CN107548305A - 用于增加移植后造血干细胞的植入疗效的新型组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包括至少一种二肽基肽酶IV(DPP‑IV)抑制剂的组合物的新用途，用于增加干细胞移植受体中造血祖细胞的迁移和归巢，其中所述造血干细胞和/或祖细胞在移植之前已经在体外用移植增强化合物，特别是用前列环素类似物和cAMP增强子进行处理。

Description

用于增加移植后造血干细胞的植入疗效的新型组合物
本发明提供了包括至少一种二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制剂的组合物的新用途，用于增加干细胞移植受体中造血祖细胞的迁移和归巢，其中所述造血祖细胞在所述细胞移植之前在体外已经用前列环素类似物进行处理，用于增强所述祖细胞的植入。具体地，在移植之前用前列环素类似物和cAMP增强子进行预处理。
造血干细胞(HSCs)是能够在个体的整个生命周期中再生所有血液制品的原始细胞，平衡其自我更新与子代分化。HSCs在发育过程中经历位置转换，并在哺乳动物的整个生命周期中循环，进入和离开血液，在归巢和植入的连续步骤中融入骨髓龛(niches)。归巢是供体干细胞通过该途径进入骨髓的过程，干细胞的植入意味着它们在骨髓中生长。
由于在移植受体中HSCs能够恢复血液和免疫细胞而具有治疗潜力。此外，HSCs具有为其它组织(例如脑、肌肉和肝脏)产生细胞的潜力。目前人类自体和同种异体骨髓移植方法用作治疗疾病(例如白血病、淋巴瘤和其它危及生命的疾病)的方法。自体骨髓移植是标准方法，用于增加细胞毒性药物的治疗窗，从而允许高剂量强度化疗(Aksentijevich I，Flinn I(2002)Chemotherapy and bone marrow reserve：lessons from autologousstem cell transplantation.Cancer Biother Radiopharm 17：399-403，Awedan AA(2002)High intensity regimens with autologous hematopoetic stem celltransplantation as treatment of multiple myeloma.Ann Transplant 7：38-43)。然而，对于这些方法，必须分离大量的供体骨髓以确保有足够的HSCs用于移植。
细胞运输，特别是HSCs的归巢由几种不同的细胞内机制调节。
首先，描述了在体内需要Gαs转导的信号以通过HSCs聚集于(populate)骨髓龛(Adams GB等人，(2009)Haematopoietic stem cells depend on Gαs-mediatedsignaling to engraft bone marrow.Nature 459:103-107)。这些发现证实了早期的体外实验，其表明Gαs的活化促进造血干细胞的存活和分化(Dexter TM等人(1985)Inhibitorsof cholera toxin-induced adenosine diphosphate ribosylation of membrane-associated proteins block stem cell differentiation.Blood 65:1544-1548,LongMW等人，(1988)Cholera toxin and phorbol diesters synergistically modulatemurine hematopoietic progenitor cell proliferation Exp Hematol.16:195-200)。Gαs是鸟嘌呤核苷酸结合异源三聚体G蛋白的α亚基础＝，其刺激膜结合哺乳动物腺苷酸环化酶的全部9个亚型。可以通过用霍乱毒素处理细胞在离体/体外组成性激活Gαs。这是因为霍乱毒素APD核糖基化起催化作用的精氨酸残基(R186/187/201/202，精氨酸的精确数目取决于Gαs的剪接变体)；GTP水解需要完整的精氨酸残基，并导致Gαs的失活(Freissmuth M,GilmanAG(1989)Mutations of Gsαdesigned to alter the reactivity of the protein withbacterial toxins.Substitutions at ARG187result in loss of GTPase activity.JBiol Chem 264:21907-21914)。在用霍乱毒素预处理造血干细胞后，确实可以观察到植入增强：如果干细胞制剂用霍乱毒素预处理过，则骨髓中约有两倍的(Lin-)前体细胞(Adams，2009))。其次，HSCs表达所有四种前列腺素E受体(EP1-4)。用(二甲基化)前列腺素E2预处理造血干细胞增强了它们的植入(North TE等人(2007)Prostaglandin E2regulatesvertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.Nature 447:1007-1011,8；Hoggatt J等人(2009)Prostaglandin E2enhances hematopoietic stem cell homing,survival,and proliferation(Blood 113:5444-5455)。由于cAMP诱导蛋白激酶A(PKA)的激活与Wnt依赖性信号协同稳定β-连环蛋白，这种作用是由典型的Gαs依赖性信号传导介导的(Goessling W等人(2009)Genetic interaction of PGE2 and Wnt signalingregulates developmental specification of stem cells and regeneration.Cell136:1136-1147)。
此外，PGE2还增加HSC CXCR4 mRNA和表面表达，增强其在体外迁移到基质细胞衍生因子-1(SDF-1)，并在体内归巢到骨髓中，以及刺激HSC进入和通过细胞周期发展。
WO2012/095511中描述了使用前列环素类似物(任选地与毛喉素组合)增强HSCs植入的方法。
已知所述SDF-1-CXCR4轴也参与细胞归巢。SDF-1在调节正常HSCs的运输及其归巢和停留在骨髓中起着关键作用(Kucia等人，Stem Cells，2005)。
根据WO2009/152186 A1，抑制CD26肽酶(DPPIV，二肽基肽酶IV)活性可以增强迁移活性，并描述了使用CD26肽酶抑制剂来增强细胞的归巢和植入。
WO 2012/074676描述了含有GLP-1拮抗剂和DPPIV抑制剂的用于肝脏保存的组合物。
Hussain Filza等人报道了曲前列环素(Treprostinil)对干细胞移植的作用(BMCPharmacology，vol 11，no.Suppl 2，2011，p A6)。
US 2008/085264公开了使用DPP-IV抑制剂/CD26肽酶抑制剂用于预处理以增加造血干细胞的移植疗效。
Broxmeyer H.等人提供了关于用造血干细胞移植的调查(STEM CELLS ANDDEVELOPMENT,2013,vol.22,suppl.1,pp.103-110)，并进一步讨论了使用dmPGE2与西他列汀的组合(Broxmeyer H.and Pelus，L.2014，Blood Cells，Molecules and Diseases 53,34-38)。
Schwaiger E.等人公开了DPP-IV抑制剂的用途，并公开这些抑制剂的存在不影响骨髓的植入(Experimental Hematology,2011,vol.40,no.2,pp.97-106)。
Hoggatt J.等人报道了使用PGE2刺激造血干细胞(BLOOD,2009,vol.113,no.22,pp.5444-5455)。
WO2012/095511描述了用曲前列环素和毛喉素处理造血干细胞。
移植后干细胞的定位是成功移植的关键决定因素。目前，移植需要大量干细胞，因为干细胞不容易植入骨髓，而长期的骨髓发育不全会导致成熟血细胞减少。
因此，仍然需要提供方法和治疗方案来有效地刺激HSCs，以增加分离的HSCs的归巢、植入和停留在经历骨髓移植的受试者的骨髓龛，并减少移植所需的HSCs的数量。
发明简述
本发明的实施方案解决了所述问题。
出乎意料地显示了通过用前列环素类似物离体预处理所述干细胞和/或祖细胞刺激所述细胞的植入性能，并且进一步施用二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制剂给移植有所述造血干细胞的个体，可以成功地增加造血干细胞归巢和植入。
具体地，发明人已经表明，通过用至少一种前列环素类似物和至少一种cAMP增强子的组合离体预处理所述细胞，并且进一步施用二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制剂给移植有所述造血干细胞的个体，可以成功地增加造血干细胞归巢和植入。
具体地，本发明提供的组合物包括至少一种用于处理造血干细胞移植受体的二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制剂，其中所述造血干细胞在移植之前已经在体外特别地用前列环素类似物和cAMP增强子进行处理。
具体地，本发明提供了组合物，该组合物包括至少一种用于处理造血干细胞移植受体的二肽基肽酶IV(DPP-IV)的抑制剂，其中所述受体移植了已经在体外用前列环素类似物和任选的cAMP增强子处理的血液造血干细胞以增强植入。
本发明出乎意料地显示了，在移植前用前列环素类似物，任选地与cAMP增强子(如毛喉素)一起孵育分离的造血干细胞，以及在将所述细胞移植到有需要的患者之前和之后立即施用DPP-IV抑制剂以大幅增加HSC归巢和植入效率。这是出乎意料的，因为DPP-IV(通过格列汀(gliptin))的抑制本身不足以增强小鼠模型中的骨髓移植(Schwaiger E等人，Exp Hematol.2002Feb；40(2)：97-106doi：10.1016/j.exphem.2011.10.010)。
根据优选实施方案，将造血干细胞与前列环素类似物和能够进一步升高cAMP的化合物(特别是毛喉素或cAMP降解抑制剂(磷酸二酯酶抑制剂))的组合一起孵育。
此外，发明人在体内动物模型中出乎意料地发现了，施用DPP-IV抑制剂(特别是维格列汀(vildagliptin))，与施用前列环素类似物相比，在移植所述细胞后显著地增加了所述造血细胞受体的存活率。
发明人进一步发现，在用曲前列环素和毛喉素预处理的造血干细胞移植后，前列环素类似物(特别是曲前列环素)和DPP-IV抑制剂(特别是维格列汀)的组合施用是相互拮抗的。
根据本发明的实施方案，所用的所述组合物含有DPP-IV抑制剂，该DPP-IV抑制剂选自格列汀，更具体地选自由西他列汀、维格列汀、阿格列汀(alogliptin)、沙格列汀(saxagliptin)、利格列汀(linagliptin)、阿拉格列汀(anagliptin)、特力利汀(teneligliptin)、吉格利汀(gemigliptin)和杜拓格利普汀(dutogliptin)或它们的功能性类似物组成的组。
根据本发明的具体实施方案，所述造血干细胞在体外与前列环素类似物一起孵育，所述前列环素类似物选自曲前列环素、伊洛前列素(Iloprost)、西卡前列素(Cicaprost)和贝前列素(Beraprost)或其药学上可接受的盐的组，具体地所述前列环素类似物是曲前列环素的衍生物，选自曲前列环素的酸衍生物、曲前列环素的前药、曲前列环素的多晶型物或曲前列环素的异构体和曲前列环素的无水多晶型物。
根据所述实施方案，造血干细胞的预处理进一步在存在cAMP增强子(特别是毛喉素)的情况下进行。
本发明涉及将DPP-IV抑制剂用于治疗所选定的个体群，即患有骨髓疾病或骨髓相关疾病的个体，具体地所述骨髓疾病是白血病、骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性疾病、再生障碍性贫血、镰状细胞疾病、血细胞隔室缺陷、化疗或辐照引起的骨髓疾病，所述个体群使用造血干细胞样品进行干细胞移植，所述样品在移植前在体外用前列环素类似物和cAMP抑制剂预处理。
更具体地，血细胞隔室缺陷可以是但不限于血红蛋白病或嗜中性粒细胞功能(neutrophil granulocyte function)缺陷、T淋巴细胞和/或B淋巴细胞缺陷(例如，重症联合免疫缺陷、布鲁顿无丙种球蛋白血症(Bruton’s agammaglobulinemia))。
根据本发明的具体实施方案，移植后施用前列环素类似物的个体不包含用DPP-IV抑制剂治疗的个体群中。
根据本发明的实施方案，所述DPP-IV抑制剂是维格列汀，并且其中造血干细胞在移植前已经在体外用曲前列环素和毛喉素进行处理。
根据又一实施方案，在造血干细胞移植前至少5小时，特别是至少10小时，特别是至少15小时，特别是至少24小时施用所述DPM-IV抑制剂。
所述DPP-IV抑制剂的施用的时间为在骨髓中足够的干细胞植入所需的时间。
本发明的实施方案还涉及在骨髓移植后施用DPP-IV抑制剂至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天，优选至少10天、优选至少14天。
根据本发明，所述组合物可以通过静脉内给药或皮下给药或以口服形式给药，所述口服形式选自缓释形式，片剂和胶囊。
本发明还提供了增强造血细胞植入能力的方法，包括以下连续步骤：
a)提供造血干细胞和/或祖细胞样品，
b)向所述细胞施用有效量的前列环素类似物增强植入，
c)将所述混合物孵育足以刺激所述细胞中的Gαs信号传导的时间，
d)分离所述细胞
e)将所述细胞移植到有需要的个体中
f)向所述个体施用有效量的DPP-IV抑制剂。
本发明具体提供了增强造血细胞植入能力的方法，包括以下连续步骤：
a)提供造血细胞样品，
b)向所述细胞施用有效量的前列环素类似物和cAMP增强子增强植入，
c)将所述混合物孵育足以刺激所述细胞中的Gαs信号传导的时间，
d)分离所述细胞
e)将所述细胞移植到有需要的个体中
f)向所述个体施用有效量的DPP-IV抑制剂。
本发明还提供了一种方法，其中所述干细胞来自脐带血、供体骨髓或胎盘。
本发明还提供了用于增加在移植后植入骨髓的造血细胞数量的方法，包括以下步骤：在体外使造血细胞与有效量的前列环素类似物(特别是曲前列环素)接触，具体地，曲前列环素与cAMP增强子(具体地是毛喉素)一起，将预培养后的细胞施用到有需要的个体中，并且在施用造血细胞之前和/或之后立即进一步将DPP-IV抑制剂(特别是维格列汀)施用于所述个体。
根据本发明的又一实施方案，提供了通过HSCs的离体预处理来增强造血干细胞(HSCs)植入的方法，其包括以下步骤：
a)提供含有造血干细胞和/或祖细胞的样品，
b)将包括前列环素类似物的组合物与所述样品混合，用于增加干细胞和/或祖细胞的植入能力，特别是所述组合物包括前列环素类似物和cAMP增强子以获得混合物，
c)将所述混合物孵育足以刺激所述细胞中的Gαs信号传导的时间，
d)分离所述已刺激的细胞，
e)将所述细胞移植到个体中
f)向所述个体施用DPP-IV抑制剂，特别是静脉内给药。
本发明还提供了一种试剂盒，其包括：
a)在第一单位剂型中至少一种前列环素类似物和毛喉素的量，
b)至少一种选自格列汀的DPP-IV抑制剂的量，
以组份a)和b)的两个、三个、四个或更多个单独的单元的形式，特别是用于治疗骨髓疾病，具体地所述骨髓疾病是白血病、血细胞隔室缺陷和化疗或辐照引起的骨髓疾病。
附图：
图1：在存在曲前列环素和毛喉素的情况下，鼠和人的造血干细胞和祖细胞的预孵育增加它们向SDF-1/CXCL12的迁移
图2：CXCR4拮抗剂AMD3100对SDF-1/CXCL12诱导的鼠造血干细胞和祖细胞的迁移的抑制，其已经在存在曲前列环素和毛喉素的情况下被刺激
图3：维格列汀增强造血干细胞和祖细胞向SDF-1/CXCL12的迁移，其用曲前列环素和毛喉素预孵育
图4：维格列汀和曲前列环素增加造血干细胞和祖细胞的归巢，其用曲前列环素和毛喉素预孵育，但在体内组合时相互拮抗
图5：将曲前列环素和维格列汀组合施用于致死辐照的BALB/c受体小鼠，其注射了在体外用曲前列环素和毛喉素的组合预处理的造血干细胞和祖细胞，在增强这些小鼠的存活方面比在体内只施用维格列汀或曲前列环素效果差。
图6：在鼠和人的造血干细胞和祖细胞(HSPCs)中的前列腺素受体表达(A，B)。从鼠HSPCs(A)和人HSPCs(B)中分离RNA并逆转录。从鼠脑细胞(神经元和神经胶质细胞的混合培养物)和人细胞系PC3和HCT116制备的RNA作为阳性对照。使用表1中列出的引物进行PCR依赖性扩增。所有E前列腺素受体(EP1至EP4)、I前列腺素受体(IP)和D前列腺素受体-1(DP1)的扩增子在琼脂糖凝胶上电泳分辨，并通过溴化乙锭染色观察。标记为H2O的泳道表示对照，其中在没有事先逆转录的情况下进行扩增。将编码GAPDH的mRNA扩增作为内标。
图7：比较曲前列环素和dmPGE2诱导的cAMP在人HSPCs中的积累。
图8：用曲前列环素和毛喉素预处理鼠和人的HSPCs既不诱导凋亡也不改变细胞周期进程或分化潜能。将人HSPCs用10μM曲前列环素和30μM毛喉素孵育1小时。随后，通过流式细胞术分析评估(A，B)凋亡诱导和(C，D)细胞周期进程。在未处理和处理的细胞之间检测到根据G0/1、S和G2期的凋亡细胞或细胞分布没有差异(单因素方差分析(one way ANOVA))(E，F)。数据为±SEM(n＝3)。
图9：用曲前列环素和毛喉素体外预处理增强CXCR4(A&B)和CD26/DPPIV(B)的表达。
图10：用曲前列环素和毛喉素体外预处理通过CXCR4增强SDF-1的作用。
图11：CXCR4拮抗剂(AMD3100)的体内施用消除了曲前列环素对受体小鼠存活的有益作用。在体外用曲前列环素和毛喉素预处理鼠HPSCs，如图4的图例所示，并注射(每只小鼠2×105)到致死辐照的受体小鼠。随后分成两组。分给第1组(n＝10)的小鼠进一步用曲前列环素(0.15mg kg-1 8h-1)进行体内治疗，而第2组(n＝10)的小鼠接受曲前列环素(0.15mgkg-1 8h-1)和AMD3100(3.3mg kg-1 8h-1)，每8小时皮下注射10天。两条生存曲线之间的差异具有统计学意义(P＝0.007，对数秩检验(log-rank test))。
图12：单独用维格列汀和曲前列环素但不用其组合体内处理受体小鼠，增加了HSPCs的归巢，HSPCs已经用曲前列环素和毛喉素预孵育。
图13：单独体内施用DPP-IV抑制剂维格列汀增加了用曲前列环素和毛喉素体外处理HSPCs对受体小鼠存活率的有益效果。
发明详述：
提供使HSCs归巢和植入到骨髓环境中的方法和手段具有强大的生物学和医学意义。移植后干细胞的定位对于临床手术是非常重要的，因为目前在临床移植中需要大量的干细胞，从而导致需要大量的供体细胞。这样的方法也是非常有用的，因为大量的自身供体移植物含有的干细胞或HSCs数量不足。同样，患者通常不能找到组织相容的供体，强调对减少成功植入所需HSCs数量的方法和组合物的需求。在体外或离体提高HSCs的归巢和植入性能的能力允许从供体中收集更少的细胞，从而减少与获得骨髓/外周干细胞相关的时间和不适，并增加加入HSC供体库的意愿。
本发明提供二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制剂在治疗经过造血祖细胞移植的患者的新用途，附加条件是用于移植的所述干细胞已经用至少一种前列环素类似物孵育以增强细胞的植入，特别是在施用或将所述细胞返回到个体的身体之前使用cAMP增强子。
造血干细胞和祖细胞，特别是鼠和人的造血干细胞和祖细胞(HSPCs)表达几种前列腺素受体(即EP1、EP2、EP3、EP4、IP和DP1，图6)。已知曲前列环素特异性激活所有Gs偶联受体，即EP2、EP4、IP和DP1受体，而dmPGE2也刺激EP3受体。发明人已经表明，曲前列环素刺激造血祖细胞中的cAMP。在人造血干细胞和祖细胞中，曲前列环素的浓度-响应曲线10％到90％之间的响应超过两个数量级。这与几种刺激的受体的激活一致。与毛喉素(腺苷酸环化酶的直接活化剂)组合后，可以增强曲前列环素诱导的cAMP积累。
造血干细胞和祖细胞可以暴露于曲前列环素和毛喉素的组合中，对其生存能力及其随后进行不对称细胞分裂和分化为红细胞和粒细胞/单核细胞谱系的能力没有任何可检测的影响。因此，移植所需的细胞数量明显少于没有用前列环素类似物和毛喉素预处理的移植所需的细胞数量。
用曲前列环素和毛喉素的组合预处理造血干细胞和祖细胞增强被辐照的生物体内的骨髓植入。
在体内用曲前列环素对受体的另外处理进一步增强骨髓植入。
所述DPP-IV抑制剂特别地选自格列汀的组。
如本文和权利要求中所使用的，单数形式，例如“a”、“an”和“the”包括复数，除非上下文另有明确规定。
具体地，前列环素类似物选自曲前列环素、伊洛前列素、贝前列素和西卡前列素或其药学上可接受的盐的组。
曲前列环素是前列环素的合成类似物，且代谢稳定。曲前列环素市售为RemodulinTM。曲前列环素是(1R,2R,3aS,9aS)-[[2,3,3a,4,9,9a-六氢-2-羟基-1-[(3S)-3-羟基辛基]-1H-苯并[f]茚-5-基]氧基]乙酸单钠盐。
伊洛前列素市售为“Ilomedine”，是5-{(E)-(1S,5S,6R,7R)-7-羟基-6[(E)-(3S,4RS)-3-羟基-4-甲基-1-辛烯-6-壬基]-双环[3.3.0]辛-3-亚基}戊酸。
贝前列素是2,3,3a,8b-四氢-2-羟基-1-(3-羟基-4-甲基-1-辛烯-6-炔基)-1H-环戊二烯(b)苯并呋喃-5-丁酸。
西卡前列素是2-[(2E)-2-[(3aS,4S,5R,6aS)-5-羟基-4-[(3S,4S)4-甲基-1,6-二炔基]-3,3a,4,5,6,6a-六氢-1H-戊二烯-2-亚基]乙氧基]乙酸。
根据本发明，术语“前列环素类似物”包括所述物质的功能衍生物和功能类似物。
术语“类似物”或“衍生物”涉及在结构和功能上与另一化学物质相似的化学分子，其通常在单个元素或基团上有结构上的不同，如果它保持与亲本化学物质相同的功能，其可以通过多于一个基团(例如，2、3或4个基团)的修饰而不同。这样的修饰是技术人员常用的，并且包括例如另外的或取代的化学部分，例如酸的酯或酰胺，用于醇或硫醇的保护基团(例如苄基)，和用于胺的保护基团叔丁氧基羰基。还包括对烷基侧链的修饰，例如烷基取代(例如甲基、二甲基、乙基等)，侧链的饱和度或不饱和度的修饰，以及加入改性基团例如取代的苯基和苯氧基。衍生物还可以包括缀合物，例如生物素部分或抗生物素蛋白部分、酶(例如辣根过氧化物酶等)，以及放射性标记部分、生物发光部分、化学发光部分或荧光部分。此外，可以将部分加入到本文所述的试剂中以改变其药物代谢动力学性质，例如在其它所需的性质中增加离体半衰期，或增加其细胞穿透性能等。还包括前药，已知其增强药物的许多期望的性质(例如溶解度、生物利用度、制造等)。
术语“衍生物”还包括在其范围内对母体分子进行的改变，包括添加、缺失和/或取代，以提供功能等同或功能改进的分子。
根据本发明的具体实施方案，所述曲前列环素衍生物选自曲前列环素的酸衍生物、曲前列环素的前药、曲前列环素的多晶型物、曲前列环素的无水多晶型物或曲前列环素的异构体的组。
类似地，伊洛前列素、西卡前列素或贝前列素由此可以是来自酸衍生物、前药、多晶型物或异构体的衍生物。
根据具体的发明实施方案，本发明方法中可以使用两种，特别是三种或更多种不同的前列环素类似物。或者，可以使用四种、五种或六种甚至更多不同的前列环素类似物。
具体地，还可以使用前列环素类似物、(二甲基化)前列腺素E2。
16,16-二甲基PGE2是15-羟基PGDH的竞争性抑制剂，但它不是酶的底物。由于其耐受15-羟基PGDH的代谢，因此其具有延长的体内半衰期。16,16-二甲基PGE2作为大多数EP受体亚型的激动剂。激活分离的EP2受体的Kd为约1nM。3 16,16-二甲基PGE2用于保持自我更新性质，同时防止培养扩增期间造血干细胞的分化。4,5
DPP-IV是非经典的丝氨酸、膜结合的氨基二肽酶，其从多肽和蛋白质的氨基末端去除Xaa-Pro二肽。在骨髓内，DPP-IV位于结缔组织基质膜上的特定的膜质微区。
格列汀是一类抑制DPP-IV的选择性降血糖剂，主要用于治疗糖尿病。格列汀通过抑制胰高血糖素样肽1(GLP-1)(由肠壁细胞响应于食物而合成的胰岛素促分泌素)的分解有助于降低餐后葡萄糖。
本发明中呈现的格列汀具体地选自由西他列汀、维格列汀、阿格列汀、沙格列汀、利格列汀、阿拉格列汀、特力利汀、吉格利汀或杜拓格利普汀和任何其它格列汀组成的组，其显示为纯化的、可溶的或细胞表面二肽基肽酶的有效抑制剂。
具体地，可以在施用根据本发明预处理的HSCs之前、期间或之后将DPP-IV抑制剂施用到个体。
根据本发明，术语“处理”、“预处理”或“孵育”可以互换使用。关于分离的造血干细胞所用的术语，可以与前列环素类似物和cAMP增强子接触。
更具体地，这意味着含有造血干细胞的样品与至少一种前列环素类似物和至少一种cAMP增强子混合以获得混合物，将所述混合物孵育足以刺激所述细胞中Gαs信号传导的时间。
根据具体实施方案，所使用的组合物可以含有曲前列环素，以及伊洛前列素、贝洛前列素或西卡前列素中的一种，和cAMP增强子(特别是毛喉素)。或者，曲前列环素可以与不止一种其他前列环素类似物组合混合，例如两种、三种、四种或五种，例如但不限于伊洛前列素、贝前列素或西卡前列素或其生理上可接受的盐与cAMP增强子(特别是毛喉素)组合。
根据本发明的用途，所述DPP-IV抑制剂是维格列汀，并且所述造血干细胞在移植前已经在体外用曲前列环素和毛喉素进行处理。
根据替代的方法，所述DPP-IV抑制剂选自西他列汀、阿格列汀、沙格列汀、利格列汀、阿拉格列汀、特力利汀、吉格利汀和杜拓格利普汀，且所述造血干细胞在移植之前已经在体外用曲前列环素和毛喉素进行处理。
根据又一替代的方法，所述DPP-IV抑制剂选自西他列汀、维格列汀、阿格列汀、沙格列汀和利格列汀、阿拉格列汀、特力利汀、吉格利汀和杜拓格利普汀，且所述造血干细胞在移植之前已经在体外用伊洛前列素和毛喉素进行处理。
根据又一替代的方法，所述DPP-IV抑制剂选自西他列汀、维格列汀、阿格列汀、沙格列汀和利格列汀、阿拉格列汀、特力利汀、吉格利汀和杜拓格利普汀，且所述造血干细胞在移植之前已经在体外用贝洛前列素和/或西卡前列素和毛喉素进行处理。
根据具体实施方案，环AMP(cAMP)增强子或，作为替代，前列腺素EP受体的配体可用于预处理干细胞。cAMP增强子的实例包括但不限于二丁酰基cAMP(DBcAMP)、佛波酯、毛喉素、舍曲林(sclareline)、8-溴-CAMP、霍乱毒素(CT)、氨茶碱、2,4-二硝基苯酚(DNP)、去甲肾上腺素、肾上腺素、异丙基肾上腺素、异丁甲基黄嘌呤(IBMX)、咖啡因、茶碱(二甲基黄嘌呤)、多巴胺、咯利普兰、前列腺素E1、前列腺素E2、垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)和血管活性肠多肽(VIP)，是本领域已知的，可以在孵育之前加入到干细胞或干细胞/曲前列环素或干细胞/曲前列环素、伊洛前列素、西卡前列素和/或贝前列素混合物中。cAMP增强子的实例还包括cAMP和cAMP的类似物，例如sp-5,6-DC1-BIMPS(BIMPS)。
组合物特别优选包含毛喉素。
前列环素类似物的量取决于制备受刺激的HSCs的方法。
非常具体地，对于本发明申请，曲前列环素的有效浓度在0.1μM至100μM的范围内，特别是1μM至50μM，特别是5μM至25μM，特别是约10μM。
根据本发明，术语“约”包括数值的偏差最大为10％，具体地，最大为5％，更具体地最大为1％。作为示例，因此术语“约10μM”限定为9μM至11μM的范围，具体为9.5μM至10.5μM，具体为9.9μM至1.1μM。
根据本发明的又一具体实施方案，前列环素类似物的最佳浓度范围对应于在所述细胞中刺激cAMP积聚的其EC50的10至30倍。
根据本发明的具体实施方案，前列环素类似物和毛喉素的比例可以为约1:3。用毛喉素和前列环素类似物处理的HSCs可以在再植入之前纯化，但是，这些HSCs也可以被重新植入而不需要进一步的纯化步骤，因为可能存在少量的毛喉素，但不会引起任何负作用。
根据具体方面，cAMP增强子的浓度，特别是用于培养干细胞的毛喉素的浓度可以在1μM至100μM之间，具体地在10μM至约50μM之间，约30μM。
在造血干细胞移植前至少5小时，特别是至少10小时，特别是至少15小时，特别是至少24小时施用所述DPM-IV抑制剂。
或者，DDP-IV抑制剂可以在手术前(即进行移植的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天之前)，和/或手术后(即移植后至少5小时，特别是至少10小时，特别是至少15小时，特别是至少24小时，最多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天)施用到患者。
具体地，维格列汀可以以50至200mg/d，特别是75至150mg/d，特别是约100mg/d的量施用到个体。
具体地，西他列汀可以以50至200mg/d，特别是75至150mg/d，特别是约100mg/d的量施用到个体。
具体地，沙格列汀可以以约2.5至10mg/d，特别是约5mg/d的量施用到个体。
具体地，利格列汀可以以约2.5至10mg/d，特别是约5mg/d的量施用到个体。
具体地，阿格列汀可以以约12.5至50mg/d，特别是约25mg/d的量施用到个体。
本发明的方法有利地提供刺激的干细胞，其可以直接施用于个体并进一步刺激所述细胞的归巢和植入。
“个体”意指广泛地包括任何动物，特别是哺乳动物，特别是接受根据本发明预处理的干细胞移植的人。
在被再植入之前，可以纯化用格列汀和前列环素类似物处理的HSCs，但是，这些HSCs也可以被重新植入而无需进一步的纯化步骤。
刺激所述细胞中的Gαs信号传导所需的时间可以根据已知方法测量，例如通过使用其中存在许多变体的cAMP测量：RIA、荧光共振能量转移(FRET)与EPAC(epac1)(Ponsiouen B.等人，EMBO reports,5,12,1176-1180(2004))、放射化学法等。刺激的细胞中Gαs信号传导发生可以通过本领域已知的方法(如基于FRET的cAMP报告)，从没有刺激的细胞中选择或鉴别或分离。
抑制CD26肽酶活性和有效增加所述细胞中对SDF-1的迁移响应所需的时间可以根据已知的方法测量，例如通过荧光测定Ala-Pro-7-酰氨基-三氟甲基香豆素的裂解(cleavage)。或者，可以通过HPLC或ELISA监测天然底物(例如CXCL12或GLP-1)裂解的抑制。
根据本发明的实施方案，各细胞的孵育时间为约30分钟至24小时，优选约1小时和12小时，优选约1小时至4小时。
根据又一实施方案，用前列环素类似物和cAMP增强子预处理HSCs的体外孵育时间为至少10分钟，具体地至少20分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少50分钟、至少60分钟。
根据本发明的又一方面，在约37℃下将至少1×105供体细胞/ml与前列环素类似物和cAMP增强子一起孵育。
cAMP依赖性途径是促进造血干细胞移植的必需途径。发明人已经表明，前列环素类似物可触发造血干细胞中的cAMP升高。它通过激活多个受体即IP-受体和EP-受体来实现，从而导致增加Gαs信号传导。因此，前列环素类似物(如曲前列环素、伊洛前列素、西卡前列素或贝前列素)更有效地提高了cAMP水平。
在本发明说明书中术语“造血干细胞”(HSCs)或更一般术语“干细胞”理解为等效术语，并且通常涉及产生血液细胞类型的多潜能或多能“干细胞”，所述血液细胞类型包括骨髓(例如单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞)和淋巴系统(例如，T细胞、B细胞、NK细胞)，和其它本领域已知的。
“干细胞”的特征通常是形成多种细胞类型(即多能的)的能力及其自我更新能力。但是，也可以包括寡能和单能祖细胞。
术语“祖细胞”包括像干细胞一样具有分化成特定类型的细胞的趋势的生物细胞，但是已经比干细胞更具特异性，并且被推动分化成其“靶”细胞。祖细胞是可分化形成一种或多种细胞的干细胞的早期后代。干细胞和祖细胞之间最重要的区别是干细胞可以无限复制，而祖细胞只能分化有限的次数。大多数祖细胞被描述为寡能的，它们被比作成体干细胞。据说祖细胞处于进一步的细胞分化阶段。它们在干细胞和完全分化的细胞之间的“中心”。它们具有的这种潜力取决于它们的“父本”干细胞的类型，也取决于它们的龛。祖细胞可以通过身体移动，并向它们需要的组织移动。成体干细胞和祖细胞共享许多性质。
祖细胞存在于成体生物体中，并且它们充当身体的修复系统。它们补充特殊细胞，还能维护血液、皮肤和肠道组织。它们也存在于发育中的胰腺组织中。
“造血”一般是指从HSC细胞分化或形成特定的血细胞的过程。在发育期间，造血从胎肝转移到骨髓，然后在整个成年期间保留造血的部位。一旦骨髓中建立，HSCs不是随机分布在整个骨腔内。相反，HSCs通常存在于靠近骨内膜表面的位置。随着到骨表面距离的增加，成熟干细胞数量增加。
造血组织含有具有长期和短期再生能力的细胞，以及定型的多能祖细胞、寡能祖细胞和单能祖细胞。具体地，含有HSCs的样品具体可以是骨髓。
可以通过已知技术从已知含有HSCs的来源获得HSCs，具体从外周血、脐带或脐带血、胎盘和骨髓。或者，来源也可以是如胎肝、胎脾和动物的主动脉-性腺-中肾。本发明的方法和组合物优选来自人源的HSCs。
例如，可以在成人的骨髓(包括股骨、髋、肋骨、胸骨和其它骨骼)中发现HSCs。HSCs可以通过使用针和注射器从髋部(或从血液)取出直接获得，通常在用细胞因子如G-CSF(粒细胞集落刺激因子)预处理后，所述细胞因子诱导细胞从骨髓腔室释放。
可以根据某些表型或基因型标记鉴定HSCs。例如，HSCs可以通过它们的小尺寸、谱系(lin)标记缺乏、用活体染料(如罗丹明123(rho10)或Hoechst 33342)低染色(侧群细胞(side population))以及它们表面上存在各种抗原标记来鉴定，其中许多属于分化系列的簇(例如CD5、CD11b、CD34、CD38、CD90、CD133、CD105、CD45、GR-1(＝Ly-6G/C)、7-4、Ter-119和c-kit)。HSCs对于通常用于检测谱系定型的标记主要是阴性的，因此通常被称为lin(-)细胞。大多数人HSCs可以表征为CD5+、CD45R(B220)+、CD11+、GR-1+、CD34+、CD59+、Thyl/CD90+、CD38lo/～、C-kit/CD117+和lin(-)。但是，并不是所有的干细胞被这些组合物覆盖，因为某些HSCs是CD347+和CD38+。
还有一些研究表明，最早的干细胞在细胞表面缺乏c-kit。通过流式细胞术或FACS纯化lin(-)HSCs，可以使用一系列成熟血谱标记抗体来消耗lin(+)细胞或晚期多能祖细胞(MPP)，包括例如抗体CD3epsilon、CD5、CD45R、CD11b、CD16、GR-1,7-4和Ter-119、CD13、CD32和CD33、CD71、CD19、CD61、Mac-1(CDIIb/CD18)、Gr-I、117Ra、CD3、CD4、CD5和CD8，以及其他本技术领域已知的。另外的纯化方法是本领域已知的，例如使用细胞表面分子的“信号传导淋巴细胞活化分子”(SLAM)族的特定标记的方法。
无论是来自脐带血、骨髓、外周血还是其它来源，HSCs可以在任何合适的、可商购的或定制的培养基(有或没有血清)中生长或扩增。来自人源的HSCs是本发明的优选实施方案。
例如，在某些实施方案中，无血清培养基可以使用白蛋白和/或转铁蛋白。此外，可以包括细胞因子，例如Flt-3配体、干细胞因子(SCF)和血小板生成素(TPO)等。HSCs也可以在诸如生物反应器的血管中生长。用于HSCs的离体扩增的合适的培养基还可以包括HSC支持细胞，例如基质细胞(例如淋巴网状基质细胞)，其可以来自于例如淋巴组织的解聚，并且其已经显示出支持HSCs以及它们的子代的体外、离体和体内维持、生长和分化。
“脐血”(Cord blood)或“脐带血”(umbilical cord blood)通常涉及来自新生儿的相对少量的血液(高达约180ml)，其返回到新生儿循环中。脐血富含HSCs，并且可以根据本领域已知的技术获得和储存以备后用。
术语“离体”或“体外”是指在生物体之外发生的活动，例如在生物体外的人造环境中的活体组织中或其上进行的实验或测量，优选自然条件最小的改变。在某些实施方案中，可以收集和冷冻这些组织或细胞，并且随后解冻以进行离体处理。组织培养实验或使用活细胞或组织持续超过几天的方法通常被认为是“体外”，尽管该术语可以与离体互换使用。“离体给药”、“离体处理”或“离体治疗使用”的叙述通常涉及其中一种或多种器官、细胞或组织从活的或最近死亡的受试者获得的医学程序，可选择纯化/富集，执行处理或程序以处理干细胞或祖细胞(例如，包括用本发明的组合物孵育细胞以增强HSCs的移植能力的离体施用步骤)，然后在可选的处理或程序之后施用于相同的或不同的个体。
施用到个体的DPP-IV抑制剂的量取决于该受试者的特征，例如一般健康、年龄、性别、体重和药物耐受性，以及对曲前列环素和/或细胞移植的反应的程度、严重程度和类型。
接受干细胞移植的个体可以患有任何骨髓疾病，即其中正常骨髓结构被恶性肿瘤取代、镰状细胞疾病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性疾病、再生障碍性贫血或感染，导致减少血细胞和血小板的产生。所述骨髓疾病可以是例如白血病、血细胞隔室的缺陷，或化疗或辐照治疗后需要移植骨髓。
更具体地，所述血细胞隔室缺陷可以是血红蛋白病(如地中海贫血症)、嗜中性粒细胞功能缺陷，嗜中性粒细胞功能缺陷，T淋巴细胞和/或B淋巴细胞缺陷，例如重症联合免疫缺陷、布鲁顿无丙种球蛋白血症(Bruton’s agammaglobulinemia)。
用于治疗患有骨髓疾病的个体，例如由于化疗或辐照并因此经历造血干细胞移植的个体，在骨髓移植后通过施用一种或多种DPP-IV抑制剂在有限的时间内被本发明覆盖。
至少一种前列环素类似物与一种或多种的cAMP增强子一起用于预处理分离的干细胞，并且向移植的患者施用一种或多种DPP-IV抑制剂，可以用于在骨髓移植期间增强人HSCs的植入或通过使用HSCs重建骨髓。加速植入缩短受试者容易受到致命感染、出血和其它严重并发症的时期。因此，前列环素类似物与格列汀组合应该是预处理供体骨髓以增强骨髓植入(即通过减少所需细胞数量并缩短骨髓发育不全的持续时间)的有用的治疗选择。
骨髓移植之后使用DPP-IV抑制剂持续治疗受试者数天导致通过提高植入(即，通过减少所需细胞数量并缩短骨髓发育的持续时间)来改善临床结果。
因此，根据具体实施方案，在移植后至少1天，具体地在移植后至少5天，更具体地在移植后至少10天，更具体地在移植后至少14天进行治疗。
所述DPP-IV抑制剂可以通过本领域已知的任何方式施用于受试者。更具体地，提供肠内、静脉内或皮下给药。
静脉内给药是优选的给药方式。
但是，DPP-IV抑制剂可以是的口服形式，选自缓释形式、片剂或胶囊剂。
本发明还提供了一种试剂盒，其包括：
a)在第一单位剂型中至少一种前列环素类似物和毛喉素的量，
b)至少一种选自格列汀的DPP-IV抑制剂的量，
以组份a)和b)的两个、三个、四个或更多个单独的单元的形式，特别是用于治疗骨髓疾病，具体地所述骨髓疾病是白血病、血细胞隔室缺陷和化疗或辐照引起的骨髓疾病。
本发明还包括包装，其包括根据本发明的试剂盒以及使用说明书。
参考以下实施例将更充分地理解上述描述。但是，这些实施例仅仅代表实施本发明的一个或多个实施方案的方法，并且不应被视为限制本发明的范围。
实施例：
实施例1：
体外迁移试验
鼠造血祖细胞在体外用10μM曲前列环素(Trep)和30μM毛喉素(Fsk)(SigmaAldrich，维也纳，奥地利)或载体在含有生长因子的干细胞培养基([StemSpanTM(SFEM)(Stemcell technologies，USA)(50ng/mL鼠干细胞因子(SCF)，50ng/mL类fms酪氨酸激酶-3配体(Flt3)，50ng/mL白介素11(IL11)和150ng/mL鼠白介素3(mIL3)]购自PeproTech(伦敦，英国))中在37℃下预处理1小时。此后，洗涤细胞并在培养基中以2×106个细胞/mL重新悬浮。
将细胞悬浮液(0.1mL含有2×105个细胞)加入到TranswellTM培养皿(5μm孔径)的上室中。接着将培养基或含有100ng/ml鼠基质衍生因子-1(SDF-1＝CXCL12)的培养基加入到底部室。使细胞在37℃下迁移4小时。随后，通过细胞计数器测定从下室重获的细胞的数量。迁移细胞的数目表示为加到上室的总细胞的百分比。
将人脐带血衍生的CD34+细胞维持在干细胞培养基[X-VIVOTM 15(Lonza，瑞士)，添加有50ng/mL人Flt3、50ng/mL人血小板生成素和50ng/mL人(SCF)，购自PeproTech(伦敦，英国)]中。进行鼠细胞所述的迁移试验，除了将重组人SDF-1加入到下室中。显示的数据代表三个独立实验一式三份的平均值±SEM。通过单因素方差分析(one-way ANOVA)评估统计学显著性差异，接着进行Dunnett的多重比较(*，p＜0.05)。
数据如图1所示。
实施例2：
CXCR4拮抗剂AMD3100对SDF-1/CXCL12诱导的鼠造血祖细胞的迁移的抑制，其在存在曲前列环素和毛喉素的情况下被刺激
用曲前列环素(10μM；T)和毛喉素(30μM；F)在37℃下预孵育造血干细胞和祖细胞1小时，洗涤并以2×106个细胞/mL的细胞密度重新悬浮。将细胞悬液(0.1mL中2×105个细胞)加入到TranswellTM培养皿的上室中，其含有具有和不具有10μM CXCR4拮抗剂AMD3100(10μM)的培养基。下室中的培养基中含有100ng/ml鼠SDF-1。在37℃持续孵育4h；然后如图1的图例所示计算在下室中重获的细胞数。显示的数据是三个独立实验一式三份的平均值±SEM。通过单因素方差分析评估统计学显著性差异，接着进行Dunnett的多重比较(***，p＜0.001)。
CXCR4拮抗剂AMD3100对SDF-1/CXCL12诱导的鼠造血祖细胞的迁移的抑制，其在存在曲前列环素和毛喉素的情况下被刺激。
数据如图2所示。
实施例3：
维格列汀增强SDF-1/CXCL12诱导的造血祖细胞的迁移，其已经用曲前列环素和毛喉素预孵育。
在缺乏或存在曲前列环素(10μM；T)和毛喉素(30μM；F))的情况下将来自脐带血的鼠造血祖细胞(mHPC；左图)和人CD34+细胞(右图)预培养1小时。此后，将细胞悬浮液(0.1mL中2×105个细胞)加入到含有或不含30nM维格列汀(Vil)的培养基的TranswellTM培养皿的顶部室中。下室中的培养基适当地含有100ng/ml鼠或人SDF-1。在37℃持续孵育4h；然后如图1的图例所示计算在下室中重获的细胞的数量。显示的数据是三个独立实验一式三份的平均值±SEM。通过单因素方差分析评估统计学显著性差异，接着进行Dunnett的多重比较(*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001)。
数据如图3所示。
实施例4：
体内归巢试验
维格列汀和曲前列环素增加造血祖细胞的归巢，其用曲前列环素和毛喉素预孵育，但在体内组合时相互拮抗。
通过磁性细胞分选从6-8周龄的BALB/c供体小鼠(15只小鼠)中分离鼠造血干细胞和祖细胞，根据制造商的说明书使用保留骨髓细胞、红细胞、巨核细胞和淋巴谱系细胞和MACS微珠的谱系特异性抗体(Milteny Biotec，贝尔吉施格拉德巴赫，德国)。在不存在(载体对照＝未处理的细胞)和存在曲前列环素(10μM)和毛喉素(30μM)的组合(＝处理的细胞)下，将sca1+、c-Kit+、谱系阴性(Lin-)细胞预孵育1小时。
随后将(未处理和处理的)造血干细胞祖细胞(1×106个细胞)通过尾静脉注射到致死(9Gy)辐照的受体BALB/c小鼠中。在骨髓移植前24小时开始，受体小鼠没有接受任何额外的处理(标记为未处理的细胞和处理的细胞的条带)或者用曲前列环素(3μg/8h；标记为“体内trep”的条带)、维格列汀(10mg/kg/24h；标记为“体内vil”的条带)或曲前列环素和维格列汀的组合(标记为“体内trep+vil”的条带)注射小鼠。
通过集落形成试验在20小时后评估细胞归巢到骨髓中的能力。用PBS冲洗股骨和胫骨以收集骨髓细胞。通过红细胞裂解缓冲液(Stemcell technologies，美国)除去红细胞。将剩余的细胞重新悬浮在半固体甲基纤维素基培养基(MethoCult，stemcelltechnologies，美国)中。每种条件一式三份进行评估。加入特异性生长因子，以形成集落形成单位、粒细胞单核细胞(CFU-GM)和集落形成单位红细胞(CFU-E)，即促红细胞生成素3U/mL、IL3 10ng/mL、IL7 10ng/mL、GM-CSF 10ng/mL。培养物在37℃下含有5％CO2的潮湿气氛中保持6天。此后，在显微镜下计数菌落数。根据定义，这些菌落起源于已注射并已迁移到骨髓中的那些细胞，因为受体小鼠的内源性骨髓已被辐照破坏。因此，如果将没有注射造血祖细胞的辐照小鼠的骨髓铺板(阴性对照)，则没有获得菌落。
显然，(i)用曲前列环素和毛喉素在体外预孵育增加归巢(参见标记为未处理和处理的条带)，
(ii)用曲前列环素和/或维格列汀单独处理受体小鼠不会促进归巢(参见第2条带“未处理”，条带3至5标记为“+体内trep”、“+体内vil”、“+体内trep+vil”)，
(iii)已经注射过处理的细胞的受体小鼠的处理，用曲前列环素或维格列汀促进归巢(参见第6条带“未处理”，条带7和8号标记为“+体内trep”、“+体内vil”)，但是
(iv)组合(标记为“+体内trep+vil”的最右侧条带)的效力比单独施用的化合物(标记为“+体内trep”、“+体内vil”的条带7和8)的效力低。因此，当在体内组合时，曲前列环素和维格列汀是相互拮抗的。
维格列汀和曲前列环素增加造血祖细胞的归巢，其用曲前列环素和毛喉素预孵育，但在体内组合时相互拮抗。数据如图4所示。
实施例5：
体内移植试验
将曲前列环素和维格列汀的组合施用于致死辐照的BALB/c受体小鼠，其注射了在体外用曲前列环素和毛喉素的组合预处理的造血祖细胞，在增强这些小鼠的存活方面比在体内只施用维格列汀或曲前列环素效果差。
如图4的图例所示，从供体小鼠骨髓分离的造血祖细胞(BALB/c)。用10μM曲前列环素和30μM毛喉素或载体在37℃下体外处理细胞1小时。洗涤后，将0.2×106阴性谱系造血祖细胞通过尾静脉注射入致死辐照的(9Gy)受体BALB/c小鼠(10组)中。如果没有用曲前列环素和毛喉素的组合在体外预处理，则造血祖细胞的数量太低以致无法挽救受体动物。因此，接受未经预处理的细胞的小鼠组在第一周内死亡(黑线，CTRL)。造血干细胞有限的数量足以拯救已接受预处理细胞的50％小鼠，然后用曲前列环素(3μg/8h s.c.处理10天；体外预处理细胞+用曲前列环素体内处理受体小鼠标记为红色曲线)处理。最有效的方案是注射预处理的造血祖细胞，然后施用维格列汀(10mg/24h s.c.)：所有小鼠(即10只中的10只)存活(曲线标记为体外预处理细胞+用维格列汀对受体小鼠的体内处理)。相比之下，在所有接受预处理细胞的受体小鼠中，接受曲前列环素(3μg/8h)和维格列汀(10mg/kg/24h)的组合的小鼠具有最差的结果：10只小鼠中只有2只存活(灰线标记为体外预处理细胞+用曲前列环素和维格列汀的组合体内处理的受体小鼠)。在造血祖细胞移植后立即开始药物注射(即通过皮下注射施用曲前列环素和/或维格列汀)并持续10天。所有曲线彼此显著不同(对数秩检验)。
将曲前列环素和维格列汀组合施用于致死辐照的BALB/c受体小鼠，其注射了在体外用曲前列环素和毛喉素的组合预处理的造血祖细胞，在增强这些小鼠的存活方面比在体内只施用维格列汀或曲前列环素效果更差。数据如图5所示。
实施例6：
我们探讨了进一步增强曲前列环素和毛喉素的作用的条件。这是基于以下观察：曲前列环素和毛喉素的组合的作用至少部分地通过诱导CXCR4-受体(即趋化因子基质衍生的因子-1＝SDF1＝CXCL12的受体)介导。此外，我们比较了二甲基-PGE2和曲前列环素通过人HSPCs对cAMP积累的影响。
材料和方法
鼠和人的造血干细胞和祖细胞的分离
通过颈脱位法处死十只小鼠(C57BL/6或Balb/C)。使用注射器和271/2G针将后肢的长骨(即股骨和胫骨)从肌肉和结缔组织中分离出来，并用RPMI培养基冲洗。将细胞悬浮液从可见的结缔组织中释放出来，收集并转移到离心管中。通过离心(1,200rpm/～100g，5分钟)收集细胞，并重新悬浮于3mL红细胞裂解缓冲液(0.15M NH4Cl，10mM KHCO3，0.1mM EDTA，pH调至7.2至7.4)中。将细胞悬浮液在20℃下孵育2分钟，然后冰浴4分钟。此后，加入RPMI(10mL)，通过离心收集细胞并计数。细胞的典型产量为3*107个/鼠。
将细胞以2.5*108个细胞/mL的细胞密度重新悬浮于含有2％FCS(胎牛血清)的冰冷的PBS(磷酸盐缓冲盐水)中，向其中加入生物素化抗体的混合物(Miltenyi Biotec的“Lineage Cell Depletion Kit”)，以每108个细胞0.1mL抗体溶液的比例含有针对CD5、CD45R(B220)、CD11b、GR-1(＝Ly-6G/C)、7-4和Ter-119的谱系特异性抗体。在冰上将细胞用抗体孵育20分钟，并通过离心沉淀。重新悬浮(3.3*108个细胞/mL)后，将第二抗生物素包覆的微珠(0.2mL/108个细胞，提供Milageyi Biotec的“Lineage Cell Depletion Kit”)加入到细胞悬浮液中，在冰上将混合物孵育15分钟。此后，将样品稀释在MACS-缓冲液(30mL)中，通过离心收集细胞并重新悬浮于6mL的MACS缓冲液中。将该悬浮液装载到预包装的LS柱上，其中含有包覆有细胞相容的塑料材料的铁磁珠。通常使用三根柱(2mL细胞悬浮液/柱)。流经含有谱系标记-阴性细胞(Lin-细胞)，而谱系确定的细胞(lineage committed cells)保留在柱上。通过离心沉淀细胞并重新悬浮于2mL PBS中。典型的产量为7*105个lin-细胞/鼠。
从健康供体的脐带采集人造血干细胞和祖细胞(HCPCs)：在健康的足月分娩期间收集脐血样品使用磁激活细胞分选(magnetic-activated cell-sorter)(MACS)直接CD34祖细胞分离试剂盒(Direct CD34 Progenitor Cell Isolation Kit)(Miltenyi Biotech)分离CD34+细胞，并如(3)所述扩增。简言之，用等体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释脐带血；将该悬浮液(25ml)层叠到LymphoPrepTM(通过Nycomed获得的密度培养基，其含有三乙酸钠和多糖的混合物)。将管在浮桶式转头(swinging bucket rotor)中以355g离心30分钟。收集含有单核细胞的层，用PBS稀释(至50mL)，并以400g离心8分钟以除去残留的LymphoPrepTM。在含有150mM NH4Cl、10mM KHCO3和0.1mM EDTA(用HCl调节pH为7.2至7.4)的缓冲液中，在4℃下裂解10分钟除去红细胞。测定单核细胞的数量，并在分离试剂盒(Isolation Kit)提供的MACS缓冲液中调节至2*108个细胞/mL。加入PositiveSelection Cocktail(0.1mL/mL细胞悬浮液)，悬浮液在室温下孵育15min并加入磁性纳米粒子(50μL/mL)。在室温下再孵育10分钟后，通过加入培养基将细胞悬浮液稀释至2.5mL。将管置于磁体中5分钟，然后收集细胞。该步骤重复5次。在含有补充有GlutaMAX(2.5mM；Gibco/Invitrogen)和青霉素/链霉素(P/S；各125U/mL)的无血清X-VIVO15培养基(BioWhittaker)的悬浮培养物中，富集的细胞繁殖6天(即两次群体倍增))和Flt3L，SCF和TPO(各为50ng/mL)。典型产量为9*105个CD34+细胞/脐血样本，将其扩增至3.5*106个细胞。所有步骤均按照维也纳医科大学机构审查委员会的指导原则进行，用于进行这些研究。根据“赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki Principles)”提供知情同意书。
流式细胞术
通过流式细胞术评估鼠和人的造血干细胞和祖细胞(HSPC)制剂的纯度。用于细胞表面标记染色的抗体来自以下来源：鼠谱系抗体来自Becton Dickinson Biosciences(BD559971，其含有生物素化的抗CD3ε、抗CD11b、抗CD45R、抗Ly-6G/Ly-6c、抗Ter-119)，亲和纯化的大鼠抗鼠CD16/CD32(鼠FcγII/III嵌段、BD553142)和荧光染料链霉亲和素-别藻蓝素-Cy7(链霉亲和素APC-Cy7、BD554063)也来自Becton Dickinson Biosciences。藻红蛋白(PE)-Cy7标记的抗小鼠Ly6A/E(＝干细胞抗原-1＝Sca1)PE-Cy7(目录号25-5981-82)和PE-Cy5抗鼠CD117(c-Kit)(目录号15-1171-81)来自eBiosciences。
在MACS之后，立即将1*106个谱系阳性(Lin+)和阴性(Lin-)细胞转移到FACS(荧光激活细胞分选)管中，并在冰上储存在50μL PBS中。同时，将适用于FACS的以下抗体稀释(1:50)，并在PBS中混合：抗CD16/CD32纯化(阻断Fc受体)、生物素化的抗CD3、生物素化的抗CD11b、生物素化的抗CD45R、生物素化的抗Ly-6G/Ly-6C和生物素化的抗Ter-119、链霉亲和素标记的APC-Cy7、PE-Cy7标记的抗Sca-1、PE-Cy5标记的抗c-kit。将该主要的混合物(50μL)加入到每个样品中，然后通过温和涡旋混合，并在4℃下在黑暗中孵育15分钟。此后，通过离心收集细胞，在2mL PBS中洗涤并重悬于PBS中。在FACS Canto II(Becton Dickinson)中分析样品。浇注过程如下：通过记录向前和侧向散射来设定活细胞门。根据谱系标记(即CD11b、CD45R、Ly-6G/Ly-6C、Ter-119)的表达进一步区分活细胞。这允许定义Lin-细胞的门，进一步分析了Sca-1和c-Kit的表达。
流式细胞术也用于监测通过人HSPCs表达CXCR4和CD26/DPPIV(二肽基肽酶-IV)。用10μM曲前列环素和30μM毛喉素处理2h、4h和6h后测量CXCR4和CD26/DPPIV的表达。孵育后，按照制造商的说明书洗涤人CD34+细胞并用抗体(eBioscience)染色成CXCR4和CD26，并通过FACS分析进行定量。分别进行三次独立实验，然后对数据进行平均统计分析。数据以平均值±SEM表示，并使用单因素方差分析进行比较。
[3H]cAMP积累试验
首先在不含100ng/ml百日咳毒素(Sigma Aldrich)的情况下，在补充有生长因子的X-VIVO15培养基中将人造血CD34+干细胞和祖细胞(HSPCs，4×105/mL)预培养16小时，然后代谢标记腺嘌呤核苷酸库通过在补充有生长因子和10μg/mL腺苷脱氨酶(Roche)的X-VIVO15培养基中的[3H]腺嘌呤(Perkin Elmer，1μCi/mL)中另外孵育4小时。此后，用1或10μM曲前列环素、1或10μM二甲基-PGE2(dmPGE2)、毛喉素(30μM)或毛喉素和前列腺素的组合攻击细胞30分钟。然后将细胞沉淀(100g 5分钟)，除去培养基，将沉淀物在冰冷的含有0.1mMcAMP的2.5％高氯酸(0.9mL)中裂解，在冰上保持1小时，并用4.2M的KOH(0.1mL)中和。通过在含有Dowex AG50-X8和中性氧化铝(3)的柱上的连续色谱法分离ATP和cAMP。
细胞活力、细胞周期分布和集落形成
在存在载体或10μM曲前列环素和30μM毛喉素的组合的情况下人或鼠HSPCs在37℃孵育1小时和24小时。在4℃下用PBS洗涤后，根据制造商的方案用PE Annexin-V细胞凋亡检测试剂盒(PE Annexin-V Apoptosis Detection Kit)对细胞进行外部化的磷脂酰丝氨酸染色，或者在37℃用PI(PBS中50μg mL-1)40分钟检测DNA含量。通过流式细胞术获得的数据用Facs Diva软件进行分析。如下测定小鼠HSPCs集落的形成：在存在10M曲前列环素和30M毛喉素的情况下孵育1小时后，细胞重新悬浮于含有GM-CSF和IL-3(各10ng mL-1)的中用于形成CFU-E的CFU-GM和3U mL-1EPO和IL-3，并在37℃和5％CO2下培养7-10天。在光学显微镜下计数菌落数。
迁移试验
将从BALB/c供体小鼠的骨髓的鼠谱系-阴性造血干细胞和祖细胞和从脐带血分离的人CD34+HSPCs在鼠细胞培养基(SFEMTM；生长因子各50ng mL-1；SCF，FIt3，IL11和150ngmL-1IL3)或人干细胞培养基(X-VIVOTM 15，TPO，FL3和SCF各50ng mL-1)中用10M曲前列环素和30M毛喉素的组合刺激1小时。洗涤后，将细胞悬浮液(0.1mL中2×106个细胞)置于TranswellTM(6.5mm直径，3μm孔径)的上室中。下室充满300μL含生长因子和100ng/ml-1SDF-1的培养基。在指示的地方，上室和底部室都补充有30nM维格列汀。在37℃孵育4小时后测定SDF-1的趋化性。已经迁移到底部室的HSPCs在细胞计数器中计数。试验一式三份进行。
归巢试验
使用MACS微珠从供体小鼠B6.SJL-PtrcAPep3B/Boyl(CD45.1+)的全部骨髓细胞中分离谱系-阴性HSPCs(见上文)。用10μM曲前列环素和30μM毛喉素或载体对照在37℃下体外处理细胞1小时。洗涤后，将0.2×106个谱系-阴性的CD45.1+细胞注射到经致死辐射的(10Gy)受体C57B1/6(CD45.2+)小鼠中。也用曲前列环素(0.15mg kg 8h-1)、维格列汀(10mg/kg-1)或两种药物组合皮下施用于受体小鼠进行体内处理。用相同体积的载体注射对照小鼠。移植后16h从受体小鼠中分离全部的骨髓细胞。红细胞裂解后，细胞染色CD45.1和CD45.2标记。通过流式细胞术测定骨髓中CD45.1+细胞和CD45.2+细胞的比例。
骨髓移植：
将同基因受体小鼠(C57BL/6或BALB/c)进行致死辐照。如果没有通过静脉内施用造血干细胞和祖细胞(HSPCs)来拯救，则这些小鼠在头两周内死亡。如上所述制备Lin-(Sca1+和c-Kit+)HSPCs细胞，并在不存在和存在10μM曲前列环素+30μM毛喉素(FSK)的组合的情况下在37℃下离体预处理1小时。此后，通过尾静脉注射所述细胞(1-5*105/鼠)。通过FACS测定白细胞数目，从第9天开始每3至5天收集血液样品(血细胞计数为～1G/L)。在一些情况下，也用(i)曲前列环素(0.15mg kg 8h-1)和维格列汀(10mg kg-1 12h-1)或两者的组合每8小时皮下注射治疗小鼠(25-30g)10天。
从造血干细胞和祖细胞分离RNA和聚合酶链反应：
使用2mL(Invitrogen)从鼠、人的造血干细胞和祖细胞(3×106个细胞)，从鼠脑皮层制备的混合(即神经元和神经胶质(glial))培养物，从人前列腺癌细胞系PC3和人结肠癌细胞系HCT116(作为阳性对照)中分离RNA。将均匀化的样品在室温下孵育5分钟以允许核蛋白复合物完全解离。将氯仿(0.4mL)加入到细胞裂解物中，并用手剧烈摇动管15秒。在室温下孵育3分钟后，样品在4℃下以12,000g离心15分钟。离心后，混合物分离成较浅的红色苯酚-氯仿相，中间相和无色的上层水相。将水相(RNA)转移到新的管中，并通过与1ml异丙醇混合来沉淀RNA。在室温下孵育10分钟后，样品在4℃下以12,000g离心10分钟。除去上清液，并用2ml 75％乙醇洗涤凝胶状RNA沉淀一次。将样品通过涡旋混合并在4℃下以7,500g离心5分钟。将RNA沉淀风干10分钟，并将溶液通过吸液管尖端传递几次溶解在80μL(高度纯化的)水中，并在55℃(储存在-20℃)下孵育10分钟。
在存在1μL寡核苷酸(dT)18引物、4μl 5×反应缓冲液、1μl RiboLockTM核糖核苷酸酶抑制剂(20u/μl)、2μl 10mM dNTP混合物、1μl RevertAidTM H Minus M-MuLV逆转录酶(200u/μl)和纯化水的存在下，总体积为12μl，在42℃下用RevertAidTM H Minus第一链cDNA合成试剂盒(富酶泰斯Fermentas)将RNA(1μg)逆转录成cDNA 60分钟，然后在70℃孵育5分钟。
用1μl cDNA、1μl 10mM dNTPs、1μl正向引物[10μM]、1μl反向引物[10μM]、4μl缓冲液[5×]、0.2μl聚合酶和纯化水，最终体积为20μl(11.8μl)，通过聚合酶链反应(PCR)扩增人前列腺素受体和CXCR4的片段。首先将混合物在95℃下孵育5分钟，接着40个循环(95℃变性45秒，57℃退火30秒，72℃延伸45秒)，最后在72℃下延伸5分钟。PCR产物在2％琼脂糖凝胶上分离。
表1：使用的引物(正向和反向)：
结果：
曲前列环素和dmPGE2诱导的环AMP积聚人造血干细胞和祖细胞
用[3H]腺嘌呤代谢标记后，如材料和方法所述，用曲前列环素(Trep，10μM)，dmPGE2(10μM)或毛喉素(Fsk，30μM)，曲前列环素(10μM)或dmPGE2(10μM)与毛喉素(30μM)的组合刺激人HSPCs。在刺激之前其中指示HSPCs已经用百日咳毒素(PTX)预处理16小时。数据来自三个独立实验，一式三份，误差条表示s.e.m。在存在30μM毛喉素的情况下，10μM曲前列环素比10μM dmPGE2更有效(P＝0.03；Wilcoxon检验)。通过百日咳毒素预处理消除这种差异(ns，不显著)。数据如图7所示。
用[3H]腺嘌呤对人CD34+造血干细胞和祖细胞(HSPCs)的腺嘌呤核苷酸库进行代谢标记，并在存在和不存在30μM毛喉素的情况下，检测它们对曲前列环素和二甲基-PGE2(dmPGE2)的响应。从图7可以看出，不管细胞是在不存在或存在毛喉素的情况下被刺激，曲前列环素比dmPGE2明显更有效。这种二萜与腺苷酸环化酶的催化C1和C2结构域之间的伪底物裂缝结合，并使所述酶的各种异构体对刺激性G蛋白Gαs(5-7)更具响应性。考虑到dmPGE2也是Gi偶联EP3受体(8,9)处的完全激动剂并因此通过EP2和EP4受体引起腺苷酸环化酶的Gs依赖性刺激和通过Gi偶联的EP3受体引起伴随抑制，可以使dmPGE2的较低功效合理化。百日咳毒素通过ADP核糖基化从Gαi亚基的C末端去除的四个氨基酸的半胱氨酸残基，消除Gi偶联受体与Gi(和相关的G蛋白如Go和Gt)的相互作用。因此，在存在百日咳毒素的情况下将HSPCs预培养16小时。这种预处理增加了对dmPGE2的响应(参见图7中的第6和9条带)，使得由曲前列环素+毛喉素引起的cAMP响应和由dmPGE2+毛喉素引起的cAMP响应(参见图7中的第8和第9条带)之间没有显著差异。这证实了dmPGE2和曲前列环素对人HSPCs的作用有很大差异：dmPGE2与Gi偶联受体结合，但是曲前列环素没有。
用曲前列环素和毛喉素预处理HSPCs不会改变细胞活力、细胞周期进程或分化潜能
cAMP的持续升高可以引发造血细胞凋亡(10)。dmPGE2处理的HSCs的增强移植归因于对细胞存活、增殖和归巢的影响(11)。曲前列环素和dmPGE2在招募G蛋白的能力上有所不同：dmPE2诱导的Gi的募集可能特别相关的，因为通过Gi的信号传导可以导致脂质激酶PI3激酶和下游激酶AKT的激活，其刺激细胞的增殖和存活(12,13)。因此我们检查了是否用30μM毛喉素和10μM的组合体外处理人HSPCs
用曲前列环素和毛喉素预处理鼠和人HSPCs既不诱导凋亡也不改变细胞周期进程或分化潜能。将人HSPCs用10μM曲前列环素和30μM毛喉素孵育1小时。随后，通过流式细胞术评估(A，B)凋亡诱导和(C，D)细胞周期进程。描绘了代表性的原始图片(A，C，左图)，并且总结了三个独立实验中获得的数据(B，D，右图)。在未处理和处理的细胞之间检测到根据G0/1、S和G2期的凋亡细胞或细胞分布没有差异(单因素方差分析)(E，F)。将鼠HSPCs从骨髓中分离、预处理并重新悬浮于含有支持粒-单核细胞(CFU-GM)和红细胞谱系(BFU-E)的集落形成单位的分化和生长所需的生长因子的甲基纤维素培养基中。10天后，在光学显微镜下计数菌落数目，并观察菌落的形状和形态。显示了代表性的显微镜照片和三个独立实验的量化。数据为平均值±SEM(n＝3)。
(数据如图8所示)
曲前列环素使细胞对细胞凋亡更敏感(图8A和B)或阻碍其进入细胞周期和阻碍细胞周期的进展(图8C和D)或改变鼠HSPCs产生特异性谱系的能力(图8E和F)。如原始点图(图8A)所示和图8B所总结的，活细胞、早期凋亡的细胞和死细胞的存在是相当的，并且用30μM毛喉素和10μM曲前列环素的体外处理，膜联蛋白-V阳性细胞的数量没有增加。类似地，不管HSPCs是否暴露1小时或24小时，保持存在曲前列环素和毛喉素的异步生长的未经处理的人HSPCs和HSPCs的细胞周期分布是相当的(参见图8C的原始直方图，图8D的平均数据)。重要的是，我们还没有发现曲前列环素和毛喉素对骨髓和红系集落的形成的任何作用：从骨髓中分离鼠HSPCs，在存在曲前列环素和毛喉素的情况下孵育1小时，并重新悬浮于含有培养基的甲基纤维素中，该培养基具有需要用于支持CFU-GM和BFU-E的集落形成单位的分化和生长的生长因子。10天后，菌落的形态(图8E)和数目相当(图8F)。
曲前列环素刺激人和鼠HSPCs向SDF-1/CXCL-12的迁移
如上所述，dmPGE2处理的HSCs增强移植归因于对细胞存活、增殖和归巢的影响(10)。在我们的实验条件下，用曲前列环素和毛喉素体外处理鼠和人的HSPCs增强了骨髓重建(参见下文和图13)，但没有在体外改变细胞活力或细胞周期进程(参见图8)。
SDF-1/CXCR4轴在HSCPs归巢到骨髓龛中起主要作用。因此，我们推测，曲前列环素的有益作用是由于通过SDF-1/CXCR4介导的作用增强HSPCs的植入。
以下数据如图9所示：在体外用曲前列环素和毛喉素预处理增强CXCR4(A&B)和CD26/DPPIV(B)的表达。(A)从人HSPCs中分离RNA，其在不存在(未处理)或存在10μM曲前列环素和30μM毛喉素(Trep+Fsk)组合物的情况下孵育1小时。从人PC3细胞系制备的RNA作为阳性对照。逆转录之后，使用表1中列出的引物进行PCR依赖性扩增。CXCR4的扩增子在琼脂糖凝胶上电泳分辨，并通过溴化乙锭染色观察。将编码β-肌动蛋白的mRNA扩增作为内部对照。这些数据代表了两次具有类似结果的补充实验。(B，C)将人CD34+细胞(B)和mHSPCs与10μM曲前列环素和30μM毛喉素或载体对照(未处理)孵育2小时、4小时和6小时。随后，通过FACS分析样品的CXCR4(B)和CD26(FiC)的表达。显示≥3次独立实验中阳性细胞的百分比(平均值±SEM；*P＜0.05相对于未处理对照，单因素方差分析(ANOVA))
该推测进行如下检查：(i)曲前列环素和毛喉素预刺激人HSPCs提高了CXCR4的mRNA水平(图9A)。这也表示CXCR4蛋白质表达增强(图9B)。有趣的是，这也伴随着CD26/DPPIV(二肽基肽酶-IV)的上调，所述酶使CXCR4配体SDF-1/CXCL12降解(图9C中示出鼠HSPCs)。(ii)CXCR4的上调导致人(图10A)和鼠HSPCs向SDF-1的迁移分别增加(图10B)。(iii)这种定向迁移是特定的，因为它被选择性CXCR4拮抗剂plerixafor/AMD3100阻断(图10C)。同样，通过用曲前列环素和毛喉素预处理HSPCs没有增加基础迁移(即，在不存在SDF-1时的随机迁移)(参见图10A和B中的第一和第三条带)。
图10显示了以下数据：在体外用曲前列环素和毛喉素预处理通过CXCR4增强SDF-1的作用。将新鲜分离的鼠和人的HPSCs在体外用载体(实心条带)或10μM曲前列环素和30μM毛喉素(Trep+Fsk，封闭条带)在37℃下预处理1小时，然后进行洗涤步骤。将人HSPCs的悬浮液(A)或鼠HSPCs的悬浮液(B，C)(0.1mL的含有生长因子的培养基中的2×105个细胞)加入到TranswellTM上室中，并使其向SDF-1迁移(下部室100ng/mL)4小时。对已经迁移通过5μm过滤器的细胞进行计数。在不存在和存在10μM AMD3100(C)的情况下也孵育HSPCs。数据代表三个独立实验一式三份的平均值±SEM。采用ANOVA进行统计学比较，然后是Tukey的多重比较。(*，P＜0.05；**，P＜0.01；***P＜0.001)。
CXCR4的阻断减弱曲前列环素对骨髓移植的有益效果
AMD3100的拮抗作用在体内进行了重现：用曲前列环素和毛喉素预处理的鼠HSPCs重建致死辐照的受体小鼠的骨髓，随后向小鼠皮下注射最佳剂量的曲前列环素10天。伴随施用AMD3100(3.3mg kg-1 8h-1)减弱了曲前列环素的有益作用，使所有受体小鼠最终死于骨髓衰竭(图11)。因此，综上所述，观察结果表明曲前列环素引起的cAMP积累、CXCR4的表达增加和曲前列环素处理的HSPCs中的CXCR4增强的信号传导之间存在机械联系。此外，它们还记录曲前列环素的作用取决于CXCR4：如果CXCR4的信号传导被阻断，则骨髓未被植入且所有的动物都死亡。
通过维格列汀抑制CD26/DPPIV，仅依次增强HPSCs的归巢和增强通过HPSCs重建骨髓，而不是用曲前列环素环伴随给药
已知几种趋化因子被CD26/DPPIV(二肽基肽酶-IV)降解。SDF-1/CXCL12也是如此。鉴于曲前列环素的作用至少部分由CXCR4的诱导而介导，它取决于CXCR4。因此，预测SDF-1/CXCL12的增强作用是有益的。在这方面，值得考虑的是，使用曲前列环素和毛喉素处理还诱导了CD26的表达，其在未刺激的HSPCs中基本上是不可检测到的，但是在超过10％的已经用曲前列环素和毛喉素刺激的HSPCS中检测到(图9C)。DPP-IV的几种抑制剂是可获得的，它们的人体药理学被很好地理解，它们已经施用到数百万患者多年以治疗II型糖尿病。事实上，绝大多数患者耐受DPP-IV抑制剂而没有危险的副作用。
鉴于DPP-IV抑制剂是曲前列环素的合适的组合伙伴，我们探讨了DPP-IV抑制剂维格列汀是否增强了曲前列环素的作用。首先首次用一种方法进行测试，所述方法测量了注射的HSPCs归巢至骨髓的能力：将从CD45.1+供体小鼠的骨髓中收获的HSPCs注射到同基因CD45.2受体。16小时后处死动物，通过FACS定量从它们的骨髓中回收的CD45.1+细胞数量。
这些实验表明
(i)在体外用前列环环素+毛喉素的组合单独预处理HSPCs不足以引起统计学显著增强巢(参见图12中的第三条带和第一条带)。图12表明单独用维格列汀和曲前列环素但不用其组合体内治疗受体小鼠，增加了HSPCs的归巢，所述HSPCs已经用曲前列环素和毛喉素预孵育。用载体(“未处理的细胞”)或用曲前列环素和毛喉素(“处理的细胞”)预处理从CD45.1+供体小鼠的骨髓中分离的鼠HSPCs，并通过尾静脉注射移植(每只小鼠2×105个细胞)到致死辐照的受体C57B1/6(CD45.2+)小鼠中。然后将受体小鼠分成7组。第1组和第2组中的小鼠仅具有未处理的对照细胞，此外，第2组中的小鼠用维格列汀(Vil，10mg kg-1/d)进行体内处理。分配到第3组的小鼠仅接受体外处理的细胞，第4组中的那些另外在体内给予曲前列环素(Trep，0.15mg kg-1 8h-1)。分配到第5组的小鼠给予曲前列环素(0.15mg kg-18h-1)和AMD3100(3.3mg kg-1 8h-1)的组合进行体内处理。第5组中的小鼠在体内接受曲前列环素(0.15mg kg-1 8h-1)和维格列汀(10mg kg-1/d)，并且最后将第6组中的小鼠体内给予维格列汀。16小时后通过FACS分析受试者的骨髓，评估CD45.1+细胞归巢到骨髓中的能力。数据为平均值±SEM(n＝3)。通过ANOVA进行统计学比较，然后进行Tukey的多重比较。
体外预处理+体内维格列汀的组合(最后的条带，“+体内(Vil)”)相对于所有其它组均有统计学意义(**，p＜0.01)。第4条带(“+体内Trep”)在统计学显著性方面与前三个条带、第5条带(“+体内(Trep+AMD3100”)和第6条带(“+体内(Trep+Vil)”)不同(*，p＜0.05)。
早期观察表明，使用dmPE2的体外预处理增强了HSPCs的归巢(11)。因此，这些研究结果再次突出了在dmPGE2(11)中预孵育的HSPCs与在曲前列环素和毛喉素的组合中预孵育的HSPCs之间的差异。
(ii)用曲前列环素+毛喉素的组合在体外预处理HSPCs增加了它们归巢到受体小鼠的骨髓中，条件是这些受体小鼠也在体内用曲前列环素处理(参见图12第四条带和第三条带)。
(iii)如果将CXCR4拮抗剂AMD3100/普乐沙福(plerixafor)，由于依次体外预处理(用曲前列环素+毛喉素)随后体内施用曲前列环素，导致增强的归巢消除(参见图12第四条带和第五条带)。这一观察结果与上文和图9、图10和图11中总结的结果一致，表明曲前列环素的作用取决于CXCR4的诱导。
(iv)仅将维根格汀体内施用于接受未经处理的HSPCs的受体小鼠，没有增强归巢(参见图12第二条带和第一条带)。
(v)将维格列汀体内施用于受体小鼠，其接受了曲前列环素+毛喉素预处理的HSPCs，随后在体内施用曲前列环素，消除了曲前列环素的归巢作用(参见图12第四条带和第六条带)。
(vi)如果用曲前列环素和毛喉素的组合体外预处理HSPCs，并且将维格列汀施用于受体小鼠，观察到归巢最显著的增加；在该方案之后归巢超过所有其它方案，包括注射曲前列环素+毛喉素预处理的HSPCs，随后体内施用曲前列环素(参见图12第七条带和第四条带)或随后在体内施用曲前列环素和维格列汀(参见图12第七条带和第六条带)。
维格列汀对CD26/DPPIV的抑制提高了通过仅在连续施用曲前列环素+毛喉素HPSCs后骨髓的重建
通过静脉注射2*105Lin-、c-Kit+、Sca1+HSPCS来拯救致死辐照的BALB/c小鼠。在这些条件下，HSPCs的数量是有限的，使得已经注射未处理的HSPCs的所有动物死亡(图13中的实线)。相比之下如果HSPCs已经在体外用曲前列环素和毛喉素组合预处理，并且向受体动物施用曲前列环素10天，则60％的动物存活下来(图13中的三角形/虚线)。如果HSPCs在体外用前列环素和毛喉素的组合预处理，并且向受体动物施用维格列汀10天，则受体小鼠的存活率增加至100％(图13中的圆圈/虚线)。但是，组合施用曲前列环素和维格列汀导致明显的相互拮抗作用：如果向受体注射在体外用前列环环素和毛喉素的组合预处理的HSPCs，然后施用曲前列环素和维格列汀，则绝大多数受体死亡(图13中的正方形/虚线)。这些观察结果与图13总结的归巢测定结果一致；换句话说，两种独立的方法记录了当在体内同时施用时曲前列环素和维格列汀的相互拮抗作用，但是当以正确的时间序列施用时即协同作用，即用曲前列环素+毛喉素的体外预处理HSPCs，然后向受体小鼠体内施用维格列汀。
AMD3100/普乐沙福对CXCR4的阻断可减弱维格列汀对受体小鼠存活的有益作用，但是AMD3100/普乐沙福本身也可提高存活率：
该项目的工作假设假定将将维格列汀施用至受体小鼠，该小鼠接受了用毛喉素+曲前列环素的组合预处理的HSPCs，由于抑制了SDF-1/CXCL12的分解，因此通过上调CXCR4的信号传导增强。如果是这样，通过同时施用AMD3100/普乐沙福，维格列汀的作用应该减小。用7组受体BALB/c小鼠进行实验(5只/组)。这些组中的几个是内部对照，其包括验证先前的发现是可重复的。所有小鼠接受HSPCs，其通过尾静脉注射之前已经用曲前列环素和毛喉素的组合体外预处理。HSPCs的数量是有限的(BALB/c中2×105/小鼠)，以致只注射预处理的HSPCs不足以拯救受体。已经注射维格列汀的受体小鼠表现最好；它们的存活优于已经施用曲前列环素的组(图11的数据，参见下文)。另外，施用曲前列环素和维格列汀组合的动物表现不好；因此这些观察结果概括在图13所示的结果。已经接受维格列汀和AMD3100/普乐沙福的组合处理的受试者的存活率低于只用维格列汀处理的动物。因此，维格列汀的作用可以至少部分通过CXCR4增强SDF-1/CXCL12的信号传导来解释。强调所有条件都是并行测试的，所以比较是合理的。
结论：
主要实验结果可概括如下：
(i)曲前列环素与dmPGE2不同，因为曲前列环素激活(鼠和人)HSPCs中的Gs偶联的前列腺素受体，dmPGE2还激活也存在于HSPCs上的Gi偶联的EP3受体。因此，用曲前列环素(与毛喉素组合)的单独体外处理不能增加体外HSPCs的增殖和存活(图8)，也不能增加它们体内归巢到骨髓(图11)。这与dmPGE2(11)的公开数据形成对比。如果受体动物在体内用曲前列环素连续处理，则仅归巢增强(图12)。
(ii)曲前列环素的作用至少部分取决于CXCR4的诱导(图9)，并且通过CXCR4导致增强SDF-1/CXCL12的信号传导。在体外，，通过显示曲前列环素+毛喉素预处理的HSPCs向SDF1的迁移(趋化性)增强(图10A，B)，通过用CXCR4拮抗剂AMD3100/普乐沙福阻断这种作用(图10C)，并且在体内，通过证明AMD3100/普乐沙福对曲前列环素诱导的增强归巢(图12)和受体小鼠的骨髓移植/存活的抑制(图11)。(iii)CD26/DPP-IV的抑制本身不会影响HSPCs归巢到骨髓，但与曲前列环素有协同作用，条件是HSOPCs首先在体外暴露于曲前列环素和毛喉素，然后在体内暴露于维格列汀(图12)。如果两种化合物同时体内施用，则存在相互拮抗作用。在独立实验中概括了这种协同作用和相互拮抗作用，其中测试了HSPCs的植入而不是其归巢，即HSPCs在致死辐照的受体小鼠中重建骨髓的能力，从而支持其存活(图13)。
图13表明单独体内施用DPP-IV抑制剂维格列汀增加了用曲前列环素和毛喉素体外处理HSPCs对受体小鼠存活率的有益效果。用10μM曲前列环素和30μM毛喉素或载体(实线)在体外37℃下处理从供体BALB/c小鼠分离的鼠HPSCs 1小时。洗涤后，将2×105个细胞注射到致死辐照(10Gy)的受体BALB/c小鼠中。接受载体处理的HSPCs的小鼠组在体内没有接受任何额外的处理，并作为辐照对照(实线，n＝19)：它们都因骨髓衰竭而死亡。另外一组小鼠(虚线/三角形，n＝20)接受了用10μM曲前列环素和30μM毛喉素预处理的HSPCs，并且还用曲前列环素(0.15mg kg-1 8h-1)体内处理。接下来的一组小鼠(虚线/正方形；n＝20)再次接受体外用毛喉素+曲前列环素处理的HSPCs，并进一步用曲前列环素(0.15mg kg-1 8h-1)和维格列汀(10mg/kg/24h)体内处理。最后，一组小鼠(虚线/圆圈；n＝20)接受体外用毛喉素+曲前列环素预处理的HSPCs，并用维格列汀(每天10mg kg-1)进行体内处理。通过皮下注射进行体内处理，移植后直接引发并持续10天。通过对数秩检验进行比较存活曲线；三种处理条件之间的差异具有统计学意义(p＜0.01)。
这个令人惊讶的发现是难以理解的，但它强调了信号序列的重要性：曲前列环素提供的Gs依赖性信号必须先于由通过CXCR4的SDF-1/CXCL12生成的Gi/Gq依赖性信号。
(iv)体内AMD3100/普乐沙福拮抗了曲前列环素和维格列汀的有益效果。要预测这种拮抗作用，因为曲前列环素诱导CXCR4，且维格列汀阻断降解SDF-1/CXCL12的酶。因此，这两个操作导致通过CXCR4增强信号传导，其被AMD3100/普乐沙福阻断。该观察结果强调了按顺序向移植的HSPCs提供正确的线索的重要性(见上文(iii))。此外，我们以前注意到，在体内，曲前列环素的剂量-响应曲线是钟形的，即较高的剂量在促进骨髓移植方面比在当前实验中使用的标准剂量更不利。这是由于细胞内层endo-ostal龛上EP4受体的存在，其刺激可以抵消前列腺素对HSPCs移植的作用(15)。同样，可以想象的是，SDF1/CXCL12还对内源性龛发挥复杂的作用，这可以既有利于也可以阻碍骨髓重建，这取决于上下文中的信号传导。
基于这些发现，可以得出结论
(i)用曲前列环素和毛喉素的组合体外预处理的HSPCs可以与体内施用曲前列环素或维格列汀的组合以增强骨髓重建。
(ii)同时施用两种化合物(即曲前列环素和维格列汀)的组合导致相互拮抗，因此具有较低的价值。但是，可以想象，以交替方案施用维格列汀和曲前列环素的顺序方案是有用的。
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<223> 引物
<400> 10
tgatgtgatc ctggcagaaa 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
tggatccctg ggtttatctg 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
gggaaacagg tactgcaatg a 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
ttactcattg ccacctccct 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
cgctccaaac ttggctgata 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
tctctggtgg tgctcatctg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
tgcaaatctg ggtttctgct 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
aggaagctgt tggctgaaaa 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
ctcactgacg ttggcaaaga 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
aggtgcaggt agcagtgacc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
actcacactg atcggttcca 20
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
gggcacgaga ggatgaagt 19
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
gatggcctga gtgaagcct 19
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
gtgtgctccc tgcctctc 18
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
ggggttgaag gcgtagaag 19
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
aaggctccat agtacgcacg 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
ctcagactac aggcacgggt 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
cggaggtctt ctgcttcttc 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
cactatgtgt tctctgcccg 20

Claims (15)

1.一种组合物，其包括至少一种用于处理造血干细胞移植受体的二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制剂，其中所述造血干细胞和/或祖细胞在移植前在体外已经用前列环素类似物进行处理以增强植入。
2.根据权利要求1所用的所述组合物，其中所述造血干细胞和/或祖细胞在移植前已经用前列环素类似物和cAMP增强子处理。
3.根据权利要求1或2所用的所述组合物，其中所述DPP-IV抑制剂选自格列汀。
4.根据权利要求1-3所用的所述组合物，其中格列汀选自由西他列汀、维格列汀、阿格列汀、沙格列汀和利格列汀、阿拉格列汀、特力利汀、吉格利汀和杜拓格利普汀组成的组。
5.根据权利要求1-4中任一项所用的所述组合物，其中所述前列环素类似物选自曲前列环素、伊洛前列素、西卡前列素和贝前列素或其药学上可接受的盐的组。
6.根据权利要求1-5中任一项所用的所述组合物，其中所述前列环素类似物是曲前列环素，优选曲前列环素的衍生物，选自曲前列环素的酸衍生物、曲前列环素的前药、曲前列环素的多晶型物或曲前列环素的异构体的组。
7.根据权利要求1-6中任一项所用的所述组合物，其中所述cAMP增强子为毛喉素。
8.根据权利要求1所用的所述组合物，其中所述DPP-IV抑制剂是维格列汀，并且其中所述造血干细胞在体外已经用曲前列环素和毛喉素处理。
9.根据权利要求1-8中任一项所用的所述组合物，其中所述DPP-IV抑制剂在造血干细胞移植前至少5小时，具体至少10小时，具体至少15小时，具体至少24小时施用。
10.根据权利要求1-9中任一项所用的所述组合物，其中所述DPP-IV抑制剂在造血干细胞移植后至少1天，具体地至少2天，具体至少3天，具体至少4天施用。
11.根据权利要求1-10中任一项所用的所述组合物，其用于治疗患有骨髓疾病的个体。
12.根据权利要求1-11中任一项所用的所述组合物，其中所述骨髓疾病为白血病、血细胞隔室缺陷、化疗或辐照引起的骨髓疾病。
13.根据权利要求12所用的组合物，其中所述血细胞隔室缺陷是血红蛋白病、嗜中性粒细胞功能缺陷或T淋巴细胞和/或B淋巴细胞缺陷。
14.用于增强造血细胞植入能力的方法，包括以下连续步骤：
a)提供造血干细胞和/或祖细胞的样品，
b)向所述细胞施用有效量的前列环素类似物和cAMP增强子，
c)将所述混合物孵育足以刺激所述细胞中的Gαs信号传导的时间，
d)分离所述细胞
e)将所述细胞移植到有需要的个体中
f)向所述个体施用有效量的DPP-IV抑制剂。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述干细胞或祖细胞衍生自脐带血、供体骨髓或胎盘。
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