KR102577669B1 - 이식 후에 조혈 줄기 세포의 생착 효능을 증가시키는데 사용하기 위한 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 줄기 세포 이식된 수용자(recipient)들 내의 조혈 전구 세포들의 이동(migration) 및 귀환(homing)을 증가시키기 위한, 적어도 하나 이상의 디펩티딜 펩티다제-IV(DPP-IV) 저해제를 포함하는 조성물의 신규 용도로서, 조혈 줄기(stem) 및/또는 전구(progenitor) 세포는 이식(transplantation) 전에 생착 증강 화합물(engraftment enhancing compound), 구체적으로 프로스타사이클린 유사체(prostacyclin analogue) 및 cAMP 인핸서(enhancer)로 시험관내에서(in vitro) 처리된 것인 조성물의 신규 용도에 관한 것이다.

Description

이식 후에 조혈 줄기 세포의 생착 효능을 증가시키는데 사용하기 위한 조성물
본 발명은 줄기 세포 이식된 수용자들 내의 조혈 전구 세포 (haematopoietic progenitor cell)들의 이동 및 귀환(homing)을 증가시키기 위한, 적어도 하나 이상의 디펩티딜 펩티다제-IV(DPP-IV) 저해제를 포함하는 조성물의 신규 용도로서, 상기 조혈 전구 세포는 상기 세포들의 이식(transplantation) 전에 상기 전구 세포들의 생착(engraftment)을 증강시키기 위해 프로스타사이클린 유사체로 시험관내(in vitro) 처리된 것인 조성물의 신규 용도를 제공한다. 구체적으로, 전처리(pretreatment)는 이식 전에 프로스타사이클린 유사체및 cAMP 인핸서(enhancer)를 이용하여 수행한다.
조혈 줄기 세포(haematopoietic stem cell: HSC)들은 개체의 생애 전반에 걸쳐 모든 혈액 생성물(blood product)들을 재생시킬 수 있고, 그들의 자기 재생(self-renewal)을 자손 분화(progeny differentiation)와 균형을 이루도록 할 수 있는 원시 세포(primitive cell)들이다. HSC들은 발달 기간 중에 전위(transition in location)를 겪으며, 혈류 내외로 이동하여 귀환 및 생착의 연속 단계들에서 골수 서식지(bone marrow nitche)에 들어가면서, 생애 전반에 걸쳐 포유동물들 내에서 순환한다. 귀환은 공여자 줄기 세포들이 골수로 향하는 길을 찾는 과정인데, 줄기 세포들의 생착(engrafting)은 골수에서의 성장을 의미한다.
HSC들은 이식 수용자들 내의 혈액 및 면역 세포들을 재저장할 수 있는 능력의 결과로서의 치료 잠재력을 가진다. 더욱이, HSC들은 뇌, 근육 및 간과 같은 다른 조직들을 위한 세포들을 재생시키는 잠재력을 가진다. 인간 자가(autologous) 및 동종(allogenic) 골수 이식 방법들은 최근에 백혈병 (leukemia), 림프종(lymphoma) 및 기타 다른 생명을 위협하는 질병들에 대한 요법으로 이용된다. 자가 골수 이식은 세포독성 약물(cytotoxic drug)들의 치료 범위(therapeutic window)를 증가시키고, 따라서 고용량 강도 화학요법(high dose intensity chemotherapy)을 허용하는데 사용되는 표준 방법이다(문헌[Aksentijevich I, Flinn I (2002) Chemotherapy and bone marrow reserve: lessons learned from autologous stem cell transplantation. Cancer Biother Radiopharm 17:399-403], 문헌[Awedan AA (2002) High intensity regimens with autologous hematopoetic stem cell transplantation as treatment of multiple myeloma. Ann Transplant 7:38-43] 참조). 그러나, 이들 방법의 경우, 생착을 위해 충분한 HSC들이 존재해야 한다는 것을 보장하도록, 다량의 공여자 골수가 분리되어야 한다.
HSC들의 세포 추적(cell trafficking), 구체적으로 귀환(homing)은 몇몇 다른 세포내 메카니즘(intracellular mechanism)들에 의해 조절된다.
첫째, HSC들에 의해 골수 서식지에 이주시키는, 생체내(in vivo) Gαs-형질도입된 신호(Gαs-transformed signal)의 필요성이 기술되어 있다(문헌[Adams GB et al., (2009) Haematopoietic stem cells depend on Gs-mediated signaling to engraft bone marrow. Nature 459:103-107] 참조). 이들 연구결과는 Gαs의 활성화가 조혈 줄기 세포들의 생존 및 분화를 촉진시킨다는 것을 보였던 초기 시험관내(in vitro) 실험들을 확인한다(문헌[Dexter TM et al., (1985) Inhibitors of cholera toxin-induced adenosine diphosphate ribosylation of membrane-associated proteins block stem cell differentiation. Blood 65:1544-1548], 문헌[Long MW et al., (1988) Cholera toxin and phorbol diesters synergistically modulate murine hematopoietic progenitor cell proliferation Exp Hematol. 16:195-200] 참조). Gαs는 막-결합된 포유동물 아데닐 사이클라제(adenyl cyclase)의 모든 9종의 아형(isoform)을 자극하는 이종삼함체성 G 단백질(heterotrimeric G protein)의 구아닌 뉴클레오티드 결합 α-서브유닛(guanine nucleotide binding α-subunit)이다. Gαs는 콜레라 독소(cholera toxin)로 세포들을 처리함으로써 생체외(ex vivo)/시험관내(in vitro)에서 본질적으로 활성화될 수 있다. 이는 콜레라 독소가 촉매적 아르기닌 잔기를 APD-리보실화하고(R186/187/201/202, 아르기닌의 정확한 수는 Gαs의 스플라이스 변이체(splice variant)에 달려 있고; 온전한 아르기닌 잔기는 GTP-가수분해 및 그 결과로 초래되는 Gαs의 탈활성화(deactivation)를 필요로 한다(문헌[Freissmuth M, Gilman AG (1989) Mutations of Gsα designed to alter the reactivity of the protein with bacterial toxins. Substitutions at ARG187 result in loss of GTPase activity. J Biol Chem 264:21907-21914] 참조). 증강된 생착은 사실상 콜레라 독소를 이용한 조혈 줄기 세포들의 전처리 후에 관찰될 수 있다: 줄기 세포 제제(stem cell preparation)이 콜레라 독소로 전처리되었다면, 골수에서 (Lin-) 전구(precursor) 세포들의 약 2배이었다(문헌[Adams, 2009] 참조). 둘째, HSC들은 모든 4종의 프로스타글란딘 E 수용체들(EP1-4)을 발현시킨다. (디메틸화된) 프로스타글란딘 E2를 이용한 조혈 줄기 세포들의 전처리는 생착을 증강시킨다(문헌[North TE, et al., (2007) Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature 447:1007-1011, 8]; 문헌[Hoggatt J, et al., (2009) Prostaglandin E2 enhances hematopoietic stem cell homing, survival, and proliferation (Blood 113:5444-5455] 참조). 이 효과는 정준(canonical) Gαs-의존성 신호화에 의해 매개되는데, 이는 단백질 키나제 A(PKA)의 cAMP-유도 활성화가 Wnt-의존성 신호화와 상승작용을 하여 β-카테닌(β-catenin)을 안정화시키기 때문이다(문헌[Goessling W et al. (2009) Genetic interaction of PGE2 and Wnt signaling regulates developmental specification of stem cells and regeneration. Cell 136:1136-1147] 참조).
또한, PGE2도 HSC CXCR4 mRNA 및 표면 발현(surface expression)을 증가시키고, 시험관내(in vitro) 기질세포 유래 인자-1(SDF-1)로의 이동 및 생체내(in vivo) 골수로의 귀환을 증강시키며, HSC의 세포 주기에의 진입 및 세포 주기를 통한 진행을 자극한다.
선택적으로 포스콜린(forskolin)과 병용하여, 프로스타사이클린 유사체를 이용하여 HSC들의 생착을 증강시키는 방법은 WO2012/095511에 기재되어 있다.
SDF-1 -CXCR4 축(axis)은 또한 세포 귀환과 관련되어 있는 것으로 알려져 있다. SDF-1은 정상적인 HSC들의 추적(trafficking) 및 이들의 골수에서의 귀환(homing) 및 보류(retention)의 조절에 중추적인 역할을 한다(문헌[Kucia et al., Stem Cells, 2005] 참조).
WO2009/152186 A1에 따르면, CD26 펩티다제(DPP-IV, 디펩티딜 펩티자제-IV) 활성의 저해는 이동 활성(migration activity)을 증강시킬 수 있고, CD26 펩티다제 저해제의 이용은 세포들의 귀환 및 생착을 증강시키는 것으로 기술되어 있다.
WO 2012/074676에는 GLP-1 길항제(antagonist) 및 DPP-IV 저해제(inhibitor)를 함유하는 간 보존(liver preservation)용 조성물이 기재되어 있다.
Hussain Filza 등은 줄기 세포 이식에 대한 트레프로스티닐(Treprostinil)의 효과를 보고한다(문헌[BMC Pharmacology, vol 11, no. Suppl 2, 2011, p A6] 참조).
US 2008/085264에는 조혈 줄기 세포의 이식 효능을 증가시키는 전처리를 위한 DPP-IV 저해제/CD26 펩티다제 저해제의 용도가 기재되어 있다.
Broxmeyer H. 등은 조혈 줄기 세포들을 이용한 이식에 대한 조사를 제공하고(문헌[STEM CELLS AND DEVELOPMENT, 2013, vol. 22, suppl. 1, pp. 103-110] 참조), 시타글립틴(sitagliptin)과 병용되는 dmPGE2의 용도를 추가로 논의한다(문헌[Broxmeyer H. and Pelus, L. 2014, Blood Cells, Molecules and Diseases 53, 34-38] 참조).
Schwaiger E. 등은 DPP-IV 저해제들의 용도를 기술하고 있고, 이들 저해제들의 존재가 골수의 생착을 하지 않는다는 것을 기술하고 있다(문헌[Experimental Hematology, 2011, vol. 40, no. 2, pp. 97-106] 참조).
Hoggatt J. 등은 조혈 줄기 세포들을 자극하기 위한 PGE2의 용도를 보고한다(문헌[BLOOD, 2009, vol. 113, no. 22, pp. 5444-5455] 참조).
WO2012/095511에는 트레프로스티닐 및 포스콜린을 이용한 조혈 줄기 세포들의 처리가 기재되어 있다.
이식에 수반되는 줄기 세포들의 국재화(localization)는 성공적인 이식을 위해 대단히 중요한 결정인자(critical determinant)이다. 현재, 다수의 줄기 세포들이 이식에 필요한데, 이는 줄기 세포들이 골수에 용이하게 생착되지 않으며, 성숙한 혈액 세포들의 감소를 초래하는 골수 무형성증(bone marrow aplasia)이 장기간 존재하기 때문이다.
따라서, HSC들을 효율적으로 자극하여, 골수 이식을 겪는 피험체들의 골수 서식지에의 분리된 HSC들의 귀환, 생착 및 보류를 증가시키고 이식에 필요한 HSC들의 수를 감소시키는 방법들 및 치료 요법들을 제공할 필요가 있다.
문제는 본 발명의 실시태양들에 의해 해결된다.
놀랍게도, 본 발명자들은 조혈 줄기 세포 귀환 및 생착이 상기 세포들의 생착 특성들을 자극하는 프로스타사이클린 유사체로 상기 줄기 및/또는 전구 세포들을 생체외(ex vivo) 전처리하고, 상기 조혈 줄기 세포들로 이식된 개체에 디펩티딜 펩티다제-IV(DPP-IV) 저해제를 추가로 투여함으로써, 성공적으로 증가될 수 있다는 것을 보였다.
구체적으로, 본 발명자들은 조혈 줄기 세포 귀환 및 생착이 적어도 하나 이상의 프로스타사이클린 유사체와 적어도 하나 이상의 cAMP 인핸서의 배합물로 상기 세포들을 생체외(ex vivo) 전처리하고, 상기 조혈 줄기 세포들로 이식된 개체에 디펩티딜 펩티다제-IV(DPP-IV) 저해제를 추가로 투여함으로써, 성공적으로 증가될 수 있다는 것을 보였다.
구체적으로, 본 발명은 조혈 줄기 세포 이식된 수용자들의 치료에 사용하기 위한, 적어도 하나 이상의 디펩티딜 펩티다제-IV(DPP-IV) 저해제를 포함하는 조성물로서, 상기 조혈 줄기 세포는 이식 전에 구체적으로 프로스타사이클린 유사체 및 cAMP 인핸서로 시험관내(in vitro) 처리된 것인 조성물을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 조혈 줄기 세포 이식된 수용자들의 치료에 사용하기 위한, 적어도 하나 이상의 디펩티딜 펩티다제-IV(DPP-IV) 저해제를 포함하는 조성물로서, 상기 수용자들은 생착을 증강시키기 위해 프로스타사이클린 유사체 및 선택으로 cAMP 인핸서로 시험관내(in vitro) 처리된 조혈 줄기 세포들이 이식된 것인 조성물을 제공한다.
놀랍게도, 본 발명은 이식 전에 프로스타사이클린 유사체를 이용하여, 선택적으로 포스콜린과 같은 cAMP 인핸서와 함께 프로스타사이클린 유사체를 이용하여, 분리된 조혈 줄기 세포를 항온처리(incubating)하고, 필요로 하는 환자에게 상기 세포들의 이식 직전 및 직후에 DPP-IV 저해제를 투여하면 HSC 귀환 및 생착 효율을 매우 증가시킨다는 것을 보였다. 이는 (글립틴에 의한) DPP-IV의 저해가 그 자체로 뮤린 모델(murine model)에서 골수 이식을 증강시키에 충분하지 않기 때문에 놀라운 것이다(문헌[Schwaiger E, et al., Exp Hematol. 2012 Feb; 40(2):97-106. doi: 10.1016/j.exphem.2011.10.010] 참조).
바람직한 실시태양에 따르면, 프로스타사이클린 유사체와 추가로 cAMP를 상승시킬 수 있는 화합물, 구체적으로 포스콜린 또는 cAMP 분해(degradation)의 저해제[포스포디에스테라제 저해제(phosphodiesterase inhibitor)]의 배합물을 이용하여 조혈 줄기 세포들을 항온처리한다.
또한, 놀랍게도, 본 발명자들은 생체내(in vivo) 동물 모델에서 상기 세포들의 이식 후에 DPP-IV 저해제, 구체적으로 빌다글립틴의 투여가 프로스타사이클린 유사체의 투여에 비하여 상기 조혈 세포 수용자들의 생존율(survival rate)을 유의적으로 증가시킨다는 것을 보였다.
또한, 본 발명자들은 트레프로스티닐 및 포스콜린 전처리된 조혈 줄기 세포의 이식 후, 프로스타사이클린 유사체, 구체적으로 트레프로스티닐과 DPP-IV 저해제, 구체적으로 빌다글립틴의 병용 투여가 상호 길항적이라는 것을 보였다.
본 발명의 실시태양에 따르면, 상기 용도의 조성물은 글립틴(gliptin)류로부터, 보다 구체적으로 시타글립틴(sitagliptin), 빌다글립틴(vildagliptin), 알로글립틴(alogiptin), 삭사글립틴(saxagliptin), 리나글립틴(linagliptin), 아나글립틴(anagliptin), 테넬리글립틴(teneligliptin), 제미글립틴(gemigliptin) 및 듀토글립틴(dutogliptin) 또는 이들의 기능적 유사체들로 이루어진 군으로부터 선택되는 DPP-IV 저해제를 포함한다.
본 발명의 구체적인 실시태양에 따르면, 조혈 줄기 세포는 트레프로스티닐(Treprostinil), 일로프로스트(Iloprost), 시카프로스트(Cicaprost) 및 베라프로스트(Beraprost) 또는 이들의 약학적 허용 염들로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로스타사이클린 유사체를 이용하여 시험관내(in vitro) 항온처리되고, 구체적으로 상기 프로스타사이클린 유사체는 트레프로스티닐의 산 유도체(acid derivative)들, 트레프로스티닐의 전구약물(prodrug)들, 트레프로스티닐의 다형체(polymorph)들, 트레프로스티닐의 이성질체(isomer)들 및 트레프로스티닐의 무수 다형체(anhydrous polymorph)들의 그룹으로부터 선택되는 트레프로스티닐의 유도체이다.
실시태양에 따르면, 조혈 줄기 세포들의 전처리는 또한 cAMP 인핸서, 구체적으로 포스콜린의 존재하에서 수행된다.
본 발명은 이식 전에 프로스타사이클린 유사체 및 cAMP 저해제로 시험관내(in vitro) 전처리된 조혈 줄기 세포 샘플들을 이용하여 줄기 세포 이식을 하는 개체, 즉 골수 질환들 또는 골수 관련 질환들[구체적으로 골수 질환은 백혈병(leukemia), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome), 골수증식성 질환(myeloproliferative disorder)들, 재생불량성 빈혈(aplastic anemia), 겸상적혈구 질환(sickle cell disease), 혈액 세포 격실의 결함(defect of the blood cell compartment), 화학요법 또는 방사선조사에 의해 유도되는 골수 질환임]을 겪는 개체의 선택된 그룹의 치료에 사용되는 DPP-IV 저해제의 용도를 포함한다.
보다 구체적으로, 혈액 세포 격실의 결함은 헤모글로빈병증 또는 호중구성 과립구 기능의 결함, T- 및/또는 B-림프구들의 결함[예: 중증 복합형 면역결핍증(severe combined immunodeficiency), 브루톤형 무감마글로불린혈증(Bruton’agammaglobulinemia)일 수 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 실시태양에 따르면, 이식 후에 프로스타사이클린 유사체들이 투여되는 개체은 DPP-IV 저해제로 치료되는 개체의 그룹에 포함되지 않는다.
본 발명의 실시태양에 따르면, DPP-IV 저해제는 빌다글립틴이고, 조혈 줄기 세포는 이식 전에 트레프로스티닐 및 포스콜린으로 시험관내(in vitro) 처리되었다.
본 발명의 추가의 실시태양에 따르면, DPP-IV 저해제는 조혈 줄기 세포 이식 하기 적어도 5시간, 구체적으로 적어도 10시간, 구체적으로 적어도 15시간, 구체적으로 적어도 24시간 전에 투여한다.
DPP-IV 저해제의 투여는 골수에 있어서의 충분한 줄기 세포 생착에 필요한 기간 동안일 수 있다.
또한, 본 발명의 실시태양은 골수 이식 후에 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 바람직하게는 적어도 10일, 바람직하게는 적어도 14일 기간 동안 DPP-IV 저해제를 투여하는 것을 포함한다.
본 발명에 따르면, 조성물은 정맥내(intravenous) 또는 피하(subcutaneous) 투여, 또는 서방형(sustained release form)들, 정제들 및 캡슐들의 그룹으로부터 선택되는 경구 제형으로 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 조혈 세포들의 생착 능력을 증강시키는 방법으로서, 하기 연속 단계들을 포함하는 방법을 제공한다:
a) 조혈 줄기 및/또는 전구 세포들의 샘플을 제공하는 단계.
b) 상기 세포들에 생착을 증강시키는 유효량의 프로스타사이클린 유사체를 투여하는 단계,
c) 상기 세포들에서 G-alphas-신호화를 자극하기에 충분한 기간 동안 혼합물을 항온처리(incubating)하는 단계,
d) 상기 세포들을 분리하는 단계,
e) 이식을 필요로 하는 개체에 상기 세포들을 이식하는 단계,
f) 상기 개체에 유효량의 DPP-IV 저해제를 투여하는 단계.
구체적으로, 본 발명은 조혈 세포들의 생착 능력을 증강시키는 방법으로서, 하기 연속 단계들을 포함하는 방법을 제공한다:
a) 조혈 세포들의 샘플을 제공하는 단계,
b) 상기 세포들에 생착을 증강시키는 유효량의 프로스타사이클린 유사체 및 cAMP 인핸서를 투여하는 단계,
c) 상기 세포들에서 G-alphas-신호화를 자극하기에 충분한 기간 동안 혼합물을 항온처리하는 단계,
d) 상기 세포들을 분리하는 단계,
e) 이식을 필요로 하는 개체에 상기 세포들을 이식하는 단계,
f) 상기 개체에 유효량의 DPP-IV 저해제를 투여하는 단계.
또한, 본 발명은 이식 후 골수에 생착되는 조혈 세포들의 수를 증가시키는 방법으로서, 조혈 세포들의 이식 직전 및/또는 직후에, 구체적으로 cAMP 인핸서, 구체적으로 포스콜린과 함께, 유효량의 프로스타사이클린 유사체, 구체적으로 트레프로스티닐과 조혈 세포들을 시험관내(in vitro) 접촉시키는 단계, 예비-항온처리된(pre-incubated) 세포들을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계, 및 DPP-IV 저해제, 구체적으로 빌다글립틴을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 실시태양에 따르면, 조혈 줄기 세포(HSC)들의 생체외(ex vivo) 전처리에 의해 HSC들의 생착을 증강시키는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법이 제공된다:
a) 조혈 줄기 및/또는 전구 세포들을 함유하는 샘플을 제공하는 단계,
b) 상기 줄기 및/또는 전구 세포들의 생착 능력을 증강시키는 프로스타사이클린 유사체, 구체적으로 프로스타사이클린 유사체 및 cAMP 인핸서를 포함하는 조성물을 상기 샘플에 혼합하여 혼합물을 수득하는 단계,
c) 상기 세포들에서 G-alphas-신호화를 자극하기에 충분한 기간 동안 상기 혼합물을 항온처리하는 단계,
d) 상기 자극된 세포들을 분리하는 단계,
e) 상기 세포들을 개체에 이식하는 단계,
f) 상기 개체에 DPP-IV를 투여하는 단계(구체적으로 정맥내 투여될 수 있음).
또한, 본 발명은 골수 질환(구체적으로 골수 질환은 백혈병, 혈액 세포 격실의 결함, 및 화학요법 또는 방사선조사에 의해 유도되는 골수 질환들임)의 치료에 사용하기 위한, 하기 성분 a) 및 b)의 2, 3, 4 또는 그 이상의 개별 단위(separate unit)의 형태로 하기 성분 a) 및 b)를 포함하는 부품들의 키트를 제공한다:
a) 제1 단위 제형 내의 유효량의 적어도 하나 이상의 프로스타사이클린 유사체 및 포스콜린;
b) 글립틴으로부터 선택되는 유효량의 적어도 하나 이상의 DPP-IV 저해제.
도 1: 트레프로스티닐 및 포스콜린의 존재하에 뮤린(murine) 및 인간 조혈 줄기 및 전구 세포들의 예비-항온처리은 상기 세포들의 SDF-1/CXCR 12를 향한 이동을 증가시킨다.
도 2: 트레프로스티닐 및 포스콜린의 존재하에 자극된 뮤린 조혈 줄기 및 전구 세포들의 SDF-1/CXCR 12-유도된 이동의 CXCR4 길항제 AMD3100에 의한 저해.
도 3: 빌다글립틴은 트레프로스티닐 및 포스콜린으로 예비-항온처리된 조혈 줄기 및 전구 세포들의 SDF-1/CXCR12를 향한 이동을 증강시킨다.
도 4: 빌다글립틴 및 트레프로스티닐은 트레프로스티닐 및 포스콜린으로 예비-항온처리된 조혈 줄기 및 전구 세포들의 귀환을 증가시키지만, 생체내에서(in vivo) 배합될 때 상호 길항적이다.
도 5: 트레프로스티닐과 포스콜린의 배합물로 시험관내(in vitro) 전처리된 조혈 줄기 및 전구 세포들이 주입된, 치명적으로 방사선조사된 BALB/c 마우스들에의 트레프로스티닐과 빌다글립틴의 병용 투여는 빌다글립틴 또는 트레프로수티닐의 단독 생체내(in vivo) 투여보다 상기 마우스들의 생존을 증강시키는데 덜 효과적이다.
도 6: 뮤린(murine) 및 인간(human) 조혈 줄기 및 전구 세포들(haematopoietic stem and progenitor cell, HSPC)들 내의 프로스타노이드 수용체(prostanoid receptor) 발현(A, B). RNA는 뮤린(A) 및 인간 HSPC들 (B)로부터 분리되고, 역전사된다. 뮤린 뇌 세포(뉴런 및 신경아교세포의 혼합 배양액) 및 인간 세포주 PC3 및 HCT116으로부터 제조된 RNA는 양성 대조군(positive contron)으로서의 역할을 한다. PCR-의존 증폭(PCR-dependent amplification)은 표 1에 열거된 프라이머(primer)들을 사용하여 수행되었다. 모든 E 프로스타노이드 수용체들(EP1 내지 EP4), I 프로스타노이드 수용체(IP) 및 D 프로스타노이드 수용체-1(DP1)을 위한 증폭반응체(amplicon)들은 아가로스 겔 상에서 전기영동식으로 분해되고(electrophoretically resolved), 브롬화 에티듐 염색(ethidium bromide staining)에 의해 가시화되었다. 레인(lane) 표지된 H2O는 대조군을 의미하는데, 증폭은 이전의 역전사의 부재하에 행하였다. GAPDH를 코딩하는 mRNA는 내부 참조(internal reference)용으로 증폭되었다.
도 7: 인간 HSPC들 내의 트레프로스티닐- 및 dmPGE2-유도된 cAMP 축적(accumulation)의 비교.
도 8: 트레프로수티닐 및 포스콜린을 이용한 뮤린 및 인간 HSPC들의 전처리는 세포사멸(apoptosis)을 유도하지 않으며, 세포 주기 진행 또는 분화 잠재력을 변경시키지 않는다. 인간 HSPC들은 10 μM 트레프로스티닐 및 30 μM 포스콜린을 이용하여 1시간 동안 항온처리하였다. 연이어, 유세포분석(flow cytometric analysis)에 의해 (A, B) 세포사멸 유도 및 (C, D) 세포 주기 진행을 평가하였다. 미처리된 세포들과 처리된 세포들 간에 G0/1기, S기 및 G2기에 따른 세포사멸성 세포(apoptotic cell)들 또는 세포들의 분포에 있어서의 차이가 발견되지 않았다[일원배치 분산분석(one way ANOVA)]. (E, F) 데이터는 평균±표준편차 (n=3)이었다.
도 9: 트레프로스티닐 및 포스콜린을 이용한 시험관내(in vitro) 전처리는 CXCR4 (A & B) 및 CD26/DPP-IV (B)의 발현을 증강시킨다.
도 10: 트레프로스티닐 및 포스콜린을 이용한 시험관내(in vitro) 전처리는 CXCR4를 통하여 SDF-1의 작용을 증강시킨다.
도 11: CXCR4-길항제 (AMD3100)의 생체내(in vivo) 투여는 수용자 마우스들의 생존에 대한 트레프로스티닐의 이로운 효과를 없앤다. 뮤린 HSPC들은 도 4에 범례로 개략적으로 설명된 바와 같이 트레프로스티닐 및 포스콜린을 이용하여 시험관내(in vitro) 전처리하였고, 치명적으로 방사선조사된 수용자 마우스들에 주입하였다(마우스당 2 x 105). 연이어, 마우스들을 두 그룹으로 분할하였다. 그룹 1(n=10)에 할당된 마우스들은 트레프로스티닐(0.15 mg kg-1 8 h- 1)을 이용하여 생체내(in vivo) 처리된 반면에, 그룹 2(n=10)내의 마우스들은 10일 동안 매 8시간마다 피하 주사에 의해 트레프로스티닐(0.15 mg kg-1 8 h-1) 및 AMD3100(3.3 mg kg-1 8h-1)을 수용하였다. 2개의 생존 곡선 간의 차이는 통계적으로 유의적이었다(p=0.007, 로그순위 검정).
도 12: 빌다글립틴 및 트레프로스티닐을 단독으로 이용하지만 병용하여 이용하지 않은 수용자 마우스들의 생체내(in vivo) 처리는 트레프로스티닐 및 포스콜린을 이용하여 예비-항온처리된 HSPC들의 귀환을 증가시킨다.
도 13: DPP-IV 저해제 빌다글립틴의 단독 생체내(in vivo) 투여는 수용자 마우스들에서의 생존율에 대한 트레프로스티닐 및 포스콜린을 이용한 시험관내(in vitro) 처리의 이로운 효과를 증가시킨다.
골수 환경에의 HSC들의 귀환 및 생착을 증가시키는 방법 및 수단을 제공하는 것은 강력하게 생물학적 및 의학적 영향을 미친다. 이식에 수반되는 줄기 세포들의 국재화(localization)는 임상 방법에 매우 중요한데, 이는 현재 다수의 줄기 세포들이 임상적 이식에 필요하며, 따라서 다량의 공여자 세포들의 필요성을 초래하기 때문이다. 또한, 상기 방법은 매우 유용한데, 이는 상당수의 자가 공여자 이식물(autologous donor transplant)들이 불충분한 수의 줄기 세포들 또는 HSC들을 함유하기 때문이다. 마찬가지로, 환자들은 종종 조직적합한 공여자들을 찾을 수 없는데, 이는 성공적인 이식에 필요한 HSC들의 수를 감소시키는 방법 및 조성물의 필요성을 강조하게 된다. 시험관내에서(in vitro) 또는 생체외에서(ex vivo) HSC들의 귀환 및 생착 특성들을 향상시킬 수 있는 능력은 공여자들로부터 보다 소수의 세포들의 수집을 허용하고, 이로써 골수/말초 줄기 세포 수확과 관련된 시간 및 불편을 감소시키고, 자발적인 HSC들 공여자들의 풀을 증가시킨다.
본 발명은 조혈 전구 세포들의 이식을 겪는 환자들의 치료에 사용하기 위한 디펩티딜 펩티다제-IV(DPP-IV)의 신규 용도를 제공하는데, 다만 이식에 사용되는 상기 줄기 세포는 개체의 몸에 투여하거나 또는 개체의 몸에 상기 세포들을 되돌리기 전에, 구체적으로 cAMP 인핸서와 함께, 상기 세포들의 생착을 증강시키는 적어도 하나 이상의 프로스타사이클린 유사체를 이용하여 항온처리하였다.
조혈 줄기 및 전구 세포들, 구체적으로 뮤린 및 인간 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)들은 몇몇 프로스타노이드 수용체들(즉, EP1, EP2, EP3, EP4, IP 및 DP1, 도 6)을 발현시킨다. 트레프로스티닐은 모든 Gs-커플링된 수용체들, 즉 EP2, EP4, IP 및 DP1 수용체들을 특이적으로 활성화시키는 것으로 알려져 있는 반면에, dmPGE2는 또한 EP3 수용체들을 자극한다. 본 발명자들은 트레프로스티닐이 조혈 전구 세포들 내의 cAMP를 자극한다는 것을 보였다. 인간 조혈 줄기 및 전구 세포들에서, 트레프로스티닐에 대한 농도-반응 곡선(concentration-response curve)은 반응의 10% 내지 90% 범위에서 두자릿수(more than two orders of magnitude)이었다. 이는 몇몇 자극성 수용체들의 활성화와 일치한다. 트레프로스티닐-유도된 cAMP 축적은 아데닐 사이클라제의 직접적 활성화제인 포스콜린과의 병용시에 증강될 수 있다.
조혈 줄기 및 전구 세포는 이들의 생존 및 적혈구(erythroid) 및 과립구(granulocyte)/단핵구(monocyte) 계통(lineage)으로의 비대칭적 세포 분할 및 분화를 연이어 겪을 수 있는 능력에 대한 탐지가능한 영향 없이, 트레프로스티닐과 포스콜린의 배합물에 노출될 수 있다. 따라서, 이식에 필요한 세포들의 수는 프로스타사이클린 유사체 및 포스콜린을 이용한 전처리 없이 이식에 필요한 세포들에 비하여 유의적으로 더 적다.
트레프로스티닐과 포스콜린의 배합물을 이용한 조혈 줄기 및 전구 세포들의 전처리는 방사선조사된 기관들 내의 골수 생착을 증강시킨다.
생체내에서(in vivo) 트레프로스티닐을 이용한 수용자의 추가의 처리는 골수 생착을 더 증강시킨다.
상기 DPP-IV 저해제들은 구체적으로 글립틴류의 그룹으로부터 선택된다.
본 명세서와 특허청구범위에서 사용되는 바와 같이, 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 단수 형태(예컨대, "a", "an" 및 "the")는 복수를 포함한다.
구체적으로, 프로스타사이클린 유사체는 트레프로스티닐, 일로프로스트, 베라프로스트 및 시카프로스트 또는 이들의 약학적 허용 염들의 그룹으로부터 선택된다.
트레프로스티닐은 프로스타사이클린의 합성 유사체이고, 대사적으로 안정하다. 트레프로스티닐은 레모듈린(Remodulin
Figure 112017072693773-pct00001
)으로 시판된다. 트레프로스티닐은 프로스타사이클린의 합성 유사체이다. 트레프로스티닐은 레모듈린(Remodulin
Figure 112017072693773-pct00002
)으로 시판된다. 트레프로스티닐은 (1R,2R,3aS,9aS)-[[2,3,3a,4,9,9a-헥사하이드로-2-하이드록실-1-[(3S)-3-하이드록시옥틸]-1H-벤즈[f]인덴-5-일]옥시]아세트산 모노소듐 염이다.
일로프로스트는 "일로메딘(Ilomedine)"으로 시판되고, 5-(E)-(1S,5S,6R,7R)-7-하이드록시-6[(E)-(3S, 4RS)-3-하이드록시-4-메틸-1-옥텐-6-이닐]-비-사이클로[3.3.0]옥탄-3-일리덴}펜타노산이다.
베라프로스트는 2,3,3a,8b-테트라하이드로-2-하이드록시-1-(3-하이드록시-4-메틸-1-옥텐-6-이닐)-1H-사이클로펜타(b)벤조푸란-5-부타노산이다.
시카프로스트는 2-[(2E)-2-[(3aS,4S,5R,6aS)-5-하이드록시-4-[(3S,4S)-3-하이드록시-4-메틸노나-1,6-디이닐]-3,3a,4,5,6,6a-헥사하이드로-1H-펜타렌-2-일리덴]에톡시]아세트산이다.
본 발명에 따르면, "프로스타사이클린 유사체들"이라는 용어는 상기 물질들의 기능적 유도체들 및 기능적 유사체들을 포함한다.
"유사체(analogue)" 또는 "유도체(derivative)"라는 용어들은 구조 및 기능에서 다른 화학 물질과 유사한 화학 분자인데, 모 화학물질(parent chemical)과 동일한 기능을 보유한다면 하나 이상의 작용기(예컨대, 2개, 3개 또는 4개의 작용기)의 수식(modification)에 의해 상이할 수 있는 단일 원소 또는 작용기에 의해 종종 구조적으로 상이할 수 있다. 상기 수식은 당업자들에게 통상적인 것이며, 예를 들어 추가의 또는 치환된 화학적 관능기(chemical moiety)들[예컨대, 산의 에스테르 또는 아미드], 보호기(protecting group)들[예컨대, 알콜 또는 티올에 대한 벤질기, 및 아민에 대한 tert-부톡시카르보닐기]을 포함한다. 또한, 알킬 측쇄들에 대한 수식들[예컨대, 알킬 치환들(예: 메틸, 디메틸, 에틸 등)], 측쇄들의 포화 또는 불포화의 레벨에 대한 수식들, 및 수식된 작용기들(예컨대, 치환된 페닐 및 페녹시)의 부가를 포함한다. 또한, 유도체들은 컨쥬게이트들(예컨대, 비오틴 또는 아비딘 관능기들), 효소들(예컨대, 호스래디시 퍼옥시다제 등), 및 방사능 표지, 생물발광, 화학발광 또는 형광 관능기들을 포함한다. 또한, 관능기들은 본 명세서에 기술된 제제들에 부가되어, 이들 제제의 약물동력학적 특성들(예컨대, 다른 바람직한 특성들 중에서도, 생체외 반감기를 증가시키는 특성들, 또는 세포 투과 특성을 증가시키는 특성들)을 변경시킬 수 있다. 또한, 약제들의 다수의 바람직한 품질들(예: 용해도, 생물학적 이용률, 제조 등)을 향상시키는 것으로 알려진 전구약물들을 포함한다.
또한, "유도체"라는 용어는 기능적으로 동등하거나 기능적으로 향상된 분자를 제공하는 부가, 결실, 및/또는 치환을 비롯하여, 소정의 범위내에서 모 분자(parent molecule)에 행하여진 변경을 포함한다.
본 발명의 구체적인 실시태양에 따르면, 트레프로스티닐 유도체는 트레프로스티닐의 산 유도체들, 트레프로스티닐의 전구약물들, 트레프로스티닐의 다형체들, 트레프로스티닐의 무수 다형체들, 또는 트레프로스티닐의 이성질체들의 그룹으로부터 선택된다.
마찬가지로, 일로프로스트, 시카프로스트 또는 베라프로스트는 이들의 산 유도체들, 전구약물들, 다형체들 또는 이성질체들의 그룹으로부터의 유도체들일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시태양에 따르면, 2 이상, 구체적으로 3 이상의 상이한 프로스타사이클린 유사체들은 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 대안으로, 4, 5 또는 6 또는 보다 더 많은 다른 프로스타사이클린 유사체들이 사용될 수 있다.
구체적으로, 프로스타사이클린 유사체 이외에도, (디메틸화된) 프로스타글란딘 E2가 사용될 수 있다.
16,16-디메틸 PGE2는 15-하이드록시 PGDH의 경쟁적 저해제이나, 효소에 대한 기질은 아니다. 15-하이드록시 PGDH에 의한 대사에 대한 내성 때문에, 그것은 생체내에서(in vivo) 연장된 반감기를 가진다. 16,16-디메틸 PGE2는 대부분의 EP 수용체 서브타입틀에 대한 작동제(agonist)로서 작용한다. 분리된 EP2 수용체들의 활성화에 대한 Kd는 약 1 nM이다. 16,16-디메틸 PGE2는 배양액에서의 팽창 기간 중에 조혈 줄기 세포들의 분화를 방지하면서 자기 재생 특성들을 보존하는데 사용된다.
DPP-IV 저해제는 폴리펩티드 및 단백질의 아미노 말단으로부터 Xaa-Pro 디펩티드를 제거하는, 비전형적인 세린, 막-결합 아미노펩티다제이다. 골수 내에서, DPP-IV 저해제는 결합 조직 기질(connective tissue stroma)의 막 상의 특수 마이크로도메인(specialized microdomain) 내에 국재화된다.
글립틴류는 진성 당뇨병의 치료에 주로 사용되는 DPP-IV를 저해하는 선택적 혈당강하제의 일종이다. 글립틴류는 음식과의 반응에서 소화벽(gut wall) 세포들에 의해 합성되는 인슐린 분비촉진제인 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1)의 분해를 저해함으로써, 식후 글루코스를 저하시키는 것을 돕는다.
본 발명의 실시태양에 개시된 글립틴류는 구체적으로 시타글립틴, 빌다글립틴, 알로글립틴, 삭사글립틴, 리나글립틴, 아나글립틴, 테넬리글립틴, 제미글립틴 또는 듀토글립틴 및 정제된, 가용성 또는 세포 표면 디펩티딜펩티다제의 강력한 저해제들로 보여지는 기타 다른 글립틴류로 이루어진 군으로부터 선택된다.
구체적으로, 개체에의 DPP-IV 저해제의 투여는 본 발명에 따라 전처리된 HSC들의 투여 전, 투여 중 또는 투여 후일 수 있다.
본 발명에 따르면, "처리(treating)", "전처리(pretreating)" 또는 "항온처리(incubation)"이라는 용어들은 호환적으로 사용될 수 있다. 이들 용어는 프로스타사이클린 유사체 및 cAMP 인핸서와 접촉하게 되는 분리된 조혈 줄기 세포들에 대하여 사용된다.
보다 구체적으로, 그것은 조혈 줄기 세포들을 함유하는 샘플을 적어도 하나 이상의 프로스타사이클린 유사체 및 적어도 하나 이상의 cAMP 인핸서와 혼합하여 혼합물을 수득하고, 상기 세포들 내에서 G-alphas-신호화를 자극하기에 충분한 기간 동안 상기 혼합물을 항온처리하는 것을 의미한다.
본 발명의 구체적인 실시태양에 따르면, 조성물은 일로프로스트, 베라프로스트 또는 시카프로스트 중 하나와 함께 트레프로스티닐, 및 cAMP 인핸서, 구체적으로 포스콜린을 함유할 수 있다. 대안으로, 트레프로스티닐은 cAMP 인핸서, 구체적으로 포스콜린과 병용되는데, 예컨대 일로프로스트, 베라프로스트 또는 시카프로스트 또는 이들의 생리학적 허용 염들이지만 이들에 한정되지 않는 1종 이상, 예컨대 2종, 3종, 4종 또는 5종의 다른 프로스타사이클린 유사체들과 함께 혼합될 수 있다.
본 발명의 용도에 따르면, DPP-IV 저해제는 빌다글립틴이고, 조혈 줄기 세포는 이식 전에 트레프로스티닐과 포스콜린으로 시험관내(in vitro) 처리되었다.
본 발명의 대안의 방법에 따르면, DPP-IV 저해제는 시타글립틴, 알로글립틴, 삭사글립틴, 리나글립틴, 아나글립틴, 테넬리글립틴, 제미글립틴 및 듀토글립틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 조혈 줄기 세포는 이시 전에 트레프로스티닐과 포스콜린으로 시험관내(in vitro) 처리되었다.
본 발명의 추가 대안의 방법에 따르면, DPP-IV 저해제는 시타글립틴, 빌다글립틴, 알로글립틴, 삭사글립틴, 리나글립틴, 아나글립틴, 테넬리글립틴, 제미글립틴 및 듀토글립틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 조혈 줄기 세포는 이식 전에 일로프로스트와 포스콜린으로 시험관내(in vitro) 처리되었다. 본 발명의 추가 대안의 방법에 따르면, DPP-IV 저해제는 시타글립틴, 빌다글립틴, 알로글립틴, 삭사글립틴, 리나글립틴, 아나글립틴, 테넬리글립틴, 제미글립틴 및 듀토글립틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 조혈 줄기 세포는 이식 전에 베라프로스트 및/또는 시카프로스트와 포스콜린으로 시험관내(in vitro) 처리되었다.
본 발명의 구체적인 실시태양에 따르면, 고리형 AMP(cAMP) 인핸서 또는, 대안으로서, 프로스타글란딘 EP 수용체에 대한 리간드는 줄기 세포들의 전처리에 사용될 수 있다. cAMP 인핸서들의 예는 항온처리 전에 줄기 세포들 또는 줄기 세포들/트레프로스티닐 또는 줄기세포들/트레프로스티닐, 일로프로스트, 시카프로스트 및/또는 베라프로스트 혼합물에 첨가될 수 있는 당업계에 공지된 다른 cAMP 인핸서들 중에서도, 디부티릴 cAMP(DBcAMP), 포르볼 에스테르, 포스콜린, 스클라레린(sclareline), 8-브로모-cAMP, 콜레라 독소(CT), 아미노필린, 2,4-디니트로페놀(DNP), 노르에피네프린, 에피네프린, 이소프로테레놀, 이소부틸메틸-크산틴(IBMX), 카페인, 테오필린 (디메틸크산틴), 도파민, 롤리프람, 프로스타글란딘 E1, 프로스타글란딘 E2, 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성화 폴리펩티드(PACAP), 및 혈관작용 장 폴리펩티드(VIP)를 포함하나 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, cAMP 인핸서들의 예는 cAMP 및 cAMP 유사체들[ 다른 유사체들 중에서도, 예컨대 sp-5,6-DCI-BIMPS (BIMPS)]을 포함한다.
포스콜린은 구체적으로 조성물에 포함되는 것이 바람직하다.
프로스타사이클린 유사체의 양은 자극된 HSC들을 제조하는 방법에 달려 있다.
매우 구체적으로, 본 발명의 응용의 경우, 트레프로스티닐의 유효 농도는 0.1 μM 내지 100 μM 범위, 구체적으로 1 μM 내지 50 μM 범위, 구체적으로 5 μM 내지 25 μM 범위, 구체적으로 약 10 μM이다.
본 발명에 따르면, "약(about)"이라는 용어는 최대 10%, 구체적으로 최대 5%, 보다 구체적으로 최대 1%의 절대값의 편차를 포함한다. 예로서, "약 10 μM"이라는 용어는 9 내지 11 μM 범위, 구체적으로 9.5 내지 10.5 μM 범위, 구체적으로 9.9 내지 10.1 μM 범위를 의미한다.
본 발명의 추가의 구체적인 실시태양에 따르면, 프로스타사이클린 유사체에 대한 최적 농도 범위는 상기 세포들 내의 cAMP의 축적에 대한 EC50의 10 내지 30 배에 상응한다.
본 발명의 구체적인 실시태양에 따르면, 프로스타사이클린 유사체와 포스콜린의 비율은 약 1:3일 수 있다. 포스콜린 및 프로스타사이클린 유사체로 처리된 HSC들은 재이식되기 전에 정제될 수 있으나, HSC들은 또한 추가의 정제 단계 없이 재이식될 수 있는데, 이는 소량의 포스콜린이 존재할 수 있지만 유해적인 부작용(negative side effect)을 야기하지 않을 수 있기 때문이다.
본 발명의 구체적인 양상에 따르면, 줄기 세포들을 항온처리하기 위해 사용되는 cAMP 인핸서, 구체적으로 포스콜린의 농도는 1 μM 내지 100 μM 범위, 구체적으로 10 μM 내지 50 μM 범위, 보다 구체적으로 약 30 μM일 수 있다.
DPP-IV 저해제는 조혈 줄기 세포를 이식하기 적어도 5시간, 구체적으로 적어도 10시간, 구체적으로 적어도 15시간, 구체적으로 적어도 24시간 전에 투여된다.
대안으로, DPP-IV 저해제는 수술 전(즉, 이식 전 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 10일) 및/또는 수술 후(즉, 이식 후 적어도 5시간 이상, 구체적으로 적어도 10시간 이상, 구체적으로 적어도 15시간 이상, 구체적으로 적어도 24시간 이상) 최대 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일 또는 그 이상까지 환자에게 투여될 수 있다.
구체적으로, 빌다글립틴은 50 내지 200 mg/d, 구체적으로 75 내지 150 mg/d, 구체적으로 약 100 mg/d의 양으로 개체에 투여될 수 있다.
구체적으로, 시타글립틴은 50 내지 200 mg/d, 구체적으로 75 내지 150 mg/d, 구체적으로 약 100 mg/d의 양으로 개체에 투여될 수 있다.
구체적으로, 삭사글립틴은 약 2.5 내지 10 mg/d, 구체적으로 약 5 mg/d의 양으로 개체에 투여될 수 있다.
구체적으로, 리나글립틴은 약 2.5 내지 10 mg/d, 구체적으로 약 5 mg/d의 양으로 개체에 투여될 수 있다.
구체적으로, 알로글립틴은 약 12.5 내지 50 mg/d, 구체적으로 약 25 mg/d의 양으로 개체에 투여될 수 있다.
본 발명의 방법은 개체에 직접 투여될 수 있고, 추가로 줄기 세포들의 귀환 및 생착을 자극할 수 있는 자극된 줄기 세포를 제공하는 이점이 있다.
"개체(individual)"는 본 발명에 따라 전처리된 줄기 세포들의 이식을 받는 동물, 구체적으로 포유동물, 보다 구체적으로 인간을 광범위하게 포함하는 것으로 의미된다.
글립틴 및 프로스타사이클린으로 처리된 HSC들은 재이식되기 전에 정제될 수 있으나, 이들 HSC들은 추가의 정제 단계 없이 재이식될 수도 있다.
상기 세포들 내에서 G-alphas-신호화를 자극하는데 필요한 기간은 공지된 방법에 따라, 예컨대 다름과 같은 다수의 다양한 cAMP 측정법을 사용함으로써, 측정될 수 있다: RIA, EPAC(epac1)을 이용한 형광 공명 에너지 전이(FRET)(문헌[Ponsiouen B. et al., EMBO reports, 5, 12, 1176-1180 (2004)] 참조), 방사화학적 방법 등. G-alphas-신호화가 일어나는 자극된 세포는 FRET계 cAMP 리포터(FRET-based cAMP reporter)와 같이 당업계에 공지된 방법에 의해 미처리된 세포들로부터 선별되거나, 구별되거나 또는 분리될 수 있다.
CD26 펩티다제 활성을 저해하는데 필요하고 상기 세포들 내의 SDF-1에 대한 이동 반응(migratory response)을 증가시키는데 유효한 기간은 공지된 방법에 따라, 예컨대 Ala-Pro-7-아미도-트리플루오로메틸쿠마린의 절단(cleavage)의 형광분광학적 분석(fluorometric determination)에 의해 측정될 수 있다. 대안으로, 천연 물질들(예컨대, CXCL12 또는 GLP-1)의 절단의 저해는 HPLC 또는 ELISA에 의해 모니터링될 수 있다.
본 발명의 실시태양에 따르면, 각각의 세포들에 대한 항온처리 시간은 약 30분 내지 24시간, 바람직하게는 약 1시간 내지 12시간, 보다 바람직하게는 약 1시간 내지 4시간이다.
본 발명의 추가의 실시태양에 따르면, 프로스타사이클린 유사체 및 cAMP 인핸서를 이용한 HSC들의 전처리를 위한 시험관내(in vitro) 항온처리 시간은 적어도 10분 이상, 구체적으로 적어도 20분 이상, 적어도 30분 이상, 적어도 40분 이상, 적어도 50분 이상, 적어도 60분 이상이다.
본 발명의 추가의 양상에 따르면, 적어도 1x105 공여자 세포/ml 이상은 약 37℃에서 프로스타사이클린 및 cAMP 인핸서를 이용하여 항온처리된다.
cAMP-의존성 경로는 조혈 줄기 세포들의 생착을 촉진하기 위한 필수 경로이다. 본 발명자들은 프로스타사이클린 유사체가 조혈 줄기 세포들 내의 cAMP 상승을 촉발시킨다는 것을 보였다. 프로스타사이클린 유사체는 다중 수용체들(즉, IP- 및 EP-수용체들)을 활성화시키고, 따라서 증가된 G-alphas-신호화를 초래함으로써, 조혈 줄기 세포들 내의 cAMP 상승을 촉발시킨다. 따라서, 트레프로스티닐, 일로프로스트, 시카프로스트 또는 베라프로스트와 같은 프로스타사이클린 유사체들은 더 효과적으로 cAMP 레벨을 상승시킨다.
"조혈 줄기 세포들(HSC들)"이라는 용어 또는 "줄기 세포"라는 보다 일반적인 용어는 본 발명의 기술에 있어서 동등한 용어로 이해되며, 일반적으로 혈액 세포 유형들을 일으키는 골수 계통(예: 단핵구 및 대식세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 적혈구, 거핵세포/혈소판, 수지상 세포) 및 림프 계통(예: T-세포, B-세포, NK-세포), 및 당업계에 공지된 다른 계통을 비롯한 혈액 세포 유형들의 원인이 되는 만능성(pluripotent) 또는 다능성(multipotent) "줄기 세포들"에 관한 것이다. "줄기 세포"는 통상적으로 다중 세포 유형들을 형성시킬 수 있는 능력(즉, 다능성) 및 자기 재생 능력에 의해 특징지워진다. 그러나, 소능(oligopotent) 및 단능(unipotent) 전구세포들도 포함될 수 있다.
"전구 세포(progenitor cell)"라는 용어는 줄기 세포처럼 구체적인 유형의 세포로 분화되는 경향이 있지만, 줄기 세포보다 더 특이적이고, "표적(target)" 세포로 분화되는 상황에 처하는 생물학적 세포를 포함한다. 전구 세포는 1종 이상의 세포들을 형성하도록 분화될 수 있는 줄기 세포들의 초기 자손이다. 줄기 세포와 전구 세포 간의 가장 중요한 차이는 줄기 세포가 무한히 복제될 수 있는 반면에, 전구 세포는 한정된 회수로만 분할될 수 있다는 것이다. 대부분의 전구 세포는 소능(oligopotent)인 것으로 기술되고, 성체 줄기 세포와 비교될 수 있다. 전구 세포는 세포 분화의 추가 단계에 있는 것으로 일컬어진다. 전구 세포는 줄기 세포와 완전히 분화된 세포 간의 "중심(center)"에 있다. 전구 세포가 가지는 효력(potency)의 종류는 "모(parent)" 줄기 세포의 유형에 달려 있고, 전구 세포의 서식지(nitche)에도 달려 있다. 전구 세포는 몸체를 통해 이동할 수 있고, 필요로 하는 조직을 향해 이동할 수 있다. 다수의 특성들은 성체 줄기 세포와 전구 세포에 의해 공유된다.
전구 세포는 성체 기관에서 발견되고, 몸체에 대한 복구 시스템(repair system)으로 작용한다. 전구 세포는 특수 세포를 보충할 뿐만 아니라, 혈액, 피부 및 내장 조직들을 유지시킨다. 또한, 전구 세포는 발달하는 배아성 췌장 조직에서도 발견된다.
"조혈(haematopoesis)"은 일반적으로 HSC로부터 유래한 특수 혈액 세포들의 세포 분화 또는 형성의 과정을 의미한다. 발달(development) 기간 중, 조혈은 태아 간(fetal liver)으로부터 골수로 전위된 후, 골수가 성체기(adulthood) 전반에 걸쳐 조혈의 위치로 남는다. 골수에 자리잡으면, HSC들은 골강(bone cavity)에 있는 동안 내내 무작위적으로 분포되지 않는다. 오히려, HSC들은 일반적으로 골내막 표면(endosteal surface)의 근위부에서 발견된다. 보다 성숙한 줄기 세포는 골 표면으로부터의 거리가 증가함에 따라 그 수가 증가한다.
조혈 조직들은 수임된 다능, 소능 및 단능 전구 세포들 뿐만 아니라, 장기 및 단기 재생 능력을 가지는 세포들을 함유한다.
HSC들을 함유하는 샘플은 구체적으로 골수일 수 있다.
HSC들은 HSC들을 함유하는 것으로 알려진 원천(source), 구체적으로 말초 혈액(peripheral blood), 제대(umbilical cord) 또는 제대혈(cord blood), 태반(placenta) 및 골수(bone marrow)로부터 공지된 기법에 의해 수득될 수 있다. 대안으로, 동물의 태아 간(fatal liver), 태아 비장(fetal spleen), 및 대동맥-생식샘-중신(aorta-gonad-mesonephros)과 같은 원천도 가능하다. 본 발명의 방법 및 조성물의 경우, 인간 기원으로부터 유래한 HSC들이 바람직하다.
예를 들어, HSC들은 대퇴골(femur)들, 고관절(hip), 늑골(rib)들, 흉골(sternum) 및 기타 다른 골(bone)들을 비롯하여 성체의 골수에서 발견될 수 있다. HSC들은 니들 및 시린즈를 사용하여 고관절로부터, 또는 종종 골수 격실로부터 방출되는 세포들을 유도하는 G-CSF(과립구 콜로니-자극 인자)와 같은 사이토카인류를 이용한 전처리 후에 혈액으로부터 제거(removal)에 의해 직접 수득될 수 있다.
HSC들은 특정 표현형 또는 유전자형 마커들에 따라 동정될 수 있다. 예를 들어, HSC들은 작은 크기, 계통(lin) 마커들의 결핍, 로다민 123(rho10) 또는 Hoechst 33342와 같은 생염료에 의한 낮은 염색(측면 집단(side population)), 및 표면 상의 다양한 항원성 마커들[이들의 다수는 분화 시리즈(예: CD5, CD11b, CD34, CD38, CD90, CD133, CD105, CD45, GR-1 (=Ly-6G/C), 7-4, Ter-119 및 c-kit)의 클러스터에 속함]의존재에 의해 동정될 수 있다. HSC들은 계통 결정(lineage commitment)을 탐지하는데 일반적으로 사용되는 마커들에 대하여 주로 음성(negative)이고, 따라서 종종 lin(-) 세포들로 칭한다. 대부분의 인간 HSC들은 CD5+, CD45R (B220)+, CD11+, GR-1+, CD34+, CD59+, Thyl/CD90+,CD38lo /~, C-kit/CD117+, 및 lin(-)로서 특징지워질 수 있다. 그러나, 특정 HSC들은 CD347+ 및 CD38+이기 때문에, 모든 줄기 세포들이 상기 조합에 포함되는 것은 아니다. 또한, 몇몇 연구들은 최초 줄기 세포들이 세포 표면상에 c-kit가 결핍될 수 있다는 것을 시사한다.
유세포분석(flow cytometry)에 의한 lin(-) HSC들의 정제, 또는 FACS의 경우, 예컨대, 당업계에 공지된 다른 항체들 중에서도, CD3엡실론, CD5, CD45R, CD11b, CD16, GR-1, 7-4 및 Ter-119, CD 13, CD32 및 CD33, CD71, CD 19, CD61, Mac-1 (CDl lb/CD18), Gr-I, 117Ra, CD3, CD4, CD5, 및 CD8에 대한 항체들을 비롯하여, 다수의 성숙한 혈통(blood-lineage) 마커 항체들은 lin(+) 세포들 또는 후기(late) 다능 전구 세포들(MPP)을 고갈시키는데 사용될 수 있다. 추가의 정제 방법들은 당업계에 공지되어 있는데, 그 예로는 세포 표면 분자들의 '신호화 림프구 활성화 분자들'(SLAM) 패밀리의 특정 특징(signature)을 이용하는 방법들을 들 수 있다.
제대혈, 골수, 말초 혈액 또는 다른 원천으로부터 유래하는 HSC들은 혈청이 존재하거나 부재하는, 적당하거나, 상업적으로 이용가능하거나 또는 관습적으로 정해진 배지에서 성장되거나 팽창될 수 있다. 인간 원천으로부터 유래한 HSC들은 본 발명의 바람직한 실시태양이다. 예를 들어, 특정 실시태양에 있어서, 무혈청 배지(serum-free medium)는 알부민 및/또는 트랜스페린을 이용할 수 있다. 또한, 사이토카인들은 다른 사이토카인들 중에서도, Flt-3 리간드, 줄기 세포 인자(SCF) 및 트롬보포이에틴(TPO)과 같은 것들이 포함될 수 있다. 또한, HSC들은 생물반응기(bioreactor)와 같은 용기에서 성장할 수 있다. 또한, HSC들의 생체외(ex vivo) 팽창에 적당한 배지는 예컨대 림프 조직의 분해(disaggregation)으로부터 유도될 수 있고, HSC들 및 그 자손의 시험관내(in vitro), 생체외(ex vivo) 및 생체내(in vivo) 유지, 성장 및 분화를 지지나는 것으로 보였던 기질 세포들(예: 림프망상 기질 세포)과 같은 HSC들 지지 세포들을 포함할 수 있다.
"제대혈(cord blood)" 또는 "제대혈(umbilical cord blood)"은 일반적으로 신생 순환(neonatal circulation)으로 되돌려지는 신생아로부터 유래한 상대적으로 적은 양의 혈액(9최대 약 180 ml)을 의미한다. 제대혈은 HSC들에 풍부하고, 당업계에 공지된 기법에 따라 나중에 사용하기 위해 수확 및 저장될 수 있다.
"생체외(ex vivo)" 또는 "시험관내(in vitro)"라는 용어들은 바람직하게는 천연 조건의 최소한의 변경이 있는, 기관 외부의 인공 환경에서의 생조직내 또는 생조직상에서 행하여지는 실험 또는 측정과 같은, 유기체(organism) 외부에서 일어나는 활성들을 의미한다. 특정 실시태양에 있어서, 조직들 또는 세포는 생체외(ex vivo) 처리를 위해 회수되고, 동결되며, 나중에 해동될 수 있다. 비록 "시험관내(in vitro)"라는 용어가 "생체외(ex vivo)"라는 용어와 호환적으로 사용될 수 있지만, 생세포들을 사용하여 수 일 이상 오래 지속하는 조직 배양 실험들 또는 방법들은 일반적으로 "시험관내(in vitro)"로 간주한다. "생체외 투여", "생체외 처리" 또는 "생체외 치료 용도"라는 용어들은 일반적으로 하나 이상의 기관, 세포 또는 조직이 살아있거나 최근에 죽은 피험체(subject)로부터 수득되고, 선택적으로 정제/농축되며, 줄기 또는 전구 세포들을 처리하는 처리 또는 방법(예: HSC들의 생착 능력을 증강시키는 본 발명의 조성물로 세포들을 항온처리하는 것을 포함하는 생체외 투여 단계)에 노출되고, 이어서 선택적인 처리 또는 방법 후에 동일하거나 상이한 개체에 투여되는 의학적 방법에 관한 것이다.
개체에 투여되는 DPP-IV 저해제의 양은 피험체(subject)의 특성들[예컨대, 트레프로스티닐 및/또는 세포 이식물(cell transplant)에 대한 반응의 정도(degree), 중증도(severity) 및 유형(type) 뿐만 아니라, 일반적인 건강상태, 연령, 성별, 체중 및 약물에 대한 내성]에 달려 있다.
줄기 세포 이식을 받는 개체은 골수 질환[즉, 정상적인 골수 구조(architecture)가 악성 종양에 의해 대체되는 질환, 겸형적혈구 질환, 골수이형성 증후군, 골수증식성 질환, 재생불량성 빈혈, 또는 혈액 세포들 및 혈소판들의 생성의 감소를 야기시키는 감염]을 겪을 수 있다. 상기 골수 질환은 예를 들어 백혈병, 혈액 세포 격실의 결함, 또는 화학요법 또는 방사선조사 치료 후의 골수 이식이 필요한 상태일 수 있다.
보다 구체적으로, 혈액 세포 격실의 결함은 지중해빈혈과 같은 헤모글로빈병증, 호중구성 과립구 기능의 결함, 호중구성 과립구 기능의 결함, T- 및 B-림프구의 결함(예: 중증 복합형 면역결핍증, 브루톤형 무감마글로불린혈증)일 수 있다.
골수 이식 후에 제한된 기간 동안 하나 이상의 DPP-IV 저해제를 투여함으로써, 예컨대 화학요법 또는 방사선조사에 기인한 골수 질환을 겪고 따라서 조혈 줄기 세포 이식을 받는 개체의 치료 용도는 본 발명에 포함된다.
분리된 줄기 세포들의 전처리 및 이식된 환자에의 하나 이상의 DPP-IV 저해제의 투여를 위해 하나 이상의 cAMP 인핸서와 병용되는 적어도 하나 이상의 프로스타사이클린 유사체는 골수 이식 기간 중에 또는 HSC들의 사용에 의한 골수의 재구성시에 인간 HSC들의 생착을 증강시키는데 사용될 수 있다. 가속화된 생착은 피험체들이 잠재적으로 치명적인 감염, 출혈 및 다른 심각한 합병증에 걸릴 수 있는 기간을 단축시킨다. 그러므로, 글립틴과 병용되는 프로스타사이클린 유사체는 공여자 골수를 전처리하여 골수 생착을 증강시키는데(즉, 필요한 세포들의 수를 감소시키고 골수 무형성증의 기간을 단축시킴으로써) 유용한 치료 옵션이다.
골수 이식 후 수 일 동안 DPP-IV 저해제를 이용한 피험체들의 연속 치료는 생착을 증강시킴으로써(즉, 필요한 세포들의 수를 감소시키고 골수 무형성증의 기간을 단축시킴으로써) 개선된 임상 결과를 초래한다.
따라서, 본 발명의 구체적인 실시태양에 따르면, 처리는 이식 후 적어도 1일 이상, 구체적으로 이식 후 적어도 5일 이상, 보다 구체적으로 이식 후 10일 이상, 보다 더 구체적으로 이식 후 14일 이상 수행된다.
DPP-IV 저해제는 적용가능하고 당업계에 공지된 방식에 의해 피험체에 투여될 수 있다. 보다 구체적으로, 경장(enteral), 정맥내 또는 피하 투여가 제공된다.
정맥내 투여는 바람직한 투여 방식이다.
그러나, DPP-IV 저해제는 서방형, 정제 또는 캡슐의 그룹으로부터 선택되는 경구투여 제형일 수 있다.
또한, 본 발명은 골수 질환(구체적으로 골수 질환은 백혈병, 혈액 세포 격실의 결함, 화학요법 또는 방사선조사에 의해 유도되는 골수 질환들임)의 치료에 사용하기 위한, 하기 성분 a) 및 b)의 2, 3, 4 또는 그 이상의 개별 단위(separate unit)의 형태로 하기 성분 a) 및 b)를 포함하는 부품들의 키트를 제공한다:
a) 제1 단위 제형 내의 유효량의 적어도 하나 이상의 프로스타사이클린 유사체 및 포스콜린,
b) 글립틴으로부터 선택되는 유효량의 적어도 하나 이상의 DPP-IV 저해제.
또한, 본 발명은 사용 설명서(instructions for use)와 함께 본 발명에 따른 키트를 포함하는 패키지(package)를 포함한다.
전술한 내용은 하기 실시예들을 참조하면 보다 완벽히 이해될 것이다. 그러나, 하기 실시예들은 본 발명의 하나 이상의 실시태양들의 대표적인 예일 뿐이고, 본 발명의 범주를 한정하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
실시예
실시예 1:
시험관내(in vitro) 이동 분석
PeproTech (London, United Kingdom)로부터 구입한 성장 인자 함유 줄기 세포 배지[StemSpan™ (SFEM) (Stemcell technologies, USA) (50 ng/mL 뮤린 줄기 세포 인자 (SCF), 50 ng/mL fms-유사 티로신 키나제-3 리간드 (Flt3), 50 ng/mL 인터류킨 11 (IL11) 및 150 ng/mL 뮤린 인터류킨 3 (mIL3)]내에서 37℃에서 1시간 동안 10 μM 트레프로스티닐(Trep)과 30 μM 포스콜린(Fsk) (Sigma Aldrich, Vienna, Austria)의 배합물 또는 비히클(vehicle)을 이용하여, 뮤린 조혈 전구 세포들을 시험관내(in vitro) 전처리하였다. 그 후, 세포들을 세척하고, 배지 내에서 2x106 세포/mL로 재현탁시켰다.
Transwell™ 디쉬(5 μm 공극 직경)의 상부 챔버(upper chamber)에 세포 현탁액(2x105 세포들을 함유하는 0.1 mL)을 첨가하였다. 하부 챔버(bottom chamber)에는 100 ng/ml 뮤린 기질세포 유래 인자-1(SDF-1 = CXCL 12)을 함유하는 배지를 배치시켰다. 37℃에서 4시간 동안 세포들을 이동시켰다. 연이어, 하부 챔버(lower chamber)로부터 회수된 세포들의 수를 세포 계수기에 의해 측정하였다. 이동된 세포들의 수는 상부 챔버에 첨가된 총 세포들의 백분율로 표현하였다.
인간 제대혈 유래 CD34+ 세포는 줄기 세포 배지[50 ng/mL 인간 Flt3, 50 ng/mL 인간 트롬보포이에틴 및 50 ng/mL 인간 줄기 세포 인자 (SCF)가 보충되고, PeproTech (London, United Kingdom)로부터 구입된 X-VIVO™ 15 (Lonza, Switzerland)]에서 유지시켰다. 이동 분석은 재조합 인간 SDF-1를 하부 챔버에 첨가한 것을 제외하고는, 뮤린 세포들에 대해 기술한 바와 같이 수행하였다. 보여진 데이터는 3회 수행한 3개의 독립된 실험으로부터의 평균±표준 편차이다. 통계적으로 유의적인 차이는 일원배치 분산분석과 연이은 던넷 다중 비교(Dunnett's multiple comparison)에 의해 평가하였다(*, p<0.05).
데이터는 도 1에 나타나 있다.
실시예 2:
트레프로스티닐 및 포스콜린의 존재하에 자극된 뮤린 조혈 전구 세포들의 SDF-1/CXCL12-유도된 이동의 CXCR4 길항제 AMD3100에 의한 저해
37℃에서 1시간 동안 트레프로스티닐(10 μM; T)과 포스콜린(30 μM; F)을 이용하여 조혈 줄기 및 전구 세포들을 예비-항온처리하고, 세척하고, 2 x106 세포/mL의 세포 강도로 재현탁시켰다. 10 μM CXCR4 길항제 AMD3100 (10 μM)가 있거나 없는 배지를 함유한 Transwell™ 디쉬의 상부 챔버에 세포 현탁액(0.1 mL 중 2 x105 세포)을 첨가하였다. 하부 챔버 내의 배지는 100 ng/ml 뮤린 SDF-1을 함유하였다. 37℃에서 4시간 동안 항온처리을 지속한 후, 하부 챔버에서 회수된 세포들을 도 1의 범례에 개략적으로 설명된 바와 같이 계수하였다. 통계적으로 유의적인 차이는 일원배치 분산분석과 연이은 던넷 다중 비교에 의해 평가하였다(***, p<0.001).
CXCR4 길항제 AMD3100은 트레프로스티닐 및 포스콜린의 존재하에 자극된 뮤린 조혈 전구 세포들의 SDF-1/CXCL12-유도된 이동을 저해한다.
데이터는 도 2에 나타나 있다.
실시예 3:
빌다글립틴은 트레프로스티닐 및 포스콜린을 이용하여 예비-항온처리된 조혈 전구 세포들의 SDF-1/CXCL 12-유도된 이동을 증강시킨다.
1시간 동안 트레프로스티닐(10 μM; T)과 포스콜린(30 μM; F)의 부재 또는 존재 하에, 뮤린 조혈 전구 세포들(mHPC; 좌측 패널) 및 제대혈로부터 유래한 인간 CD34+ 세포들(우측 패널)을 예비-항온처리하였다. 그 후, 30 nM 빌다글립틴(Vil)이 있거나 없는 배지를 함유한 Transwell™ 디쉬의 상부 챔버(top chamber)에 세포 현탁액(0.1 mL 중 2 x105 세포)을 첨가하였다. 하부 챔버 내의 배지는 100 ng/ml의 뮤린 또는 인간 SDF-1을 적절히 함유하였다. 37℃에서 4시간 동안 항온처리을 지속한 후, 하부 챔버에서 회수된 세포들을 도 1의 범례에 개략적으로 설명된 바와 같이 계수하였다. 보여진 데이터는 3회 수행한 3개의 독립된 실험으로부터의 평균±표준 편차이다. 통계적으로 유의적인 차이는 일원배치 분산분석과 연이은 던넷 다중 비교에 의해 평가하였다(*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001).
데이터는 도 3에 나타나 있다.
실시예 4:
생체내(in vivo) 귀환 분석
빌다글립틴과 트레프로스티닐은 트레프로스티닐 및 포스콜린을 이용하여 예비-항온처리된 조혈 전구 세포들의 귀환을 증가시키지만, 생체내에서(in vivo) 배합시 상호 길항적이다.
제조업체의 지시에 따라, MACS 마이크로 비드(Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)와 골수, 적혈구, 거핵세포 및 림프구 계통의 세포들을 보유한 계통-특이적(lineage specific) 항체들을 이용한 자성 세포 분류(magnetic cell sorting)에 의해 생후 6-8주의 BALB/c 공여자 마우스들(15마리의 마우스)로부터 뮤린 조혈 줄기 및 전구 세포들을 분리하였다. 트레프로스티닐(10 μM)과 포스콜린(30 μM)의 배합물의 부재(비히클 대조군 = 미처리 세포들) 및 존재(처리 세포들) 하에 1시간 동안 sca1+, c-Kit+, 계통-음성 (Lin-) 세포들을 예비-항온처리하였다.
치명적으로(9 Gy) 방사선조사된 수용자 BALB/c 마우스들에 꼬리 정맥을 통해 (미처리 및 처리) 조혈 줄기 및 전구 세포들(1x106 세포들)을 연이어 주입하였다. 수용자 마우스들은 추가의 처리[미처리 세포 및 처리 세포 표지된 바(bar)]를 받지 않거나, 또는 골수 이식 이전 처음 24시간에 트레프로스티닐(3 μg/8h; “in vivo trep”표지된 바), 빌다글립틴(10 mg/kg/24h; “in vivo vil”표지된 바) 또는 트레프로스티닐과 빌다글립틴의 배합물(“in vivo trep+vil”표지된 바)을 마우스들에 주입하였다.
콜로니 형성 분석(colony formation assay)에 의해 골수로 귀환할 수 있는 세포들의 능력을 24시간 후에 평가하였다. 대퇴골 및 경골을 PBS로 플러싱(flushing)하여 골수 세포들을 수집하였다. 적혈구 세포 용해 완충액(red blood cell lysis buffer)(Stemcell technologies, USA)에 의하여 적혈구들을 제거하였다. 잔존하는 세포는 반고체 메틸셀룰로스계 배지(MethoCult, stemcell technologies, USA)내에서 재현탁시켰다. 각각의 조건을 3회 평가하였다. 특이적인 성장 인자들을 첨가하여, 과립구-단핵구 콜로니 형성 단위(CFU-GM)와 적혈구 콜로니 형성 단위(CFU-E)의 형성[즉, 에리트로포이에틴 3U/mL, IL3 10 ng/mL, IL7 10 ng/mL, GM-CSF 10 ng/mL]을 지원하였다. 5% CO2를 함유하는 가습된 대기에서 37℃에서 6일 동안 배양액을 유지시켰다. 그 후, 현미경 하에서 콜로니 수를 계수하였다. 의미상, 수용자 마우스들의 내인성 골수가 방사선조사에 의해 파괴되었기 때문에, 콜로니는 주입되어 골수로 이동한 세포들로부터 생겼다. 따라서, 조혈 전구 세포들이 주입되지 않은, 방사선조사된 마우스들의 골수가 도말된 경우(음성 대조군), 콜로니가 전혀 수득되지 않았다.
하기 (i) 내지 (iv)는 분명한 사항이다:
(i) 트레프로스티닐 및 포스콜린을 이용한 시험관내(in vitro) 예비-항온처리은 귀환을 증가시켰다["미처리(untreated)" 및 "처리(treated)" 표지된 바(bar) 참조]
(ii) 트레프로스티닐 및/또는 빌다글립틴을 이용한 수용자 마우스들의 단독 처리는 귀환을 촉진시키지 않았다["미처리 세포" 표지된 두번째 바(bar), "미처리 세포" 표지와 함께 각각 “in vivo trep”“in vivo vil”“in vivo trep+vil”표지된 세번째 내지 다섯번째 바(bar) 참조].
(iii) 처리 세포가 주입된 수용자 마우스들의 트레프로스티닐 또는 빌다글립틴을 이용한 처리는 귀환을 촉진시켰다["처리 세포" 표지된 여섯번째 바(bar), "처리 세포" 표지와 함께 각각 “in vivo trep”“in vivo vil”표지된 일곱번째 및 여덟번째 바(bar) 참조].
(iv) 배합물[“in vivo trep+vil”표지된 맨 오른쪽 바(bar)]은 단독으로 투여된 화합물[“in vivo trep”“in vivo vil”표지된 일곱번째 및 여덟번째 바(bar)]보다 덜 효과적이다. 따라서, 생체내에서(in vivo) 배합될 때, 트레프로스티닐과 빌다글립틴은 상호 길항적이다.
빌다글립틴 및 트레프로스티닐은 트레프로스티닐 및 포스콜린으로 예비-항온처리된 조혈 전구 세포들의 귀환을 증가시키지만, 생체내에서(in vivo) 배합될 때 상호 길항적이다. 데이터는 도 4에 나타나 있다.
실시예 5:
생체내(in vivo) 생착 분석
트레프로스티닐과 포스콜린의 배합물로 시험관내(in vitro) 전처리된 조혈 전구 세포들이 주입된, 치명적으로 방사선조사된 BALB/c 수용자 마우스들에의 트레프로스티닐과 빌다글립틴의 병용 투여는 빌다글립틴 또는 트레프로스티닐의 단독 생체내(in vivo) 투여보다 상기 마우스들의 생존을 향상시키는데 덜 효과적이다.
도 4의 범례에 개략적으로 설명된 바와 같이, 공여자 마우스들의 골수로부터 조혈 전구 세포들을 분리하였다. 37℃에서 1시간 동안 10 μM 트레프로스티닐 및 30 μM 포스콜린, 또는 비히클로 세포들을 시험관내(in vitro) 처리하였다. 세척 후, 치명적으로 방사선조사된(9 Gy) 수용자 BALB/c 마우스들(10/그룹)에 꼬리 정맥을 통해 0.2x106 계통-음성 조혈 전구 세포들을 주입하였다. 트레프로스티닐과 포스콜린의 배합물로 시험관내(in vitro) 전처리되지 않은 경우, 조혈 전구 세포들의 수다 너무 적어서 수용자 동물들을 구조하지 못한다. 따라서, 전처리되지 않은 세포들을 수용한 마우스들의 그룹은 첫주 내에 사멸한다(검정선, 대조군). 제한 숫자의 조혈 줄기 세포는 전처리 세포들을 수용하고 이어서 트레프로스티닐로 처리된 마우스들의 50%를 구조하였다(10일 동안 3μg/8h 피하 주사; "시험관내 전처리 세포 + 트레프로스티닐을 이용한 수용자 마우스의 생체내 처리" 표지된 붉은색 곡선). 가장 효과적인 요법은 전처리된 조혈 전구 세포들의 주입 및 연이은 빌다글립틴의 투여(10 mg/kg/24h 피하 주사)이다: 모든 마우스들(즉, 10마리 중 10마리)이 생존하였다("시험관내 전처리 세포 + 빌다글립틴을 이용한 수용자 마우스의 생체내 처리" 표지된 곡선). 대조적으로, 트레프로스티닐(3μg/8h)과 빌다글립틴(10 mg/kg/24h)의 배합물을 수용한 마우스들은 전처리 세포들을 수용한 수용자 마우스들 중 최악의 결과를 나타내었다: 10마리 중 2마리만 생존하였다("시험관내 전처리 세포 + 트레프로스티닐과 빌다글립틴의 배합물을 이용한 수용자 마우스의 생체내 처리" 표지된 회색 곡선). 조혈 전구 세포 이식 직후에 약물 주입(즉, 피하 주사에 의한 트레프로스티닐 및/또는 빌다글립틴의 투여)을 개시하였고, 10일 동안 계속하였다. 모든 곡선은 서로 유의적으로 상이하였다(로그순위 검정).
트레프로스티닐과 포스콜린의 배합물로 시험관내(in vitro) 전처리된 조혈 전구 세포들이 주입된, 치명적으로 방사선조사된 BALB/c 수용자 마우스들에의 트레프로스티닐과 빌다글립틴의 병용 투여는 빌다글립틴 또는 트레프로스티닐의 단독 생체내(in vivo) 투여보다 이들 마우스의 생존을 증강시키는데 덜 효과적이다. 데이터는 도 5에 나타나 있다.
실시예 6:
본 발명자들은 트레프로스티닐과 포스콜린의 작용이 추가로 향상되는 조건을 탐구하였다. 이는 트레프로스티닐과 포스콜린의 배합물의 작용이 CXCR4-수용체(즉, 케모카인 기질세포 유래 인자-1 = SDF1 = CXCL 12에 대한 수용체)의 도입에 의해 적어도 부분적으로 매개되었다는 관찰에 기초하였다. 또한, 본 발명자들은 인간 HSPC들에 의한 cAMP 축적에 대한 디메틸-PGE2 및 트레프로스티닐의 효과를 비교하였다.
재료 및 방법
뮤린 및 인간 조혈 줄기 및 전구 세포들의 분리
자궁 전위(cervical dislocation)에 의해 10마리의 마우스들(C57BL/6 또는 BALB/c)를 희생시켰다. 뒷다리의 장골(long bone)들(즉, 대퇴골 및 경골)에서 근육 및 결합 조직을 제거하고, 시린지 및 27½G 니들을 사용하여 RPMI 배지로 플러싱하였다. 가시적인 결합 조직으로부터 세포 현탁액을 분리하여 수집하고 원심분리 튜브에 옮겼다. 원심분리(5분 동안 1,200 rpm/~100 g)에 의해 세포들을 수확하고, 3 mL 적혈구 용해 완충액(0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA, 7.2 내지 7.4로 조절된 pH) 중에서 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 20℃에서 2분 동안 항온처리한 후 얼음 상에서 4분 동안 항온처리하였다. 그 후, RPMI(10 mL)을 첨가하고, 원심분리에 의해 세포들을 수확하여 계수하였다. 세포들의 일반적인 수율은 3*107/마우스이었다.
108 세포 당 0.1 mL 항체 용액의 비율로 CD5, CD45R (B220), CD11b, GR-1 (=Ly-6G/C), 7-4, 및 Ter-119에 대한 계통-특이적 항체들을 함유하는, 비오티닐화 항체들의 칵테일(cocktail)[Miltenyi Biotec 의 "Lineage Cell Depletion Kit"]에 2.5 * 108 세포/mL의 세포 밀도로 2% FCS(우태아 혈청)을 함유하는 빙냉(ice-cold) PBS(인산 완충 식염수) 중에서 세포들을 재현탁시켰다. 얼음 상에서 20분 동안 세포들을 항체들과 함께 항온처리하고, 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 재현탁(3.3 *108 세포/mL) 후, 제2 항-비오틴-코팅된 마이크로비드(0.2 mL/108 세포, Miltenyi Biotec 의 "Lineage Cell Depletion Kit" )를 세포 현탁액에 첨가하고, 혼합물을 얼음상에서 15분 동안 항온처리하였다. 그 후, MACS-완충액(30mL) 중에서 샘플을 희석시키고, 원심분리에 의해 세포들을 수집하고, 6 mL MACS-완충액 중에서 재현탁시켰다. 세포적합성(cell-compatible) 플라스틱 재료로 코팅된 강자성 비드(ferromagnetic bead)를 함유하는, 예비패킹된(prepacked) LS 칼럼 상에 이 현택액을 적재하였다. 일반적으로 (2 mL 세포 현탁액/칼럼을 위해) 3개의 칼럼을 이용하였다. 플로우쓰루(flow-through)는 계통 마커-음성 세포들(Lin- 세포들)을 함유한 반면에, 계통 결정된(lineage committed) 세포는 칼럼상에 보류되었다. 원심분리에 의해 세포들을 펠렛화하고, 2 mL PBS 중에서 재현탁시켰다. 일반적인 수율은 7*105 lin- 세포/마우스이었다.
건강한 공여자들의 제대혈로부터 인간 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)들을 수확하였다: 건강한 만기 출산(healthy full-time delivery) 중에 제대혈 샘플(50 mL)을 수집하였다. 자성 활성화 세포 분류기(MACS) 직접 CD34 전구 세포 분리 키트[magnetic-activated cell-sorter (MACS) Direct CD34 Progenitor Cell Isolation Kit](Miltenyi Biotech)를 사용하여 CD34+ 세포들을 분리하고, 참고문헌 3에 기재된 바와 같이 팽창시켰다. 간략히, 동등한 부피의 인산 완충 식염수(PBS)로 제대혈을 희석시키고; 이 현탁액(25 ml)을 LymphoPrep™ (소듐 트리아세테이트와 폴리사카라이드의 혼합물을 함유하는, Nycomed를 통해 구입한 밀도 배지) 상에 적층하였다. 355g에서 30분 동안 스윙 버킷 로터(swing bucket rotor)에서 튜브를 원심분리하였다. 단핵 세포들을 함유하는 층을 수확하고, PBS로 희석시키고(50 mL), 400g에서 8분 동안 원심분리하여, 잔류 LymphoPrep™ 을 제거하였다. 4℃에서 10분 동안 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 및 0.1 mM EDTA를 함유하는 완충액(7.2 내지 7.4로 조절된 pH) 중에서 세포용해(lysis)에 의해 적혈구를 제거하였다. 단핵 세포들의 수를 측정하고, 분리 키트(Isolation Kit)로 제공된 MACS 완충액 중에서 2*108 세포/mL로 조절하였다. EasySep® 양성 선택 칵테일(Positive Selection Cocktail)을 첨가하고(0.1 mL/mL 세포 현탁액), 실온에서 15분 동안 현탁액을 항온처리하고, EasySep® 자성 나노입자들(Magnetic Nanoparticles) (50 μL/mL)을 첨가하였다. 실온에서 15분 동안의 추가 항온처리 후에, 배지의 첨가에 의해 세포 현탁액을 2.5 mLfh 희석시켰다. 튜브를 5분 동안 자석(magnet)에 배치시키고, 연이어 세포들을 수집하였다. 이 단계를 5회 반복하였다. GlutaMAX (2.5 mM; Gibco/Invitrogen) 및 페니실린/스트렙토마이신 (P/S; 125 U/mL each) 및 Flt3L, SCF 및 TPO (각각 50 ng/mL)(BioWhitt르fr)가 보충된 무혈청 X-VIVO15 배를 함유하는 현탁 배양액 중에서 풍부한 세포들을 6일 동안 증식시켰다[즉, 2 집단 배가(population doublings)]. 일반적인 수율은 9*105 CD34+ 세포/제대혈 시료이었는데, 이를 팽장시켜 3.5 * 106 세포들을 수득하였다. 이들 연구를 위한 'the Medical University of Vienna Institutional Review Board'의 가이드라인에 따라 모든 절차들을 수행하였다. 헬싱키 원칙 선언(Declaration of Helsinki Principles)에 따라 사전 동의(informed consent)를 받았다.
유세포분석 (Flow cytometry )
뮤린 및 인간 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC) 제조물의 순도를 유세포분석에 의해 평가하였다. 세포 표면 마커들의 염색에 사용된 항체들은 다음과 같은 원천들로부터 유래한 것이었다: 마우스 계통 패널 항체들은 Becton Dickinson Biosciences (BD 559971, containing in biotinylated from 항-CD3, 항-CD11b, 항-CD45R, 항-Ly-6G/Ly-6c, 항-Ter-119로부터 비오티닐화된 형태로 함유)로부터 유래하였고, 친화성 정제된 랫트(rat) 항-마우스(anti-mouse) CD16/CD32 (mouse FcγII /III block, BD 553142) 및 형광 염료 스트렙타비딘-알로피코시아닌-Cy7 (스트렙타비딘 APC-Cy7, BD554063)도 또한 Becton Dickinson Biosciences로부터 유래하였다. 피코에리트린(PE)-Cy7-표지된 항-마우스 Ly6A/E (=줄기 세포 항원-1 = Sca1) PE-Cy7 (카탈로그 no. 25-5981-82) 및 PE-Cy5 항-마우스 CD117 (c-Kit) (카탈로그 no. 15-1171-81)는 eBiosciences로부터 유래하였다.
MACS 직후, 1*106 계통 양성 (Lin+) 및 음성 (Lin-) 세포들을 FACS(형광 활성화 세포 분류) 튜브로 옮기고, 50 μL PBS 중의 얼음 상에 저장하였다. 그 동안, FACS에 적당한 하기 항체들을 희석시키고(1:50), PBS 중에서 혼합하였다: (Fc-수용체들을 차단하기 위해) 정제된 항-CD16/CD32, 비오티닐화된 항-CD3, 비오티닐화된 항-CD11b, 비오티닐화된 항-CD45R, 비오티닐화된 항-Ly-6G/Ly-6C, 및 비오티닐화된 항-Ter-119, 스트렙타비딘-표지된 APC-Cy7, PE-Cy7-표지된 항-Sca-1, PE-Cy5-표지된 항-c-kit. 이 마스터 믹스(master mix)를 각각의 샘플에 첨가한 후, 조심스러운 소용돌이식 진탕(gentle vortexing)에 의해 혼합하고, 15분 동안 암소에서 4℃에서 항온처리하였다. 그 후, 원심분리에 의해 세포들을 수확하고, 2 mL PBS 중에서 세척하고, PBS 중에서 재현탁시켰다. FACS Canto II (Becton Dickinson)에서 샘플을 분석하였다. 게이팅(gating) 방법은 다음과 같다: 전방 및 측방 산란을 기록함으로써 생세포들에 대한 게이트(gate)들을 설정하였다. 계통 마커들(즉, CD11b, CD45R, Ly-6G/Ly-6C, Ter-119)의 발현에 기초하여 생세포들을 추가로 구별하였다. 이는 Sca-1 및 c-Kit의 발현에 대해 추가로 분석되는 Lin- 세포들을 위한 게이트들을 설정하는 것을 허용하였다.
또한, 인간 HSPC들에 의해 CXCR4 및 CD26/DPP-IV(디펩티딜 펩티다제-IV)를 모니터링하는데 유세포분석을 이용하였다. 2시간, 4시간 및 6시간 동안 10 μM 트레프로스티닐 및 30 μM 포스콜린으로 처리 후에 CXCR4 및 CD26/DPP-IV 발현을 측정하였다. 항온처리 후, 인간 CD34+ 세포들을 세척하고, 제조업체의 지시사항에 따라 CXCR4 및 CD26에 대한 항체들(eBioscience)로 염색하고, FACS 분석에 의해 정량하였다. 3개의 독립적인 실험들을 개별적으로 수행한 후, 통계 분석을 위해 데이터를 평균하였다. 데이터는 평균±표준 편차으로 제시되었고, 일원배치 분산분석을 이용하여 비교하였다.
[ 3 H] cAMP 축적 분석
성장 인자들이 보충된 X-VIVO15 배지 내에서 100 ng/ml 백일해 독소(Sigma Aldrich)의 부재 하에서 16시간 동안 인간 조혈 CD34+ 줄기 및 전구 세포(HSPC, 4*105/mL)들을 먼저 예비-항온처리하고, 이어서 성장 인자들 및 10 μg 아데닌 탈아미노효소(Roche)가 보충된 X-VIVO15 배지 내에서 추가의 4시간 항온 기간에 의해 아데닌 뉴클레오티드 풀을 대사 표지(metabolic labelling)하였다. 그 후, 1 또는 10 μM 트레프로스티닐, 1 또는 10 μM 디메틸-PGE2(dmPGE2), 포스콜린(30 μM) 또는 포스콜린과 프로스타노이드류의 배합물을 이용하여 30분 동안 세포들을 챌린징(challenging)하였다. 이어서, 세포들을 펠렛화하고(100 g에서 5분), 배지를 제거하고, 1시간 동안 얼음 상에 놓인, 0.1 mM cAMP를 함유하는 빙냉 2.5% 과염소산(0.9 mL) 중에서 펠렛을 용해하고, 4.2 M KOH (0.1 mL)로 중화시켰다. Dowex AG50-X8 및 중성 알루미나(참조문헌 3)를 함유하는 칼럼 상에서 연속 크로마토그래피에 의해 ATP와 cAMP를 분리시켰다.
세포 생존도, 세포 주기 분포 및 콜로니 형성
37℃에서 1시간 및 24시간 동안 비히클, 또는 10 μM 트레프로스티닐과 30 μM 포스콜린의 배합물의 존재 하에서 인간 또는 뮤린 HSPC들을 항온처리하였다. 4℃에서 PBS로 세척한 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 PE 아넥신-V 세포사멸 검출 기트 I
Figure 112017072693773-pct00003
(PE Annexin-V Apoptosis Detection Kit I
Figure 112017072693773-pct00004
)을 이용하여 외재화(externalized) 포스파티딜세린에 대하여, 또는 PI(PBS 중의 50 μmL- 1)를 이용하여 DNA 함량(content)에 대하여, 37℃에서 40분 동안 세포들을 염색하였다. Facs Diva software®를 이용하여, 유세포분석에 의해 수득된 데이터를 분석하였다. 뮤린 HSPC들의 콜로니 형성은 다음과 같이 측정하였다: 10 μM 트레프로스티닐 및 30 μM 포스콜린의 존재 하에서 1시간 동안 항온처리한 후, CFU-GM의 형성을 위해 GM-CSF 및 IL-3 (각각 10 ng mL- 1)을 함유하고 CFU-E의 형성을 위해 3 U mL-1 EPO 및 IL-3을 함유하는 MethoCult®에서 세포들을 재현탁시켰다. 광학 현미경 하에서 콜로니들의 수를 계수하였다.
이동 분석
뮤린 줄기 세포 배지(SFEM™; 각각 50 ng mL-1의 성장 인자들; SCF, Flt3, IL11 및 150 ng mL-1의 IL3) 또는 인간 줄기 세포 배지(X-VIVO™ 15, 각각 50 ng mL-1의 TPO, FL3, 및 SCF) 내에서 1시간 동안 10 μM 트레프로스티닐과 30 μM 포스콜린의 배합물을 이용하여 BALB/c 공여자 마우스들의 골수로부터 유래한 뮤린 계통-음성 조혈 줄기 및 전구 세포들(HSPC들)과 제대혈로부터 분리된 인간 CD34+ HSPC들을 자극하였다. 세척 후, Transwell™ (6.5 mm 직경, 3 μM 공극 크기)의 상부 챔버에 세포 현탁액(0.1 mL 중 2 x106 세포)을 배치시켰다. 하부 챔버에 성장 인자들 및 100 ng ml-1 SDF-1을 함유하는 300 μL 배지를 충진시켰다. 지시된 바대로, 상부 및 하부 챔버에 30 nM 빌다글립틴을 보충하였다. 37℃에서 4시간 항온처리 후에 SDF-1에 대한 주화성(chemotax)을 측정하였다. 세포 계수기를 이용하여, 하부 챔버로 이동한 HSPC들을 계수하였다. 3회 분석을 행하였다.
귀환 분석
MACS 마이크로비드(전술한 내용 참조)를 이용하여, 공여자 마우스들 B6.SJL-PtrcAPep3B/Boyl (CD45.1+)의 전체 골수 세포들로부터 계통-음성 HSPC들을 분리하였다. 37℃에서 1시간 동안 10 μM 트레프로스티닐 및 30 μM 포스콜린, 또는 비히클 대조군으로 세포들을 시험관내(in vitro) 처리하였다. 세척 후, 치명적으로 방사선조사된(10 Gy) 수용자 C57Bl/6 (CD45.2+) 마우스들에 0.2 x106 계통-음성 CD 45.1+ 세포들을 주입하였다. 또한, 트레프로스티닐(0.15 mg kg-1 8 h-1), 빌다글립틴(10 mg kg-1), 또는 상기 두 약물의 배합물을 피하 주사함으로써, 수용자 마우스들을 생체내(in vivo) 처리하였다. 대조군 마우스들에 동일한 부피의 비히클을 주입하였다. 이식 후 16시간에 수용자 마우스들로부터 전체 골수 세포들을 분리하였다. 적혈구 세포들의 용해 후, CD45.1 및 CD45.2 마커들에 대해 세포들을 염색하였다. 유세포분석에 의해 골수 중의 CD45.1와 CD45.2의 비율을 측정하였다.
골수 이식
동종유전자형(isogenic) 수용자 마우스들(C57BL/6 또는 BALB/c)에 치명적 방사선조사를 행하였다. 조혈 줄기 및 전구 세포들(HSPC들)의 정맥내 투여에 의해 구조되지 않는다면, 이들 마우스들은 처음 2주 이내에 사멸되었다. 위에서 개략적으로 설명된 바와 같이 Lin- (Sca1+ 및 c-Kit+) HSPC들을 제조하고, 37℃에서 1시간 동안 10 μM 트레프로스티닐(Trp) + 30 μM 배합물의 부재 및 존재 하에서 생체외(ex vivo) 전처리하였다. 그 후, 꼬리 정맥을 통해 세포들(1-5*105/마우스)을 주입하였다. FACS에 의해 백혈구 세포 계수를 측정하고, 9일째에 시작하여 매 3일 내지 5일마다 혈액 샘플을 수집하였다(혈액 세포 계수는 ~1 G/L이었다). 몇몇 경우에, 10일 동안 매 8시간마다 피하 투여되는 트레프로스티닐(0.15 mg kg-1 8 h-1) 및 빌다글립틴 (10 mg kg-1 12 h-1) 또는 트레프로스티닐과 빌다글립틴의 배합물을 이용하여 마우스들(25-30 g)을 처리하였다.
조혈 줄기 및 전구 세포들로부터 RNA의 분리 및 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)
2 mL Trizol®(Invitrogen)을 사용하여, 뮤린 및 인간 조혈 줄기 및 전구 세포들(3*106 세포)로부터, 뮤린 대뇌 피질(cerebral cortex)로부터 제조된 혼합된(즉, 뉴런 및 신경아교세포) 배양액으로부터, 그리고 인간 전립선암 세포주 PC3 및 인간 대장암 세포주 HCT116(양성 대조군)으로부터 RNA를 분리하였다. 균질화된 샘플을 실온에서 5분 동안 항온처리하여, 핵단백질 복합체들의 완전한 해리를 허용하였다. 세포 용해물(cell lysate)에 클로로포름(0.4 mL)을 첨가하고, 15초 동안 튜브를 손으로 격렬히 진탕하였다. 실온에서 3분 동안 항온처리 후, 4℃에서 15분 동안 12,000g에서 샘플을 원심분리하였다. 원심분리 후, 혼합물을 연한 붉은색(lower red)의 페놀-클로로포름상(phenol-chloroform phase), 중간상(interphase), 및 무색의 상부 수상(colorless upper aqueous phase)으로 분리시켰다. 수상(RNA)을 새로운 튜브로 옮기고, 1 ml 이소프로필 알코올과 혼합함으로써 RNA를 침전시켰다. 실온에서 10분 동안 항온처리 후, 4℃에서 10분 동안 12,000g에서 샘플을 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 2 ml의 75% 에탄올로 겔-유사 RNA-펠렛(gle-like RNA pellet)을 한 번 세척하였다. 소용돌이식 진탕(vortexing)에 의해 샘플을 혼합하고, 4℃에서 5분 동안 7,500g에서 원심분리하였다. RNA-펠렛을 10분 동안 공기 건조시키고, 피펫 팁(pipette tip)을 통해 수 회 용액을 통과시켜 80 μL의 (매우 정제된) 물에 용해시키고, 55℃에서 10분 동안 항온처리하였다(55℃에서 저장).
1 μL 올리고 (dT)18 프라이머, 4 μl 5x 반응 완충액, 1 μl RiboLockTM RNase 저해제 (20u/μl) 2 μl 10mM dNTP Mix, 1 μl RevertAidTM H Minus M-MuLV 역전사효소 (200u/μl) 및 정제수(총 부피를 12 μl가 되도록 함)의 존재하에 RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas)를 이용하여 42℃에서 60분 동안 RNA(1 μg)를 cDNA로 역전사시킨 후, 70℃에서 5분 동안 항온처리하였다.
1 μl cDNA, 1 μl 10 mM dNTPs, 1 μl 순방향 프라이머 [10 μM], 1 μl 역방향 프라이머 [10 μM], 4 μl GoTaq® 완충액 [5x], 0.2 μl GoTaq® 폴리머라제 및 정제수(11.8 μl)(최종 부피가 20 μl가 되도록 함)를 이용하여, 인간 프로스타글란디 수용체들 및 CXCR4의 단편들의 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 증폭을 행하였다. 먼저 95℃에서 5분 동안 혼합물을 항온처리한 후, 40 주기(cycle) [95℃에서 45 초(s) 해리(denaturation), 57℃에서 30 초(s) 결합(annealing), 72℃에서 45 초(s) 연장(extension)]를 수행하고, 72℃에서 5분 동안 최종 연장을 행하였다. 2% 아가로스 겔 상에서 PCR 생성물들을 분리시켰다.
사용된 프라이머들 (순방향 & 역방향)
H EP1 F GAGAGCCAGGGCGCAGT
(SEQ ID NO 1)		 M EP4 F TCTCTGGTGGTGCTCATCTG
(SEQ ID NO 15)
H EP1 R GCAAGGGCTCATGTCAGG
(SEQ ID NO 2)		 M EP4 R TGCAAATCTGGGTTTCTGCT
(SEQ ID NO 16)
M EP1 F AGCAGGAGCCAAGTTCCAG
(SEQ ID NO 3)		 H CXCR4 F AGGAAGCTGTTGGCTGAAAA
(SEQ ID NO 17)
M EP1 R CATCCGCTAGGCTCAGGTTA
(SEQ ID NO 4)		 H CXCR4 R CTCACTGACGTTGGCAAAGA
(SEQ ID NO 18)
H EP2 F CCACCTCATTCTCCTGGCTA
(SEQ ID NO 5)		 M CXCR4 F AGGTGCAGGTAGCAGTGACC
(SEQ ID NO 19)
H EP2 R TTTCCTTTCGGGAAGAGGTT
(SEQ ID NO 6)		 M CXCR4 R ACTCACACTGATCGGTTCCA
(SEQ ID NO 20)
M EP2 F TTATGACCATCACCTTCGCC
(SEQ ID NO 7)		 M PI F GGGCACGAGAGGATGAAGT
(SEQ ID NO 21)
M EP2 R TAAAAACCGAAGAGCTCGGA
(SEQ ID NO 8)		 M PI R GATGGCCTGAGTGAAGCCT
(SEQ ID NO 22)
H EP3 F AGCGACCATTTGGAAAGATG
(SEQ ID NO 9)		 H PI F GTGTGCTCCCTGCCTCTC
(SEQ ID NO 23)
H EP3 R TGATGTGATCCTGGCAGAAA
(SEQ ID NO 10)		 H PI R GGGGTTGAAGGCGTAGAAG
(SEQ ID NO 24)
M EP3 F TGGATCCCTGGGTTTATCTG
(SEQ ID NO 11) 		M PGRD F AAGGCTCCATAGTACGCACG
(SEQ ID NO 25)
M EP3 R GGGAAACAGGTACTGCAATGA
(SEQ ID NO 12)		 M PGRD R CTCAGACTACAGGCACGGGT
(SEQ ID NO 26)
H EP4 F TTACTCATTGCCACCTCCCT
(SEQ ID NO 13)		 H PGRD F CGGAGGTCTTCTGCTTCTTC
(SEQ ID NO 27)
H EP4 R CGCTCCAAACTTGGCTGATA
(SEQ ID NO 14)		 H PGRD R CACTATGTGTTCTCTGCCCG
(SEQ ID NO 28)
결과:
인간 조혈 및 전구 세포들의 트레프로스티닐 - 및 dmPGE2 -유도된 고리형 AMP 축적
상기 재료 및 방법 하에 개략적으로 설명되어 있는 바와 같이, [3H]아데닌으로 대사적 표지(metabolic labelling) 후, 트레프로스티닐(Trep, 10 μM) dmPGE2 (10 μM), 또는 포스콜린(30 μL)과 트레프로스티닐(10 μM) 또는 dmPGE2 (10 μM)의 배합물로 인간 HSPC들을 자극하였다. 지시된 바대로, 자극 이전에 16시간 동안 백일해 독소(PTX)로 HSPC들을 전처리하였다. 3회 수행한 3개의 독립적인 실험들로부터 데이터를 얻었고, 오차 바(error bar)는 s.e.m을 나타낸다. 30 μM 포스콜린의 존재 하에서, 10 μM 트레프로스티닐이 10 μM dmPGE2보다 더 효능이 우수하였다[ns, 유의적이지 않음(not significant)](P = 0.03; 윌콕슨 검정(Wilcoxon test)). 이 차이는 백일해 독소 전처리에 의해 없어졌다(ns. 유의적이지 않음). 데이터는 도 7에 나타나 있다.
인간 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포들(HSPC들)의 아데닌 뉴클레오티드 풀(adenine nucleotide pool)을 [3H]아데닌으로 대사적 표지하고, 30 μM 포스콜린의 존재 및 부재 하에서 트레프로스티닐에 대한 반응과 디메틸-PGE2에 대한 반응을 조사하였다. 세포들이 포스콜린의 부재 또는 존재 하에서 자극되는지 여부에 상관없이, 트레프로스티닐이 dmPGE2보다 유의적으로 더 효능이 우수하다는 것이 도 7에 명확히 나타나 있다. 디테르펜(diterpene)은 아데닐 사이클라제의 촉매적 C1 도메인과 C2 도메인 사이의 유사기질 틈새(pseudosubstrate cleft)에서 결합하고, 효소의 다양한 아형(isoform)들이 조절성 G 단백질 Gαs에 더 반응성이 되도록 한다(참고문헌 5-7 참조). dmPGE2가 또한 Gi-커플링된 EP3 수용체들에서 완전한 작동제(full agonist)이고(참고문헌 8, 9 참조), 따라서 EP2 및 EP4 수용체들을 통한 Gs-의존성 자극과 Gi-커플링된 EP3 수용체들을 통한 동시(comcomitant) 저해를 둘다 야기시킨다는 것을 고려함으로써, dmPGE2의 보다 낮은 효능을 합리화할 수 있다. 백일해 독소는 Gαi-서브유닛의 C-말단으로부터 제거된 시스테인 잔기 4개의 아미노산들을 ADP-리보실화함으로써, Gi (및 관련된 G 단백질 (예컨대, Go 및 Gt))와 Gi-커플링된 수용체들의 상호작용을 없앤다. 따라서, 백일해 독소의 존재 하에서 16시간 동안 HSPC들을 예비-항온처리하였다. 이 전처리는 트레프로스티닐 + 포스콜린에 의해 유도되는 반응과 dmPGE2 + 포스콜린에 의해 야기되는 반응 간에 유의적인 차이가 없도록(도 7의 8번째 바 및 9번째 바 참조), dmPGE2에 대한 반응을 증가시켰다(도 7의 6번째 바 및 9번째 바 참조). 이는 인간 HSPC들에 대한 dmPGE2의 작용과 트레프로스티닐의 작용 간에 주된 차이가 있다는 것을 확인한다: dmPGE2는 Gi-커플링된 수용체에 관여하지만, 트레프로스티닐은 그렇지 않다.
트레프로스티닐 및 포스콜린을 이용한 HSPC들의 전처리는 세포 생존도, 세포 주기 진행 또는 분화 잠재력을 변경시키지 않는다.
cAMP의 지속적인 상승은 조혈 세포들의 세포사멸(apoptosis)을 촉발시킨다(참고문헌 10 참조). dmPGE2-처리된 HSC들의 증강된 생착은 세포 생존, 증식 및 귀환에 대한 효과에 기인하였다(참고문헌 11 참조). 트레프로스티닐과 dmPGE2는 G 단백질들을 모집할 수 있는 능력에서 차이가 있다: Gi를 통한 신호화가 세포들의 증식 및 생존을 자극하는 지질 키나제 PI3-키나제 및 다운스트림 키나제 AKT의 활성을 초래하기 때문에, Gi의 dmPE2-유도된 모집(recruitment)는 특히 관련있을 수 있다(참고문헌 12, 13 참조). 따라서, 본 발명자들은 30 μM 포스콜린과 10 μM 트레프로스티닐의 배합물을 이용한 인간 HSPC들의 시험관내(in vitro) 처리에 대해 조사하였다. 트레프로스티닐 및 포스콜린을 이용한 뮤린 및 인간 HSPC들의 전처리는 세포사멸을 유도하지 않으며, 세포 주기 진행 또는 분화 잠재력을 변경시키지 않는다. 1시간 동안 10 μM 트레프로스티닐 및 30 μM 포스콜린을 이용하여 인간 HSPC들을 항온처리하였다. 연이어, 유세포분석에 의하여, (A, B) 세포사멸 유도 및 (C, D) 세포 주기 진행을 평가하였다. 대표적인 오리지날 사진들이 도시되어 있고(A, C, 좌측 패널), 3개의 독립적인 실험들에서 수득한 데이터가 요약되어 있다(B, D, 우측 패널). 미처리 세포들과 처리 세포들 사이에 G0/1기, S기 및 G2기에 따른 세포사멸성(apoptotic) 세포 또는 세포들의 분포에 있어서의 차이는 탐지되지 않았다(일원배치 분산분석)(E, F). 골수로부터 뮤린 HSPC들을 분리하고, 전처리하고, 과립구-단핵구 콜로니 형성 단위(CFU-GM)와 적혈구 계통 콜로니 형성 단위(CFU-E)의 분화 및 성장을 지지하는데 필요한 성장 인자들을 함유하는 메틸셀룰로오스 배지에서 재현탁시켰다. 10일 후, 광학 현미경 하에서 콜로니들의 수를 계수하고, 콜로니들의 형상(shape) 및 형태(morphology)를 관찰하였다. 3개의 독립적인 실험들의 현미경사진과 정량화가 제시되어 있다. 데이터는 평균±표준 편차 (n=3)이다
(데이터는 도 8에 나타나 있다).
트레프로스티닐은 세포들을 세포사멸(apoptosis)에 더 민감하게 하거나(도 8A & B), 세포 주기에의 진입 또는 세포 주기를 통한 증식을 방해하거나(도 8C & D), 또는 특이적인 계통들을 야기시킬 수 있는 뮤린 HSPC들의 능력을 변경시켰다(도 8E & F). 점도표(dot plot)(도 8A)에 실증되어 있고 도 8B에 요약되어 있는 바와 같이, 생존, 초기 세포사멸 및 사멸 세포들의 존재는 비교할 만하고, 아넥신-V 양성 세포들의 수는 30 μM 포스콜린 및 10 μM 트레프로스티닐을 이용한 시험관내(in vitro) 처리시에 증가되지 않았다. 마찬가지로, HSPC들이 1시간 또는 24시간 동안 노출되었는지 여부에 상관없이, 비동기로(asynchronously) 성장하는 미처리 인간 HSPC들의 세포 주기 분포와 트레프로스티닐 및 포스콜린의 존재 하에서 유지된 HSPC들은 비교할 만하다(대표적인 오리지날 히스토그램의 경우 도 8C, 평균된 데이테의 경우 도 8D 참조). 중요하게, 본 발명자들은 골수 및 적혈구 콜로니의 형성에 대한 트레프로스티닐 및 포스콜린의 효과를 탐지하지 못했다: 골수로부터 뮤린 HSPC들을 분리하고, 트레프로스티닐 및 포스콜린의 존재 하에서 1시간 동안 항온처리하고, 과립구-단핵구의 콜로니 성장 단위(CFU-GM) 및 적혈구의 콜로니 성장 단위(CFU-E)의 분화 및 성장을 지지하는데 필요한 성장 인자를 가지는 메틸셀룰로오스 함유 배지에서 재현탁시켰다. 10일 후, 형태(도 8E) 및 콜로니들의 수는 비교할 만하다(도 8F).
트레프로스티닐은 SDF -1/ CXCL -12를 향한 인간 및 뮤린 HSPC들의 이동을 자극한다.
전술한 바와 같이, dmPGE2-처리된 HSC들의 증강된 생착은 세포 생존, 증식 및 귀환에 대한 효과에 기인한다(참조문헌 10 참조). 본 발명자들의 실험 조건들 하에서, 트레프로스티닐 및 포스콜린을 이용한 뮤린 및 인간 HSPC들의 시험관내(in vitro) 처리는 골수 재구성을 증강시켰지만(후술하는 내용 및 도 13 참조), 생체내에서(in vivo) 세포 생존도 또는 세포 주기 진행을 변경시키지 않았다(도 8 참조).
SDF-1/CXCR4 축은 골수 서식지(bone marrow nitche)에의 HSPC들의 귀환에 주요 역할을 한다. 따라서, 본 발명자들은 트레프로스티닐의 이로운 작용이 SDF-1/CXCR4-매개 효과의 증강된 생착에 기인하는 것으로 추측하였다.
다음 데이터는 도 9에 나타나 있다: 트레프로스티닐 및 포스콜린을 이용한 시험관내(in vitro) 전처리는 CXCR4 (A & B) 및 CD26/DPP-IV (C)의 발현을 증강시킨다. 10 μM 트레프로스티닐과 30 μM 포스콜린의 배합물 (Trep + Fsk)의 부재(미처리) 또는 존재 하에서 1시간 동안 항온처리된 인간 HSPC들로부터 (A) RNA를 분리하였다. 인간 PC3 세포주로부터 제조된 RNA는 양성 대조군으로서 역할을 하였다. 역전사 후, 표 1에 열거된 프라이머들을 사용하여, PCR-의존성 증폭을 행하였다. 증폭반응체(amplicon)들은 아가로스 겔 상에서 전기영동식으로 분해되고, 브롬화 에티듐 염색에 의해 가시화되었다. β-액틴을 코딩하는 mRNA는 내부 대조군(internal 증control)으로서 폭되었다. 데이터는 유사한 결과를 가지는 2개의 추가의 실험들을 대표하는 것이다.(B, C). 10 μM 트레프로스티닐 및 30 μM 포스콜린, 또는 비히클 대조군 (미처리)을 이용하여 2시간, 4시간 및 6시간 동안 인간 CD34+ 세포들 (B) 및 mHPSCs를 항온처리하였다. 연이어, FACS에 의해, CXCR4 (B) 및 CD26 (C)의 발현에 대해 샘플을 분석하였다. 3개 이상의 독립적인 실험들에서 양성 세포들의 백분율을 나타내었다(평균±표준 편차; *P < 0.05 vs. 미처리 대조군, 분산분석).
이러한 가설(conjecture)을 다음과 같이 조사하였다: (i) 트레프로스티닐 및 포스콜린을 이용한 인간 HSPC들의 예비자극(prestimulation)은 CXCR4의 mRNA 레벨을 상승시켰다(도 9A). 이는 또한 CXCR4 단백질의 증강된 발현으로 해석되었다(도 9B). 흥미롭게, 이는 또한 CXCR4 리간드 SDF-1/CXCL12를 분해시키는 효소인 CD26/DPP-IV(디펩티딜 펩티다제-IV)의 상향조절(upregulation)을 수반하였다(도 9C에 뮤린 HSPC들에 대해 나타나 있음). (ii) CXCR4의 상향조절은 SDF-1을 향한 인간 (도 10A) 및 뮤린 (도 10B) HSPC들의 증강된 이동을 각각 초래하였다. (iii) 이러한 지향(directed) 이동은 특이적인데, 이는 그것이 선택적인 CXCR4 길항제 플레릭사포(plerixafor)/AMD3100에 의해 차단되기 때문이다(도 10C). 마찬가지로, 기저 이동(basal migration)(즉, SDF-1 부재 하에서의 무작위 이동)은 트레프로스티닐 및 포스콜린을 이용한 HSPC들의 전처리에 의해 증강되지 않았다(도 10A &B의 첫번째 바 및 세번째 바 참조).
도 10은 다음 데이터를 나타낸다: 트레프로스티닐 및 포스콜린을 이용한 시험관내(in vitro) 전처리는 CXCR4를 통한 SDF-1의 작용을 증강시킨다. 비히클[개방된 바(open bar)들] 또는 10 μM 트레프로스티닐 및 30 μM 포스콜린 [Trep + Fsk, 폐쇄된 바(closed bar)들])을 이용하여, 신선하게 분리된 뮤린 및 인간 HSPC들을 전처리한 후, 세척 단계를 수행하였다. 인간 (A) 및 뮤린 (B, C) HSPC들의 현탁액(성장 인자를 함유하는 0.1 mL 배지 중의 2 ×105 세포)을 상부 Transwell™ 챔버에 첨가하고, 4시간 동안 SDF-1 (하부 챔버 중에 100 ng/mL)를 향해 이동시켰다. 5 μm 필터를 통해 이동한 세포들을 계수하였다. 또한, 10 μM AMD3100의 부재 및 존재하에서 HSPC들을 항온처리하였다. 데이터는 3회 수행한 3개의 독립적인 실험들로부터 얻은 평균±표준 편차이다. 통계적인 비교는 분산분석(ANOVA) 및 연이은 터키 다중 비교(Tukey's multiple comparison)에 의해 수행하였다(*, P < 0.05; **, P < 0. 01; *** P < 0.001).
CXCR4의 차단은 골수 이식에 대한 트레프로스티닐의 이로운 효과를 둔화시킨다.
AMD3100에 의한 길항작용은 생체내에서(in vivo) 개략적으로 설명되었다: 트레프로스티닐- 및 포스콜린-전처리된 뮤린 HSPC들을 이용하여, 치명적으로 방사선조사된 수용자 마우스들의 골수를 재구성하고, 연이어 10일 동안 최적 투여량(optimum dose)의 트레프로스티닐을 피하 투여하였다. AMD3100 (3.3 mg kg-1 8h-1)의 동시 투여는 트레프로스티닐의 이로운 작용을 둔화시켜, 모든 수용자 마우스들이 결구 골수 부전으로 쓰러졌다(도 11). 따라서, 종합적으로, 연구결과(observation)들은 트레프로스티닐-처리된 HSPC들에서 트레프로스티닐닐-유도된 cAMP 축적, CXCR4의 증가된 발현, 및 CXCR4에 의한 증가된 신호화 간에 밀접한 연관성(mechanistic link)이 있음을 나타낸다. 또한, 연구결과들은 트레프로스티닐의 작용이 CXCR4에 달려있다는 것을 뒷받침한다: CXCR4에 의한 신호화가 차단된 경우, 골수는 생착되지 않았고, 모든 동물들은 사멸하였다.
트레프로스티닐의 연속적이지만 비동시적인 투여시, 빌다글립틴에 의한 CD26/DPP-IV의 저해는 HSPC들의 귀환 및 HSPC들에 의한 골수의 재구성을 증강시킨다 .
몇몇 케모카인들은 CD26/DPP-IV(디펩티딜 펩티다제-IV)에 의해 분해되는 것으로 알려져 있다. 이는 SDF-1/CXCL12의 경우에도 사실이다. 트레프로스티닐의 작용이 CXCR4의 유도에 의해 - 적어도 부분적으로 - 매개된다는 것을 고려하면, 그것은 CXCR4에 달려있다. 따라서, SDF-1/CXCL12의 증강된 작용은 이로울 것으로 예측된다. 이와 관련하여, 트레프로스티닐 및 포스콜린을 이용한 처리는 미처리 HSPC들에서 본질적으로 검출될 수 없었지만, 트레프로스티닐 및 포스콜린으로 자극된 HSPC들의 10% 이상에서 검출되었던 CD26의 발현도 또한 유도하였다는 것을 고려할 가치가 있다(도 9C). 몇몇 DPP-IV 저해제들이 시판되고, 이들의 인간 약리작용(pharmacology)이 잘 이해되며,이들은 제2형 당뇨병의 치료에 다년간 수 백만명의 환자들에게 투여되어 왔다. 사실상, 대다수의 환자들은 위험한 부작용 없이 DPP-IV 저해제들에 내성이 있다.
DPP-IV 저해제들이 트레프로스티닐에 대한 적당한 병용 파트너일 수 있다는 것을 고려하여, 본 발명자들은 DPP-IV 저해제 빌다글립틴이 트레프로스티닐의 작용을 증강시키는지 여부를 탐구하였다. 이것은 주입된 HSPC들의 골수에의 귀환 능력을 측정하는 접근법(approach)으로 먼저 시험하였다: CD 45.1+ 공여자 마우스들의 골수로부터 수확한 HSPC들을 동질유전자형(isogenic) CD45.2 수용자들에 주입하였다. 16시간 후에 동물들을 희생시키고, 골수로부터 회수된 CD45.1+ 세포들의 양을 FACS에 의해 정량화하였다.
이들 실험은 다음과 같은 것들을 보여주었다:
(i) 시험관내에서(in vitro) 트레프로스티닐+포스콜린의 배합물을 이용한 HSPC들의 단 하나의 전처리는 통계적으로 유의적인 증강된 귀환을 초래하기에 충분하지 않았다(도 12의 세번째 바 및 첫번째 바 참조).
도 12는 빌다글립틴과 트레프로스티닐의 배합물이 아니라 빌다글립틴 및 트레프로스티닐을 단독으로 이용한 수용자 마우스들의 생체내(in vivo) 처리가 트레프로스티닐 및 포스콜린으로 예비-항온처리된 HSPC들의 귀환을 증가시키는다는 것을 보여준다. CD45.1+ 공여자 마우스들의 골수로부터 분리된 뮤린 HSPC들을 비히클 ("비처리 세포"), 또는 트레프로스티닐 및 포스콜린 ("처리 세포")으로 전처리하고, 치명적으로 방사선조사된 수용자 C57Bl/6 (CD45.2+)에 꼬리 정맥 주사를 통해 이식하였다. 이어서, 수용자 마우스들을 7개의 그룹으로 분할하였다. 그룹 1 및 2에 할당된 마우스들에만 미처리 대조군 세포들이 있으며, 그룹 2에 할당된 추가의 마우스들은 빌다글립틴(Vil, 10 mg kg-1/d)으로 생체내(in vivo) 처리하였다. 그룹 3에 할당된 마우스들은 시험관내(in vitro)-처리된 세포들만 수용하였고, 그룹 4에 할당된 마우스들은 -추가로- 생체내(in vivo) 트레프로스티닐(Trep, 0.15 mg kg-1 8h-1) 처리되었다. 그룹 5에 할당된 마우스들에는 트레프로스티닐(0.15 mg kg-1 8h-1)과 AMD3100 (3.3 mg kg-1 8h- 1)을 병용하여 생체내(in vivo) 처리 투여하였다. 그룹 5에 할당된 마우스들은 생체내에서(in vivo) 트레프로스티닐(0.15 mg kg-1 8h-1) 과 빌다글립틴(10 mg kg-1/d)을 둘다 수용하였고, 마지막으로 그룹 6에 할당된 마우스들은 생체내에서(in vivo) 빌다글립틴을 수용하였다. 16시간 후, FACS에 의해 수용자들의 골수를 분석함으로써, 골수에 귀환할 수 있는 CD45.1+ 세포들의 능력을 평가하였다. 데이터는 평균±표준 편차 (n=3)이다. 분산분석(ANOVA) 및 연이은 터키 다중 비교(Tukey's multiple comparison)에 의해 통계적 비교를 행하였다. 시험관내(in vitro) 전처리 + 생체내(in vivo) 빌다글립틴의 조합 (마지막 바, "+ 생체내 (빌다글립틴)")은 모든 다른 것들로부터 통계적으로 유의적이다(**, p< 0.01). 네번째 바("+ 생체내 (트레프로스티닐)")는 처음 3개의 바들, 다섯번째 바("+ 생체내 (트레프로스티닐+AMD3100)") 및 여섯번째 바("+ 생체내 (트레프로스티닐+빌다글립틴)")과 통계적으로 유의적인 방식에서 다르다(*, p<0.05).
초기 관찰은 dmPGE2를 이용한 시험관내(in vitro) 전처리가 HSPC들의 귀환을 증강시켰다는 것을 보였다(참고문헌 11 참조). 따라서, 이러한 연구결과는 dmPGE2을 이용한 예비-항온처리과 트레프로스티닐과 포스콜린의 배합물을 이용한 예비-항온처리 간의 차이를 다시 강조한다.
(ii) 수용자 마우스들이 또한 생체내에서(in vivo) 트레프로스티닐로 처리된다면, 시험관내에서(in vitro) 트레프로스티닐+포스콜린의 배합물을 이용한 HSPC들의 전처리는 수용자 마우스들의 골수에의 귀환을 증가시켰다(도 12의 네번째 바 및 세번째 바 참조).
(iii) CXCR4 길항제 AMDd3100/플레릭사포를 수용자 마우스에 투여한다면, 트레프로스티닐+포스콜린을 이용한 연속 시험관내(in vitro) 전처리 및 연이은 트레프로스티닐의 생체내(in vivo) 투여에 기인하는 증강된 귀환은 없어졌다(도 12의 네번째 바 및 다섯번째 바 참조). 이러한 관찰은 트레프로스티닐의 작용이 CXCR4의 도입에 달려 있다는 것을 보였던 도 9, 10, 11 및 위에서 요약된 연구결과와 일치한다.
(iv) 미처리 HSPC들을 수용한 수용자 마우스들에의 빌다글립틴의 단독 생체내(in vivo) 투여는 귀환을 증강시키지 않았다(도 12의 두번째 바 및 첫번째 바 참조).
(v) 트레프로스티닐+포스콜린-전처리된 HSPC들을 수용하고, 연이어 생체내에서(in vivo) 트레프로스티닐이 투여된 수용자 마우스들에의 빌다글립틴의 생체내(in vivo) 투여는 트레프로스티닐의 귀환 효과를 없앴다(도 12의 네번째 바 및 여섯번째 바 참조).
(vi) 트레프로스티닐과 포스콜린의 배합물을 이용하여 HSPC들을 전처리하고, 수용자 마우스들에 빌다글립틴을 투여하는 경우, 귀환에 있어서의 가장 확연한 증가를 관찰하였다: 이 요법 후의 귀환은 트레프로스티닐+포스콜린-전처리된 HSPC들의 투여와 연이은 생체내에서의(in vivo) 트레프로스티닐의 투여 (도 12의 일곱번째 바 및 네번째 바 참조) 또는 연이은 생체내에서의(in vivo) 트레프로스티닐 및 빌다글립틴의 투여(도 12의 일곱번째 바 및 여섯번째 바 참조)를 비롯한 모든 다른 것들을 능가하였다.
빌다글립틴에 의한 CD26/ DPP -IV의 저해는 연속 투여시에만 트레프로스티닐 +포스콜린에 의한 골수의 재구성을 증강시킨다.
2*105 Lin-, c-Kit+, Sca1+ HSPC들의 정맥내 투여에 의해 치명적으로 방사선조사된 BALB/c 마우스들을 구조하였다. 이들 조건 하에서, HSPC들의 수는 제한적이어서, 미처리 HSPC들가 주입된 모든 동물들은 사멸한다(도 13의 실선). 대조적으로, 시험관내에서(in vitro) 트레프로스티닐과 포스콜린의 배합물을 이용하여 HSPC들을 전처리하고 10일 동안 트레프로스티닐을 수용자 동물들에 투여한다면, 동물들의 60%가 생존하였다(도 13의 삼각형/점선). 시험관내에서(in vitro) 트레프로스티닐과 포스콜린의 배합물을 이용하여 HSPC들을 전처리하고 10일 동안 빌다글립틴을 수용자 동물들에 투여한다면, 수용자 마우스들의 생존은 100%로 증가되었다(도 13의 원/파선). 그러나, 트레프로스티닐과 빌다글립틴의 병용 투여는 확연한 상호 길항작용을 야기시켰다: 시험관내에서(in vitro) 트레프로스티닐과 포스콜린의 배합물로 처리된 HSPC들을 수용자 동물들에 주입하고 트레프로스티닐 및 빌다글립틴을 투여한 경우, 대다수의 수용자 동물들이 사멸되었다(도 13의 정사각형/점선). 이러한 실험결과는 도 13에 요약된 귀환 분석의 결과와 일치한다: 다시 말해서, 2개의 독립적인 접근법은 생체내에서(in vivo) 동시에 투여될 때에는 트레프로스티닐과 빌다글립틴이 상호 길항작용(mutual antagonism)을 나타내지만, 올바른 시제 연속으로(in the right temporal sequence)로 적용될 때, 즉 트레프로스티닐+포스콜린을 이용한 HSPC들의 시험관내(in vitro) 전처리 및 연이은 수용자 마우스들에의 빌다글립틴의 생체내(in vivo) 투여시에는 트레프로스티닐과 빌다글립틴이 상승작용(synergism)을 나타낸다는 것을 기록하였다.
AMD3100 / 플레릭사포에 의한 CXCR4의 차단은 수용자 마우스들의 생존에 대한 빌다글립틴의 이로운 효과를 길항하고 둔화시키지만, AMD3100 / 플레릭사포 그 자체는 또한 생존을 증강시킨다:
이 프로젝트의 기저가 되는 작업 가설(working hopothesis)은 포스콜린+트레프로스티닐의 배합물로 전처리된 HSPC들을 수용한 수용자 마우스들에의 빌다글립틴의 투여가 SDF-1/CXCL12의 분해(brakdown)를 저해하고, 따라서 상향조절된 CXCR4를 통한 신호화를 증강시킨다는 것을 사실로 상정한다. 이것이 사실인 경우, 빌다글립틴의 작용은 AMD3100/플레릭사포의 동시 투여에 의해 둔화된다. 7 그룹의 수용자 BALB/c 마우스들(5/그룹)을 사용하여 실험을 행하였다. 이들 그룹 중 몇몇은 초기 연구결과가 개략적으로 설명된다는 것을 입증하기 위해 포함된 내부 대조군(internal control)이었다. 모든 마우스들은 꼬리 정맥을 통한 주입 이전에 시험관내에서(in vitro) 트레프로스티닐과 포스콜린의 배합물로 전처리된 HSPC들을 수용하였다. HSPC들의 수는 제한적이어서((2*105/마우스 BALB/c), 미처리 HSPC들의 단독 주입은 수용자들을 구조하기에 충분하지 않았다. 빌다글립틴이 주입된 수용자 마우스들이 최고의 결과를 나타냈다: 그들의 생존은 트레프로스티닐이 투여된 그룹에서보다 더 우수하였다(도 11로부터의 데이터, 하기 참조). 또한, 트레프로스티닐과 빌다글립틴의 배합물이 투여된 동물들은 결과가 좋지 못하였다: 따라서, 이들 관찰은 도 13에 보여진 결과들을 개략적으로 재정리한다. 빌다글립틴과 AMD3100/플레릭사포의 배합물을 수용한 수용자들의 생존은 빌다글립틴이 단독으로 처리된 동물들의 생존보다 낮았다. 따라서, 빌다글립틴의 작용은 - 적어도 부분적으로- CXCR4를 통한 SDF-1/CXCL12의 증강된 신호화에 의해 설명될 수 있다. 모든 조건들은 병렬적으로(in parallel) 시험되었고, 따라서 비교는 합법적이라는 것이 강조된다.
결론:
주요 연구결과들은 다음과 같이 요약될 수 있다:
(i) 트레프로스티닐이 (뮤린 및 인간) HSPC들 내의 Gs-커플링된 프로스타노이드 수용체들을 활성화시키고, dmPGE2 또한 HSPC들상에 존재하는 Gi-커플링된 EP3 수용체들을 활성화시키기 때문에, 트레프로스티닐은 dmPGE와 다르다. 따라서, (포스콜린과 병용하여) 트레프로스트닐을 이용한 단독 시험관내(in vitro) 처리는 시험관내에서(in vitro) HSPC들의 증식 및 생존을 증강시키지 않으며(도 8), 생체내에서(in vivo) 골수에의 귀환을 증강시키지 않는다(도 11). 이는 dmPGE에 대한 공표된 데이터와 대조적이다(참고문헌 11 참조). 귀환은 단지 수용자 동물들이 생체내에서(in vivo) 트레프로스티닐로 연속적으로 처리되는 경우에 증강된다(도 12).
(ii) 트레프로스티닐의 작용은 - 적어도 부분적으로 - CXCR4의 유도(도 9), 및 그 결과로 초래되는 CXCR4를 통한 SDF-1/CXCL12의 증강된 신호화에 달려있다. 이는 시험관내에서(in vitro) SDF-1을 향한 트레프로스티닐+포스콜린-전처리된 HSPC들의 증강된 이동(주화성)(도 10A, B), CXCR4 길항제 AMD3100/플레릭사포에 의한 이 효과의 차단(도 10C)을 보임으로써, 그리고 생체내에서(in vivo) 트레프로스티닐-유도된 증강된 귀환(도 12) 및 수용자 마우스들의 골수 증강/생존(도 11)의 AMD3100/플레릭사포에 의한 저해를 입증함으로써 기록되었다.
(iii) CD26/DPP-IV의 저해는 그 자체로 골수에의 HSPC들의 귀환에 영향을 미치지 않지만, HSPC들가 먼저 시험관내에서(in viro) 트레프로스티닐 및 포스콜린에 노출되고, 이어서 생체내에서(in vivo) 빌다글립틴에 노출된다면, 트레프로스티닐과 상승작용을 한다(도 12). 두 화합물들이 생체내에서(in vivo) 동시에 투여된다면, 상호 길항작용이 있다. 이 상승작용과 상호 길항작용은 HSPC들의 귀환보다는 오히려 생착, 즉 치명적으로 방사선조사된 수용자 마우스들 내의 골수를 재구성하고 따라서 그들의 생존을 지지할 수 있는 능력을 시험한 독립적인 실험들에서 개략적으로 재정리되었다(도 13).
도 13은 DPP-IV 저해제 빌다글립틴의 단독 생체내(in vivo) 투여가 수용자 마우스들의 생존율에 대한 트레프로스티닐 및 포스콜린을 이용한 시험관내(in vitro) 처리의 이로운 효과를 증가시킨다는 것을 보인다. 공여자 BALB/c 마우스들로부터 분리된 뮤린 HSPC들을 37℃에서 1시간 동안 10 μM 트레프로스티닐 및 30 μM 포스콜린, 또는 비히클 (실선)로 시험관내에서(in vitro) 처리하였다. 세척 후, 치명적으로 방사선조사된(10 Gy) 수용자 BALB/c 마우스들에 2 x 105 세포들을 주입하였다. 비히클-처리된 HSPC들을 수용한 마우스들의 그룹은 생체내에서(in vivo) 추가 처리를 수용하지 않았고, 방사선조사를 위한 대조군으로서의 역할을 하였다(실선, n=19): 그들은 골수 부전으로 인해 사멸되었다. 마우스들의 다른 그룹(점선/삼각형; n=20)은 10 μM 트레프로스티닐 및 30 μM 포스콜린으로 전처리된 HSPC들을 수용하였고, 또한 트레프로스티닐(0.15 mg kg-1 8h-1)로 생체내에서(in vivo) 처리되었다. 마우스들의 다음 그룹(점선/정사각형; n=20)은 다시 시험관내에서(in vitro) 포스콜린+트레프로스티닐로 전처리된 HSPC들을 수용하였고, 추가로 생체내에서(in vivo) 트레프로스티닐(0.15 mg kg-1 8h-1)과 빌다글립틴(10 mg/kg/24h) 둘다로 추가 처리되었다. 마지막으로, 마우스들의 한 그룹(파선/원; n=20)은 시험관내에서(in vitro) 포스콜린+트레프로스티닐로 전처리된 HSPC들을 수용하였고, 생체내에서(in vivo) 빌다글립틴(10 mg/kg/일)으로 처리되었다. 로그순위 검정에 의해 생존 곡선을 비교하였다: 3가지 처리 조건들 간의 차이는 통계적으로 유의적이다(p<0.01).
이러한 놀라운 연구결과는 이해하기 어렵지만, 그것은 신호(signal)들의 순서의 중요성을 강조한다: 트레프로스티닐-제공된 Gs-의존성 신호는 CXCR4를 통해 SDF-1/CXCL12에 의해 생성되는 Gi/Gq-의존성 신호에 앞서야 한다.
(iv) 생체내에서(in vivo) AMD3100/플레릭사포는 트레프로스티닐 투여 및 빌다글립틴 투여 둘다의 이로운 효과를 길항한다. 이러한 길항작용은 예측될 수 있는데, 이는 트레프로스티닐이 CXCR4를 유도하고 빌다글립틴이 SDF-1/CXCL12를 분해하는 효소를 차단하기 때문이다. 따라서, 둘다의 조작(manipulation)은 AMD3100/플레릭사포에 의해 차단되는 CXCR4를 통한 증강된 신호화를 초래한다. 이러한 관찰은 이식된 HSPC들에 대한 올바른 신호(right cue)를 연속적인 순서로 제공하는 것의 중요성을 강조한다(상기 (iii) 참조). 또한, 본 발명자들은 생체내에서(in vivo) 트레프로스티닐에 대한 용량-반응 곡선(dose-response curve)이 벨 형상이라는 것, 즉 보다 높은 용량이 현재의 실험들에서 사용되는 표준 용량보다 골수 생착을 촉진시키는데 있어서 덜 이로웠다는 것을 이전에 알았다. 이는 그 자극이 HSPC들의 생착에 대한 프로스타노이드의 작용에 대항하는 골내막 틈새(endosteal nitche)에 늘어선 세포들 상의 EP4 수용체들의 존재로 인한 것일 수 있다. 마찬가지로, SDF-1/CXCL12이 또한 신호화 상황(signalling context)에 달려있는 골수 재구성(bone marrow reconstitution)을 이롭게하기도 하며 방해하기도 할 수 있는, 골내막 틈새에 대한 복잡한 작용을 한다는 것을 생각할 수 있다.
이들 연구결과에 기초하여, 다음과 같이 결론지울 수 있다:
(i) 트레프로스티닐과 포스콜린의 배합물을 이용한 HSPC들의 시험관내(in vitro) 전처리는 트레프로스티닐 또는 빌다글립틴의 생체내(in vivo) 투여와 병용되어 골수 재구성을 증강시킬 수 있다.
(ii) 두 화합물들(즉, 트레프로스티닐 및 빌다글립틴)의 동시 투여는 상호 길항작용을 초래하며, 따라서 덜 가치있다. 그러나, 빌다글립틴과 트레프로스티닐이 교대 방식(alternating scheme)으로 투여되는 연속 요법(sequential regimen)이 유용할 수 있다는 것을 생각할 수 있다.
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Claims (15)

  1. 빌다글립틴을 포함하는, 조혈 줄기 세포가 이식된 수용자의 골수 질환의 치료에 사용하기 위한 조성물로서,
    상기 조혈 줄기 및/또는 전구 세포는 생착(engraftment)을 증강시키기 위해 이식 전에 트레프로스티닐 또는 이의 약학적 허용 염으로 시험관내(in vitro) 처리된 것이며,
    상기 골수 질환은 백혈병, 혈액 세포 격실(compartment)의 결함, 화학요법 또는 방사선조사에 의해 유도된 골수 질환인 것인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조혈 줄기 및/또는 전구 세포는 이식 전에 트레프로스티닐 또는 이의 약학적 허용 염; 및 cAMP 인핸서로 처리된 것인 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 cAMP 인핸서는 포스콜린인 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조혈 줄기 세포는 트레프로스티닐 및 포스콜린으로 시험관내 처리된 것인 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 빌다글립틴은 조혈 줄기 세포를 이식하기 적어도 5시간, 적어도 10시간, 적어도 15시간, 또는 적어도 24시간 전에 투여되는 것인 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 빌다글립틴은 조혈 줄기 세포 이식 후 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 또는 적어도 4일의 기간 동안 투여되는 것인 조성물.
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  9. 제1항에 있어서, 상기 혈액 세포 격실의 결함은 헤모글로빈병증, 호중구성 과립구 기능의 결함, 또는 T- 및/또는 B-림프구의 결함인 것인 조성물.
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