良好的线性关系，在河水样或池塘水样中，S‑(‑)‑氟甲喹和R‑(+)‑氟甲喹的检测限(LOD)值为2.5μg/kg，定量限(LOQ)值为8.0μg/kg；沉积物样品中，两个对映体的LOD和LOQ值分别为5μg/kg和15μg/kg；河水样或池塘水样中S‑(‑)‑氟甲喹和R‑(+)‑氟甲喹的回收率为81.0‑82.8％，沉积物样品中两个对映体的回收率为73.6‑77.5％。

Description

一种氟甲喹的手性对映体的检测方法
1、技术领域
本发明涉及一种氟甲喹的手性对映体的检测方法，具体涉及一种沉积物、河水或池塘水样品中氟甲喹的手性对映体的检测。
2、背景技术
近年来抗生素的大量使用已经导致其在环境中的残留，在地球的各种环境中都检测到了残留的人类或兽用抗生素，这些抗生素最终会给陆地和水中的各种生物带来潜在的危险。
氟甲喹(Flumequine，FMQ)为第二代氟喹诺酮类广谱抗菌药物，其主要作用于DNA转旋酶A亚单位，抑制其活性，从而使得脱氧核糖核酸、核糖核酸以及蛋白质的合成受阻，阻止细菌细胞分裂以达到杀菌药效。氟甲喹结构式中含有一个手性碳原子，因此含有一对手性对映体，对映体结构如下式I所示。
式I氟甲喹对映体结构式
手性对映体往往会表现出不同的生物活性和环境行为。手性药物在生物体内往往存在立体选择性，对映体浸入生物体后与血浆蛋白、转运蛋白以及其他具有立体特异性代谢酶作用，引起对映体毒性、代谢途径、生物活性的差异，有的对映体活性较强，可达到理想作用，其他对映体活性不高甚至对机体产生毒性作用。
由于氟甲喹具有抗菌谱广、与其他类抗生素药物没有交叉耐药性特点，已广泛应用于水产养殖中，然而氟甲喹在水生生物体内的生物利用度很低，在养殖水体及底泥中的降解也很慢，加之过度使用，已经导致了氟甲喹的残留。
发明专利CN201410459726.1公开了一种海水中氟甲喹手性对映体的检测方法，但该方法仅能应用于海水中氟甲喹手性对映体的检测，且在检测时需要在流动相中加入添加剂。
3、发明内容
本发明提供了一种氟甲喹对映体的检测方法，该方法可以实现氟甲喹手性对映体的拆分，且该方法既可应用于沉积物的检测，也可应用于河水或池塘水的检测。
本发明要求保护一种氟甲喹对映体的检测方法，检测步骤为：
(1)将沉积物、河水或池塘水样品进行前处理，待净化；
(2)将Cleanert PEP固相萃取小柱(150mg/6mL)进行活化，将上述待净化液上样于Cleanert PEP(150mg/6mL)固相萃取小柱上，弃去流出液，再用6mL 5％甲醇水溶液淋洗，弃去流出液，抽干小柱，再用洗脱剂进行洗脱，收集流出液于45℃下氮吹至干，用流动相定容至1mL，过0.45μm Nylon针式过滤器过滤，待检测；
(3)使用Lux 5μm Cellulose-2(250mm×4.6mm i.d.×5μm,Phenomenex,USA)手性柱，以0.2％甲酸水为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，流速为1mL/min，运行时间为30min，柱温30℃，进样体积为1μL，Q-TOF检测为电喷雾离子源，雾化器压力为55psi，碰撞能量10V，毛细管电压5.5kV，离子温度600℃，质量范围m/z 100-700。
所述的沉积物样品的前处理方法为：称取样品，加入提取液，涡旋1min，超声提取10min，8000rpm离心5min，转移上清液，残渣再重复上述操作提取2次，合并3次上清液，45℃旋蒸至15mL左右，加水稀释至30mL，混匀，待净化。
所述的河水或池塘水样品的前处理方法为：取样品用微孔滤膜过滤，待净化。
所述的步骤(1)的提取液为乙腈和EDTA-Mcllvaine。优选的，所述的乙腈和EDTA-Mcllvaine的体积比为40：60。
所述的步骤(2)的固相萃取小柱是依次用6mL甲醇、6mL水活化平衡。
所述的步骤(2)的洗脱剂为甲醇；所述的甲醇的洗脱体积为6ml。
所述的步骤(3)洗脱程序如下：
。
所述的步骤(3)的Q-TOF检测以正离子模式进行。
本发明具有以下优点：
(1)本发明的氟甲喹的手性对映体的检测方法对保障生态环境安全和人类健康具有极其重要的意义。
(2)本发明的氟甲喹的手性对映体的检测方法既可以应用于沉积物中氟甲喹的手性对映体的检测，也可以应用于河水或池塘水中氟甲喹的手性对映体的检测。
(3)本发明的氟甲喹的手性对映体的检测方法准确性好，测量和计算质量之间的误差范围为-0.2至0mDa。
(4)本发明的氟甲喹的手性对映体的检测方法在1.0μg/L至200μg/L的浓度范围呈现良好的线性关系，在河水样或池塘水样中，S-(-)-氟甲喹和R-(+)-氟甲喹的检测限(LOD)值为2.5μg/kg，定量限(LOQ)值为8.0μg/kg；沉积物样品中，两个对映体的LOD和LOQ值分别为5μg/kg和15μg/kg；河水样或池塘水样中S-(-)-氟甲喹和R-(+)-氟甲喹的回收率为81.0-82.8％，沉积物样品中两个对映体的回收率为73.6-77.5％。
4、附图说明
图1为氟甲喹单体旋光性；
图2为氟甲喹MS/MS光谱。
5、具体实施例
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。
实施例氟甲喹手性对映体的检测
1、样品前处理
沉积物：称取沉积物样品(2.00±0.01g)，加入10mL提取液(乙腈：EDTA-Mcllvaine＝40:60,v/v)，涡旋1min，超声提取10min，8000rpm离心5min，转移上清液，残渣再重复上述操作提取2次，合并3次上清液，45℃旋蒸至15mL左右，加水稀释至30mL，混匀，待净化。
河水或池塘水：取样品适量，用微孔滤膜过滤，待净化。
2、将Cleanert PEP固相萃取小柱(150mg/6mL)依次用6mL甲醇、6mL水活化平衡，将上述待净化液上样于Cleanert PEP(150mg/6mL)固相萃取小柱上，弃去流出液，再用6mL5％甲醇水(V/V)溶液淋洗，弃去流出液，抽干小柱，再用6mL甲醇洗脱，收集流出液于45℃下氮吹至干，用流动相定容至1mL，过0.45μm Nylon针式过滤器过滤，待检测。
3、氟甲喹手性拆分使用Lux 5μm Cellulose-2(250mm×4.6mm i.d.×5μm,Phenomenex,USA)手性柱，流动相为A:0.2％甲酸水，B:乙腈。梯度洗脱程序如下：0-20min，A：B(45:55，V/V)；20-24min，A：B(5:95，V/V)；24-25min，A：B(45:55，V/V)；流速为1mL/min，运行时间为30min。柱温30℃。进样体积为1μL。Q-TOF检测(SCIEX，USA)为电喷雾离子源(ESI)，以正离子模式进行，雾化器压力为55psi；碰撞能量10V；毛细管电压5.5kV；离子温度600℃；质量范围m/z 100-700。
由图1可看出，氟甲喹在手性色谱柱中的流出顺序为先流出氟甲喹左旋对映体，后流出氟甲喹右旋对映体。
通过HPLC/QTOF-MS对质子化的氟甲喹进行MS/MS分析。氟甲喹的保留时间为13.9分钟。测量和计算质量之间的误差范围为-0.2至0mDa，表明准确性好。质子化的分子离子([M+H]+)和碎片离子[M+H]+全部被检测。检最可能的元素组成和产物离子见表1和图2。
表1氟甲喹MS/MS分析
对标准溶液浓度范围为1.0至200μg/L的八个浓度进行分析。以定量离子对的响应面积(Y)和对应浓度(X)进行线性回归得到标准曲线，氟甲喹对映体的标准曲线R2>0.999。以3倍信噪比(S/N≥3)估算方法检出限，在水样中，S-(-)-氟甲喹和R-(+)-氟甲喹的检测限(LOD)值为2.5μg/kg，定量限(LOQ)值为8.0μg/kg。沉积物样品中，两个对映体的LOD和LOQ值分别为5μg/kg和15μg/kg。水样中S-(-)-氟甲喹和R-(+)-氟甲喹的回收率为81.0-82.8％，沉积物样品中两个对映体的回收率为73.6-77.5％。

Claims (10)

1.一种氟甲喹的手性对映体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将沉积物、河水或池塘水样品进行前处理，待净化；
(2)将Cleanert PEP固相萃取小柱(150mg/6mL)进行活化，将上述待净化样品上样于Cleanert PEP(150mg/6mL)固相萃取小柱上，弃去流出液，再用6mL 5％甲醇水溶液淋洗，弃去流出液，抽干小柱，再用洗脱剂进行洗脱，收集流出液于45℃下氮吹至干，用流动相定容至1mL，过0.45μm Nylon针式过滤器过滤，待检测；
(3)使用Lux 5μm Cellulose-2(250mm×4.6mm i.d.×5μm,Phenomenex,USA)手性柱，以0.2％甲酸水为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，流速为1mL/min，运行时间为30min，柱温30℃，进样体积为1μL，Q-TOF检测为电喷雾离子源，雾化器压力为55psi，碰撞能量10V，毛细管电压5.5kV，离子温度600℃，质量范围m/z 100-700。
2.如权利要求1所述的氟甲喹的手性对映体的检测方法，其特征在于，所述的沉积物样品的前处理方法为：称取样品，加入提取液，涡旋1min，超声提取10min，8000rpm离心5min，转移上清液，残渣再重复上述操作提取2次，合并3次上清液，45℃旋蒸至15mL左右，加水稀释至30mL，混匀，待净化。
3.如权利要求1所述的氟甲喹的手性对映体的检测方法，其特征在于，所述的河水或池塘水样品的前处理方法为：取样品用微孔滤膜过滤，待净化。
4.如权利要求1所述的氟甲喹的手性对映体的检测方法，其特征在于，所述的步骤(1)的提取液为乙腈和EDTA-Mcllvaine。
5.如权利要求4所述的氟甲喹的手性对映体的检测方法，其特征在于，所述的乙腈和EDTA-Mcllvaine的体积比为40：60。
6.如权利要求1所述的氟甲喹的手性对映体的检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)的固相萃取小柱是依次用6mL甲醇、6mL水活化平衡。
7.如权利要求1所述的氟甲喹的手性对映体的检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)的洗脱剂为甲醇。
8.如权利要求7所述的氟甲喹的手性对映体的检测方法，其特征在于，所述的甲醇的洗脱体积为6ml。
9.如权利要求1所述的氟甲喹的手性对映体的检测方法，其特征在于，所述的步骤(3)洗脱程序如下：
。
10.如权利要求1所述的氟甲喹的手性对映体的检测方法，其特征在于，所述的步骤(3)的Q-TOF检测以正离子模式进行。
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高小峰等: "鱼组织中氟甲喹对映体检测方法研究", 《浙江海洋学院学报（自然科学版）》 *

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