CN107537029A - 一种寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗 - Google Patents
一种寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗,属于生物制品制备技术领域。本发明的联合灭活疫苗中含有0.5‑10ug/ml黄热病毒和0.5‑10ug/ml寨卡病毒。本发明还提供了寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗的制备方法,包括黄热病毒和寨卡病毒的接种、纯化和灭活步骤,其中黄热病毒接种MOI为0.01‑1PFU/ml,寨卡病毒接种MOI为0.001‑0.1CCID50/ml。本发明的疫苗能够同时免疫寨卡病毒和黄热病毒,避免了减毒疫苗导致的感染和过敏反应,具有良好的防控寨卡病毒和黄热病毒引起疾病的能力。
Description
技术领域
本发明属于生物制品制备技术领域,具体地说,涉及一种含有寨 卡病毒和黄热病毒的联合灭活疫苗。
背景技术
目前全球广泛使用的黄热疫苗均为使用17D减毒株接种鸡胚组 织制备的。我国自1953年开始生产黄热疫苗,至今已有50余年。多年 临床应用表明,减毒黄热疫苗较安全有效,但也有因注射减毒黄热疫 苗引起的严重副反应,主要是与黄热病毒有关的嗜内性疾病(yellow fever associated viscerotropic disease,YEL-AVD)和嗜神经性疾病 (yellowfever associated neurotropic disease,YEL-AND)。YEL-AVD是 一种引发肝脏和其它脏器急性爆发的感染,可导致60%的死亡率。而 YEL-AND引发神经性疾患,可导致1-2%死亡率。从安全角度出发, 本发明人利用细胞培养黄热病毒17D株,制备灭活疫苗,可杜绝 YEL-AND和YEL-AVD的发生,并且避免了受试者因鸡胚导致的过敏 反应。
寨卡病毒自20世纪中期发现,主要在南美、非洲以及东南亚等热 带地区流行,尚无疫苗保护。而2015年至2016年,在巴西由寨卡病毒 引起的新生儿小头病多达上千例,引起巨大恐慌。随着我国经济水平 的提高,人民群众出游前述地区商务及旅行的机会越来越多,亟需开 发寨卡疫苗为国民健康保驾护航。目前还没有黄热病毒和寨卡病毒的 联合灭活疫苗研制的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种安全、有效预防寨卡病毒和黄热病毒感 染的二联灭活疫苗。
本发明提供的一种寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗含有寨卡 病毒和黄热病毒,且两者病毒均灭活。
进一步,本发明的寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗含有0.5-10 ug/ml黄热病毒和0.5-10ug/ml寨卡病毒。
优选地,本发明的寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗含有1-8 ug/ml黄热病毒和1-8ug/ml寨卡病毒。
更优选地,本发明的寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗含有3-6 ug/ml黄热病毒和3-6ug/ml寨卡病毒。
本发明的联合疫苗还含有0.25%-1%谷氨酸钠、0.5%-1%甘露醇、 0.5%-1%甘氨酸氧化三甲胺及0.2%-0.62%氢氧化铝,所述%均为质量 体积比。最终pH调节到7.0-8.0。
本发明实施例所用的黄热病毒为黄热病毒17D,用于培养黄热病 毒17D的宿主细胞为Vero细胞。
本发明提供一种寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗的制备方法, 包括制备黄热病毒灭活液、制备寨卡病毒灭活液、将两种病毒灭活液 按照蛋白含量进行稀释后混合,添加添加剂,使联合疫苗中含有0.5-10 ug/ml黄热病毒和0.5-10ug/ml寨卡病毒。
本发明的制备方法中,制备黄热病毒灭活液的方法包括以下步 骤:
(1)黄热病毒按照分种或混种的方式接种宿主细胞MOI为0.01-1 PFU/ml,培养温度25-37℃,细胞病变60%-100%时收获病毒液;
(2)黄热病毒收获液澄清、超滤后得到浓缩液,采用两步层析 法纯化浓缩液,得到黄热病毒纯化液;
(3)黄热病毒纯化液过滤,调节pH值7.5-8.5,灭活即得。
其中,步骤(1)中步骤(1)中黄热病毒按照分种或混种的方式 接种宿主细胞MOI为0.1-1PFU/ml;培养温度为33-37℃,细胞病变 60%-85%时收获病毒液;步骤(3)中灭活是向黄热病毒纯化液中添 加0.05-0.2%β丙内酯,于4℃下搅拌灭活20-26小时后,37℃水解2小 时,得到黄热病毒灭活液。
所述黄热病毒为黄热病毒17D,所述宿主细胞为Vero细胞。
本发明的联合灭活疫苗的制备方法中,制备寨卡病毒灭活液的方 法包括以下步骤:
(1)寨卡病毒接种宿主细胞MOI为0.001-0.1CCID50/ml,培养温 度25-35℃,待细胞病变25-35%收获80%的上清液,补加新鲜病毒培 养液,继续培养至细胞病变45-55%,收获80%的上清液,补加新鲜病 毒培养液,继续培养至细胞病变70-80%,收获80%的上清液,补加新 鲜病毒培养液,继续培养至细胞病变90-100%,收获全部上清液;将 前述4批上清液合并即为寨卡病毒的收获液;或
待细胞病变45-55%,收获80%的上清液,补加新鲜病毒培养液, 继续培养至细胞病变70-80%,收获80%的上清液,补加新鲜病毒培养 液,继续培养至细胞病变90-100%,收获全部上清液;将前述3批上清 液合并即为寨卡病毒的收获液;
(2)寨卡病毒的收获液澄清、超滤,得到寨卡病毒浓缩液;采 用两步层析法纯化浓缩液,得到寨卡病毒纯化液;
(3)将寨卡病毒纯化液经0.22μm过滤,将pH调节至7.5-8.5之间, 灭活即得。
步骤(3)中灭活是向过滤后的寨卡病毒纯化液添加0.05-0.2%的β 丙内酯在4℃下灭活20-26小时后水解,或向过滤后的寨卡病毒纯化液 添加30-180ug/ml甲醛在22-28℃灭活96小时,去除甲醛,即为寨卡病 毒灭活液。
本发明的联合灭活疫苗的制备方法还包括将两种病毒灭活液按 照蛋白含量进行稀释后混合,添加终浓度为0.2%-0.62%的氢氧化铝佐 剂,0.5-1%谷氨酸、0.5-1%甘露醇、0.5-1%甘氨酸氧化三甲胺,调节 pH到7.0-8.0。
本发明的疫苗稳定性较好,理化性质稳定,两种免疫原无互相干 扰,能够同时免疫寨卡病毒和黄热病毒,避免了减毒疫苗导致的感染 和过敏反应,接种本发明的疫苗可以减少接种针次,简化免疫程序, 操作上更加简洁,大大提高接种的覆盖率。同时可有效预防人及动物 因上述病毒所致的疾病,覆盖更加广泛,免疫效果更好,具有良好的 防控寨卡病毒和黄热病毒引起疾病的能力。本发明制备联合疫苗的方 法简便,成本低,便于工业化大规模生产。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。在不 背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的 修改或替换,均属于本发明的范围。如下所采纳的实施例使用了标准 的技术,除非另有详细描述,为本领域技术人员众所周知且为常规技 术。实施例是例证性的,但并不限制本发明。
实施例1黄热病毒17D在Vero细胞挑斑与适应性培养
为了使黄热病毒17D更好地在Vero细胞上适应生长,使用黄热病 毒减毒活疫苗在Vero细胞上挑斑培养。经冻干的黄热病毒17D减毒活 疫苗用注射水恢复原体积。根据已知疫苗的病毒滴度,用无血清199 培养液系列稀释病毒。将每一个稀释度的病毒接种在已形成单层细胞 的6孔板中,每孔接种0.4ml,在37℃,5%CO2培养箱中吸附1小时, 然后加入无血清羧甲基纤维素工作液。培养一段时间后,在显微镜下 选取蚀斑数少于3个的培养孔。用吸管吸取蚀斑,接种至单层的Vero 细胞上培养。待到细胞病变为60-100%时,收获病毒培养液,离心去 细胞碎片,得到蚀斑第一代病毒种子。向蚀斑第一代病毒种子加入一 定量的病毒保护剂,检测病毒滴度,保存于-80℃冰箱。将蚀斑第一 代病毒种子依照上法进行第二次蚀斑筛选。经过三次蚀斑筛选,挑选 出适用于疫苗生产的黄热病毒株。
将黄热病毒17D按照0.01PFU/cell接种至已经单层的Vero细胞表 面。待细胞病变为75-85%时收获上清,分装冻存。记为P1代。将P1 代按照0.01PFU/细胞接种至新鲜的单层Vero细胞表面。待细胞病变为 65-90%时收获上清,分装冻存。记为P2代。如此进行黄热病毒在Vero 细胞上的适应性培养,在Vero细胞上共适应培养15代。
实施例2黄热病毒17D在Vero细胞上不同代次的滴度和免疫原性比 较
1、挑选在Vero细胞上适应性传代的第1、4、7、10、13、15代进 行病毒滴定试验。用199细胞维持液体系列稀释病毒,选择3个适宜稀 释度的病毒液,接种至细胞已形成单层的6孔板中。每个稀释度病毒 接种2孔,设立2孔细胞对照。在37℃、5%CO2培养箱内吸附1小时, 然后每孔添加羧甲基纤维素使用液4ml,继续在培养箱中培养。6天后 取出培养板,倒掉覆盖物,加入1%结晶紫染液染色,用自来水漂洗、 晾干。对蚀斑数少于30个的孔内的蚀斑计数,计算出PFU。病毒滴 度的单位为LgPFU/ml。病毒滴度结果如表1所示,使用Vero细胞连续 传代培养的黄热病毒滴度远高于在黄热病毒在Vero细胞上适应第一 代病毒的滴度。
表1黄热病毒传代滴度(LgPFU/ml)
2、对黄热病毒的免疫原性研究分别采用家兔和小鼠来评价
(1)家兔免疫原性实验
将黄热病毒在Vero细胞上传代的第1、4、7、10、13、15代稀释 至6.50LgPFU/ml,将Vero细胞悬液加入病毒保护剂,作为阴性对照, 将2批鸡胚疫苗作为阳性对照(批号分别为10140101,10140102),稀释至 6.50LgPFU/ml,分别免疫家兔(皮下免疫2次,每次1ml,间隔1周), 即采用0,7天免疫程序,分别于免前和第二次免疫后28天采血,黄热 病毒疫苗免疫前的兔血清稀释度为1:5,免疫后的兔血清的起始稀释 度为1:10,然后进行倍比稀释。免疫前及免疫后的阴性对照兔血清稀 释度均为1:5。将稀释后的兔血清于65℃灭活30分钟。用PRNT法测定 血清中和抗体效价。将灭活的兔血清分别于3批稀释至4000PFU/ml的 鸡胚疫苗等量混合,同时设立病毒对照,并将黄热病毒(17D)猴免 疫血清系列稀释后与病毒混合,作为质量控制血清对照。37℃中和后 接种Vero细胞和BHK-21细胞,吸附后添加羧甲基纤维素。6天后染色 计数。与病毒对照相比,蚀斑数减少50%以上的抗血清最高稀释度为 血清中和抗体效价。结果显示Vero细胞传代的黄热病毒17D株第1、4、 7代免疫家兔后,其免疫血清可中和源于同一工作种子批的3批鸡胚黄 热减毒活疫苗,不同代次病毒免疫的血清中和抗体效价均高于 1:1280。随着代次的增加,中和抗体效价逐渐升高,最高升至1:5120。 经Vero细胞传代的第10代黄热疫苗病毒与统一批号的鸡胚黄热疫苗 病毒免疫家兔后,二者血清中和抗体效价无显著差异(P>0.05),10 代之后逐渐趋于稳定。结果如表2所示。
表2家兔免疫原性试验
(2)黄热病毒小鼠免疫原性试验
将第1、4、7、10、13、15代黄热病毒疫苗和2批鸡胚疫苗稀释至 6.50LgPFU/ml,后者作为阳性对照。将Vero细胞悬液,Vero细胞培养 液上清、疫苗稀释液各加入病毒保护剂,作为阴性对照。分别免疫小 鼠,每组10只,免疫2次,每次腹腔注射0.5ml,皮下0.1ml,间隔1周, 即采用0,7天免疫程序。另外设立未免疫的小鼠作为空白对照。上述 实验组和对照组分别于免疫前和第2次免疫后4周采血。由结果可知, 黄热疫苗病毒17D株第1、4、7代免疫小鼠后,其免疫血清可中和源 于同一工作种子批的3批鸡胚黄热减毒活疫苗病毒,不同代次的Vero 细胞黄热疫苗中和抗体效价均高于1:640。随着代次的增加,中和抗 体效价逐渐升高,最高升至1:2560。但是与免疫家兔产生的中和抗体 相比,小鼠血清中和抗体效价略低,这可能与不同种属动物对黄热病 毒的敏感性不同有关。结果如表3所示。
表3小鼠免疫原性实验
实施例3黄热病毒17D在Vero细胞上的培养优化
为确定黄热病毒在Vero细胞上的最佳培养条件,发明人依据接种 方式、接种MOI、培养温度以及收获时间,采用JMP10软件进行试验 设计。各个因子的水平分别如下,接种方式为分种和混种,接种MOI 为1、0.1、0.01PFU/ml,病毒培养温度为33-37℃,收获时间为病变 25%、50%、75%、100%。采用黄热病毒的病毒滴度结果,确定最优 的试验条件。试验设计及结果如表4所示:
表4黄热病毒培养条件优化结果
温度(℃) | MOI(PFU/ml) | 病变程度 | 病毒滴度 |
33 | 0.01 | 0.25 | 6.99 |
33 | 1 | 0.5 | 7.64 |
37 | 1 | 1 | 7.2 |
37 | 0.01 | 0.5 | 7.27 |
33 | 1 | 0.75 | 7.68 |
33 | 0.01 | 1 | 6.47 |
33 | 0.1 | 1 | 7.47 |
37 | 0.01 | 0.75 | 7.96 |
33 | 1 | 0.25 | 6.99 |
37 | 0.1 | 0.25 | 7.68 |
37 | 1 | 1 | 7.2 |
37 | 1 | 0.25 | 7.38 |
经JMP10计算得出,CPE是关键工艺参数,最适合收获为细胞病 变60-85%之间。33℃和37℃培养无明显区别。接种MOI在0.01-1 PFU/ml之间区别不大。故本实验条件为按照MOI为0.01-1PFU/ml将黄 热病毒接种至单层的Vero细胞上,33-37℃培养至细胞病变为60-85% 时收获培养上清。
实施例4黄热病毒灭活疫苗的纯化
将Vero细胞在Cytodex1上培养至单层后,在MOI为0.01-1PFU/ml 的范围内接种黄热病毒工作种子,37℃培养至细胞病变80%,收获细 胞上清作为病毒收获液。
病毒收获液经过澄清、超滤浓缩后采用0.1%β丙内酯在室温条件 下灭活16小时,水解β丙内酯之后得到黄热病毒灭活液。
将黄热病毒灭活液经过两步纯化法,分别去除杂质蛋白和宿主细 胞核酸后,得到黄热病毒纯化液。
实施例5寨卡病毒的筛选
将寨卡病毒种子在Vero细胞上适应生长至第15代,挑选第1、4、 7、10、13、16代分别进行病毒滴度测定,分别用细胞法和ELISA法 测定小鼠中和抗体滴度。结果采用SPSS17.0软件进行数据分析, 计量资料以(x±s)表示,根据需要采用方差分析和t检验,P<0.05, 具有统计学意义。结果如表5所示,根据结果,本发明选择第10代寨 卡病毒的原始种子,并建立主病毒种子和工作病毒种子,主病毒种子 代次为13代,工作病毒种子代次为15代。
表5寨卡病毒Z-3各代次病毒滴度(lgCCID50/ml,x±s,n=3)和中和抗体滴度
实施例6寨卡病毒疫苗的培养工艺
1、在Cytodex1上培养Vero细胞单层后,按照MOI为0.001-0.1 CCID50/ml接种寨卡病毒工作种子,培养至细胞出现30%病变后,收 获上清,置于2-8℃。补加新鲜病毒培养液,继续培养24-60小时,待 细胞出现50%病变后,再次收获上清,置于2-8℃。补加新鲜病毒培养液,继续培养至细胞出现75%病变后,收获上清,置于2-8℃。补 加新鲜病毒培养液,至细胞出现病变达到85-100%,收获上清。合并 上述多次收获的上清液,即为寨卡病毒收获液,放置于2-8℃暂存, 即为001批。
2、在Cytodex1上培养Vero细胞单层后,按照MOI为0.001-0.1 CCID50/ml接种寨卡病毒工作种子,培养至细胞出现30-40%病变,收 获80%上清,置于2-8℃。补加新鲜病毒培养液。继续培养至细胞出现 病变达到60-75%病变,收获80%上清,置于2-8℃。补加新鲜培养液, 继续培养至细胞出现85-100%病变,收获全部上清。合并上清液,即 为寨卡病毒收获液,放置于2-8℃暂存,即为002批。
3、在Cytodex1上培养Vero细胞单层后,按照MOI为0.001-0.1 CCID50/ml接种寨卡病毒工作种子,培养至细胞出现50%病变,收获 80%的上清,置于2-8℃。补加新鲜病毒培养液,继续培养至细胞出 现病变达到85-100%,收获上清,合并收获液。即为寨卡病毒收获液, 放置于2-8℃暂存,记为003批。
4、在Cytodex1上培养Vero细胞单层后,按照MOI为0.001-0.1 CCID50/ml接种寨卡病毒工作种子,培养至细胞出现85-100%病变,收 获上清,即为寨卡病毒收获收获液,放置于2-8℃暂存,记为004批。
比较上述四种方法获得的病毒收获液的病毒滴度(重复三次),确 定最佳培养方法。如表6所示,001批和002批的收获液的滴度最高, 同时收获液的体积也最大,故选择四次收获或三次收获的方法均能达 到较好的结果。
表6不同收获方式的寨卡病毒滴度比较(LgCCID50/ml)
批次 | 病毒滴度(lgCCID50/ml) | 收获液体积(一个发酵罐体积) |
001 | 8.1±0.09 | ≈4 |
002 | 8.25±0.12 | ≈3 |
004 | 7.8±0.17 | ≈2 |
003 | 7.7±0.19 | 1 |
本发明选择第002批的寨卡病毒培养工艺,根据不同的细胞病变 程度共收获4次,最大程度上提高了收获体积,并保证了收获液单位 体积内病毒滴度的含量。
实施例7寨卡病毒疫苗的纯化工艺
寨卡病毒培养液经澄清和超滤后得到寨卡病毒超滤浓缩液,后经 两步层析得到寨卡病毒纯化液。第一步层析为去除杂质蛋白的凝胶过 滤层析,第二步层析为去除杂质核酸的离子交换层析。凝胶过滤层析 可选用的填料为GE Sepharose 4Fast Flow、Sepharose4Fast Flow、 Sephacryl S-300HR、Sephacryl S-400HR和Sephacryl S-500HR等分离范 围合适、易于放大的高通量高载量填料。离子交换层析可选用的填料 为GE DEAE、CM以及ANX等填料。具体操作如下所示。
(1)首先将寨卡病毒疫苗浓缩液经过层析柱过滤层析,紫外检测波 长为280nm,流速为6cm/h,流动相为pH7.4的 10mmol/LPBS(NaCl0.2-0.6mol/L),收集第一个吸收峰,即寨卡病毒蛋 白初纯液。
(2)用10mmol/LPBS(NaCl0.2-0.6mol/L)平衡阴离子层析柱至紫外、 电导平衡,流速3cm/h。
(3)将寨卡病毒初纯液按2被柱床体积加载到离子交换层析介质中, 宿主核酸牢固吸附在阴离子层析介质上,而寨卡病毒蛋白于离子交换 介质的结合点被缓冲液中的离子取代,直接穿透,紫外检测波长为 280nm,收集吸收峰。
(4)当样品全部加载后,继续用10mmol/LPBS(NaCl0.2-0.6mol/L)缓 冲液洗涤离子交换层析柱2倍柱床体积,知道紫外吸收值降到基线, 收集的流传峰为最终纯化液。
经两步层析法后,蛋白去除率平均大于99.9%DNA去除率平均大于 99.9%。时间结果如表6所示。
表6杂质蛋白和宿主DNA去除率
实施例8寨卡病毒疫苗的灭活工艺
采用两种灭活方法灭活寨卡病毒超滤浓缩液,一种为终浓度 0.025%β丙内酯4℃灭活,另一种为30-180ug/ml甲醛25±3℃灭活,分 别于0、6、12、24、36、48、72、96小时取样,检测病毒滴度,结 果采用SPSS17.0软件进行数据分析,以(x±s)表示,根据需要采用方差分析和t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果如表7所示,甲醛 灭活6小时后,病毒滴度开始下降,24小时后大多数病毒已经被灭活, 48小时后未检测出病毒滴度。β-丙内酯灭活12小时后即检不出病毒。 取β丙内酯灭活24小时,甲醛灭活96小时的样品,接种Vero细胞,盲 传三代,验证病毒灭活效果。结果显示两种灭活方法灭活的病毒均不 会引起Vero细胞病变效应。
将甲醛和β丙内酯灭活的寨卡病毒(含有5μg蛋白),同时设立未 灭活的寨卡病毒超滤浓缩液(含有5μg蛋白)和PBS阴性对照,按照0, 14天免疫,28天采血的程序免疫小鼠,通过检测ELISA血清抗体滴度 来确定灭活寨卡病毒诱发小鼠产生抗体的水平。灭活的寨卡病毒的免 疫原性检测结果如表8所示,甲醛、β丙内酯和灭活前超滤液引发小鼠 的抗体滴度相当,无显著差异。3次重复结果相似。
表7甲醛和β丙内酯灭活不同时间寨卡病毒滴度(lgCCID50/ml,x±s,n=3)
注:“-”表示未检测出感染性滴度
表8甲醛和β丙内酯灭活诱发小鼠抗体滴度比较
灭活方法 | 抗体滴度 |
甲醛 | 18066.67±6609.86 |
β丙内酯 | 21500.00±13063.87 |
超滤液 | 22533.33±14368.89 |
实施例9灭活寨卡疫苗的攻毒保护
为评价寨卡疫苗的有效性,将实施例8制得的寨卡疫苗接种免疫 缺陷小鼠,免疫程序为0,14免疫,28天后并用106TCID50的 ZIKV/Homo sapiens/PRI/PRVABC59/2015株腹腔攻击,观察小鼠的存 活情况。本次试验设置为阴性对照组、供试品1组和供试品2组,阴性对照组采用氢氧化铝溶液3mg/ml,供试品1组含有2ug/ml的寨 卡疫苗,供试品2组含有1ug/ml的寨卡疫苗,每组10只免疫缺陷小 鼠。实验结果如表9所示。
表9灭活寨卡疫苗的攻毒保护实验设计
攻毒后,观察12天小鼠的体重变化及存活状况,供试品1组和 2组全部存活,对照组第8天死亡6只,第9天全部死亡。本实验证 明,本发明创造的寨卡病毒灭活疫苗可以保护免疫缺陷的小鼠免受寨 卡病毒的攻击,具有良好的保护性。
实施例10联合疫苗配比工艺
实施例8制得的寨卡病毒灭活液和实施例4制得的黄热病毒灭活 液按照蛋白含量进行稀释后,混合、添加稳定剂后,使得寨卡病毒蛋 白含量为4ug/ml,黄热病毒蛋白含量为4ug/ml,添加0.2%((w/v) 的氢氧化铝佐剂以及0.5%-1%谷氨酸、0.5%-1%甘露醇、0.5%-1%甘 氨酸氧化三甲胺,调节pH到7.5。以上%均为质量体积比。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (19)
1.一种寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗,其特征在于,含有寨卡病毒和黄热病毒,且两种病毒均灭活。
2.根据权利要求1所述的寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗,其特征在于,含有0.5-10ug/ml黄热病毒和0.5-10ug/ml寨卡病毒。
3.根据权利要求1所述的寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗,其特征在于,含有1-8ug/ml黄热病毒和1-8ug/ml寨卡病毒。
4.根据权利要求1所述的寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗,其特征在于,含有3-6ug/ml黄热病毒和3-6ug/ml寨卡病毒。
5.根据权利要求1所述的寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗,其特征在于,所述黄热病毒为黄热病毒17D,用于培养黄热病毒17D的宿主细胞为Vero细胞。
6.根据权利要求1-5任一所述的寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗,其特征在于,含有0.25%-1%谷氨酸钠、0.5%-1%甘露醇、0.5%-1%甘氨酸氧化三甲胺及0.2%-0.62%氢氧化铝,所述%均为质量体积比。
7.根据权利要求1-5任一所述的寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗,其特征在于,疫苗pH为7.0-8.0。
8.一种寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗的制备方法,其特征在于,包括制备黄热病毒灭活液、制备寨卡病毒灭活液、将两种病毒灭活液按照蛋白含量进行稀释后混合,添加添加剂,使联合疫苗中含有0.5-10ug/ml黄热病毒和0.5-10ug/ml寨卡病毒。
9.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于:制备黄热病毒灭活液的方法包括以下步骤:
(1)黄热病毒按照分种或混种的方式接种宿主细胞MOI为0.01-1PFU/ml,培养温度25-37℃,细胞病变60%-100%时收获病毒液;
(2)黄热病毒收获液澄清、超滤后得到浓缩液,采用两步层析法纯化浓缩液,得到黄热病毒纯化液;
(3)黄热病毒纯化液过滤,调节pH值7.5-8.5,灭活即得。
10.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中黄热病毒按照分种或混种的方式接种宿主细胞MOI为0.1-1PFU/ml。
11.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中培养温度为33-37℃,细胞病变60%-85%时收获病毒液。
12.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)中灭活是向黄热病毒纯化液中添加0.05-0.2%β丙内酯,于4℃下搅拌灭活20-26小时后,37℃水解2小时,得到黄热病毒灭活液。
13.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于,所述黄热病毒为黄热病毒17D,所述宿主细胞为Vero细胞。
14.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述灭活是采用0.1%β丙内酯在室温条件下将过滤后的黄热病毒纯化液灭活12-20小时。
15.根据权利要求8-14任一所述的制备方法,其特征在于,制备寨卡病毒灭活液的方法包括以下步骤:
(1)寨卡病毒接种宿主细胞MOI为0.001-0.1CCID50/ml,培养温度25-35℃,待细胞病变25-35%收获80%的上清液,补加新鲜病毒培养液,继续培养至细胞病变45-55%,收获80%的上清液,补加新鲜病毒培养液,继续培养至细胞病变70-80%,收获80%的上清液,补加新鲜病毒培养液,继续培养至细胞病变90-100%,收获全部上清液;将前述4批上清液合并即为寨卡病毒的收获液;或
待细胞病变45-55%,收获80%的上清液,补加新鲜病毒培养液,继续培养至细胞病变70-80%,收获80%的上清液,补加新鲜病毒培养液,继续培养至细胞病变90-100%,收获全部上清液;将前述3批上清液合并即为寨卡病毒的收获液;
(2)寨卡病毒的收获液澄清、超滤,得到寨卡病毒浓缩液;采用两步层析法纯化浓缩液,得到寨卡病毒纯化液;
(3)将寨卡病毒纯化液经0.22μm过滤,将pH调节至7.5-8.5之间,灭活即得。
16.根据权利要求15所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)寨卡病毒接种宿主细胞MOI为0.01-0.1CCID50/ml,培养温度30-35℃。
17.根据权利要求15所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中每次补加新鲜病毒培养液均在2-8℃下进行。
18.根据权利要求15所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)中灭活是向过滤后的寨卡病毒纯化液添加0.05-0.2%的β丙内酯在4℃下灭活20-26小时后水解,或向过滤后的寨卡病毒纯化液添加30-180ug/ml甲醛在22-28℃灭活96小时,去除甲醛,即为寨卡病毒灭活液。
19.根据权利要求8-18任一所述的制备方法,其特征在于:将两种病毒灭活液按照所述蛋白含量进行稀释后混合,添加终浓度为0.2%-0.62%的氢氧化铝佐剂,0.5%-1%谷氨酸、0.5%-1%甘露醇、0.5%-1%甘氨酸氧化三甲胺,调节pH到7.0-8.0。
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