CN107556300A

CN107556300A - 一类吲哚细胞松弛素类化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN107556300A
Application number: CN201710892685.9A
Authority: CN
Inventors: 杨斌; 刘永宏; 周雪峰; 王俊锋; 董俊德; 廖升荣
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: Shaanxi Biochemical Industry Technology Innovation Platform Co.,Ltd.
Priority date: 2017-09-27
Filing date: 2017-09-27
Publication date: 2018-01-09
Anticipated expiration: 2037-09-27
Also published as: CN107556300B

Abstract

本发明公开了一类吲哚细胞松弛素类化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明吲哚细胞松弛素类化合物是从真菌(Micromonospora sp.)DPZ‑SYz‑2‑3的发酵培养物中分离纯化得到，其结构式分别如式(I)、式(II)和式(III)所示；本发明吲哚细胞松弛素类化合物具有显著的抗肿瘤活性，可用于开发抗肿瘤药物，对中国海洋药物资源开发具有重要意义；

Description

一类吲哚细胞松弛素类化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属微生物及其天然产物的应用技术领域，更具体地说，本发明涉及从真菌(Micromonospora sp.)DPZ-SYz-2-3的发酵培养物中分离纯化得到的一类吲哚细胞松弛素类化合物，以及将该化合物应用于制备抗肿瘤药物中。

背景技术

癌症是威胁人类生命的三大致死性疾病之一，据世界卫生组织统计，全球有4000多万肿瘤患者，其中每年因患癌症而死亡的人数都在700万以上，预计到2030年，每年因患癌症而死亡的人数将到达1700万，如何挽救癌症患者的生命已经成为一个世界性的难题。对于恶性肿瘤的治疗，天然产物及其衍生物药物发挥着重要作用。

海洋真菌是产生新的活性物质、生产新药的巨大宝库。从海洋真菌的应用意义上来说，对海洋真菌的活性代谢产物的研究对寻找新的抗肿瘤药物有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于：根据目前治疗肿瘤的药物仍不够全面有效，及海洋资源应用亟待开发等问题，提供一类吲哚细胞松弛素类化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一类吲哚细胞松弛素类化合物1～3，其结构式分别如式(I)、式(II)和式(III)所示：

本发明吲哚细胞松弛素类化合物是从真菌(Micromonospora sp.)DPZ-SYz-2-3的发酵培养物中分离纯化得到，其中，所述真菌(Micromonospora sp.)DPZ-SYz-2-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.4810，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2011年5月16日。

为了实现上述发明目的，本发明还提供了吲哚细胞松弛素类化合物的制备方法，其包括如下步骤：

(1)将真菌(Micromonospora sp.)DPZ-SYz-2-3接种至种子培养基中培养，得到种子培养液；

(2)将种子培养液接种至发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵培养物；

(3)将发酵培养物用丙酮浸泡，减压蒸馏浓缩得到浸膏；

(4)将浸膏溶解，用乙酸乙酯萃取、减压蒸馏浓缩，得到乙酸乙酯萃取部位，经正向硅胶柱层析，再用氯仿-甲醇作为洗脱剂从体积比10:0～5:5梯度洗脱，得到17个流份Frs.a～n；

将Fr.i经正相硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂从体积比6:1～1:1梯度洗脱，得到15个流份Frs.i1～i15；

将Frs.i8用HPLC制备，选用YMC半制备柱，流动相是体积比为60:40的甲醇/水洗脱，流速为2.0ml/min，波长为220nm，出峰时间为48min，纯化得到如式(I)所示的吲哚细胞松弛素类化合物(化合物1)；

将Frs.i14用HPLC制备，选用YMC半制备柱，流动相是体积比为65:35的甲醇/水洗脱，流速为2.0ml/min，波长为220nm，出峰时间为43min，纯化得到如式(II)所示的吲哚细胞松弛素类化合物(化合物2)；

将Frs.k用葡聚糖凝胶层析，以体积比为1:1的氯仿-甲醇为洗脱剂洗脱，得到4个流份Frs.k1～k4，将其中的Frs.k1用HPLC制备，选用YMC半制备柱，流动相是体积比为57:43的甲醇/水洗脱，流速为2.0ml/min，波长为220nm，出峰时间为53min，纯化得到如式(III)所示的吲哚细胞松弛素类化合物(化合物3)。

为了实现上述发明目的，本发明还提供了吲哚细胞松弛素类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

通过对化合物1～3的抗肿瘤活性评价，发现化合物2和化合物3对人非小细胞肺腺癌(H1975)、组织细胞淋巴瘤(U937)、红白血病(K562)、人胃癌(BGC823)、人急性淋巴母细胞白血病(MOLT-4)、人乳腺癌(MCF-7)、人肺腺癌(A549)、人宫颈癌(Hela)、人早幼粒白血病(HL60)和人肝癌(Huh-7)都具有一定的抑制作用；其中，化合物1对组织细胞淋巴瘤(U937)有一定的抑制作用；化合物2对Huh-7、U937和MOLT-4，以及化合物3对Huh-7、BGC823、MCF-7、U937、HL60、Hela和MOLT-4肿瘤细胞株的IC₅₀均<5μM，可以作为抗肿瘤药物开发的先导化合物。

相对于现有技术，本发明具有如下优点：

本发明从真菌(Micromonospora sp.)DPZ-SYz-2-3的发酵培养物中分离纯化得到一类吲哚细胞松弛素类化合物，该化合物具有显著的肿瘤细胞抑制活性，因此，本发明为抗肿瘤药物的创新开发提供了备选化合物，对中国海洋药物资源开发也具有重要意义。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式，对本发明一类吲哚细胞松弛素类化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用、有益效果进行详细说明。

图1是本发明中化合物1和2核磁共振¹H-¹H COSY和HMBC相关图谱。

图2是本发明中化合物1核磁共振NOESY相关图谱。

图3是本发明化合物1-3圆二色谱(CD)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。

实施例1

化合物1～3的制备及结构鉴定：

1.制备真菌(Micromonospora sp.)DPZ-SYz-2-3的发酵培养物

MB种子培养基配置：麦芽浸膏15g，精海盐10g，用蒸馏水1000ml溶解，加入15颗玻璃珠，调节pH为7.4～7.8。装100mL三角瓶，每瓶装10mL，115℃，保温30分钟灭菌。接入菌株，27℃，200rpm，培养48小时。

大米培养基配置：选用1000mL三角瓶发酵，精海盐2g加蒸馏水200ml溶解与200g大米混合。115℃，保温30分钟灭菌。

发酵培养：在大米培养基中加入种子液，27℃，静置培养80天。

2.化合物1、2和3的分离纯化

发酵培养物用丙酮浸泡，减压蒸馏浓缩得到浸膏，浸膏用3升水溶解后，用3升乙酸乙酯萃取，减压蒸馏浓缩得到乙酸乙酯萃取部位，乙酸乙酯萃取部位经正相硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂从体积比10:0～5:5梯度洗脱，得到17个流份(Frs.a-n)。

Fr.i经正相硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂从体积比6：1～1：1梯度洗脱，得到15个流份(Frs.i1-i15)。

Fr.i8用HPLC制备，选用YMC半制备柱(ODS-A,12nm,S-50μm)，流动相为体积比60/40的甲醇/水洗脱，流速为2.0ml/min，波长为220nm，出峰时间t_R＝48min，纯化即得到纯品即化合物1(3.0mg)。

Fr.i14用HPLC制备，选用YMC半制备柱(ODS-A,12nm,S-50μm)，流动相为体积比65/35的甲醇/水洗脱，流速为2.0ml/min，波长为220nm，出峰时间t_R＝43min，纯化即得到纯品即化合物2(3.2mg)。

Fr.k用葡聚糖凝胶层析，以氯仿-甲醇体积1：1为洗脱剂洗脱得到4个流份(Fr.k 1～Fr.k 4),Fr.k1用HPLC制备，选用YMC半制备柱(ODS-A,12nm,S-50μm)，流动相为体积比57/43的甲醇/水洗脱，流速为2.0ml/min，波长为220nm，出峰时间t_R＝53min，纯化得到纯品即化合物3(4.2mg)。

3.化合物1、2和3的结构鉴定

对化合物1、2和3进行质谱(MS)、核磁共振(NMR)、旋光(OR)和圆二色谱(CD)等数据测试，从而确定其化学结构。

4.化合物1结构鉴定：

高分辨质谱m/z 735.4008[M+H]⁺(calcd for 735.4004)建议其分子式为C₄₅H₅₅N₂O₇，含有20个不饱和度，¹H和¹³C NMR数据见表1，¹³C NMR结合DEPT-135谱，指出其45个碳信号包括：5个甲基，4个sp³杂化亚甲基，13个sp³杂化和14个sp²杂化的次甲基，1个sp³杂化和6个sp²杂化的季碳，两个酮基和一个酰胺基碳。通过分析发现其含有一个与chaetoglobosin O(Chem.Pharm.Bull.1983,31,490–498.)类似的吲哚环的细胞松弛素母核，差异主要是化合物1多出了13个碳信号，包括1个甲基(δ_H 5.69,1H,d,J＝5.5Hz；δ_C18.1),2个亚甲基(δ_H2.52,1H,m；2.35,1H,m；3.59,1H,m；3.98,1H,t,J＝8.5Hz；δ_C24.9,70.2),4个次甲基(δ_H 2.73,1H,m；2.88,1H,m；3.64,1H,m；3.81,1H,m；δ_C38.4,52.4,80.5,81.5),3对二取代的双键(δ_H 5.39,1H,dd,J＝9.0,6.0Hz；5.68,1H,m；5.74,1H,m；6.02,1H,m；6.07,1H,m；6.10,1H,m；δ_C122.9,127.9,129.5,129.9,130.8,133.6).¹H-¹H COSY(图1)确认了这多余的十三个碳的连接顺序C-21/C-22/C-26/C-27/C-28/C-29(38)/C-30/C-31/C-32(38)/C-33/C-34/C-35/C-36/C-37，HMBC的相关信息(图1)(H-21与C-20,C-22,C-23,C-26,C-28,和C-29,H-22与C-20,C-21,和C-23,H-30与C-28,C-29,和C-31,H-33与C-31,C-32,C-34,和C-38相关)进一步验证了该连接顺序，同时确认了十三碳的结构连接在细胞松弛素13碳环的C21和C22位置，H-38与C-30HMBC相关确证C-30与C-38通过一个氧相连成环(图1)，由此推测出化合物1的平面结构。化合物1的立体结构是通过NOESY(图2)和CD来确证，2DNOESY中H-3与H₃-11,H-4与H-8,和H-3与H-7相关.16位甲基是α起源，19位羟基是β起源是通过H-14与H-8和H-16,H-17与H-20和H-15α，以及H-13与H-15α和H-7的NOESY相关来确证，H-21与H-19,H-22和H-29，H-32与H-29和H-38α,H-33与H-30,H-31和H-38β推测H-21,H-22,H-29,和H-32是α起源和H-30和H-31是β起源.此外化合物1的CD谱与armochaetoglobin Z(Sci.Rep.2016,6.)一致从而确认化合物的立体构型(图3)。化合物1为崭新的结构，命名为acremoglobosin A。

表1

5.化合物2结构解析：

高分辨质谱m/z 531.2849[M+H]⁺(calcd for 531.2853)建议其分子式为C₃₂H₃₈N₂O₅含有20个不饱和度，NMR数据与文献中chaetoglobosin F很相近，区别是chaetoglobosin F中6,7-三元氧环被一个酮基和次甲基取代，¹H-¹H COSY(图1)确认了该片段的连接顺序[C-10/C-3/C-4/C-5(11)/C-6(12)]，通过H₃-11与C-4,C-5和C-6,H₃-12与C-5,C-6和C-7,H-6与C-7和H-8与C-1,C-7,C-9,C-13和C-23的HMBC相关进一步验证了该结构。化合物2与chaetoglobosin F的CD谱与NOESY谱完全一致(图3)，从而推测化合物2的立体构型。化合物2为崭新的结构，命名为acremoglobosin B。

化合物2核磁数据：¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ:7.47(1H,d,J＝8.0Hz,H-4′),7.40(1H,d,J＝8.0Hz,H-6′),7.24(1H,t,J＝7.5Hz,H-5′),7.16(1H,d,J＝7.5Hz,H-6′),7.06(1H,s,H-3′),6.15(1H,d,J＝9.0Hz,H-17),6.08(1H,dd,J＝9.5,13.5Hz,H-13),5.15(1H,dt,J＝11.5Hz,H-14),4.76(1H,s,H-20),3.75(1H,m,H-3),3.66(1H,d,J＝9.5Hz,H-8),3.07(1H,d,J＝12.5Hz,H-10a),2.72(2H,m,H-10b,H-16),2.66(2H,m,H-22),2.61(1H,m,H-4),2.44(1H,d,J＝13.0Hz),2.26(1H,m,H-5),2.12(3H,m,H-6,H-15),1.92(1H,m,H-21a),1.84(3H,s,H-25),1.70(1H,m,H-21b),1.17(3H,d,J＝3.0Hz,H-11),1.15(3H,d,J＝3.0Hz,H-12),1.03(3H,d,J＝6.5Hz,H-24)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ:212.4(C,C-7),206.6(C,C-23),203.5(C,C-19),172.8(C,C-1),149.1(CH,C-17),136.4(C,C-1′a),134.4(CH,C-13),134.1(C,C-18),127.0(C,C-3′a),124.8(CH,C-14),123.3(CH,C-2′),122.6(CH,C-5′),120.1(CH,C-7′),118.2(CH,C-4′),111.6(CH,C-6′),110.4(C,C-3′),71.6(CH,C-20),64.4(C,C-9),52.7(CH,C-3),52.1(CH,C-8),47.4(CH,C-4),46.4(CH,C-6),40.8(CH₂,C-15),36.7(CH₂,C-10),35.1(CH,C-5),33.3(CH,C-16),31.6(CH₂,C-21),29.7(CH₂,C-22),19.8(CH₃,C-24),16.1(CH₃,C-11),15.7(CH₃,C-12),12.3(CH₃,C-25)。

6.化合物3结构解析:

高分辨质谱和NMR数据与文献(Tetrahedron Lett.1976,1351–1354.)中chaetoglobosin E基本一致，NOESY确定化合物3的立体构型亦与文献一致，因此化合物3鉴定为chaetoglobosin E。

实施例2化合物2和3的抗肿瘤细胞的实验数据

采用国际通用的肿瘤细胞株，即：人非小细胞肺腺癌(H1975)，组织细胞淋巴瘤(U937)，红白血病(K562)，人胃癌(BGC823)，人急性淋巴母细胞白血病(MOLT-4)，人乳腺腺癌(MCF-7)，人肺腺癌(A549)，人宫颈癌(Hela)，人早幼粒白血病(HL60)，人肝癌(Huh-7)。以抗肿瘤药物Trichostatin A(TSA)为阳性对照，试验方法为国际通用的SRB法或MTT法。

化合物2和化合物3对这些肿瘤细胞的抑制活性数据如表2所示。

表2化合物2和化合物3在对多种肿瘤细胞的抑制活性(IC₅₀)

上述实验结果表明，化合物2和化合物3对肿瘤细胞的抑制作用虽然弱于抗肿瘤药物Trichostatin A，但从IC₅₀数值来看，可以认为有较强的抗肿瘤活性。尤其是化合物2对Huh-7，U937，MOLT-4，以及化合物3对Huh-7，BGC823，MCF-7，U937，HL60，Hela，MOLT-4，肿瘤细胞株的IC50均<5μM，可以做为抗肿瘤药物开发的先导化合物。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims

1.一类吲哚细胞松弛素类化合物，其特征在于，其结构式分别如式(I)、式(II)和式(III)所示：

2.权利要求1所述吲哚细胞松弛素类化合物的制备方法，其特征在于，所述吲哚细胞松弛素类化合物是从真菌(Micromonospora sp.)DPZ-SYz-2-3的发酵培养物中分离纯化得到。

3.根据权利要求2所述吲哚细胞松弛素类化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(3)将发酵培养物用丙酮浸泡，减压蒸馏浓缩得到浸膏；

将Frs.i8用HPLC制备，选用YMC半制备柱，流动相是体积比为60:40的甲醇/水洗脱，流速为2.0ml/min，波长为220nm，出峰时间为48min，纯化得到如式(I)所示的吲哚细胞松弛素类化合物；

将Frs.i14用HPLC制备，选用YMC半制备柱，流动相是体积比为65:35的甲醇/水洗脱，流速为2.0ml/min，波长为220nm，出峰时间为43min，纯化得到如式(II)所示的吲哚细胞松弛素类化合物；

将Frs.k用葡聚糖凝胶层析，以体积比为1:1的氯仿-甲醇为洗脱剂洗脱，得到4个流份Frs.k1～k4，将其中的Frs.k1用HPLC制备，选用YMC半制备柱，流动相是体积比为57:43的甲醇/水洗脱，流速为2.0ml/min，波长为220nm，出峰时间为53min，纯化得到如式(III)所示的吲哚细胞松弛素类化合物。

4.根据权利要求3所述吲哚细胞松弛素类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述培养的条件是27℃，200rpm，培养40～60h；所述种子培养基为MB培养基，每份包括：麦芽浸膏15g，精海盐10g，蒸馏水1000ml，pH7.4～7.8。

5.根据权利要求3所述吲哚细胞松弛素类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述发酵培养的条件是27℃静置培养70～90天；每份所述大米培养基包括：大米200g，精海盐2g，蒸馏水200ml。

6.权利要求1所述吲哚细胞松弛素类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，式(I)所示的吲哚细胞松弛素类化合物用于制备治疗组织细胞淋巴瘤的药物。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，式(II)所示的吲哚细胞松弛素类化合物用于制备治疗人肝癌、组织细胞淋巴瘤和/或人急性淋巴母细胞白血病的药物。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，式(III)所示的吲哚细胞松弛素类化合物用于制备治疗人肝癌、人胃癌、人乳腺癌、组织细胞淋巴瘤、人宫颈癌、人急性淋巴母细胞白血病和/或人早幼粒白血病的药物。

10.一种抗肿瘤药物，其特征在于，包括有效剂量的作为活性成分的权利要求1所述吲哚细胞松弛素类化合物，及药学上可接受的载体。