CN107573315A - 一种山楂中的黄酮类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种山楂中的黄酮类化合物及其制备方法与应用，属于植物化学技术领域。该黄酮类化合物是从山楂中分离得到，化合物命名为：2′‑羟基‑7‑(3‑羟丙基)‑6‑甲氧基‑黄酮，英文名为：2′‑hydroxy‑7‑(3‑hydroxypropyl)‑6‑methoxy‑flavone，其分子式为C19H18O5，其结构式如式（I）所示：，式（I）；本发明以山楂为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、MCI脱色、硅胶柱层析和高效液相色谱分离步骤制得。本发明化合物添加到卷烟滤嘴中，卷烟抽吸时烟气更清晰圆润，生津感得到加强，喉部刺激性得到降低，而且口腔略带回甜感，余味改善明显。
Description
技术领域
本发明属于植物化学技术领域，涉及一种山楂中的黄酮类化合物及其制备方法与应用，具体涉及一种从山楂中首次提取得到的黄酮类化合物。该化合物添加到卷烟滤嘴中，卷烟抽吸时烟气更清晰圆润，生津感得到加强，喉部刺激性得到降低，口腔略带回甜感，余味改善明显。
背景技术
山楂(Crataegus pinnatifida)，又名山里果、山里红，为蔷薇科山楂属落叶小乔木，在我国南北各地地均有分布，生于海拔100-1500米的山坡林边或灌木丛中。山楂果实酸甜可口，含丰富的维生素、山楂酸、柠檬酸、黄酮类化合物等，能生津止渴，亦可入药，是一种非常受人们喜爱的果实。经常吃山楂可以帮助减肥瘦身、强心降脂、降血压、生津开胃等功效。山楂干果还具有非常高的药用价值；民间中成药焦兰仙、保和丸、山楂丸等均以山楂为其主要成分。山楂入药归脾、胃、肝经，有消食化积、活血散瘀的功效。
国内外研究表明，山楂中的主要化学成分有：黄酮类化合物、有机酸类化合物、三萜类化合物、原花青素等。黄酮类物质是山楂中的主要活性成分，目前，从山楂中分离得到100余种黄酮类化合物。山楂黄酮具有降血脂、抗动脉粥样硬化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等多种较强的生理活性。黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环（A-与B-环）通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮。黄酮类化合物结构中常连接有酚羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团。此外，它还常与糖结合成苷。黄酮的功效是多方面的，它是一种很强的抗氧剂，阻止氧化的能力是维生素E的十倍以上，这种抗氧化作用可以阻止细胞的退化、衰老，也可阻止癌症的发生。黄酮可以改善血液循环，降低胆固醇，改善心脑血管疾病。另外，黄酮类化合物也有突出的改善味觉功效，有些黄酮类化合物的味觉表现非常特别，入口后有一种自然的甜味。橄榄所含的黄酮就是其能回甘的主要原因，而且黄酮含量越高，回甘就越明显，气味越醇厚。本发明从山楂中分离得到了一种黄酮类化合物，该化合物添加到卷烟过滤嘴中，卷烟抽吸时烟气更清晰圆润，生津感得到加强，喉部刺激性得到降低，口腔略带回甜感，余味改善明显。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种山楂中的黄酮类化合物；第二目的在于提供所述黄酮类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述黄酮类化合物在卷烟滤嘴加香中的应用，滤嘴中添加了该黄酮类化合物的卷烟抽吸时烟气更清晰圆润，生津感得到加强，喉部刺激性得到降低，口腔略带回甜感，余味改善明显
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一目的是这样实现的，一种山楂中的黄酮类化合物是从山楂中分离得到，该化合物为浅黄色胶状物，命名为：2′-羟基-7-(3-羟丙基)-6-甲氧基-黄酮，英文名为：2′-hydroxy-7-(3-hydroxypropyl)-6-methoxy-flavone，其分子式为C19H18O5，其结构式如式（I）所示：
，式（I）。
本发明的第二目的是这样实现的，所述黄酮类化合物的制备方法，是以山楂为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、MCI脱色、硅胶柱层析和高效液相色谱分离步骤制得，具体为：
A、浸膏提取：将山楂粉用溶剂超声提取2~5次，每次所用提取溶剂的质量为山楂粉质量的2~6倍，每次提取时间为30~60分钟，合并提取液并过滤，滤液减压浓缩至刚有沉淀物析出，静置20~60分钟，滤除沉淀物，之后将所得滤液减压浓缩成浸膏a；
B、有机溶剂萃取：向浸膏a中加入重量是浸膏a重量1~3倍的水，然后用有机溶剂萃取3~5次，每次所用有机溶剂的体积与水体积的相同，合并有机溶剂萃取相，之后将合并得到的有机溶剂萃取相减压浓缩成浸膏b；
C、MCI脱色：向浸膏b中加入是浸膏b重量3~5倍的体积浓度为95%甲醇水溶液，待浸膏b完全溶解后，上MCI柱，用体积浓度为90%~95%甲醇水溶液进行洗脱，合并洗脱液，之后将合并后的洗脱液减压浓缩成浸膏c；
D、硅胶柱层析：将浸膏c上硅胶柱层析，装柱硅胶为160~200目，所用硅胶的重量为浸膏c重量6~10倍量；以体积比为1:0~0:1的氯仿和丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
E、高效液相色谱分离：将采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分采用高效液相色谱分离纯化，即得所述的黄酮类化合物。
进一步，优选的是，所述A步骤的溶剂为体积浓度为70~100%的丙酮水溶液、体积浓度为90~100%的乙醇水溶液或体积浓度为90~100%的甲醇水溶液。
进一步，优选的是，所述B步骤的有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙醚或石油醚。
进一步，优选的是，所述D步骤中浸膏c在经硅胶柱层析前，先用重量是浸膏c 1.5~3倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏c 0.5~2.0倍的80~100目硅胶拌样，之后上样。
进一步，优选的是，所述D步骤中，梯度洗脱时，所使用的氯仿和丙酮混合有机溶剂的体积比依次为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和1:1；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱。
进一步，优选的是，所述E步骤的高效液相色谱分离纯化是以体积浓度为55%的甲醇水溶液为流动相，流速20 ml/min，以21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为355 nm，每次进样50~200μL，收集34.2 min的色谱峰，多次累加后蒸干即可得本发明的化合物。
本发明的山楂粉为普通市购品。本发明对山楂粉的粒度无限制。
本发明化合物添加到卷烟过滤嘴中，卷烟抽吸时烟气更清晰圆润，生津感得到加强，喉部刺激性得到降低，口腔略带回甜感，余味改善明显。
所制备的化合物的结构通过以下方法进行鉴定：
本发明化合物为黄色胶状物；
HRESI-MS显示其准分子离子峰为349.1059 [M+Na]+(计算值349.1052)，结合1H NMR和DEPT谱确定其分子式为C19H18O5，不饱和度为11。红外光谱中显示了羟基(3408)、羰基(1665)和芳环(1614、1550和1438 cm-1)的共振吸收峰。而紫外光谱在210、250、355 nm有最大吸收也说明了化合物中可能存在芳环结构。
化合物的1H和13C NMR谱数据（如表1、图1和图2）显示其含有19个碳和18个氢，包括1个1,2,4,5-四取代的苯环(C-5~C-10，H-5、H-6)，1个1,2-二取代的苯环(C-1'~C-6'，H-3'~H-6')，1个α,β-不饱和羰基(C-2、C-3、C-4，H-3)，1个羟丙基(C-1''~C-3''，H2-1''~H2-3'')，1个甲氧基 (d C 56.3 q，d H 3.84 s)，以及1个酚羟基(d H 10.90 s)。根据典型的2个苯环、α,β-不饱和羰基和双键信号，可推测该化合物为黄酮类化合物。根据H-3和C-2、C-4、C-10、C-1′，H-5和C-4、C-9、C-10，H-8和C-6、C-7、C-9、C-10，以及H-6′和C-2的HMBC相关(如图2)可进一步确认化合物为黄酮类结构。化合物的母体确定后，其余的取代基，羟丙基、甲氧基和酚羟基可视为黄酮上的取代基。
化合物的HMBC谱中(如图3)可观察到甲氧基氢(d H 3.84)与C-6(d C 153.0)的HMBC相关，可推测该甲氧基分别取代在C-6位；根据H2-1'' (d H 2.79)与C-6(d C 153.0)、C-7(d C130.5)、C-8(d C 116.7)，H2-2'' (d H1.90)与C-7(d C 130.5)，以及H-8 (d H 6.79)和C-1''(d C28.8)的HMBC相关，可证实羟丙基取代在C-7位。酚羟基取代在C-2'可通过酚羟基氢(d H10.90)和C-1' (d C 119.4)、C-2' (d C 158.4) 和C-3' (d C 116.3)的HMBC相关得到确认。另外典型的苯环上质子信号[H-5，d H 7.16 s；H-8, d H 6.79 s，H-3′, d H 6.90 (d) 7.6；H-4′，d H 7.31 (t) 7.6；H-5′，d H 6.85 (t) 7.6；H-6′，d H 7.71(d) 7.6]也可证实化合物1的B环为6,7-位二取代，C环为2'-位单取代。
至此，化合物的结构得到确定，并命名为：2′-羟基-7-(3-羟丙基)-6-甲氧基-黄酮。
表1. 本发明化合物的1H NMR 和13C NMR 数据 (CCl3)
化合物的红外、紫外和质谱数据： UV (甲醇) λ max (log ε) 355 (3.68)、250 (3.86)、210 (4.24) nm; IR (溴化钾压片): ν max 3408、2832、1665、1614、1550、1438、1160、1258、1137、1062 cm–1; 1H 和13C NMR 数据 (500 and 125 MHz),见表-1; 正离子模式ESIMS m/z 349; 正离子模式HRESIMS m/z 349.1059 [M+Na]+ (计算值C19H18NaO5，349.1052).
本发明的第三目的是这样实现的：
所述的山楂中的黄酮类化合物作为制备卷烟滤嘴添加剂的应用。
本发明考虑到三醋酸甘油酯为卷烟滤嘴成型最常用的增塑剂，而且本发明化合物溶于三醋酸甘油酯，在卷烟滤嘴成型过程中，本发明化合物可通过三醋酸甘油酯添加到过滤嘴中。
供添加用卷烟为红塔集团的卷烟“红塔山经典”，用三醋酸甘油酯将上述黄酮类化合物用配成0.5 mg/mL的溶液。按滤嘴丝束重量的5-8%均匀的喷洒到滤嘴丝束上，制成滤棒，然后将该滤棒通过常规的卷烟卷接制成卷烟，进行感官评析，并以未添加该化合物的相同卷烟作为对照。评析结果表明：和对照相比较，本发明化合物添加到卷烟滤嘴中，卷烟抽吸时烟气更清晰圆润，生津感得到加强，喉部刺激性得到降低，口腔略带回甜感，余味改善明显。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明化合物是以山楂中分离得到，原料来源非常广泛，成本低；生产该化合物可综合利用废弃资源，对提高山楂加工的附加值具有重要现实意义。
本发明化合物结构简单，也可通过人工合成进行生产，较容易实现，为烟草工业提供新添加剂。而本发明化合物溶于三醋酸甘油酯，在卷烟滤嘴成型过程中，可通过三醋酸甘油酯添加到过滤嘴中，不增加额外的工序，在卷烟中的应用容易实现。
和对照相比较，本发明化合物添加到卷烟滤嘴中，卷烟抽吸时烟气更清晰圆润，生津感得到加强，喉部刺激性得到降低，口腔略带回甜感，余味改善明显。
附图说明
图1本发明黄酮类化合物的核磁共振碳谱（13C NMR）；
图2为本发明黄酮类化合物的核磁共振氢谱（1H NMR）；
图3本发明黄酮类化合物的关键HMBC相关图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明所述的山楂中的黄酮类化合物是从山楂中分离得到，命名为：2′-羟基-7-(3-羟丙基)-6-甲氧基-黄酮，英文名为：2′-hydroxy-7-(3-hydroxypropyl)-6-methoxy-flavone，其分子式为C19H18O5，其结构式如式（I）所示：
，式（I）。
该化合物为浅黄色胶状物，命名为：化合物命名为：2′-羟基-7-(3-羟丙基)-6-甲氧基-黄酮，英文名为：2′-hydroxy-7-(3-hydroxypropyl)-6-methoxy-flavone。
本发明所述黄酮类化合物的制备方法，是以山楂为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、MCI脱色、硅胶柱层析和高效液相色谱分离步骤制得，具体为：
A、浸膏提取：将山楂粉用溶剂超声提取2~5次，每次所用提取溶剂的质量为山楂粉质量的2~6倍，每次提取时间为30~60分钟，合并提取液并过滤，滤液减压浓缩至刚有沉淀物析出，静置20~60分钟，滤除沉淀物，之后将所得滤液减压浓缩成浸膏a；
B、有机溶剂萃取：向浸膏a中加入重量是浸膏a重量1~3倍的水，然后用有机溶剂萃取3~5次，每次所用有机溶剂的体积与水体积的相同，合并有机溶剂萃取相，之后将合并得到的有机溶剂萃取相减压浓缩成浸膏b；
C、MCI脱色：向浸膏b中加入是浸膏b重量3~5倍的体积浓度为95%甲醇水溶液，待浸膏b完全溶解后，上MCI柱，用体积浓度为90%~95%甲醇水溶液进行洗脱，合并洗脱液，之后将合并后的洗脱液减压浓缩成浸膏c；
D、硅胶柱层析：将浸膏c上硅胶柱层析，装柱硅胶为160~200目，所用硅胶的重量为浸膏c重量6~10倍量；以体积比为1:0~0:1的氯仿和丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
E、高效液相色谱分离：将采用体积比为8:2的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分采用高效液相色谱分离纯化，即得所述的黄酮类化合物。
所述A步骤的溶剂为体积浓度为70~100%的丙酮水溶液、体积浓度为90~100%的乙醇水溶液或体积浓度为90~100%的甲醇水溶液。
所述B步骤的有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙醚或石油醚。
所述D步骤中浸膏c在经硅胶柱层析前，先用重量是浸膏c 1.5~3倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏c 0.5~2.0倍的80~100目硅胶拌样，之后上样。
所述D步骤中，梯度洗脱时，所使用的氯仿和丙酮混合有机溶剂的体积比依次为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和1:1；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱。
所述E步骤的高效液相色谱分离纯化是以体积浓度为55%的甲醇水溶液为流动相，流速15~25 ml/min，以21.2×250 mm，5μm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为355 nm，每次进样50~200 μL，收集34.2 min的色谱峰，多次累加后蒸干。
本发明化合物添加到卷烟过滤嘴中，而且和对照相比较，，卷烟抽吸时烟气更清晰圆润，生津感得到加强，喉部刺激性得到降低，口腔略带回甜感，余味改善明显。
实施例1
山楂样品来源于云南大理，品种为大金星。
A、浸膏提取：将山楂粉用溶剂超声提取2次，每次所用提取溶剂的质量为山楂粉质量的2倍，每次提取时间为30分钟，合并提取液并过滤，滤液减压浓缩至刚有沉淀物析出，静置20分钟，滤除沉淀物，之后将所得滤液减压浓缩成浸膏a；
B、有机溶剂萃取：向浸膏a中加入重量是浸膏a重量1倍的水，然后用有机溶剂萃取3次，每次所用有机溶剂的体积与水体积的相同，合并有机溶剂萃取相，之后将合并得到的有机溶剂萃取相减压浓缩成浸膏b；
C、MCI脱色：向浸膏b中加入是浸膏b重量3倍的体积浓度为95%甲醇水溶液，待浸膏b完全溶解后，上MCI柱，用体积浓度为90%甲醇水溶液进行洗脱，合并洗脱液，之后将合并后的洗脱液减压浓缩成浸膏c；
D、硅胶柱层析：浸膏c先用重量是浸膏c 1.5倍的丙酮溶解，然后用重量是浸膏c 0.8倍的80目硅胶拌样，之后上样进行柱层析，装柱硅胶为160目，所用硅胶的重量为浸膏c重量6倍量；以体积比为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和1:1的氯仿和丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
E、高效液相色谱分离：将采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分采用高效液相色谱分离纯化，高效液相色谱分离纯化的具体方法是：以体积浓度为55%的甲醇水溶液为流动相，流速20 ml/min，以21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为355 nm，每次进样50μL，收集34.2 min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的黄酮类化合物。
其中，A步骤的溶剂为体积浓度为70%的丙酮水溶液。所述B步骤的有机溶剂为氯仿。
实施例2
山楂样品来源于山东潍坊，品种为大绵球。
A、浸膏提取：将山楂粉用溶剂超声提取5次，每次所用提取溶剂的质量为山楂粉质量的6倍，每次提取时间为60分钟，合并提取液并过滤，滤液减压浓缩至刚有沉淀物析出，静置60分钟，滤除沉淀物，之后将所得滤液减压浓缩成浸膏a；
B、有机溶剂萃取：向浸膏a中加入重量是浸膏a重量2倍的水，然后用有机溶剂萃取5次，每次所用有机溶剂的体积与水体积的相同，合并有机溶剂萃取相，之后将合并得到的有机溶剂萃取相减压浓缩成浸膏b；
C、MCI脱色：向浸膏b中加入是浸膏b重量5倍的体积浓度为95%甲醇水溶液，待浸膏b完全溶解后，上MCI柱，用体积浓度为95%甲醇水溶液进行洗脱，合并洗脱液，之后将合并后的洗脱液减压浓缩成浸膏c；
D、硅胶柱层析：浸膏c先用重量是浸膏c 3倍的甲醇溶解，然后用重量是浸膏c 1.2倍的100目硅胶拌样，之后上样进行柱层析，装柱硅胶为200目，所用硅胶的重量为浸膏c重量10倍量；以体积比为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和1:1的氯仿和丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
E、高效液相色谱分离：将采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分采用高效液相色谱分离纯化，高效液相色谱分离纯化的具体方法是：以体积浓度为55%的甲醇水溶液为流动相，流速20 ml/min，以21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为355 nm，每次进样200μL，收集34.2 min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的黄酮类化合物。
其中，A步骤的溶剂为丙酮。所述B步骤的有机溶剂为二氯甲烷。
实施例3
山楂样品来源于陕西安康，品种为歪把红。
A、浸膏提取：将山楂粉用溶剂超声提取3次，每次所用提取溶剂的质量为山楂粉质量的3倍，每次提取时间为40分钟，合并提取液并过滤，滤液减压浓缩至刚有沉淀物析出，静置40分钟，滤除沉淀物，之后将所得滤液减压浓缩成浸膏a；
B、有机溶剂萃取：向浸膏a中加入重量是浸膏a重量1.5倍的水，然后用有机溶剂萃取4次，每次所用有机溶剂的体积与水体积的相同，合并有机溶剂萃取相，之后将合并得到的有机溶剂萃取相减压浓缩成浸膏b；
C、MCI脱色：向浸膏b中加入是浸膏b重量4倍的体积浓度为95%甲醇水溶液，待浸膏b完全溶解后，上MCI柱，用体积浓度为93%甲醇水溶液进行洗脱，合并洗脱液，之后将合并后的洗脱液减压浓缩成浸膏c；
D、硅胶柱层析：浸膏c先用重量是浸膏c 2倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏c1倍的90目硅胶拌样，之后上样进行柱层析，装柱硅胶为180目，所用硅胶的重量为浸膏c重量8倍量；以体积比为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和1:1的氯仿和丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
E、高效液相色谱分离：将采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分采用高效液相色谱分离纯化，高效液相色谱分离纯化的具体方法是：以体积浓度为55%的甲醇水溶液为流动相，流速20 ml/min，以21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为355 nm，每次进样100μL，收集34.2 min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的黄酮类化合物。
其中，A步骤的溶剂为乙醇。所述B步骤的有机溶剂为乙酸乙酯。
本实施例采用山楂粉5.2 kg，得到浸膏a 350 g，浸膏b 110 g，浸膏c 76 g，体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分22 g。
实施例4
山楂样品来源于新疆和田，品种为新疆山里红。
A、浸膏提取：将山楂粉用溶剂超声提取4次，每次所用提取溶剂的质量为山楂粉质量的4倍，每次提取时间为50分钟，合并提取液并过滤，滤液减压浓缩至刚有沉淀物析出，静置40分钟，滤除沉淀物，之后将所得滤液减压浓缩成浸膏a；
B、有机溶剂萃取：向浸膏a中加入重量是浸膏a重量1.2倍的水，然后用有机溶剂萃取4次，每次所用有机溶剂的体积与水体积的相同，合并有机溶剂萃取相，之后将合并得到的有机溶剂萃取相减压浓缩成浸膏b；
C、MCI脱色：向浸膏b中加入是浸膏b重量4.5倍的体积浓度为95%甲醇水溶液，待浸膏b完全溶解后，上MCI柱，用体积浓度为92%甲醇水溶液进行洗脱，合并洗脱液，之后将合并后的洗脱液减压浓缩成浸膏c；
D、硅胶柱层析：浸膏c先用重量是浸膏c 2.5倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏c 0.9倍的80目硅胶拌样，之后上样进行柱层析，装柱硅胶为160目，所用硅胶的重量为浸膏c重量8倍量；以体积比为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和1:1的氯仿和丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
E、高效液相色谱分离：将采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分采用高效液相色谱分离纯化，高效液相色谱分离纯化的具体方法是：以体积浓度为55%的甲醇水溶液为流动相，流速20 ml/min，以21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为355 nm，每次进样80μL，收集34.2 min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的黄酮类化合物。
其中，A步骤的溶剂为甲醇。所述B步骤的有机溶剂为乙醚。
本实施例采用山楂粉10 kg，得到浸膏a 820 g，浸膏b 315 g，浸膏c 220 g，体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分63 g。
实施例5
山楂样品来源于四川西康，品种为歪把红。
A、浸膏提取：将山楂粉用溶剂超声提取4次，每次所用提取溶剂的质量为山楂粉质量的5倍，每次提取时间为35分钟，合并提取液并过滤，滤液减压浓缩至刚有沉淀物析出，静置55分钟，滤除沉淀物，之后将所得滤液减压浓缩成浸膏a；
B、有机溶剂萃取：向浸膏a中加入重量是浸膏a重量1.6倍的水，然后用有机溶剂萃取4次，每次所用有机溶剂的体积与水体积的相同，合并有机溶剂萃取相，之后将合并得到的有机溶剂萃取相减压浓缩成浸膏b；
C、MCI脱色：向浸膏b中加入是浸膏b重量4.5倍的体积浓度为95%甲醇水溶液，待浸膏b完全溶解后，上MCI柱，用体积浓度为94%甲醇水溶液进行洗脱，合并洗脱液，之后将合并后的洗脱液减压浓缩成浸膏c；
D、硅胶柱层析：浸膏c先用重量是浸膏c 2.4倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏c 1倍的100目硅胶拌样，之后上样进行柱层析，装柱硅胶为200目，所用硅胶的重量为浸膏c重量7倍量；以体积比为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和1:1的氯仿和丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
E、高效液相色谱分离：将采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分采用高效液相色谱分离纯化，高效液相色谱分离纯化的具体方法是：以体积浓度为55%的甲醇水溶液为流动相，流速20 ml/min，以21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为355 nm，每次进样120μL，收集34.2 min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的黄酮类化合物。
其中，A步骤的溶剂为体积浓度为95%的甲醇水溶液。所述B步骤的有机溶剂为石油醚。
实施例6
采用实施例1方法制备得到的黄酮类化合物的结构通过以下方法进行测定：
本发明化合物为黄色胶状物；
HRESI-MS显示其准分子离子峰为349.1059 [M+Na]+(计算值349.1052)，结合1H NMR和DEPT谱确定其分子式为C19H18O5，不饱和度为11。红外光谱中显示了羟基(3408)、羰基(1665)和芳环(1614、1550和1438 cm-1)的共振吸收峰。而紫外光谱在210、250、355 nm有最大吸收也说明了化合物中可能存在芳环结构。
化合物的1H和13C NMR谱数据（如表1、图1和图2）显示其含有19个碳和18个氢，包括1个1,2,4,5-四取代的苯环(C-5~C-10，H-5、H-6)，1个1,2-二取代的苯环(C-1'~C-6'，H-3'~H-6')，1个α,β-不饱和羰基(C-2、C-3、C-4，H-3)，1个羟丙基(C-1''~C-3''，H2-1''~H2-3'')，1个甲氧基 (d C 56.3 q，d H 3.84 s)，以及1个酚羟基(d H 10.90 s)。根据典型的2个苯环、α,β-不饱和羰基和双键信号，可推测该化合物为黄酮类化合物。根据H-3和C-2、C-4、C-10、C-1′，H-5和C-4、C-9、C-10，H-8和C-6、C-7、C-9、C-10，以及H-6′和C-2的HMBC相关(如图2)可进一步确认化合物为黄酮类结构。化合物的母体确定后，其余的取代基，羟丙基、甲氧基和酚羟基可视为黄酮上的取代基。
化合物的HMBC谱中(如图3)可观察到甲氧基氢(d H 3.84)与C-6(d C 153.0)的HMBC相关，可推测该甲氧基分别取代在C-6位；根据H2-1'' (d H 2.79)与C-6(d C 153.0)、C-7(d C130.5)、C-8(d C 116.7)，H2-2'' (d H1.90)与C-7(d C 130.5)，以及H-8 (d H 6.79)和C-1''(d C28.8)的HMBC相关，可证实羟丙基取代在C-7位。酚羟基取代在C-2'可通过酚羟基氢(d H10.90)和C-1' (d C 119.4)、C-2' (d C 158.4) 和C-3' (d C 116.3)的HMBC相关得到确认。另外典型的苯环上质子信号[H-5，d H 7.16 s；H-8, d H 6.79 s，H-3′, d H 6.90 (d) 7.6；H-4′，d H 7.31 (t) 7.6；H-5′，d H 6.85 (t) 7.6；H-6′，d H 7.71(d) 7.6]也可证实化合物1的B环为6,7-位二取代，C环为2'-位单取代。
至此，化合物的结构得到确定，并命名为：2′-羟基-7-(3-羟丙基)-6-甲氧基-黄酮。
实施例7
取实施例2-5制备的化合物，为黄色胶状物。测定方法与实施例6相同，确认实施例2-5制备的化合物为所述黄酮类化合物——2′-羟基-7-(3-羟丙基)-6-甲氧基-黄酮。
实施例8
取实施例1-5中任一制备的黄酮类化合物进行卷烟滤嘴的添加效果试验，试验情况如下：
供添加用卷烟为红塔集团的卷烟“红塔山经典”，用三醋酸甘油酯将上述黄酮类化合物用配成0.1 mg/mL的溶液。按滤嘴丝束重量的8%均匀的喷洒到滤嘴丝束上，制成滤棒，然后将该滤棒通过常规的卷烟卷接制成卷烟，进行感官评析，并以未添加该化合物的相同卷烟作为对照。评析结果表明：卷烟抽吸时烟气更清晰圆润，生津感得到加强，喉部刺激性得到降低，口腔略带回甜感，余味改善明显。
实施例9
取实施例1-5中任一制备的黄酮类化合物进行卷烟滤嘴的添加效果试验，试验情况如下：
供添加用卷烟为红云红河集团的卷烟“紫云”，用三醋酸甘油酯将上述黄酮类化合物用配成0.5 mg/mL的溶液。按滤嘴丝束重量的5%均匀的喷洒到滤嘴丝束上，制成滤棒，然后将该滤棒通过常规的卷烟卷接制成卷烟，进行感官评析，并以未添加该化合物的相同卷烟作为对照。评析结果表明：，卷烟抽吸时烟气更清晰圆润，生津感得到加强，喉部刺激性得到降低，口腔略带回甜感，余味改善明显。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (8)
1.一种山楂中的黄酮类化合物，其特征在于，所述黄酮类化合物命名为：2′-羟基-7-(3-羟丙基)-6-甲氧基-黄酮，英文名为：2′-hydroxy-7-(3-hydroxypropyl)-6-methoxy-flavone，其分子式为C19H18O5，其结构式如式（I）所示：
，式（I）。
2.权利要求1所述的山楂中的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，以山楂为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、MCI脱色、硅胶柱层析和高效液相色谱分离步骤制得，具体为：
A、浸膏提取：将山楂粉用溶剂超声提取2~5次，每次所用提取溶剂的质量为山楂粉质量的2~6倍，每次提取时间为30~60分钟，合并提取液并过滤，滤液减压浓缩至刚有沉淀物析出，静置20~60分钟，滤除沉淀物，之后将所得滤液减压浓缩成浸膏a；
B、有机溶剂萃取：向浸膏a中加入重量是浸膏a重量1~3倍的水，然后用有机溶剂萃取3~5次，每次所用有机溶剂的体积与水体积的相同，合并有机溶剂萃取相，之后将合并得到的有机溶剂萃取相减压浓缩成浸膏b；
C、MCI脱色：向浸膏b中加入是浸膏b重量3~5倍的体积浓度为95%甲醇水溶液，待浸膏b完全溶解后，上MCI柱，用体积浓度为90%~95%甲醇水溶液进行洗脱，合并洗脱液，之后将合并后的洗脱液减压浓缩成浸膏c；
D、硅胶柱层析：将浸膏c上硅胶柱层析，装柱硅胶为160~200目，所用硅胶的重量为浸膏c重量6~10倍量；以体积比为1:0~0:1的氯仿和丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
E、高效液相色谱分离：将采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分采用高效液相色谱分离纯化，即得所述的黄酮类化合物。
3.根据权利要求2所述的山楂中的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，所述A步骤的溶剂为体积浓度为70~100%的丙酮水溶液、体积浓度为90~100%的乙醇水溶液或体积浓度为90~100%的甲醇水溶液。
4.根据权利要求2所述的山楂中的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，所述B步骤的有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙醚或石油醚。
5.根据权利要求2所述的山楂中的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，所述D步骤中浸膏c在经硅胶柱层析前，先用重量是浸膏c 1.5~3倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏c 0.5~2.0倍的80~100目硅胶拌样，之后上样。
6.根据权利要求2所述的山楂中的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，所述D步骤中，梯度洗脱时，所使用的氯仿和丙酮混合有机溶剂的体积比依次为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和1:1；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱。
7.根据权利要求2所述的山楂中的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，所述E步骤的高效液相色谱分离纯化是以体积浓度为55%的甲醇水溶液为流动相，流速20 ml/min，以21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为355nm，每次进样50~200μL，收集34.2 min的色谱峰，多次累加后蒸干。
8.权利要求1所述的山楂中的黄酮类化合物作为制备卷烟滤嘴添加剂的应用。
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Citations (2)
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| CN107118194A (zh) * | 2017-06-02 | 2017-09-01 | 云南中烟工业有限责任公司 | 一种能改善卷烟抽吸喉部舒适性的异黄酮类化合物及其制备方法与应用 |
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| 李小斌 等: "山楂黄酮萃取工艺优化及在卷烟中的应用", 《食品工业》 * |
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