CN107561297A - 用于血脂分型检测的试剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于血脂分型检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括：烷基酚聚氧乙烯醚，曲拉通X‑100，胆固醇酯酶，胆固醇氧化酶，过氧化物酶，磷酸盐缓冲液，苯酚，4‑氨基安替比林，PC300。本发明的试剂配方，通过添加特定比例和配比的烷基酚聚氧乙烯醚和曲拉通X‑100，能够使得脂蛋白被溶解掉，释放出内部含有的胆固醇或胆固醇酯，胆固醇酯在胆固醇酯酶的作用下生成胆固醇，胆固醇经过胆固醇氧化酶的作用生成胆甾‑4‑烯‑3‑酮和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下与苯酚、4‑氨基安替比林(4‑AAP)作用生成有色物质，通过检查吸光度的变化，计算不同的脂蛋白的含量。

Description

用于血脂分型检测的试剂

技术领域

本发明属于体外诊断领域，具体而言是检测血清样本中的不同密度的脂蛋白中的胆固醇含量。

背景技术

血液中的脂蛋白可以根据其密度大小分为高密度脂蛋白(HDL)，低密度脂蛋白(LDL)，极低密度脂蛋白(VLDL)和乳糜微粒(CM)四大类。不同种类的脂蛋白胆固醇对于引起动脉粥样硬化的能力不一样。通常临床上检测最多的组分是高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，就常规而言，高密度脂蛋白胆固醇对于动脉血管有一定的保护作用，其含量高发生心血管疾病的风险就低，低密度脂蛋白胆固醇则易引起动脉粥样硬化，增大发生心血管疾病的风险。然而，最近的研究表明，即使LDL-C的含量较低，有部分人群也容易发生心血管疾病，而部分LDL-C含量较高的人群却不一定会发生心血管疾病。这可能与LDL-C的不均一性有关，有研究显示，低密度脂蛋白的亚组分中颗粒较小密度较大的LDL称为小而密低密度脂蛋白(small dense Low-Density Lipoprotein，简称sdLDL)；而将颗粒较大、密度较低的LDL称为大而轻LDL。相比之下，sdLDL致动脉粥样硬化的能力更强，是目前公认的引发心血管疾病的重要危险因子之一。高密度脂蛋白胆固醇事实上也有较大的不均一性，按照密度来区分，可将HDL分为HDL2和HDL3，其中HDL2的密度较小颗粒较大，HDL3的密度较大颗粒较小，检测HDL的亚型与动脉粥样硬化的相关性更大。VLDL是富含甘油三酯的脂蛋白，目前临床上没有良好的检测手段，导致该项目在临床上并未得到推广，通常情况下，只是检测甘油三酯的含量来大致估算，且并不准确。脂蛋白(a)是人血浆中的一类特殊的脂蛋白，其特点是一分子的载脂蛋白(apo)B以二硫键与apo(a)相连，其含量高低主要与遗传因素相关。通常临床上检测Lpa是通过检测其上的apo(a)蛋白，但由于其具有多个重复结构，导致很多利用免疫法检测的结果并不准确。其它的如中间密码脂蛋白(IDL)，残粒样脂蛋白胆固醇(RLP-C)等，均与心血管疾病相关，但由于检查步骤繁琐，基本上很少应用到临床上。

目前常规的临床检测方法都只能检测一个或少数几个指标，能够同时检测多个指标，或者能够反应脂蛋白胆固醇分布的技术非常有限，并且基本停留在科研阶段，真正实现临床应用的并不多。其中电泳法是发展比较早的一门技术，在脂蛋白的检测中经常用到，首先经过电泳分离脂蛋白后，再用相应的方法染色，如染色脂蛋白，也有染色胆固醇的，在通过扫描将数据收集分析。该方法由于中间步骤繁琐，电泳分离精度和染色扫描等步骤的精度问题，使得该方法的精密度和准确度有待考量。另一种方法是核磁共振法，但是该法的技术门槛较高，不仅仪器昂贵，且对操作人员的要求高，故而该方法更加适合于科研用途，而在临床检验中推广有一定的难度。相比之下，美国专利US5284773，US5633168公开了一种血浆脂蛋白及其亚组分检测技术，该技术在精密度、准确度等方面均有一定的优势。该技术是利用超速离心分离脂蛋白，再用专用仪器检测连续的脂蛋白胆固醇，进而得出脂蛋白胆固醇谱图，计算各个组分的脂蛋白胆固醇含量。本文将该专用血脂检测的仪器称为血脂分型检测仪。由于该技术利用了垂直转子，使得离心时间大大缩短，且所需的样本量为50ul。但是该血脂分型检测仪需要相应的检测试剂，当样本与试剂混合时，流经一个连续的管路，在管路中完成反应，并经检测器检测。由于管路越长，反应时间就越长，反应就能够进行得越充分，但与此同时当管路越长的时候，检测的分辨率就越差，而想要提高分辨率，就必须缩短管路，这就造成了矛盾。目前常规的检测试剂，一般需要120s以上才能是反应基本完成，且检测线性范围较窄，不利于在血脂分型检测仪器上进行反应。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种在短时间能快速完成反应的用于血脂分型检测的试剂，使之能够快速方便地用于血脂检测仪器，检测血清样本中的血脂分布状况。本发明所述的试剂配方简单易制，成本低，能够大规模地产业化配制。

本发明人通过长期地研究发现，烷基酚聚氧乙烯醚对于与不同脂蛋白胆固醇反应有一定的促进作用，因此通过烷基酚聚氧乙烯醚和其它表面活性剂的组合，能够实现对血脂快速的检测。

具体地，本发明检提供的一种用于血脂分型检测的试剂，所述试剂包括：烷基酚聚氧乙烯醚，曲拉通X-100，胆固醇酯酶，胆固醇氧化酶，过氧化物酶，磷酸盐缓冲液，苯酚，4-氨基安替比林，PC300(ProClin300)。

本发明上述的烷基酚聚氧乙烯醚在试剂中的浓度为0.01％-1％(质量百分比)，优选烷基酚聚氧乙烯醚的浓度为0.1％。

本发明上述的烷基酚聚氧乙烯醚可以为己基酚聚氧乙烯醚，庚基酚聚氧乙烯醚，辛基酚聚氧乙烯醚，壬基酚聚氧乙烯醚，癸基酚聚氧乙烯醚，十二烷基聚氧乙烯醚等中的一种或者多种。

本发明上述的曲拉通X-100在试剂中的浓度为0.01％-5％(质量百分比)，优选0.1％-1％，更优选0.5％。

本发明上述的胆固醇酯酶在试剂中的浓度为0.1-20KU/L，优选胆固醇酯酶的浓度为1-5KU/L，更优选胆固醇酯酶的浓度为2KU/L。

本发明上述的胆固醇氧化酶在试剂中的浓度为0.1-20KU/L，优选胆固醇氧化酶的浓度为1-5KU/L，更优选胆固醇氧化酶的浓度为2KU/L。

本发明上述的过氧化物酶在试剂中的浓度为0.1-20KU/L，优选过氧化物酶的浓度为0.5-5KU/L，更优选过氧化物酶在试剂中的浓度为1KU/L。

本发明上述的磷酸盐缓冲液在试剂中的浓度为10-500mM，pH 6～9，优选20-100mM，pH 6.5-8，更优选50mM，pH7.0。

本发明上述的苯酚在试剂中的浓度为0.1-10mM，优选苯酚的浓度为2mM，4-氨基安替比林在试剂中的浓度为0.1-10mM，优选浓度为2mM。

本发明上述的PC300在试剂中的浓度为0.01％-1％，优选PC300的浓度为0.1％。

本发明所述的试剂中，各个主要成分的作用如下：首先，血清样本中的不同密度的脂蛋白在表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚和曲拉通X-100的作用下，使得脂蛋白被溶解掉，释放出内部含有的胆固醇或胆固醇酯，胆固醇酯在胆固醇酯酶的作用下生成胆固醇，胆固醇经过胆固醇氧化酶的作用生成胆甾-4-烯-3-酮和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下与苯酚、4-氨基安替比林(4-AAP)作用生成有色物质，通过检查吸光度的变化，计算不同的脂蛋白的含量。同时，在该反应中，利用特殊的表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚，该表面活性剂能够加速脂蛋白的溶解，使脂蛋白内部的胆固醇酯能够更快地释放出来，同时该表面活性剂的存在还有利于胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的加速催化作用，使整个反应加速进行，能够在较短的时间内完成整个反应。

在整个检测过程中，特殊的表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚和曲拉通X-100联合使用对于与脂蛋白胆固醇的快速反应至关重要，本发明人还发现，具体的烷基酚聚氧乙烯醚实例有己基酚聚氧乙烯醚，庚基酚聚氧乙烯醚，辛基酚聚氧乙烯醚，壬基酚聚氧乙烯醚，癸基酚聚氧乙烯醚，十二烷基聚氧乙烯醚等。作为商品化的原料，如巴斯夫的Lutensol AP类型，分别为Lutensol AP 6，Lutensol AP 7，Lutensol AP 8，Lutensol AP 9，Lutensol AP10，Lutensol AP 12等。其中优选Lutensol AP 8和Lutensol AP 12的效果更佳。

对于烷基酚聚氧乙烯醚表面活性剂的用量，一般而言没有太大的限制，通常0.01％-1％的浓度范围比较合适，更常用的是0.05％，0.1％，0.2％等浓度；在这些浓度下往往能够获得较好的效果。对于曲拉通X-100而言，需要使用足够的量使脂蛋白能够完全溶解，使位于脂蛋白核心的胆固醇酯充分释放，进而跟胆固醇酯酶和氧化酶作用。故使用量一般要在0.01％-5％之间，用量不足，无法使脂蛋白完全溶解，用量过多，可能导致试剂的粘度增高等问题出现；因此，更常使用的量是0.1％-1％，更优选的使用量是0.2％，0.5％，0.75％，1％。

对于胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶和过氧化物酶而言，应当有足够的量，促使反应能够快速完全地进行下去，过量的酶对于快速反应至关重要，因此合理的范围为0.1-20KU/L，优选的范围为1-5KU/L，更常用的浓度为1KU/L，2KU/L，3KU/L，4KU/L，5KU/L。

对于色原物质而言，其主要目的是提供显色所必须的物质，通常的如苯酚、4-氯酚和4-AAP组合，这些都是比较稳定的色原物质，通常情况下，这些物质的使用量为0.1-10mM，更为常用的量是0.5mM，1mM，2mM，3mM，4mM，5mM等。

血脂分型检测试剂中，还应当包含适当的缓冲液，如磷酸盐缓冲液(PB)，该缓冲液具有良好的生物相容性，且缓冲能力合适，通常使用的pH值范围为6.0-9.0间，优选6.5-8.0，为了发挥酶活的最大作用，选择pH7.0是较为合适的，其选用的缓冲液浓度一般在10-500mM之间，优选20-100mM，更常用的是25mM，50mM，75mm等。

此外，为了使试剂盒有足够长的有效期，经常需要添加一些防腐剂，如叠氮钠，PC300用以抑制微生物的污染等问题，通常情况下，需要抑制微生物生长的防腐剂浓度范围为0.01％-1％，更常用的浓度是0.02％，0.05％，0.1％，0.2％等浓度。

本发明的优点和有益效果

1.本发明的试剂配方，通过添加特定比例和配比的烷基酚聚氧乙烯醚和曲拉通X-100，能够使得脂蛋白被溶解掉，释放出内部含有的胆固醇或胆固醇酯，胆固醇酯在胆固醇酯酶的作用下生成胆固醇，胆固醇经过胆固醇氧化酶的作用生成胆甾-4-烯-3-酮和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下与苯酚、4-氨基安替比林(4-AAP)作用生成有色物质，通过检查吸光度的变化，计算不同的脂蛋白的含量。同时，在该反应中，利用特殊的表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚，该表面活性剂能够加速脂蛋白的溶解，使脂蛋白内部的胆固醇酯能够更快地释放出来，同时该表面活性剂的存在还有利于胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的加速催化作用，使整个反应加速进行，能够在较短的时间内完成整个反应。

2.本发明的血脂胆固醇检测试剂，能与血清中的脂蛋白胆固醇更快地反应。在60s内，反应完成率达到90％以上，甚至95％以上，而常规的胆固醇试剂则至少需要120s的时间，且当遇到高值样本时，即使120s也不能完成90％的反应；而之所以有这种效果证实由于本发明特殊的表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚采用才获得的。故而，本发明的血脂检测试剂能够在血脂分型检测仪器上使用，具有快速反应的优势，本发明试剂的使用调和了现有技管路长和分辨率低的矛盾，既实现了较短的管路需求和较高的分辨率效果，更加有利于在血脂分型检测仪器上进行反应。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。未在下列实施例中说明的条件或实验方法，均按照常规方法或按照厂家提供的说明书进行。

本发明试剂的配制方法，即采用水为溶剂，各个组分按照本发明上述配方比例范围进行配制即可。

实施例

按照以下表格中的配方配制试剂，共有6组。

表1不同试剂的配方

其中，血清样本试剂比例，样本：试剂＝3：150。在样本与试剂孵育时开始计时，总共反应10min，同时监测546nm处的吸光度变化，至少记录反应开始60s，120s和600s时的吸光度，以反应终点600s为100％反应完成，计算不同时间点的反应完成率，如60s的反应完成率＝60s的吸光度/600s的吸光度，120s的反应完成率＝120s的吸光度/600s的吸光度。利用上述配制的6种试剂检测，同时增加市售的胆固醇试剂作为对照试剂，同时进行比对检测，样本为常规血清，其中胆固醇值分别约为150mg/dL和300mg/dL。具体结果见表2。

表2反应速率比较

由表2可知，本发明的血脂胆固醇检测试剂，能与血清中的脂蛋白胆固醇更快地反应。在60s内，反应完成率达到90％以上，甚至95％以上，而常规的胆固醇试剂则至少需要120s的时间，且当遇到高值样本时，即使120s也不能完成90％的反应。故而，本发明的血脂检测试剂能够在血脂分型检测仪器上使用，具有快速反应的优势。

实施例2

样本检测结果比较

由于本发明的试剂能够更快地进行反应，故可以应用在血脂分型检测仪上。

取血清50ul，加入1950ul的KBr(密度调节至1.21)稀释，混匀。取一5.1ml的指封管，加入3800ul的生理盐水，再从底部缓缓加入预先稀释好的血清样本1200ul。将该离心管放入转子VTi-65.2转子中，并用Beckman超速离心机离心。参数：转速＝65000rpm，ω2t＝6.6*1010rad2/sec，温度＝23℃，加速＝6，减速＝6。

将离心后的样本小心地移至本发明VAP仪器上，进行检测，检测参数为：样本流速1.0ml/min，试剂流速1.0ml/min。用市售胆固醇试剂及本发明的6种配方的试剂进行检测比较。结果见表3。

表3不同试剂的检测结果比较

由表3可知，本发明的6种配方的检测结果之间较为一致，而市售的胆固醇试剂检测结果较本发明的检测结果偏低约10％左右，其可能的原因是，普通的胆固醇试剂，在血脂分型检测仪器上没有充足的反应时间，导致其反应未能充分进行，进而使得检测结果偏低。这种检测样本结果偏低的情况，在样本值约高的情况下，将显得越发严重。故在血脂分型检测仪上，不能直接应用普通的胆固醇试剂，应当利用本发明的血脂分型检测试剂。

实施例3

线性实验

由于血脂分型检测仪可以检测出不同成分的脂蛋白胆固醇，而其中，低密度脂蛋白胆固醇占总胆固醇的含量最高，因此利用分析LDL-C的线性范围，借以说明本发明试剂与血脂分型检测试剂配套后的可检测线性范围。取一LDL-C的高值标本，稀释成不同浓度的值，用本发明的配方和对照试剂进行检测，其检测结果如表4所示

表4线性范围

由表4可知，本发明的血脂分型检测试剂明显优于传统的胆固醇检测试剂，其线性范围上限能够达到600mg/dL，而普通的胆固醇检测试剂，在0～600mg/dL的范围内，检测样本值基本都偏低，可能是有相当一部分的样本未能完全进行反应，不能满足日常检测的应用。由于本发明利用了特殊的表面活性剂，使得本发明的试剂与不同脂蛋白胆固醇的反应速率大大加快，当遇到较高值的样本时，也能够在较短的时间内反应完全，故使得本发明的血脂分型检测试剂具有较宽的线性范围。

Claims (10)

1.一种用于血脂分型检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括：烷基酚聚氧乙烯醚，曲拉通X-100，胆固醇酯酶，胆固醇氧化酶，过氧化物酶，磷酸盐缓冲液，苯酚，4-氨基安替比林，PC300。

2.根据权利要求1所述的用于血脂分型检测的试剂，其特征在于：所述的烷基酚聚氧乙烯醚的浓度为0.01％-1％，优选为0.1％。

3.根据权利要求1所述的用于血脂分型检测的试剂，其特征在于：所述的烷基酚聚氧乙烯醚为己基酚聚氧乙烯醚，庚基酚聚氧乙烯醚，辛基酚聚氧乙烯醚，壬基酚聚氧乙烯醚，癸基酚聚氧乙烯醚，十二烷基聚氧乙烯醚中的一种或者多种。

4.根据权利要求1所述的用于血脂分型检测的试剂，其特征在于：所述的曲拉通X-100的浓度为0.01％-5％，优选为0.1％-1％，更优选为0.5％。

5.根据权利要求1所述的用于血脂分型检测的试剂，其特征在于：所述的胆固醇酯酶的浓度为0.1-20KU/L，优选胆固醇酯酶的浓度为1-5KU/L，更优选胆固醇酯酶的浓度为2KU/L。

6.根据权利要求1所述的用于血脂分型检测的试剂，其特征在于：所述的胆固醇氧化酶的浓度为0.1-20KU/L，优选胆固醇氧化酶的浓度为1-5KU/L，更优选胆固醇氧化酶的浓度为2KU/L。

7.根据权利要求1所述的用于血脂分型检测的试剂，其特征在于：所述的过氧化物酶的浓度为0.1-20KU/L，优选为0.5-5KU/L，更优选为1KU/L。

8.根据权利要求1所述的用于血脂分型检测的试剂，其特征在于：所述的磷酸盐缓冲液的浓度为10-500mM、pH 6～9，优选20-100mM、pH 6.5-8，更优选50mM、pH7.0。

9.根据权利要求1所述的用于血脂分型检测的试剂，其特征在于：所述的苯酚的浓度为0.1-10mM，优选为2mM；4-氨基安替比林的浓度为0.1-10mM，优选为2mM。

10.根据权利要求1所述的用于血脂分型检测的试剂，其特征在于：所述的PC300的浓度为0.01％-1％，优选为0.1％。