CN107586772A - 一种用于dna提取的川金丝猴粪便样品保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于DNA提取的川金丝猴粪便样品保存方法。具体包括如下步骤：(1)将粪便样本置于15 mL收集管，其中收集管内含有硅胶，表面铺设无菌滤纸;(2)然后在–20℃冰箱保存。本发明方法能够简便、准确、有效的保存粪便样品，开展川金丝猴的遗传多样性和保护遗传学等研究提供保障。

Description

一种用于DNA提取的川金丝猴粪便样品保存方法

技术领域

本发明涉及用于DNA提取的川金丝猴粪便样品保存方法，具体涉及基于川金丝猴遗传多样性研究的粪便样品保存方法。

背景技术

利用粪便样品提取动物DNA已成为野生动物保护研究中常用的非损伤性取样法，该方法对于研究大型、珍稀且难以见到的濒危动物十分有用(Smith et al., 2000; 李明等, 2001)，并已解决了诸如珍稀濒危野生动物的个体识别、遗传多样性、遗传结构、性比结构、亲缘关系、系统进化等分子生态学和种群遗传学问题，及与经典生态学方法相结合解决物种的种群数量调查、监测、保护建设等濒危物种的保护相关问题 (张于光等, 2009;Chang et al., 2012a, 2012b)。

正确的粪便样品采样及保存方法是粪便样品能否为珍稀濒危动物研究提供足够遗传信息的重要决定因素之一。从动物粪便中分离动物组织DNA是由于粪便表面通常含有脱落的动物消化道细胞，但脱落细胞含量较少，在自然环境中易降解，且粪便中常含有一定的杂质DNA和PCR抑制物等，因此，不恰当的粪便样品的保存方法，可能会造成样品DNA样本的快速降解，增加样品DNA的提取和基因扩增难度，甚至增加基因分型的错误率等(Piggott, 2005)。目前，常用的动物粪便样品保存方法有用乙醇保存、用DETs缓冲液保存、直接低温保存、干燥保存等，保存效果因物种、样品暴露的气候条件、暴露的时间等不同而变化，例如降雨能显著地增加粪便样品DNA的降解。由于不同研究对象所处的环境条件、研究对象的食物特征、个体差异等，不同物种所采用的粪便样品保存方法等还存在物种差异，尚未有适合任何物种的通用粪便样品保存方法。

川金丝猴（Rhinopithecus roxellana），隶属于灵长目、猴科、疣猴亚科、仰鼻猴属，是我国特有物种，国家I级重点保护保护野生动物。目前川金丝猴仅分布于几个相互隔离的地区（四川北部及甘肃南部、陕西秦岭和湖北神农架3个地区），其中神农架金丝猴种群是分布在最东端的孤立金丝猴群，在川金丝猴的保护和研究中具有重要的价值。由于川金丝猴种群数量少，且为典型树栖动物，生性警觉，迁移速度快，难以通过常规的组织样品开展遗传保护相关研究，因此，利用其粪便样品进行种群数量调查和遗传多样性评价等研究是一种有效的手段。

发明内容

本发明的目的是建立基于简便、高效的，适合于开展川金丝猴遗传多样性研究的粪便样品保存方法。为了达到上述目的，本发明的技术方案提供了一种进行川金丝猴粪便样品有效保存方法。

本发明提供的技术方案是：一种川金丝猴粪便样品有效保存方法：包括如下步骤：

(1)将粪便样本置于15 mL收集管，其中收集管内含有硅胶，表面铺设无菌滤纸;

(2)然后在–20℃冰箱保存。

优选地，所述的保存方法，收集管内含有2/3的硅胶。

本发明所述的方法是将粪便样本置于15 mL收集管，其中收集管内含有约2/3的硅胶，表面铺设无菌滤纸，然后在–20℃冰箱保存，粪便的干燥-冷冻法保存能够更为有效的保证DNA的提取和基因扩增效率。本发明利用优化的粪便样品保存方法，能够简便、准确、有效的保存粪便样品，并通过验证获得了高效的DNA提取效率，为获取川金丝猴个体的遗传信息，开展川金丝猴的遗传多样性和保护遗传学等研究提供保障。

具体实施方式

（1）粪便样品的采集和保存方法

粪便采集于湖北神农架国家级自然保护区，样品用干燥-冷冻法保存。干燥-冷藏保存法是采集后的样品收集在15ml收集管，其中收集管内含有约2/3的硅胶，表面铺设无菌滤纸，保存在-20℃冰箱中。

（2）粪便样品DNA的提取

粪便DNA提取是采用QIAamp DNA Stool Kit（QIAGEN）试剂盒，DNA提取的方法具体步骤和方法，根据实际情况有所调整，具体操作如下：

1）取大约0.3g粪便表面样品入新2 ml的离心管中；

2）取1.6ml ASL裂解缓冲液入有粪便样品的离心管中，振荡均匀，使样本与裂解液充分接触，静置3h以上，在静置的过程中，约20分钟振荡一次；

3）以12,000rpm速度离心2 mins，取1.4 ml上层无残渣的液体转移到新2 ml离心管中；

4）加入一片InhibitEX，充分振荡，使吸附剂片溶解完全，使剂片与液体充分接触，室温静置1min；

5）以12,000rpm速度离心l0mins，将上层液体转移到新1.5ml的离心管中；

6）以12,000rpm速度6mins；

7）取25μl蛋白酶K入新2ml的离心管中，将上一步离心管中的上清液移到含蛋白酶K的离心管中，再加入600μl AL缓冲液（不要将蛋白酶K和AL溶液直接混合），充分振荡。

8）将混匀的溶液放入70℃的水浴锅，温育10mins；

9）取600μl无水乙醇加入温育好的溶液中，并充分振荡，混匀；

10）取600μl步骤混合的溶液到DNA吸附柱中，以12,000rpm速度离心1min；更换一个新离心管，弃离心液和旧离心管，继续离心完剩下的混合液；

11）取500μl Buffer AW1溶液到吸附柱中，以12,000rpm速度离心1min，弃离心液和旧离心管；

12）取300μl Buffer AW1溶液到吸附柱中，以12,000rpm速度离心1min，弃离心液和旧离心管；

13）取500μl Buffer AW2溶液到吸附柱中，以12,000rpm速度离心1min，弃离心液和旧离心管；

14）再取300μl Buffer AW2溶液到吸附柱中，以12,000rpm速度离心1min，弃离心液和旧离心管；

15）把吸附柱移到已编号的新1.5ml的离心管中，以12,000rpm速度离心2min，以去无水乙醇的余液；

16）打开盖子，室温静置10mins，充分将无水乙醇挥发；

17）取100μl温育的Buffer AE加入离心柱底部，静置5mins，以12,000rpm速度离心1min；

18）重复步骤17），取100μl温育的Buffer AE入离心柱底部，静置5mins，以12,000rpm速度离心2min；并分装DNA，保存于-20℃冰箱备用｡

（3）粪便样品DNA的PCR扩增和基因检测

利用常规的mtDNA扩增引物，正向引物序列为：5'-AACTGGCATTCTATTTAAACTAC-3'，反向引物序列为：5'-ATTGATTTCACGGAGGATGGT-3'，PCR产物大小约为400bp｡

PCR的扩增的体系为20μl，扩增体系包括：1×PCR buffer（含MgCl2），0.2mmol/LdNTPs，1μmol/L的正向和反向引物，2μgBSA，0.6UHotMaster™ 聚合酶和10～20ng的基因组DNA模板。

PCR扩增条件为：94℃热启动5min；94℃变性15s、退火温度54℃延伸30s、72℃延伸45s（35个循环）；最后72℃延伸10min；反应结束后保存在4℃。每次扩增过程中设定阴性对照，每个样本扩增2次。

利用1.2%的琼脂糖凝胶电泳，检测PCR扩增结果。线粒体控制区片段的扩增得到的长度为400bp，以粪便DNA作为模板，能得到预期大小的条带。挑取6个粪便样本测序，得到的序列与NCBI数据库进行比对，确定是川金丝猴控制区目标条带，表明在琼脂糖凝胶电泳上有该目的条带的样本。

Claims (2)

1.一种川金丝猴粪便样品有效保存方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将粪便样本置于15 mL收集管，其中收集管内含有硅胶，表面铺设无菌滤纸;

(2)然后在–20℃冰箱保存。

2.如权利要求1所述的川金丝猴粪便样品有效保存方法，其特征在于：收集管内含有2/3的硅胶。