CN107550952A - 一种治疗乳腺浸润性导管癌的植物提取物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗乳腺浸润性导管癌的植物提取物及其制备方法。发明人经多年的攻克首次发现,确证沙棘萃取物可锁定并能选择性地治疗乳腺浸润性导管癌,沙棘萃取物对乳腺浸润性导管癌的有效率达到99.8‑99.9%,有望成为极具吸引力的治疗乳腺浸润性导管癌药物。可能的作用机制是通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和抑制血管生成而发挥抗乳腺浸润性导管癌作用。对治疗乳腺浸润性导管癌有较强的靶向性,并不产生耐药性,与传统化疗药无交叉耐药。沙棘萃取物安全而无毒,有望成为一种新的治疗乳腺浸润性导管癌的植物新药。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域,具体涉及一种植物提取物及其制备方法和应用,特别涉及沙棘提取物及其制备方法和应用。
背景技术
众所周知,恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康的多发病和常见病,与病毒性疾病、老年性疾病并称为现代医学的三大挑战,其发病机制尚未完全阐明,治疗效果亦不尽人意。据不完全统计,全球年均肿瘤的研发及治疗费用开支不低数百亿,给国家,社会和个人带来巨大损失。
一项最新调查结果显示,上海、北京及广州等城市乳腺癌已经成为对女性威胁最大的恶性肿瘤。发病率已经由1972年的17/10万发展到现在的52.98/10万,35年间增幅超过200%。
据世界卫生组织估计,全球每年约有120万妇女被确诊患乳腺癌。在我国乳腺癌已成为现代女性的“头号杀手”。
女性乳腺是由皮肤、纤维组织、乳腺腺体和脂肪组成的,乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。乳腺癌中99%发生在女性,男性仅占1%。
乳腺并不是维持人体生命活动的重要器官,原位乳腺癌并不致命;但由于乳腺癌细胞丧失了正常细胞的特性,细胞之间连接松散,容易脱落。癌细胞一旦脱落,游离的癌细胞可以随血液或淋巴液播散全身,形成转移,危及生命。目前乳腺癌已成为威胁女性身心健康的常见肿瘤。
全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。美国8名妇女一生中就会有1人患乳腺癌。中国不是乳腺癌的高发国家,但不宜乐观,近年我国乳腺癌发病率的增长速度却高出高发国家1~2个百分点。据国家癌症中心和卫生部疾病预防控制局2012年公布的2009年乳腺癌发病数据显示:全国肿瘤登记地区乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤的第1位,女性乳腺癌发病率(粗率)全国合计为42.55/10万,城市为51.91/10万,农村为23.12/10万。
非特殊性导管癌和所有乳腺癌一样在40岁以下妇女中少见,但年轻妇女与老年妇女的肿瘤分类比例是相同的。与已知的风险因素如地理、文化/生活方式、生育情况等相关的非特殊性导管癌的各型发病率无明显差异。在癌症发生过程中某些疾病如不典型导管增生和小叶内肿瘤与大多数高发病风险的特殊性乳腺癌,特别是小管癌和典型性小叶癌相关。与BRCA1基因突变相关的家族性乳腺癌通常为非特殊性导管癌,但具有髓样癌的特征,核分裂数高,大多数具有连续的向周围压排性边缘,与散发性乳腺癌相比淋巴细胞浸润明显。与BRCA2基因突变相关的家族性乳腺癌也常为非特殊性导管癌,但在其组织学分级中小管结构评分高(小管极少数),大部分肿瘤有一连续的向周围压排性边缘,与散发性乳腺癌相比核分裂数较低。
手术切除是浸润性导管癌的治疗常用方法之一,浸润性导管癌的手术治疗以根治性手术为主,其原则是:
①浸润性导管癌巢及区域淋巴结应作整块切除。
②切除全部乳腺组织,同时广泛切除其表面覆盖的皮肤。
③切除胸大肌及胸小肌。
④腋窝淋巴结作彻底的扩清。由于切除范围广,病人机体恢复较困难,并且外观异常也非常显著,随着外科技术的提高,仿根治术、肿块切除术等改良的手术方法越来越多地应用于浸润性导管癌的治疗中来。仿根治术就是保留胸大肌但切除其筋膜的根治术,通过临床观察,许多学者认为仿根治术与根治术治疗效果可以相比。肿块切除术主要用于早期浸润不广的浸润性导管癌的治疗。
现有治疗乳腺浸润性导管癌的方法局限性大,缺乏简便有效的治疗方法。迫切需要一种治疗乳腺浸润性导管癌的药物。
沙棘:性味归经:酸、涩、温。归脾、胃、肺、心经,无毒。拉丁名:Hippophaerhamnoides Linn.性状描述:采制10~11月采摘成熟果实,晒干。果实呈类球形或扁球形,有的数个粘连,单个直径5~8mm。表面橙黄色或棕红色,皱缩,基部具短小果梗或果梗痕,顶端有残存花柱。果肉油润,质柔软。种子斜卵形,长约4mm,宽约2mm,表面褐色,有光泽,中间有1纵沟,种皮较硬,种仁乳白色,有油性。气微,味酸、涩。原料来源:产河北、内蒙古、山西、陕西、甘肃、青海、四川西部。常生于海拔800-3600米温带地区向阳的山脊、谷地、干涸河床地或山坡,多砾石或沙质土壤或黄土上。中国黄土高原极为普遍。
CN105456311A公开了一种用于治疗乳腺癌、肝癌的沙棘提取物及其制备方法和其应用。本发明所述的沙棘提取物由下述方法制备得到:1)将沙棘果烘干后,制得沙棘干果;2)将沙棘干果粉碎至100~800目,制得沙棘粉;3)在4~25℃条件下,在沙棘粉中加入水,浸泡1-10h后,超声提取10min-6h,其中,沙棘粉:水的质量体积比为1:2-1:15,制得沙棘提取液;4)过滤,收集沙棘提取液,提取液经干燥,即得。该提取物对乳腺癌细胞的抑制率高达80.73%,对肝癌细胞的抑制率高达87.28%,且毒副作用小。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种疗效好的用于治疗乳腺浸润性导管癌的沙棘提取物。
本发明的另一个目的在于提供一种沙棘生物碱及其应用。
本发明所采取的技术方案是:
一种沙棘萃取物,其制备方法如下:
1)取沙棘干燥后粉碎,加入5~15倍的水,40~70℃搅拌浸出完全;
2)去除浸出液中的不溶物,干燥得到沙棘的水萃取物。
作为上述沙棘萃取物的进一步改进,固液分离后去除浸出液中的不溶物,滤液接着使用0.45μm的滤膜初滤,之后使用0.22μm的滤膜再次过滤,进一步去除不溶物。
作为上述沙棘萃取物的进一步改进,干燥时使用冷却干燥。
每kg沙棘萃取物中含有18~20g沙棘生物碱。
一种沙棘生物碱,其制备方法如下:
1)取上述的沙棘萃取物,500~700℃灰化完全,得灰化物;
2)将灰化物与水混合,搅拌溶解,去除不溶物,精滤后取滤液,干燥得到沙棘生物碱。
作为上述沙棘生物碱的进一步改进,精滤的操作为使用0.45μm的滤膜初滤,之后使用0.22μm的滤膜再次过滤。
沙棘萃取物在制备治疗乳腺浸润性导管癌药物中的应用,其中,沙棘萃取物如上所述。
一种治疗乳腺浸润性导管癌的药物,其起效成分为上述的沙棘萃取物。
药物为口服制剂。口服制剂包括但不限于片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液等常见的口服制剂。更进一步的,口服制剂为肠溶口服制剂。特别的,口服制剂为缓释制剂。
功能与主治:主要用于治疗乳腺浸润性导管癌。
用法用量:冻干粉或者喷雾干燥,颗粒剂及冲剂,标准/粒500mg,成人日服4-5次,四小时服/次,一次5-10克,30天一疗程,温开水空腹服药。
副作用:未观察到明显的毒副作用,无药物依赖性。
禁忌:孕妇及哺乳期间禁服。
本发明的有益效果是:
发明人经多年的攻克首次发现,1000克沙棘水萃取物(干重)中含有18~20g沙棘生物碱,至今尚无相关文献报道,确证沙棘萃取物(沙棘生物碱和沙棘多糖的混合物)可锁定并能选择性地治疗乳腺浸润性导管癌,沙棘萃取物有望成为极具吸引力的治疗乳腺浸润性导管癌药物。沙棘萃取物对治疗乳腺浸润性导管癌有效率达到99.8-99.9%。可能的作用机制是通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和抑制血管生成而发挥抗乳腺浸润性导管癌作用。对治疗乳腺浸润性导管癌有较强的靶向性,并不产生耐药性,与传统化疗药无交叉耐药。沙棘萃取物安全而无毒,有望成为一种新的治疗乳腺浸润性导管癌的植物新药。
沙棘萃取物具有新颖性,治疗乳腺浸润性导管癌呈现多靶点、多环节、多效应等特点,无毒副作用等进行深入研究,可能成为具有临床价值的治疗乳腺浸润性导管癌新药。
沙棘萃取物是目前治疗乳腺浸润性导管癌最快最迅速的一种植物药,它的问世必将给治疗乳腺浸润性导管癌带来一次突破。同时它能迅速挽救数以万计的患者生命,治乳腺浸润性导管癌植物药口服制剂。细胞学毒性实验结果显示,沙棘萃取物对正常细胞基本没有抑制作用,对癌细胞具有选择性杀伤作用。
本发明的沙棘提取物,对乳腺浸润性导管癌细胞增殖具有明显的抑制作用,其IC50为BT474(11.143mg/ml),对乳腺浸润性导管癌细胞具有明显促凋亡作用,且具有浓度-效应关系;可以将乳腺浸润性导管癌细胞的细胞周期阻滞于G0/G1期,且具有浓度-效应关系。口服后可以有效地治疗乳腺浸润性导管癌。
本发明的沙棘生物碱提取方法,无需使用有机溶剂,操作安全简便,提取效率高,HPLC检测结果显示得到的沙棘生物碱纯度高达99.9%以上。
附图说明
图1是沙棘萃取物水溶液在200nm~600nm波长下的吸光度曲线;
图2是沙棘萃取物的液相色谱图;
图3是沙棘萃取物的另一液相色谱图及其主峰的质谱图;
图4是沙棘生物碱的HPLC色谱图;
图5是沙棘萃取物对BT474细胞的浓度-抑制率曲线;
图6是沙棘萃取物对人乳腺导管癌细胞BT474增殖的影响;
图7是不同浓度沙棘萃取物对人乳腺导管癌细胞BT474凋亡的影响;
图8是沙棘萃取物对人乳腺导管癌细胞BT474凋亡的影响;
图9是沙棘萃取物对人乳腺导管癌细胞BT474细胞周期的影响。
具体实施方式
沙棘萃提物的制备:
1)将沙棘55~65℃干燥后粉碎至80~120目,加入5~15倍的水,于45~55℃下搅拌萃取4h;
2)去除不溶物,使用0.45μm的滤膜初滤,之后使用0.22μm的滤膜二滤,收集得到的滤液冷冻干燥,得到沙棘萃取物。
取上述的沙棘萃取物进行检测,检测结果如图1~3所示。其中,图1是沙棘萃取物水溶液(300mg/mL),在200nm~600nm波长下的吸光度曲线,显示其在272nm处具有一个峰值,其吸光度达0.981;图2是沙棘萃取物的液相色谱图;图3是沙棘萃取物的另一液相色谱图及其主峰的质谱图。
经检测,每1000g沙棘萃取物(干重)中含有18~20g沙棘生物碱,余量为沙棘多糖及极少量(少于0.5%)的杂质。
沙棘生物碱的提取:
1)取前述的提取物(每1000g干重中含有18~20g沙棘生物碱),500℃~700℃高温溶解2~3h,得到投料重量30~35%左右的灰色粉末;
2)将灰色粉末与3~4倍的水混合,搅拌溶解,去除不溶物,得滤液;
3)使用0.45μm的滤膜初滤,之后使用0.22μm的滤膜再次过滤,得到精滤液;
4)将精滤液冷冻干燥得到沙棘生物碱。
沙棘生物碱为纯白色透明细针状晶体,委托上海张江药谷公共服务平台有限公司检测其纯度,检验依据为中国药典2010版一部,附录VID高效液相色谱法。其HPLC色谱图如图4所示。根据面积归一化法,其主峰含量为100%,是一种高纯的提取物。
下面结合实验,进一步说明本发明的技术方案。
以下实验中,XL-006指上述方法制备得到的干燥沙棘萃取物。
植物药XL-006乳腺浸润性导管癌细胞生长抑制对照试验
实验委托湖南省实验动物中心(湖南省药物安全评价研究中心)进行。
1实验材料
1.1受试物:植物药编号:XL-006。植物药配制:称取XL-006 9g,加入0.9%氯化钠注射液15ml,并振荡至全部溶解,即得600mg/ml植物药溶液,此为最高浓度工作液,将母液进行除菌处理后备用。用0.9%氯化钠注射液将母液依次配制成200、60、20、6、2、0.6mg/ml的工作液。
1.2阳性对照药:顺铂(DDP),批号:SJJMI-IE,东京化成工业株式会社;5-氟尿嘧啶(5-FU),批号:HFBM160120325008,Amresco公司。阳性对照药配制:称取DDP或5-FU 2mg,用新鲜完全培养基配制成100mM的母液,再用新鲜完全培养基将母液依次配制成200、60、20、6、2、0.6μM的工作液。
1.3主要材料:
1.4主要仪器:
2试验方法
2.1细胞培养
取已长满的BT474细胞,采用含10%FBS的高糖DMEM完全培养基,于37℃、5%CO2培养箱中培养,根据细胞生长情况,1~2d传代或换液,至对数生长期备用。
2.2CCK-8法检测细胞增殖试验
取对数期生长的BT474细胞以每孔5×103个细胞接种于96孔细胞培养板中,培养12h后,设置溶媒对照组、阳性对照药(DDP)组、阳性对照药(5-FU)组、植物药XL-006组(0.3-300mg/ml),每组5个复孔。溶媒对照组以新鲜完全DMEM培养基孵育细胞,植物药组分别以含终浓度为0.3-300mg/ml植物药的新鲜完全DMEM孵育细胞,DDP和5-FU组分别以含终浓度为100、30、10、3、1、0.3μM植物药的新鲜完全DMEM孵育细胞。按上述处理方式孵育细胞72h后在每孔中加入CCK-8 10μl,继续培养1h后使用酶标仪在450nm处测量各孔的吸光度。以溶媒对照组OD值为100%细胞活力,其余各组OD值与溶媒对照组OD值的比值为相对活力。以细胞增殖抑制率评价植物药对BT474细胞的毒性,若出现有细胞增殖抑制率>100%时,判为仪器的系统误差,按100%计。
2.3细胞凋亡的检测
2.3.1Annexin V-FITC和PI双染法检测细胞凋亡
取处于对数生长期的BT474细胞,常规消化收集细胞,以5×105/孔的密度接种至6孔板中,培养12h后,设置溶媒对照组、植物药XL-006组(10、30、100mg/ml),每组5个复孔。溶媒对照组以新鲜完全DMEM培养基孵育细胞,植物药组分别以含终浓度为10、30、100mg/ml植物药的新鲜完全DMEM孵育细胞。6h后,常规消化收集细胞,加入500μl Binding Buffer缓冲液重悬细胞,将细胞转入1.5ml EP管中,加入5μl的Annexin V-FITC、5μl的PI,在室温避光条件下孵育15min,用流式细胞仪检测凋亡情况。
2.3.2荧光染色法检测细胞凋亡
按照2.3.1方法处理细胞,在植物药处理6h后,在6孔板中每孔加入Hoechst 33342染色液1ml,充分覆盖住细胞,置于37℃培养20-30min。弃去染色液,用PBS洗涤2-3次后在荧光显微镜下进行荧光检测。
2.4流式细胞术检测植物药对人乳腺导管癌细胞BT474周期的影响
取处于对数生长期的BT474细胞,常规消化收集细胞,以5×105/孔的密度接种至6孔板中,待12h细胞贴壁后,设置溶媒对照组、植物药XL-006组(100、30、10mg/ml),每组5个复孔。溶媒对照组以新鲜完全DMEM培养基孵育细胞,植物药组分别以含终浓度为10、30、100mg/ml植物药的新鲜完全DMEM孵育细胞。6h后,常规消化收集细胞,用70%冷乙醇固定过夜,加5μl的PI,室温避光孵育30min,用流式细胞仪检测细胞周期。
2.5统计学分析
采用SPSS 16.0统计软件对数据进行处理,计量资料以表示,两样本均数的比较采用Student T-Test检验,多样本组间均数的比较采用One-way ANOVA检验,P<0.05表示有统计学意义,P<0.01表示所检验的差别有非常显著性意义。
结果评价
3.1植物药XL-006对人乳腺导管癌细胞BT474增殖的影响
显微镜下观察不同浓度的植物药处理细胞后,出现细胞增殖速度减慢,细胞碎片增多、细胞间隙增大、细胞出现沙粒状空泡等现象。细胞状态与共培养时间有明确相关性,约在共培养12h后,细胞出现变圆、皱缩的现象;在共培养24h后,出现部分细胞胀大,细胞透光性变差,细胞间间隙增大;在共培养48h后,细胞出现沙粒状空泡,出现细胞破裂等情形;在共培养72h后,沙粒状空泡样细胞基本完全破裂,在300、100、30mg/ml浓度条件下无完整细胞形态的细胞,只见少量浓缩成黑点状。细胞与供试品或阳性对照药DDP和5-FU共培养72h后,细胞增殖受到明显抑制,且具有浓度-效应关系,与溶媒对照组比较具有显著性差异(P<0.01)。细胞增殖抑制结果详见表1。
表1、植物药XL-006对人乳腺导管癌细胞BT474增殖的影响
注:*表示与溶媒对照组比较,P<0.05,**表示与溶媒对照组比较,P<0.01。IC50表示抑制50%肿瘤细胞的浓度,Emax表示对肿瘤细胞的最大抑制率。
XL-006对BT474细胞的浓度-抑制率曲线如图5所示。
植物药XL-006对人乳腺导管癌细胞BT474增殖的影响如图6示,箭头表示坏死细胞。从图中可以看出,植物药XL-006可以很好地促进人乳腺导管癌细胞BT474坏死。
3.2植物药XL-006对人乳腺导管癌细胞BT474凋亡的影响
采用浓度为10、30、100mg/ml的植物药干预人乳腺导管癌细胞BT474 6h后,收集细胞,Annexin V-FITC/PI双染后检测细胞凋亡。流式细胞仪可将双染后的细胞分成4组:Q1-UL代表机械损伤细胞(Annexin V-/PI+);Q1-UR晚期凋亡细胞(Annexin V+/PI+);Q1-LL存活细胞(Annexin V-/PI-);Q1-LR早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-)。
表2、植物药XL-006对人乳腺导管癌细胞BT474凋亡的影响
注:*表示与溶媒对照组比较,P<0.05,**表示与溶媒对照组比较,P<0.01。
结果表明:经植物药XL-006处理的BT474细胞晚期凋亡及坏死细胞数明显高于溶媒对照组(P<0.05),并具有浓度-效应关系。
不同浓度植物药XL-006对人乳腺导管癌细胞BT474凋亡的影响如图7所示,图中,A为溶媒对照组,B为植物药10mg/ml组,C为植物药30mg/ml组,D为植物药100mg/ml组。
植物药XL-006对人乳腺导管癌细胞BT474凋亡的影响如图8所示,箭头表示细胞核皱缩,提示为凋亡细胞。从图中可以清楚地看出XL-006可以促使人乳腺导管癌细胞BT474凋亡。
3.3植物药XL-006对人乳腺导管癌细胞BT474周期的影响
采用浓度为10、30、100mg/ml的植物药干预人乳腺导管癌细胞BT474 6h后,收集细胞,用70%冷乙醇固定后,PI染色后,流式细胞仪分析细胞周期。实验结果如表3所示:
表3、植物药XL-006对人乳腺导管癌细胞BT474细胞周期的影响
注:*表示与溶媒对照组比较,P<0.05,**表示与溶媒对照组比较,P<0.01
结果表明:在使用植物药XL-006后,G0/G1细胞比例明显增加,G2/M期比例明显减少,表明其对人乳腺导管癌细胞BT474增殖抑制作用主要是将人乳腺导管癌细胞BT474阻滞在G0/G1期,阻止其进入S期。
植物药XL-006对人乳腺导管癌细胞BT474细胞周期的影响如图9所示,图中,A为溶媒对照组,B为植物药10mg/ml组,C为植物药30mg/ml组,D为植物药100mg/ml组。
4结论与讨论
综上所述,在本实验条件下,植物药XL-006可显著抑制1种人乳腺导管癌细胞BT474增殖,并且具有浓度-效应关系,在高浓度条件下,随着时间的延长,可将癌细胞完全杀死,其可将细胞周期阻滞在G0/G1期,诱导细胞凋亡。本植物药发挥抑制癌细胞浓度较高,为mg/ml级,可能与其特有的作用机制相关。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出的是,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种沙棘萃取物,其制备方法如下:
1)取沙棘干燥后粉碎,加入5~15倍的水,40~70℃搅拌浸出完全;
2)去除浸出液中的不溶物,干燥得到沙棘的水萃取物。
2.根据权利要求1所述的沙棘萃取物,其特征在于:固液分离后去除浸出液中的不溶物,滤液接着使用0.45μm的滤膜初滤,之后使用0.22μm的滤膜再次过滤,进一步去除不溶物。
3.根据权利要求1或2所述的沙棘萃取物,其特征在于:干燥时使用冷却干燥。
4.根据权利要求1或2所述的沙棘萃取物,其特征在于:每kg沙棘萃取物中含有18~20g沙棘生物碱。
5.一种沙棘生物碱,其制备方法如下:
1)取权利要求1~3所述的沙棘萃取物,500~700℃灰化完全,得灰化物;
2)将灰化物与水混合,搅拌溶解,去除不溶物,精滤后取滤液,干燥得到沙棘生物碱。
6.根据权利要求5所述的一种沙棘生物碱,其特征在于:精滤的操作为使用0.45μm的滤膜初滤,之后使用0.22μm的滤膜再次过滤。
7.沙棘萃取物在制备治疗乳腺浸润性导管癌药物中的应用,其特征在于:沙棘萃取物如权利要求1~3任一项所述。
8.一种治疗乳腺浸润性导管癌的药物,其特征在于:其起效成分为权利要求1~4任一项所述的沙棘萃取物。
9.根据权利要求8所述的药物,其特征在于:药物为口服制剂。
10.根据权利要求9所述的药物,其特征在于:口服制剂为肠溶口服制剂。
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