CN107532181A - Mirna模拟物和它们在治疗感觉病患中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了模拟miR‑96，miR‑182和/或miR‑183功能或活性的微小RNA模拟化合物。本发明的微小RNA模拟化合物包含含有成熟的miR‑96，miR‑182或miR‑183序列的约(22)至约(26)个核糖核苷酸的第一链；和含有基本上与第一链互补的序列并且具有至少一个经修饰的核苷酸的约(20)至约(24)个核糖核苷酸的第二链，其中第一链具有相对于第二链的3'核苷酸突出端。本发明另外提供了包含编码miR‑96，miR‑182和miR‑183中的一种或多种的多核苷酸的表达载体。本发明还提供了通过向有需要的受试者施用miR‑96，miR‑182和/或miR‑183的微小RNA模拟化合物和/或编码miR‑96，miR‑182和miR‑183中的至少一种的表达载体来治疗眼科或耳部病患的方法。

Description

MIRNA模拟物和它们在治疗感觉病患中的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年3月16日提交的，美国临时申请号62/133,590的优先权权益，其全部内容通过引用在此并入本申请。
发明领域
本发明提供了模拟miR-96，miR-182和/或miR-183的功能或活性的微小RNA模拟化合物。本发明还提供了包含编码miR-96,miR-182,和miR-183的一种或多种的多核苷酸的表达载体。本发明还提供了包含miR-96，miR-182和/或miR-183模拟化合物或编码miR-96，miR-182和/或miR-183的表达载体的组合物，以及使用微小RNA模拟化合物或编码它们的表达载体来治疗眼科和耳部病患的方法。
发明背景
微小RNA(microRNA)是小的、内源的、非编码RNA，其作用为基因表达的转录后阻遏物。微小RNA在发育和成年视网膜中具有独特的表达谱并且牵涉视网膜的正常发育和功能(Ryan et al.,Mol Vis 12:1175–1184,2006；Xu et al.,J Biol Chem 282(34):25053–25066,2007)。MiRNA在视网膜退行性小鼠模型的视网膜中失调，这暗示它们可能参与视网膜变性(Loscher et al.,Genome Biol 8(11):R248,2007；Loscher et al.,Exp Eye Res87(6):529–5342008)。小鼠视网膜中切酶(dicer)(细胞质中miRNA成熟所需的RNaseIII内切酶)的有条件失活导致视网膜分化和视杯模式化(optic-cup patterning)的改变，增加的细胞凋亡，和视网膜神经节细胞轴突的组织紊乱(disorganization)(Pinter&Hindges,PLoS ONE 5(4):e10021,2010；Davis&Ashery-Padan,Development 138(1):127–138,2011；Georgi&Reh,J Neurosci30(11):4048–4061,2010)，暗示了miRNA对于哺乳动物视网膜的正常发育和功能是重要的。然而，个别miRNA在视网膜中的体内功能仍然在很大程度上是未知的。
微小RNA-183/96/182簇在视网膜和其他感觉器官中表达。miR-183/96/182簇的敲除小鼠模型显示了发育过程中簇的失活导致光感受器的早发性和进行性突触缺陷和进行性视网膜退化(Lumayag et al.,Proc Natl Acad Sci,110(6):E507-16,2013)。另一方面，降低miR-183/96/182簇中所有三种miRNA活性的转基因抗miRNA“海绵(sponge)”小鼠模型，显示了增加的亮光诱导的视网膜变性；然而，在正常照明条件下没有观察到视网膜的组织学或功能缺陷(Zhu et al.,J Biol Chem.,286(36):31749-60,2011)。因此，仍然不确定miR-183/96/182簇在成年视网膜中的作用。
虽然使用称为antimiR的单链miRNA抑制剂的许多研究已经显示出治疗功效,恢复或增加miRNA功能的努力一直落后(van Rooij et al,Cir Res,110:496-507,2012)。目前，可以通过病毒过表达或通过使用合成双链miRNA来增加miRNA功能。使用腺伴随病毒(AAV)来驱动给定的miRNA的表达用以在体内恢复其活性已被证明在肝细胞和肺癌(Kasinski&Slack,Cancer Res,72:5576-5587,2012；Kota et al.,Cell,137:1005-1017,2009)以及脊髓和延髓肌肉萎缩(Miyazaki et al.,Nat Med.,18(7):1136-41,2012)的小鼠模型中是有效的。使用基于合成寡核苷酸的方法来增加miRNA水平尚未得到很好的探索。本发明提供模拟miR-96，miR-182和/或miR-183活性的合成的寡核苷酸以及病毒表达的多核苷酸来恢复眼和耳部功能。
发明概述
本发明提供模拟微小RNA功能或活性，特别是miR-96，miR-182和/或miR-183的功能或活性的微小RNA模拟化合物。在一些实施方案中，本发明的微小RNA模拟化合物包括合成的寡核苷酸。在其他实施方案中，本发明提供了包含编码miR-96，miR-182和miR-183的一种或多种的多核苷酸的表达载体，用于在哺乳动物中表达以治疗眼和耳部功能障碍。
在某些实施方案中，本发明的微小RNA模拟化合物包含含有第一链和第二链的合成的寡核苷酸，其中所述两条链形成完全或部分互补的双链区域。在各种实施方案中，微小RNA模拟化合物的第一链或反义链包含成熟的miR-96，miR-182或miR-183的序列，并且第二链或有义链包含基本上与第一链互补的并具有至少一个修饰的核苷酸的序列。
本发明的微小RNA模拟化合物模拟成熟的，天然存在的miR-96，miR-182或miR-183微小RNA的功能或活性并显示出对反义链的核酸酶消化增强的抗性，提高的将反义链载入miRNA诱导的沉默复合物(miRISC)的能力，和/或有义链的快速降解。
在一些实施方案中，miRNA模拟化合物的第一链是约19,20,21,22,23,24,25,26,27或28个核苷酸长度并且包含成熟的miR-96，miR-182或miR-183的序列，并且第二链是约18,19,20,21,22,23,24,25,26,或27个核苷酸长度并包含基本上与第一链互补的序列，其中第二链包含至少一个修饰的核苷酸。在某些实施方案中，第一链是约22至约26个核苷酸长度并且第二链是约20至约24个核苷酸长度。在一些实施方案中，第一链是约22至约26个核苷酸长度并且第二链是约20至约26个核苷酸长度。
在一些实施方案中，本发明的微小RNA模拟化合物的第一链的序列与成熟的miR-96，miR-182或miR-183序列约80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％(包括其间的值)相同。在另一个实施方案中，第一链的序列与成熟的miR-96，miR-182或miR-183序列完全(100％)相同。在一些实施方案中，第一链可以包含相对于第二链的3’核苷酸突出端。在其他实施方案中，第二链可以包含相对于第一链的3’核苷酸突出端。第一链和第二链上的3’突出端可以包含约1,2,3,或4个核苷酸。在某些实施方案中，3’突出端约1或2个核苷酸长。在一些实施方案中，所述第一和第二链含有相同数目的核苷酸，即两条链均没有突出端。在一些实施方案中，突出端可以存在于第一链或第二链的5’末端。
在一个实施方案中，第二链的序列与第一链的序列完全互补(100％)。在另一个实施方案中，第二链的序列与第一链的序列基本互补，如约75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,或100％(包括其间的值)互补。在又一实施方案中，第二链的序列可以包含相对于第一链的约1,2,3,4或5个错配。
在一些实施方案中，所述第一链和/或第二链可以包含一个或多个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，包含成熟miR-96，miR-182或miR-183序列的第一条链含有一个或多个修饰的核苷酸，例如一个或多个2’-含氟修饰的核苷酸。在某些实施方案中，第一条链含有至少一个2’-含氟核苷酸。在一些实施方案中，包含基本上与第一链的序列互补的序列的第二链包含至少一个经修饰的核苷酸，如2’-含氟或2’-O-甲基修饰的核苷酸。在某些实施方案中，第二链中至少一个修饰的核苷酸是2’-O-甲基修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，本发明提供了包含第一链和第二链的微小RNA模拟化合物，所述第一链为约22个至26个核糖核苷酸，其包含成熟的miR-96，miR-182或miR-183序列；所述第二链为约20个至24个核糖核苷酸，其基本上与第一链互补并且具有至少一个修饰的核苷酸，其中所述第一链具有相对于第二链的3’核苷酸突出端。在一些其他实施方案中，本发明提供了包含第一链和第二链的微小RNA模拟化合物，所述第一链为约22个至26个核糖核苷酸，其包含成熟的miR-96，miR-182或miR-183序列；所述第二链为约20个至24个核糖核苷酸，其基本上与第一链互补并且具有至少一个修饰的核苷酸，其中第一链或第二链具有3’核苷酸突出端。
本发明还提供了包含定位用于在哺乳动物细胞中表达的编码miR-96，miR-182和/或miR-183的多核苷酸的表达载体，用作治疗眼科或耳部病症的治疗剂。例如，编码miR-96，miR-182和/或miR-183的序列定位在适合的启动子附近用于在眼或耳细胞中表达并且启动子和编码序列侧翼是反向末端重复序列。然后将序列进一步插入载体序列，该载体在某些实施方案中可以在人细胞中复制。多核苷酸可以是分离的多核苷酸。
在某些实施方案中，载体是病毒表达载体。在某些实施方案中，病毒表达载体是腺病毒载体，腺伴随病毒(AAV)载体或慢病毒载体。在一些实施方案中，病毒表达载体是自身互补的腺伴随病毒载体。在某些实施方案中，AAV载体基于AAV的单一血清型，例如AAV1，AAV2，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8和AAV9。基本上基于单一血清型的修饰的AAV载体是本领域已知的，例如可以使用AAV8样并与AAV8共享93％氨基酸同一性的血清型rh.74(例如参见Martin et al.,Am.J.Cell.Physiol.296:C476-C488,2009,通过引用并入本文)。或者，腺伴随病毒载体是基于多种AAV血清型的嵌合腺伴随病毒载体。
由本发明提供的表达载体可以包括用于本发明任何方法的编码功性miR-96，miR-182和/或miR-183的任何序列。在某些实施方案中，表达载体包括选自下组的核酸序列：SEQID NOs:53-55。
本发明提供了含有编码本发明的miR-96，miR-182和/或miR-183的多核苷酸的细胞。在一些实施方案中，细胞是细菌细胞或哺乳动物细胞。细胞可以是已经递送有多核苷酸作为治疗干预的细胞。或者，细胞可以是体外用于制备用于治疗眼科或耳部病症的药物组合物的细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了包含miR-96，miR-182和miR-183模拟化合物中的至少一种或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或赋形剂的组合物。在一些其他实施例中，本发明提供包含编码miR-96，miR-182和miR-183中的至少一种的表达载体以及药学上可接受的载体或赋形剂的组合物。
本发明还提供了治疗或预防眼科病患如视网膜变性或色素性视网膜炎的方法，其包括向有需要的受试者施用本文所述的miR-96，miR-182和miR-183模拟化合物中的至少一种。本发明还包括用于在有需要的受试者中改善或恢复视敏度的方法，其包括向有需要的受试者施用本文所述的miR-96，miR-182和miR-183模拟化合物中的至少一种。
本发明还提供了治疗或预防眼科病患如视网膜变性或色素性视网膜炎的方法，其包括向有需要的受试者施用编码miR-96，miR-182和miR-183中的至少一个的表达载体。本发明还包括用于在有需要的受试者中改善或恢复视敏度的方法，其包括向有需要的受试者施用编码miR-96，miR-182和miR-183中至少一个的表达载体。
附图简述
图1A-1D显示了使用夹心ELISA测定法定量小鼠视网膜中的miRNA模拟物和RhosiRNA。显示的值为pmol寡聚物/g视网膜组织并且代表4个视网膜(微小RNA)或2个视网膜(siRNA)。图1A显示了miR-183模拟物的量，图1B显示了miR-96模拟物的量，图1C显示了miR-182模拟物的量，和图1D显示了Rho siRNA的量。
图2显示Rho siRNA对小鼠视网膜的功能性递送和Rho mRNA的下调。实线表示检测到的视紫红质siRNA的量(nmol/g视网膜组织)并且虚线表示与未治疗的眼相比，在视网膜中检测到的视紫红质mRNA的分数(时间0)。
图3A-3B显示了在R-Ret细胞中被动转染miRNA模拟物的作用。图3A显示了在转染72小时后用10μM miR-206模拟物转染的R-Ret细胞，以及图3B显示了未处理的R-Ret细胞。
图4显示了用miR-206模拟物转染的R-Ret细胞的腺苷酸激酶测定结果。
图5显示了用各种浓度的胆固醇缀合的Rho siRNA转染的R-Ret细胞中Rho mRNA的实时PCR分析。
图6A-6B显示了暴露至1μM寡核苷酸后牵涉光转导途径的基因的mRNA表达谱的实时PCR分析。图6A显示了暴露至1μM寡核苷酸后上调的基因。图6B显示了暴露至1μM寡核苷酸后下调的基因。
图7A-7B显示了暴露至3μM寡核苷酸后牵涉光转导途径的基因的mRNA表达谱的实时PCR分析。图7A显示了暴露至3μM寡核苷酸后上调的基因。图7B显示了暴露至3μM寡核苷酸后下调的基因。
图8显示了图6-7所示的处理的log2变换的平均倍数变化值的热图。
图9显示了小鼠色素性视网膜炎模型中合并的微小RNA模拟物和Rho siRNA对视敏度损失的影响。
图10显示了小鼠色素性视网膜炎模型中合并的微小RNA模拟物和Rho siRNA对视敏度损失的影响。
发明详述
微小RNA(miRNA)是小的，非蛋白编码RNA，其约18至约25核苷酸长，衍生自单个miRNA基因，衍生自蛋白编码基因的内含子，或衍生自通常编码多种紧密相关miRNA的多顺反子转录物。参见Carrington et al.(Science,Vol.301(5631):336-338,2003)的综述。MiRNA作用为靶mRNA的阻遏物，通过促进它们的降解或抑制翻译实现。
MiRNA由RNA聚合酶II(pol II)或RNA聚合酶III(pol III；参见Qi et al.(2006)Cellular&Molecular Immunology,Vol.3:411-419)转录并由初始转录物产生，所述初始转录物称为初级miRNA转录本(pri-miRNA)，其通常有数千个碱基长。在核中pri-miRNA由RNA酶Drosha加工为约70-至约100-个核苷酸的发夹形前体(pre-miRNA)。运送到细胞质后，该发夹pre-miRNA进一步由切酶(Dier)处理以产生双链RNA。成熟的miRNA链然后整合进入RNA诱导的沉默复合物(RISC)，在那里其通过碱基对互补与其靶标mRNA关联。在miRNA与mRNA靶标完全碱基配对的相对罕见的情况下，它促进mRNA降解。更常见的是，miRNA与靶mRNA形成不完美的异源双链体，影响mRNA稳定性或抑制mRNA翻译。
微小RNA-183/96/182簇在视网膜和其他感觉器官中表达。该簇位于小鼠第6号染色体上，人第7号染色体上，和大鼠第4号染色体上。以下给出小鼠，人和大鼠中成熟miR-96，miR-182和miR-183的序列。
小鼠中成熟的miR-96序列(SEQ ID NO:1)
UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU
人中成熟的miR-96序列(SEQ ID NO:2)
UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU
大鼠中成熟的miR-96序列(SEQ ID NO:3)
UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU
小鼠中成熟的miR-182序列(SEQ ID NO:4)
UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACCG
人中成熟的miR-182序列(SEQ ID NO:5)
UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU
大鼠中成熟的miR-182序列(SEQ ID NO:6)
UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACCG
小鼠中成熟的miR-183序列(SEQ ID NO:7)
UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU
人中成熟的miR-183序列(SEQ ID NO:8)
UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU
大鼠中成熟的miR-183序列(SEQ ID NO:9)
UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU
小鼠中微小RNA-183/96/182簇的敲除导致光感受器的早发性和进行性突触缺陷以及进行性视网膜退化(Lumayag et al.,(2013)Proc Nat Acad Sci,110(6)E507-E516)。尽管微小RNA-183/96/182簇已经显示出在视网膜的发育中发挥作用；尚未明确恢复或补充成人中微小RNA-183/96/182簇的活性是否可以改善或预防视网膜疾病。
本发明部分基于这样的发现，即施用模拟miR-96，miR-182和/或的miR-183的活性的微小RNA模拟化合物调节视网膜细胞中光传导基因的表达，防止或降低感光细胞的死亡，并防止或降低色素性视网膜炎小鼠模型中的视力丧失。因此，本发明提供了用于治疗或预防眼科病患的微小RNA模拟化合物，编码miR-96，miR-182和/或miR-183的表达载体，其组合物，和其方法。本发明还考虑miR-96，miR-182和/或miR-183模拟化合物和编码miR-96，miR-182和/或miR-183的表达载体在治疗，改善，或预防其他感觉器官(例如耳部)的疾病或病症中的用途。
根据本发明的微小RNA模拟化合物包含第一链和第二链，其中第一链包含成熟的miR-96，miR-182或miR-183序列，并且第二链包含与第一链基本上互补并具有至少一个修饰的核苷酸的序列，其中微小RNA模拟化合物模拟miR-96，miR-182或miR-183微小RNA的活性。本文所用的术语“微小RNA激动剂”指合成的微小RNA模拟化合物或编码miR-96，miR-182和/或miR-183的表达载体。在整个披露中，术语“第一链”可以与术语“反义链”或“引导链”互换使用；并且术语“第二链”可以与术语“有义链”或“过客链(passenger strand)”互换使用。
合成的微小RNA模拟化合物
在一个实施方案中，微小RNA模拟化合物的第一链包含约20至约28个核苷酸，并且第二链包含约18至约26个核苷酸。在各种实施方案中，第一链可以包含约18、19、20、21、22、23、24、25、26、27，或28个核苷酸，并且第二链可以包含约20、21、22、23、24、25，或26个核苷酸。在某些实施方案中，第一链包含含有成熟的miR-96,miR-182,或miR-183序列的约22至约26个核苷酸，并且第二链包含含有与第一链完全或基本互补的序列的约20至约24个核苷酸。在其他实施方案中，第一链包含含有成熟的miR-96,miR-182,或miR-183序列的约22至约26个核苷酸，并且第二链包含含有与第一链完全或基本互补的序列的约20至约26个核苷酸。
形成微小RNA模拟化合物的第一链和第二链的核苷酸可以包含核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，修饰的核苷酸及其组合。在某些实施方案中，微小RNA模拟化合物的第一链和第二链包含核糖核苷酸和/或修饰的核糖核苷酸。术语“修饰的核苷酸”是指核碱基和/或糖部分相对于未修饰的核苷酸是修饰的核苷酸。
在某些实施方案中，微小RNA模拟化合物具有第一链或反义链和第二链或有义链，所述第一链包含序列与成熟的miR-96，miR-182或miR-183序列的全部或部分相同的“miRNA区域”，并且第二链或有义链具有序列与miRNA区的序列约70％至约100％互补的“互补区域”。术语“miRNA区域”指miRNA模拟化合物的第一链上的区域，其与成熟的、天然存在的miR-96，miR-182或miR-183序列的整个序列至少约75、80、85、90、95，或100％相同，包括其间的所有整数。在某些实施方案中，miRNA区域与成熟的、天然存在的miRNA(例如小鼠，人，或大鼠miR-96，miR-182或miR-183序列)的序列是约或至少约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99，或100％相同。例如，在一些实施方案中，miRNA区域与成熟的、天然存在的miRNA的序列(如小鼠、人，或大鼠miR-96,miR-182,或miR-183序列)是约或至少约99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99，或100％相同。或者，如通过本领域公知的序列比对算法和方法比较，miRNA区域可以包含与成熟的、天然存在的miRNA相同的18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个核苷酸位置。应当理解，与成熟的、天然存在的miRNA的序列相比，第一链的miRNA区域的序列可以包括核苷酸的修饰。例如，如果成熟的，天然存在的miRNA序列在特定位置处包含胞苷核苷酸，则模拟化合物的第一链的miRNA区域可以在对应位置处包含修饰的胞苷核苷酸，例如2’-含氟胞苷，或者如果成熟的天然存在的miRNA序列在特定位置处包含尿苷核苷酸，则模拟化合物的第一链的miRNA区域可以在对应位置处包含修饰的尿苷核苷酸，如2’-含氟尿苷，2’-O-甲基-尿苷，5-氟尿嘧啶，或4-硫尿嘧啶。即使第一链的miRNA区域的序列包含此类修饰的核苷酸，该序列仍被认为与成熟的天然存在的miRNA序列的序列相同，只要被修饰的核苷酸具有与成熟的天然存在的miRNA序列中存在的核苷酸相同的碱基配对能力即可。在一些实施方案中，第一链可以包括5’末端残基修饰。例如第一链可以具有5’末端单磷酸。
术语“互补区”是指miRNA模拟化合物第二链上的区域，其与第一链上的miRNA区域的序列至少约70％互补。例如，互补区与miRNA区域的序列至少约70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99，或100％(包括其间的所有值)互补。在某些实施方案中，第二链互补区的约18、19、20、21、22，或23个核苷酸可以与第一链互补。在一些实施方案中，第二链的互补区包含相对于第一链的miRNA区域的约1、2、3、4，或5个错配。也就是说，第一链的miRNA区域和第二链的互补区之间的多达1、2、3、4，或5个核苷酸可以不是互补的。在一个实施方案中，错配是连续的，并且可以产生凸起。在另一个实施方案中，错配不是连续的，并且可能会分布在整个互补区。在又一实施方案中，多达1、2、3，或4个错配可以是连续的，创建凸起，并且剩余的错配可以分布于整个互补区。
在一些实施方案中，模拟化合物的第一链和/或第二链可以包含在链的5’或3’端的突出端。在某些实施方案中，第一链包含相对于第二链的3’突出端，即延伸超出双链体区域的单链区域。在一些实施方案中，第二链包含相对于第一链的3’突出端。第一链或第二链的3’突出端可以在约1个核苷酸至约4个核苷酸的范围内。在某些实施方案中，第一链或第二链的3’突出端可以包含1或2个核苷酸。在一些实施方案中，包含3’突出端的核苷酸通过硫代磷酸酯连接来连接。包含3’突出端的核苷酸可以包括核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，经修饰的核苷酸，或其组合。在某些实施方案中，第一链或第二链中的3’突出端包含两个核糖核苷酸。在其他实施方案中，第一链或第二链中的3’突出端包含两个修饰的核糖核苷酸。在又一实施方案中，第一链或第二链中的3’突出端包含一个核糖核苷酸和一个修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，突出端可以存在于第一链或第二链的5’末端。5’突出端可以包含约1至4个核苷酸。与3’突出端类似，5’突出端可以包含核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，经修饰的核苷酸，或其组合。在一些实施方案中，包含5’突出端的核糖核苷酸可以通过硫代磷酸酯连接来连接。在一些实施方案中，miRNA模拟化合物可以是发夹(即具有5’和3’末端的单链多核苷酸)，其中当单链自身折回时，末端之一可以产生突出端。在这些实施方案中，单链包含可以被接头区域分隔的miRNA区域和互补区域。此类单链miRNA模拟化合物可以具有更大的长度范围，例如约55至约100个核苷酸。单链miRNA模拟化合物可以含有基本上对应于接头区域的未配对的环。
从上述说明可以理解，微小RNA模拟化合物的第一链或反义链可以包含成熟的天然存在的微小RNA的整个序列或其一部分，并且可以包含不是成熟的miRNA序列的部分的额外的核苷酸。例如模拟miR-96活性的根据本发明的模拟化合物的第一链可以包含SEQ IDNOs:1,2,或3的整个序列或部分序列(如SEQ ID NOs:1,2,或3的约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个，或22个核苷酸)和多至约4至6个额外的核苷酸，其不是成熟的miR-96序列的部分。还应理解，包含成熟的天然存在的微小RNA的整个或部分序列和多至约4至6个额外的核苷酸的模拟化合物仍然保持模拟微小RNA的活性或功能的能力。还应理解，包含成熟的天然存在的微小RNA序列的第一链的序列可以包括对应于成熟的、天然存在的微小RNA中存在的核苷酸的修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供了微小RNA模拟化合物，其包含含有成熟的miR-96，miR-182或miR-183序列的约22至约26个核糖核苷酸的第一链；和包含基本上与第一链互补并具有至少一个经修饰的核苷酸的序列的约20至约24个核糖核苷酸的第二链，其中所述第一链具有相对于所述第二链突出端的3’核苷酸。在一些实施方案中，本发明提供了包含第一链和第二链的微小RNA模拟化合物，所述第一链为包含成熟的miR-96，miR-182或miR-183序列的约22至约26个核糖核苷酸，其中所述第二链为约20至约26个核糖核苷酸，其包含与第一链基本互补且具有至少一个经修饰的核苷酸的序列，其中第二链具有相对于第二链的3’核苷酸突出端。术语“基本互补”意指第二链的序列与第一链的序列至少约75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99，或100％(包括其间的所有值)互补，或者第二链的序列含有相对于第一链的序列的多至约1、2、3、4、5，或6个错配。
在某些实施方案中，根据本发明的miR-96模拟化合物包含含有SEQ ID NOs:1,2,或3的序列的约22至约26个核苷酸，和基本上与第一链互补并具有至少一个经修饰的核苷酸的约20至约24个核苷酸的第二链，其中第一链具有相对于第二链的3’核苷酸突出端。在一些实施方案中，第二链可以包含约20至约26个核苷酸并且可以包括相对于第一链的3’或5’核苷酸突出端。在本公开中，叙述“SEQ ID NOs.X,Y,或Z的序列”的语言涵盖将天然存在的核苷酸替换为相应的修饰的核苷酸的所有序列。例如，该语言涵盖其中用修饰的腺苷替换腺苷；用修饰的尿苷、胸苷，或修饰的胸苷替换尿苷；用修饰的鸟苷替换鸟苷；或用修饰的胞苷替换胞苷的序列。
在某些实施方案中，根据本发明的miR-96模拟化合物包含含有以下序列的第一链：5’-rUrUfUrGrGfCrAfCfUrArGfCrAfCrAfUfUfUfUfUrGfCfUsrUsrU-3’(SEQ ID NO:10)，和基本上与第一链互补(如约85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,或100％(包括其间的所有值)互补)的第二链。在一个实施方案中，miR-96模拟化合物的第二链包含以下序列：5’-mAmGmCrArArArAmUmUrGrArGmCmUrArGmUrGmCrGrArArA-3’(SEQ ID NO:11)。在另一个实施方案中，miR-96模拟化合物的第二链包含以下序列：5’-mAmGmCrArArArArAmUrGmUrGmCmUrArGmUrGmCmCrArArA-3’(SEQ ID NO:12)。如本文所用，碱基符号(如A、U、G、C)前的“m”表示2’-O-甲基修饰的核苷酸，碱基符号前的“r”表示未修饰的核糖核苷酸(即2’-OH)，碱基符号前的“f”表示2’-含氟核苷酸，并且“s”表示硫代磷酸酯连接。除非另有说明，反义链和有义链中的核苷酸通过磷酸二酯连接来连接。在一些实施方案中，根据本发明的miR-96模拟化合物包含包含选自SEQ ID NOs:10和26-29的序列的第一链。在一些实施方案中,根据本发明的miR-96模拟化合物包含包含选自SEQ ID NOs:11-14和30-34的序列的第二链。
在某些实施方案中，根据本发明的miR-96模拟化合物包含含有SEQ ID NOs:1,2,3,或10的约20至约26个核糖核苷酸的第一链，和含有基本上与第一链互补并且具有至少一个经修饰的核苷酸的序列的约20至24个核糖核苷酸的第二链，其中第一链具有相对于第二链的3’核苷酸突出端。在某些实施方案中，miR-96模拟化合物的第二链包含SEQ ID NO:11或12的序列。在一些实施方案中，根据本发明的miR-96模拟化合物包含含有SEQ ID NOs:1,2,3,或10的约22至约26个核糖核苷酸的第一链，和含有基本上与第一链互补并且具有至少一个经修饰的核苷酸的序列的约20至26个核糖核苷酸的第二链，其中第二链具有相对于第一链的3’核苷酸突出端。
在一些实施方案中，miR-96模拟化合物包含含有SEQ ID NO:10的约20至约26个核糖核苷酸的第一链，和含有SEQ ID NO:11的序列的约20至24个核糖核苷酸的第二链，其中第一链具有相对于第二链的3’核苷酸突出端。在另一个实施方案中，miR-96模拟化合物包含含有SEQ ID NO:10的约20至约26个核糖核苷酸的第一链，和含有SEQ ID NO:12的序列的约20至24个核糖核苷酸的第二链，其中第一链具有相对于第二链的3’核苷酸突出端。在又一实施方案中，miR-96模拟化合物包含含有SEQ ID NO:10的约20至约26个核糖核苷酸的第一链，和含有SEQ ID NO:13(5’-mA.mG.mC.rA.rA.rA.rA.mU.mU.rG.rA.rG.mC.mU.rA.rG.mU.rG.mC.rG.rA.r A.rA.chol6-3’)的序列的约20至24个核糖核苷酸的第二链，其中第一链具有相对于第二链的3’核苷酸突出端。在一些实施方案中,miR-96模拟化合物的第二链是约20至约24个核苷酸，并包含SEQ ID NO:14(5’-mA.mG.mC.rA.rA.rA.rA.mU.mU.rG.rA.rG.mC.mU.rA.rG.mU.rG.mC.rG.rA.r A.rAs.chol6-3’)的序列。在该实施方案中，第二链的寡核苷酸序列通过硫代磷酸酯连接附接至胆固醇(载体分子)。
在一些实施方案中，miR-96模拟化合物包含不超过25、26、27或28个核苷酸长且包含SEQ ID NOs:1,2,3,或10的序列的第一链。在一些其他实施例中，miR-96模拟化合物包含不超过26、27或28个核苷酸长且包含SEQ ID NOs:1,2,或3的序列的第一链，其中以5’至3’方向位于位置3(U),6(C),8(C),9(U),12(C),14(C),16(U),17(U),18(U),19(U),20(U),22(C),和/或23(U)处的核苷酸相对于SEQ ID NOs:1,2,或3是修饰的。在某些实施方案中，miR-96模拟化合物包含具有SEQ ID NOs:1,2,3,或10的序列的第一链，和除了从第二链的3’末端起位于核苷酸位置4,13,和/或16处以外与第一链互补的第二链。在一些实施方案中，miR-96模拟化合物的第二链与SEQ ID NOs:1,2,3,或10的序列互补，并包含以5’至3’方向在一个或多个选自下组的位置处修饰的核苷酸：1(A)、2(G)、3(C)、8(U)、9(U)、13(C)、14(U)、17(U),和19(C)。
在某些实施方案中，根据本发明的miR-182模拟化合物包含含有SEQ ID NOs:4,5,或6的序列的约22至约26个核苷酸的第一链，和与第一链基本上互补并且具有至少一个修饰的核苷酸的第二链，其中所述第一链具有相对于第二链的3’核苷酸突出端。在一些实施方案中，第二链可以包含约20至约26个核苷酸并可以包括相对于第一链的3’或5’核苷酸突出端。在某些实施方案中，根据本发明的miR-182模拟化合物包含含有以下序列的第一链：5’-rUrUfUrGrGfCrArAfUrGrGfUrArGrArAfCfUfCrAfCrAfCfUsrUsrU-3’(SEQ ID NO:15)和与所述第一链基本互补(如约85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,或100％(包括其间的所有值)互补)的第二链。在一个实施方案中，miR-182模拟化合物的第二链包含以下序列：5’-mAmGmUrGmUrGrArGrAmUmCrArAmCmCrAmUmUrGmCrGrArArA-3’(SEQ ID NO:16)。在另一个实施方案中，miR-182模拟化合物的第二链包含以下序列：5’-mAmGmUrGmUrGrArGmUmUmCmUrAmCmCrAmUmUrGmCmCrArArA-3’(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，根据本发明的miR-182模拟化合物包含含有选自SEQ ID NOs:15和35-38的序列的第一链。在一些实施方案中，根据本发明的miR-182模拟化合物包含含有选自SEQ ID NOs:16-19和39-43的序列的第二链。
在一些实施方案中，miR-182模拟化合物包含含有SEQ ID NO:4,5,6,或15的序列的约20至约26个核糖核苷酸的第一链，和与第一链基本上互补并且具有至少一个修饰的核苷酸的约20至约24个核糖核苷酸的第二链，其中所述第一链具有相对于第二链的3’核苷酸突出端。在某些实施方案中，miR-182模拟化合物的第二链包含SEQ ID NO:16或17的序列。在一些实施方案中，miR-182模拟化合物包含含有SEQ ID NO:4,5,6,或15的序列的约22至约26个核糖核苷酸的第一链，和含有与第一链基本上互补并且具有至少一个修饰的核苷酸的序列的约20至26个核糖核苷酸的第二链，其中所述第二链具有相对于第一链的3’或5’核苷酸突出端。
在一些实施方案中，miR-182模拟化合物包含含有SEQ ID NO:15的序列的约22至约26个核糖核苷酸的第一链，和含有SEQ ID NO:16的序列的约20至约24个核糖核苷酸的第二链，其中第一链具有相对于第二链的3’核苷酸突出端。在另一个实施方案中，miR-182模拟化合物包含含有SEQ ID NO:15的序列的约22至约26个核糖核苷酸的第一链，和含有SEQ ID NO:17的序列的约20至24个核糖核苷酸的第二链，其中第一链具有相对于第二链的3’核苷酸突出端。在又一实施方案中，miR-182模拟化合物包含含有SEQ ID NO:15的序列的约22至约26个核糖核苷酸的第一链，和含有SEQ ID NO:18(5’-mA.mG.mU.rG.mU.rG.rA.rG.rA.mU.mC.rA.rA.mC.mC.rA.mU.mU.rG.mC.rG.rA.rA.rA.chol6-3’)的序列的约20至24个核糖核苷酸的第二链，其中第一链具有相对于第二链的3’核苷酸突出端。在一些实施方案中,miR-182模拟化合物的第二链是约20至约24个核苷酸，并包含SEQ ID NO:19(5’-mA.mG.mU.rG.mU.rG.rA.rG.rA.mU.mC.rA.rA.mC.mC.rA.mU.mU.rG.mC.rG.rA.rA.rAs.chol6-3’)的序列。在该实施方案中，第二链的寡核苷酸序列通过硫代磷酸酯连接附接至胆固醇(载体分子)。
在一些实施方案中，miR-182模拟化合物包含不超过26、27或28个核苷酸长且包含SEQ ID NOs:4,5,6,或15的序列的第一链。在一些其他实施方案中，miR-182模拟化合物包含不超过27或28个核苷酸长且包含SEQ ID NOs:4,5,或6的序列的第一链，其中以5’至3’方向位于位置3(U),6(C),9(U),12(U),17(C),18(U),19(C),21(C),23(C),和/或24(U)处的核苷酸相对于SEQ ID NOs:4,5,或6是修饰的。在某些实施方案中，miR-182模拟化合物包含具有SEQ ID NOs:4,5,6,或15的序列的第一链，和除了从第二链的3’末端起位于核苷酸位置4,13,和/或16处以外与第一链互补的第二链。在一些实施方案中，miR-182模拟化合物的第二链与SEQ ID NOs:4,5,6,或15的序列互补，并包含以5’至3’方向在一个或多个选自下组的位置处修饰的核苷酸：1(A),2(G),3(U),5(U),10(U),11(C),14(C),15(C),17(U),18(U),和20(C)。
在某些实施方案中，根据本发明的miR-183模拟化合物包含含有SEQ ID NOs:7,8,或9的序列的约22至约26个核苷酸的第一链，和与第一链基本上互补并且具有至少一个修饰的核苷酸的第二链，其中所述第一链具有相对于第二链的3’核苷酸突出端。在一些实施方案中，第二链可以包含约20至约26个核苷酸并可以包括相对于第一链的3’或5’核苷酸突出端。在某些实施方案中，根据本发明的miR-183模拟化合物包含含有以下序列的第一链：5’-rUrAfUrGrGfCrAfCfUrGrGfUrArGrArAfUfUfCrAfCfUsrUsrU-3’(SEQ ID NO:20)和与所述第一链基本互补(如约85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,或100％(包括其间的所有值)互补)的第二链。在一个实施方案中，miR-183模拟化合物的第二链包含以下序列：5’-mAmGmUrGrArArAmUmCrArAmCmCrArGmUrGmCrGrAmUrA-3’(SEQ ID NO:21)。在另一个实施方案中，miR-183模拟化合物的第二链包含以下序列：5’-mAmGmUrGrArAmUmUmCmUrAmCmCrArGmUrGmCmCrAmUrA-3’(SEQ ID NO:22)。在一些实施方案中，根据本发明的miR-183模拟化合物包含含有选自SEQ ID NOs:20和44-47的序列的第一链。在一些实施方案中，根据本发明的miR-183模拟化合物包含含有选自SEQ ID NOs:21-25和48-52的序列的第二链。
在一些实施方案中，miR-183模拟化合物包含含有SEQ ID NO:7,8,9,或20的序列的约22至约26个核糖核苷酸的第一链，和含有与第一链基本上互补并且具有至少一个修饰的核苷酸的序列的约20至约24个核糖核苷酸的第二链，其中所述第一链具有相对于第二链的3’核苷酸突出端。在某些实施方案中，miR-183模拟化合物的第二链包含SEQ ID NO:21或22的序列。在一些实施方案中，根据本发明的miR-183模拟化合物包含含有SEQ ID NO:7,8,9,或20的序列的约22至约26个核糖核苷酸的第一链，和含有与第一链基本上互补并且具有至少一个修饰的核苷酸的序列的约20至26个核糖核苷酸的第二链，其中所述第二链具有相对于第一链的3’或5’核苷酸突出端。
在一些实施方案中，miR-183模拟化合物包含含有SEQ ID NO:20的序列的约22至约26个核糖核苷酸的第一链，和含有SEQ ID NO:21的序列的约18至22个核糖核苷酸的第二链，其中第一链具有相对于第二链的3’核苷酸突出端。在另一个实施方案中，miR-183模拟化合物包含含有SEQ ID NO:20的序列的约22至约26个核糖核苷酸的第一链，和含有SEQ ID NO:22的序列的约18至约22个核糖核苷酸的第二链，其中第一链具有相对于第二链的3’核苷酸突出端。在又一实施方案中，miR-183模拟化合物包含含有SEQ ID NO:20的序列的约22至约26个核糖核苷酸的第一链，和含有SEQ ID NO:23(5’-mAmGmUrGrArArAmUmCrArAmCmCrArGmUrGmCrGrAmUrA.chol6-3’)或SEQ ID NO:24(5’-mAmGmUrGrArAmUmUmCmUrAmCmCrArGmUrGmCmCrAmUrA.chol6-3’)的序列的约18至22个核糖核苷酸的第二链，其中第一链具有相对于第二链的3’核苷酸突出端。在一些实施方案中,miR-183模拟化合物的第二链包含SEQ ID NO:25(5’-mAmGmUrGrArArAmUmCrArAmCmCrArGmUrGmCrGrAmUrAs.chol6-3’).的序列。在该实施方案中，第二链的寡核苷酸序列通过硫代磷酸酯连接附接至胆固醇(载体分子)。
在一些实施方案中，miR-183模拟化合物包含不超过25、26、27或28个核苷酸长且包含SEQ ID NOs:7,8,9,或20的序列的第一链。在一些其他实施例中，miR-183模拟化合物包含不超过25、26、27或28个核苷酸长且包含SEQ ID NOs:7,8,或9的序列的第一链，其中以5’至3’方向位于位置3(U),6(C),8(C),9(U),12(U),17(U),18(U),19(C),21(C),和/或22(U)处的核苷酸相对于SEQ ID NOs:7,8,或9是修饰的。在某些实施方案中，miR-183模拟化合物包含具有SEQ ID NOs:7,8,9,或20的序列的第一链，和除了从第二链的3’末端起位于核苷酸位置4,13,和/或16处以外与第一链互补的第二链。在一些实施方案中，miR-183模拟化合物的第二链与SEQ ID NOs:7,8,9,或20的序列互补，并包含以5’至3’方向在一个或多个选自下组的位置处修饰的核苷酸：1(A),2(G),3(U),7(U),8(U),9(C),10(U),12(C),13(C),16(U),18(C),19(C),和21(U)。
本文公开的特定微小RNA模拟化合物总结在下表1中。然而，本发明不限于这些特定的模拟化合物，并且可以根据本说明书中提供的指导制备的其他模拟化合物也包括在本发明中。
表1：miR-96/182/183模拟物
可以用于本发明微小RNA模拟化合物的经修饰的核苷酸可以包括具有碱基修饰或取代的核苷酸。在RNA中的天然的或未经修饰的碱基是嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(C)和尿嘧啶(U)(DNA为胸腺嘧啶(T))。相比之下，经修饰的碱基也称为杂环碱基部分，包括其他合成的和天然的核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤素尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代，8-氨基，8-硫醇，8-硫代烷基，8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代(包括5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶)、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
在一些实施方式中，微小RNA模拟化合物可以具有带有经修饰的糖部分的核苷酸。典型的经修饰的糖包括碳环或非环糖，在其2’、3’或4’位置具有一个或多个取代的糖以及具有代替糖中的一个或多个氢原子的取代的糖。在某些实施方式中，通过在2’位置具有取代基团对糖进行修饰。在附加的实施方式中，通过在3’位置具有取代基团对糖进行修饰。在其他实施方式中，通过在4’位置具有取代基团对糖进行修饰。糖可以在一个以上这些位置具有取代，或者RNA分子可以具有在一个位置带有糖修饰的一个或多个核苷酸，其还可以具有在不同位置带有糖修饰的一个或多个核苷酸也是可以预期的。
miRNA模拟化合物中涉及的糖修饰包括但不限于选自下组的取代基：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代的或未被取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。在一些实施方案中，这些基团可以选自：O(CH2)xOCH3、O((CH2)xO)yCH3、O(CH2)xNH2、O(CH2)xCH3、O(CH2)xONH2，和O(CH2)xON((CH2)xCH3)2，其中x和y为1至10。
在一些实施方式中，miRNA模拟化合物具有选自下组的糖取代基：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、Cl、Br、CN、OCN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷氨基或类似取代基。在一个实施方式中，修饰包括2’-甲氧基乙氧基(2’-O-CH2CH2OCH3，还将其称为2’-O-(2-甲氧基乙基)或2’-MOE)，即烷氧基烷氧基基团。另一种修饰包括2’-二甲基氨氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2’-DMAOE以及2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称为2’-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2’-DMAEOE)，即2’-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2。
额外的糖取代基包括烯丙基(-CH2-CH＝CH2)、-O-烯丙基、甲氧基(-O-CH3)、氨基丙氧基(-OCH2CH2CH2NH2)，和氟(F)。2’位置(2’-)上的糖取代基可以在阿拉伯糖基(arabino)(上)位或核糖基(ribo)(下)位。一个2’-阿拉伯糖修饰是2’-F。也可以在糖部分上的其它位置进行其它类似的修饰，特别是在3’末端核苷酸上的糖的3’位置或者在2’-5’连接寡核苷酸和5’末端核苷酸的5’位置中。
在某些实施方式中，糖修饰是2’-O-烷基(例如2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基)、2’-卤素(例如2’-氟、2’-氯、2’-溴)和4’硫代修饰。例如，在一些实施方案中，miR-96,miR-182,或miR-183模拟化合物的第一链包含一个或多个2’氟核苷酸。在另一个实施方式中，模拟化合物的第一链不具有经修饰的核苷酸。在又一个实施方式中，miR-96,miR-182,或miR-183模拟化合物的第二链包含一个或多个2’-O-甲基修饰的核苷酸。
本发明微小RNA模拟化合物的第一链和第二链还可以包含骨架修饰，如一个或多个硫代磷酸酯，吗啉代或膦酰基羧酸酯键(参见例如美国专利号6,693,187和7,067,641，其全部内容通过引用并入本申请)。例如，在一些实施方式中，在第一链中包含3’突出端的核苷酸通过硫代磷酸酯键连接。
在一些实施方式中，微小RNA模拟化合物与载体分子缀合，如类固醇(胆固醇)、维生素、脂肪酸、碳水化合物或糖苷、肽或其他小分子配体，以利于体内递送和稳定性。优选地，载体分子在其3’或5’端通过接头或间隔基团连接至微小RNA模拟化合物的第二链。在不同实施方式中，载体分子是胆固醇、胆固醇衍生物、胆酸或胆酸衍生物。在美国专利号7,202,227(其全部内容通过引用并入本申请)中公开的载体分子的用途也是能够预期的。在某些实施方式中，载体分子是胆固醇并且其通过至少6个碳的接头连接至第二链的3’或5’端。在一个实施方式中，载体分子通过6个或9个碳的接头连接至第二链的3’端。在一些实施方式中，接头是可裂解的接头。在不同实施方式中，接头包含基本上为直链的烃部分。烃部分可以包含从约3至约15个碳原子并且其可以通过相对非极性的基团如醚或硫醚键与胆固醇缀合。在某些实施方式中，烃接头/间隔包含任选取代的C2至C15饱和的或非饱和的烃链(例如亚烷基或亚烯基)。可以将在美国授权前公开号2012/0128761(其全部内容通过引用并入本申请)中描述的多种接头/间隔基团用于本发明中。
编码miR-96，miR-182和/或miR-183的表达载体
包含编码miR-96，miR-182和/或miR-183的至少一个基因的表达载体包括在具有或不具有在miR-96，miR-182和/或miR-183的基因组背景中的侧翼序列的情况下，miR-96，miR-182和/或miR-183天然编码序列的部分足以产生成熟的miR-96，miR-182和/或miR-183，从而调节至少一种miR-96，miR-182和/或miR-183靶物的表达。例如，足够的部分可以包括大约21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或100个核苷酸，包括其值和范围。在一个实施方案中，足够的部分至少含有成熟的miR的序列。在某些实施方案中，足够的部分至少包括miR的发夹序列。在某些实施方案中，足够的部分包括全长miR。可以使用本领域中的常规方法确定足够的部分。应当理解，编码miR-96，miR-182和/或miR-183的序列将与所提供的RNA序列互补，并且当互补DNA链时包括T而非U。
“载体”是指能够在宿主细胞中复制的核酸分子，例如质粒、粘粒，或噬菌体。在一个实施方案中，载体是表达载体，其是重组或合成产生的能够在宿主细胞中转录核酸分子的一系列特定核酸元件的核酸构建体。通常，将表达置于某些调节元件的控制下，包括组成型或诱导型启动子，组织优选的调控元件，反向末端重复序列和增强子。
在一个实施方案中，表达载体是基于AAV的载体系统，其是调节RNA递送的特别有吸引力的平台(Franich et al.,Mol Ther 16,947-956,2008and McCarty,Mol Ther 16,1648-1656,2008)。当以病毒载体递送时，miRNA不断被转录，允许在目标组织中持续的高水平表达，而不需要重复给药。此外，组织特异性启动子的使用可以将该表达限制在特定的感兴趣细胞类型，甚至在全身递送病毒的情况下。与逆转录病毒递送系统相比，因为病毒基因组主要作为附加体持续存在，所以DNA病毒如AAV携带插入突变的风险实质性降低(Schneppet al.,J Virol 77,3495-3504,2003)。此外，多个AAV血清型的可用性允许有效靶向许多感兴趣的组织(Gao et al.,Proc Natl Acad Sci USA 99,11854-11859,2002；McCarty,Mol Ther 16,1648-1656,2008)。最后，AAV的一般安全性已得到很好的记录，使用该平台的临床试验已经在进行中(Carter,Hum Gene Ther 16,541-550,2005；Maguire et al.,NEngl J Med 358,2240-2248,2008；以及Park et al.,Front Biosci 13,2653-2659,2008)。AAV载体技术的最新进展包括增强治疗基因表达的自身互补基因组和促进递送后有效转导的非人灵长类动物AAV血清型。由于它们的尺寸小，调节RNA特别适合于AAV介导的递送。
由本发明提供的表达载体可以包括编码用于本发明任何方法的功能性miR-96，miR-182和/或miR-183的任何序列。在一些实施方案中，表达载体包括编码pre-miRNA发夹的部分或全部序列的核酸序列。在某些实施方案中，表达载体包括选自SEQ ID NOs.53-55的核酸序列(表2)。编码功能性miR-96，miR-182和/或miR-183的核酸序列可以以单个簇或两个或三个分开的簇存在。
表2
本发明提供可用于增加miR-96，miR-182或miR-183微小RNA或其任何组合的表达以治疗眼科和耳部疾病的多核苷酸疗法。可以将编码期望序列(例如编码微小RNA)的表达载体递送到具有眼科或耳部疾病的受试者的细胞。核酸分子必须以一定的形式递送到受试者的细胞，在所述形式中它们可以被摄取，并且有利地得到表达，使得可以实现治疗有效的水平。
将多核苷酸递送至根据本发明的细胞的方法包括使用递送系统如脂质体，聚合物，微球，基因治疗载体和裸DNA载体。
转导病毒(例如逆转录病毒，腺病毒，慢病毒和腺伴随病毒)载体可用于体细胞基因治疗，特别是因为它们的高感染效率和稳定的整合和表达。例如，可以将编码核酸分子的多核苷酸克隆到逆转录病毒载体中，并且可以从其内源启动子，从逆转录病毒长末端重复序列或从对感兴趣的靶细胞类型特异的启动子驱动表达。可以使用的其它病毒载体包括例如痘苗病毒，牛乳头瘤病毒或疱疹病毒，例如埃巴病毒(Epstein-Ban Virus)。逆转录病毒是特别很好开发的并已经用于临床应用(美国专利号5,399,346)。病毒载体优选在接受其递送用于治疗应用的细胞中是无复制能力的。然后也可以使用有复制能力的病毒载体。
用于本发明的优选病毒载体包括包括嵌合AAV载体的AAV载体，例如AAV血清型1,2,3,4,5,6,7,8和/或9。多种AAV血清型的可用性允许有效靶向许多感兴趣的组织(Gao etal.,2002；McCarty,2008；美国专利公开2008075737,20080050343,20070036760,20050014262,20040052764,20030228282,20030013189,20030032613,和20020019050，每个通过引用并入本文)。在优选的实施方案中，本发明包括使用自身互补的(sc)AAV载体，其例如记载于美国专利公开20070110724和20040029106，以及美国专利号7,465,583和7,186,699中(所有这些都通过引用并入本文)。用于制备用于表达微小RNA的AAV的示例性方法描述于Knabel et al.,PLoS One,10(4):e0124411,2015和Xie et al.,Semin LiverDis,35(1):81-88,2015(两者都通过引用并入本文)。
还可以使用非病毒方法将治疗性核酸分子导入具有眼科或耳部疾病的患者的细胞中。例如，可以通过在以下的存在下施用核酸将编码miR-96，miR-182和/或miR-183微小RNA的表达载体导入细胞：脂质体转染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、DEAE-葡聚糖、采用多胺转染试剂的转染的转染、细胞超声处理、使用高速微粒的基因轰击，和受体介导的转染。
用于多核苷酸疗法的核酸分子表达可以来自任何合适的启动子(如人类巨细胞病毒(CMV),猿病毒40(SV40),金属硫蛋白,U1a1snRNA,U1b2snRNA,组蛋白H2,和组蛋白H3启动子)，并且由任何适当的哺乳动物调节元件调节。可以使用组织特异性或普遍表达的启动子来指导表达。可用于治疗眼科疾病的组织特异性启动子包括但不限于视紫红质启动子、钙结合蛋白5(CABP5)启动子，和细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)启动子。如果需要，已知优先指导特定细胞类型中基因表达的增强子可用于指导核酸的表达。所使用的增强子可以包括但不限于表征为组织或细胞特异性增强子的那些。
在一个实施方案中，用于表达miR-96，miR-182或miR-183的激动剂的表达载体包含可操作地连接至编码激动剂的多核苷酸序列的启动子和终止子，其中表达的激动剂包含含有miR-96(SEQ ID NOs:1,2,或3),miR-182(SEQ ID NOs:4,5,或6),或miR-183(SEQ IDNOs:7,8,或9)的成熟序列的第一链，和与第一链基本互补的第二链。在另一个实施方案中，用于表达miR-96，miR-182或miR-183的激动剂的表达载体包含可操作地连接至编码pre-miRNA序列的多核苷酸序列的启动子和终止子，其中所述表达的激动剂包含含有成熟miRNA序列的发夹形式的多核苷酸序列。在又一实施方案中，用于表达miR-96，miR-182或miR-183的激动剂的表达载体包含可操作地连接至编码miR-96，miR-182或miR-183模拟化合物的反义链的第一多核苷酸序列的第一启动子和第一终止子，以及可操作地连接至编码miR-96,miR-182,或miR-183模拟化合物的有义链的第二多核苷酸序列的第二启动子和第二终止子。如本文所用的术语“可操作地连接”或“在转录控制下”意指启动子和终止子相对于多核苷酸处于正确的位置和取向，以控制RNA聚合酶的转录起始和终止以及多核苷酸的表达。
如本文所用，“启动子”指由细胞的合成机器或导入的合成机器识别，启动基因的特异性转录所需的DNA序列。合适的启动子包括但不限于RNA pol I，pol II，pol III和病毒启动子(如人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子，SV40早期启动子，和劳斯肉瘤病毒长末端重复)。在一个实施方案中，启动子是组织特异性启动子。特别感兴趣的是视网膜细胞特异性启动子，更具体地，是杆和锥体特异性启动子。这些包括视紫红质启动子、锥视蛋白启动子、钙结合蛋白5(CABP5)启动子、细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)启动子、光感受器间类视黄醇结合蛋白(IRBP)启动子、抑制蛋白启动子，和视紫红质激酶启动子。如本文所用，“终止子”指由细胞的合成机器或导入的合成机器识别，终止基因的特异性转录所需的DNA序列。在一个实施方案中，包含聚腺苷酸化信号/单元的序列作用为转录终止子。也考虑使用其他转录终止子。
在某些实施方案中，与编码miR-96，miR-182或miR-183的激动剂的多核苷酸可操作地连接的启动子可以是诱导型启动子。诱导型启动子是本领域已知的，包括但不限于，四环素启动子、金属硫蛋白IIA启动子、热休克启动子、类固醇/甲状腺激素/视黄酸应答元件、腺病毒晚期启动子，和诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒LTR。
治疗方法
在各种实施方案中，本发明提供了在有需要的受试者中治疗或预防眼科病患的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的miR-96，miR-182和/或miR-183的至少一种激动剂。在一些实施方案中，在有需要的受试者中治疗或预防眼科病患的方法包括向所述受试者施用治疗有效量的至少两种激动剂，例如miR-96和miR-182的激动剂，miR-96和miR-183的激动剂，或miR-182和miR-183的激动剂。在其他实施方案中，在有需要的受试者中治疗或预防眼科病患的方法包括对所述受试者施用治疗有效量的所有三种激动剂，即miR-96，miR-182和miR-183的激动剂。在一些实施方案中，miR-96，miR-182或miR-183的激动剂是双链寡核苷酸，其包含含有成熟的miR-96,miR-182,或miR-183的序列的第一链和包含基本上与第一链互补的序列的第二链，其中所述链中的至少一个包含一个或多个修饰的核苷酸。本文描述的任何微小RNA模拟化合物可用于治疗或预防有需要的受试者中的眼科病患的方法。在一些实施方案中，miR-96，miR-182或miR-183的激动剂是表达载体，该表达载体包含编码miR-96，miR-182或miR-183天然编码序列的足够部分以产生成熟的miR-96,miR-182,或miR-183的多核苷酸序列。在一个实施方案中，表达载体是重组AAV载体。
“治疗有效量或剂量”是足以产生有益或期望的临床结果的量。例如，miR-96，miR-182和/或miR-183的微小RNA模拟化合物的治疗有效量包括足以维持或改善视敏度或足以减少或防止视力丧失的量，或者足以减少或预防感光细胞死亡的量。在另一个实施方案中，治疗有效量是足以增加受试者感光细胞中一个或多个光传导基因表达的量。
可以通过施用miR-96，miR-182和miR-183的一种或多种激动剂来治疗的眼科病患包括由感光细胞的损伤和/或死亡引起的任何病症。术语“感光细胞”包括视杆，视锥，神经节细胞以及存在于眼中的其它细胞(例如视网膜细胞)。在某些实施方案中，由于感光细胞的损伤或死亡引起的眼科病患包括视网膜脱离、黄斑变性、斯特格氏病、视网膜变性、色素性视网膜炎、夜盲、视网膜毒性、葡萄膜黑素瘤、交感性眼炎和视网膜病变。在某些实施方案中，根据本发明可以治疗的眼科病患是视网膜变性。在一个实施方案中，根据本发明可以治疗的眼科病患是色素性视网膜炎。在另一个实施方案中，用miR-96，miR-182和/或miR-183的激动剂治疗的有需要的受试者可以有夜盲。
在各种实施方案中，向受试者施用至少一种miR-96，miR-182或miR-183的激动剂防止或减缓一个或多个眼科病患的发展和/或进展，并导致改善与这些病症相关的一种或多种症状。例如，在一个实施方案中，施用miR-96，miR-182或miR-183的至少一种激动剂导致改善视敏度。在另一个实施方案中，施用至少一种miR-96，miR-182或miR-183激动剂减少夜盲的体征。在又一实施方案中，施用至少两种激动剂，如miR-96和miR-182的激动剂，miR-96和miR-183的激动剂，或miR-182和miR-183的激动剂导致改善视敏度。在又一实施方案中，施用所有三个激动剂(即miR-96，miR-182和miR-183的激动剂)导致改善视敏度。
在某些实施方案中，本发明提供了在有需要的受试者中改善或恢复视敏度的方法，其包括向受试者施用miR-96，miR-182和/或miR-183的至少一种激动剂。根据本发明，向有需要的受试者全身、局部或局部施用miR-96，miR-182或miR-183的至少一种激动剂导致miR-96，miR-182和/或miR-183在受试者的各种眼细胞中的活性增加，所述眼细胞如视杆、视锥、Müller细胞、水平细胞、双极细胞、无轴突细胞、和/或神经节细胞。
在一个实施方案中，施用miR-96，miR-182和/或miR-183的至少一种激动剂维持或改善感光细胞(如视杆、视锥和/或其他视网膜细胞)的功能，维持或改善视敏度，减少或防止感光细胞死亡，和/或减少或防止视力丧失。在某些实施方案中，施用miR-96，miR-182和/或miR-183的至少一种激动剂维持或增加受试者的感光细胞中一个或多个光传导基因的表达。在施用miR-96，miR-182和/或miR-183的至少一种激动剂后可以上调的一种或多种光传导基因包括恢复蛋白(Revrn)、NRL、抑制蛋白(Sag)、视紫红质(Rho)、转导蛋白(Gnat2)，和磷转导蛋白(PDC)。
在一个实施方案中，使用测试来测量受试者中视力丧失，视敏度和/或视网膜变性，所述测试例如眼运动跟踪(optokinetic tracking，OKT)、视网膜电描记法(electroretinography，ERG)、平均空间频率阈值(SFT)，和测量视网膜的内核细胞层和外核细胞层的厚度。在另一个实施方案中，使用方案(如糖尿病视网膜病变早期治疗研究(“ETDRS”)或与年龄有关的眼科疾病研究(“AREDS”)方案)确定受试者的视敏度。在一些实施方案中，使用修改的ETDRS和/或AREDS方案来测量视敏度，如Ferris et al.,Am JOphthalmol 94:91-96,1982中描述的视敏度的测量。在一个实施方案中，通过以下方案的一个或多个测定受试者的视敏度(1)测量最佳矫正视敏度(BCVA)以及获得的显性折射(manifest refraction)；(2)测量矫正视敏度及有条件显性折射；或(3)没有显性折射的矫正视敏度测量。在本发明的各个方面，向有需要的受试者施用miR-96，miR-182或miR-183的至少一种激动剂导致改善这些眼测试中的一种或多种得分。在一些实施方案中，向受试者施用至少两种激动剂(例如miR-96和miR-182的激动剂，miR-96和miR-183的激动剂或miR-182和miR-183的激动剂)导致改善眼测试中的一种或多种得分。在一些其他实施例中，向受试者施用所有三种激动剂(即miR-96，miR-182和miR-183的激动剂)导致改善眼测试中的一种或多种得分。例如，在一个实施方案中，施用至少一种，至少两种或所有三种miR-96，miR-182和miR-183激动剂的受试者在标准化的视觉测试图表(例如ETDRS表)中的视敏度具有大于3线，4线或5线的视敏度增益。在另一个实施方案中，施用miR-96，miR-182和miR-183的至少一种，至少两种或全部三种激动剂导致受试者阅读标准化视觉测试图表(如糖尿病视网膜病变早期治疗研究图表(“ETDRS图表”))的一个或多个额外字母(在一个实施方案中三个或多个额外字母并且在一些实施方案中15或更多个额外字母)的能力。
在一些实施方案中，本发明提供治疗或预防有需要的受试者中其他感觉器官疾病或病症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的至少一种miR-96，miR-182和/或miR-183的激动剂。例如，在一个实施方案中，本发明提供了治疗或预防耳部疾病或病症的方法，如听力损失，耳鸣，梅尼埃病(Meniere's disease)，耳部感染或由这些病症引起的耳部损伤。在一些实施方案中，在有需要的受试者中治疗或预防耳部疾病的方法包括向受试者施用治疗有效量的至少两种激动剂，例如miR-96和miR-182的激动剂，miR-96和miR-183的激动剂，或miR-182和miR-183的激动剂。在其他实施方案中，在有需要的受试者中治疗或预防耳部疾病的方法包括向受试者施用治疗有效量的所有三种激动剂，即miR-96，miR-182和miR-183的激动剂。在一些实施方案中，miR-96，miR-182或miR-183的激动剂是双链寡核苷酸，其包含含有成熟的miR-96，miR-182或miR-183序列的第一链和包含基本上与第一链互补的序列的第二链，其中所述链中的至少一条包含一个或多个修饰的核苷酸。本文所述的任何微小RNA模拟化合物可用于治疗或预防有需要的受试者的耳部疾病的方法。在一些实施方案中，miR-96，miR-182或miR-183的激动剂是包含多核苷酸序列的表达载体，所述多核苷酸序列编码miR-96，miR-182或miR-183天然编码序列的足够部分以生产成熟的miR-96,miR-182,或miR-183。在一个实施方案中，表达载体是重组AAV载体。
在各种实施方案中，向受试者施用至少一种miR-96，miR-182或miR-183的激动剂预防或减缓一种或多种耳部疾病的发展和/或进展并导致与这些病症相关的一种或多种症状的改善。例如，在一个实施方案中，施用miR-96，miR-182或miR-183的至少一种激动剂导致听力的改善。在另一个实施方案中，施用至少一种miR-96，miR-182或miR-183激动剂改善了耳部感觉细胞的功能。在又一实施方案中，施用至少两种激动剂(例如miR-96和miR-182的激动剂，miR-96和miR-183的激动剂或miR-182和miR-183的激动剂)导致听力和/或耳细胞的功能的改善。在又一实施方案中，施用所有三种激动剂(即miR-96，miR-182和miR-183的激动剂)导致听力和/或耳细胞的功能的改善。
如本文所用，“受试者”或“患者”指任何脊椎动物包括但不限于，人类和其他灵长类动物(例如黑猩猩和其他猿猴类)、农场动物(例如牛，羊，猪，山羊和马)、家畜(例如狗和猫)、实验室动物(例如啮齿动物如小鼠、大鼠，和豚鼠)，以及鸟类(例如家养，野生和猎禽，如鸡、火鸡和其他鹑鸡类、鸭鹅等)。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在其他实施方案中受试者是人。
药物组合物
本发明还提供了药物组合物，其包含治疗有效量的根据本发明的miR-96，miR-182和/或miR-183的一种或多种激动剂和药学上可接受的载体或赋形剂。在一个实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含治疗有效量的根据本发明的miR-96，miR-182和/或miR-183的一种或多种合成微小RNA模拟化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或赋形剂。在其他实施方案中，本发明提供药物组合物包含一种或多种编码miR-96，miR-182和/或miR-183的表达载体和药学上可接受的载体或赋形剂，其中所述表达载体的量提供了治疗有效量的miR-96，miR-182和/或miR-183。
术语“药学上可接受的盐”指通过将化合物(如本文公开的miRNA模拟化合物)与酸或碱组合而制备的盐，所述酸的阴离子或所述碱的阳离子通常认为适合人类摄取。本公开化合物的合适的药学上可接受的酸加成盐包括衍生自无机酸的那些(如盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硼酸、氟硼酸、磷酸、偏磷酸、硝酸、碳酸、磺酸和硫酸)，和有机酸的那些(如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡萄糖酸、乙醇酸、异连硫酸(isothionic acid)、乳酸、乳糖酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、琥珀酸、甲苯磺酸、酒石酸，和三氟乙酸)。
合适的有机酸通常包括，例如，有机酸的脂肪族类、脂环族类、芳香族类、芳脂族类、杂环类、羧基类和磺酸基类。合适的有机酸的具体实例包括乙酸、三氟乙酸、甲酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、葡萄糖酸、二葡糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖醛酸、马来酸、富马酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、邻氨基苯甲酸、甲磺酸、硬脂酸、水杨酸、对羟基苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸、双羟萘酸(embonate)(双羟萘酸)、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、泛酸、甲苯磺酸、2-羟基乙磺酸、磺胺酸、环己基氨基磺酸、海藻酸、β-羟基丁酸、半乳糖酸、半乳糖醛酸、己二酸、藻酸、丁酸、camphorate、樟脑磺酸、环戊烷丙酸、十二烷基硫酸、糖庚酸、甘油磷酸、庚酸、己酸、烟酸、2-萘磺酸、草酸、棕榈酸、果胶酸、3-苯基丙酸、苦味酸、新戊酸、硫氰酸、甲苯磺酸，和十一酸。
此外，当所公开的化合物携带酸性部分时，其合适的药学上可接受的盐可以包括碱金属盐，例如，钠盐或钾盐；碱土金属盐，例如钙盐或镁盐；和与合适的有机配体形成的盐，如季铵盐。在一些形式中，碱盐从形成非毒性盐的碱形成，所述非毒性盐包括铝盐、精氨酸盐、苄星青霉素盐、胆碱盐、二乙胺盐、二乙醇胺盐、甘氨酸盐、赖氨酸盐、葡甲胺盐、醇胺盐、氨丁三醇盐和锌盐。
有机盐可以由仲胺，叔胺或季铵盐制成，如氨丁三醇、二乙胺、N,N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)，和普鲁卡因。碱性含氮基团可以用试剂季铵化，所述试剂例如低级烷基(C1-C6)卤化物(如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物，溴化物和碘化物)、硫酸二烷基酯(如硫酸二甲酯、二乙酯、二丁酯和二戊酯)，长链卤化物(如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基氯化物，溴化物和碘化物)、芳烷基卤化物(如苄基和苯乙基溴化物)等。在一些形式中，酸和碱的半盐例如还可以形成半硫酸盐和半钙盐。在某些实施方案中，本发明的模拟化合物的药学上可接受的盐包括钠盐。
在一个实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的miR-96模拟化合物和药学上可接受的载体或赋形剂，其中模拟化合物的第一链包含成熟的miR-96序列，并且第二链基本上与第一链互补。在另一个实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的miR-182模拟化合物和药学上可接受的载体或赋形剂，其中模拟化合物的第一链包含成熟的miR-182序列，并且第二链基本上与第一链互补。在又一个实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的miR-183模拟化合物和药学上可接受的载体或赋形剂，其中模拟化合物的第一链包含成熟的miR-183序列，并且第二链基本上与第一链互补。
在一些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的本发明的至少两个微小RNA模拟化合物和药学上可接受的载体或赋形剂，其中第一微小RNA模拟化合物的第一链包含成熟的miR-96序列并且第二微小RNA模拟化合物的第一链包含成熟的miR-182序列。在一些其他实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的本发明的至少两个微小RNA模拟化合物和药学上可接受的载体或赋形剂，其中第一微小RNA模拟化合物的第一链包含成熟的miR-96序列并且第二微小RNA模拟化合物的第一链包含成熟的miR-183序列。在其它一些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的本发明的至少两个微小RNA模拟化合物和药学上可接受的载体或赋形剂，其中第一微小RNA模拟化合物的第一链包含成熟的miR-182序列并且第二微小RNA模拟化合物的第一链包含成熟的miR-183序列。在又一些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含治疗有效量的本发明的三种微小RNA模拟化合物和药学上可接受的载体或赋形剂，其中第一微小RNA模拟化合物的第一链包含成熟的miR-96序列并且第二微小RNA模拟化合物的第一链包含成熟的miR-182序列，并且第三微小RNA模拟化合物的第一链包含成熟的miR-183序列。
优选地，药物组合物包含至少两种根据本发明的微小RNA激动剂，第一和第二激动剂或第一、第二和第三激动剂以等摩尔浓度存在。其他混合比率如约1:2、1:3、1:4、1:5、1:2:1、1:3:1、1:4:1、1:2:3、1:2:4也被设想用于制备包含miR-96，miR-182和miR-183激动剂的至少两种的药物组合物。
在一些实施方案中，可以同时但以分开的成分施用本发明的一种或多种微小RNA激动剂，其中同时是指短期内(如彼此约30分钟)给予模拟化合物。在一些其他实施方案中，可以在不同时间分开施用miR-96，miR-182和/或miR-183激动剂。
本发明还包含实施方案，其中可以与miR-96，miR-182和/或miR-183激动剂一同施用另外的治疗剂。另外的治疗剂可以同时施用，但可以分开配制或依次施用。在其他实施方案中，可以在施用miR-96，miR-182和/或miR-183激动剂之前的不同时间施用另外的治疗剂。在先施用例如包括在施用第二药剂之前约1周至多达30分钟的范围内施用第一药剂。在先施用例如还包括在施用第二药剂之前约2周至高达30分钟的范围内施用第一药剂。在后或后续施用例如包括在施用第一药剂后约1周至30分钟的范围内施用第二药剂。在后或后续施用例如还包括在施用第一药剂后约2周至30分钟的范围内施用第二药剂。在考虑临床应用的情况下，将以适合于意图应用的形式制备药物组合物。通常，这将需要制备基本上不含热原，以及可能对人或动物有害的其它杂质的组合物。
在一些实施方案中，包含miR-96，miR-182和/或miR-183激动剂的药物组合物可以配制用于局部眼科应用，例如，以溶液、药膏、面霜、洗液、眼膏剂、滴眼液或眼凝胶。在一些其他实施方案中，包含miR-96，miR-182和/或miR-183激动剂的药物组合物可以配制成通过注射进行局部眼部施用。通过注射施用miR-96，miR-182和/或miR-183激动剂的途径包括玻璃体内，眼周，前房内，结膜下或经巩膜施用。
在各种实施方案中，用于表面或局部眼部施用的药物组合物可以含有合适的眼科添加剂，例如包括缓冲剂、等渗剂、防腐剂、增溶剂(稳定剂)、pH调节剂、增稠剂和螯合剂，帮助药物渗透的溶剂，以及软膏和霜剂中的润肤剂。缓冲液可以选自但不限于下组：磷酸盐缓冲液，硼酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，酒石酸盐缓冲液，乙酸盐缓冲液(例如乙酸钠)和氨基酸。等渗剂可以选自但不限于下组：糖如山梨糖醇，葡萄糖和甘露糖醇，多元醇如甘油，聚乙二醇和聚丙二醇，和盐如氯化钠。防腐剂可以选自但不限于下组：苯扎氯铵，苄索氯铵，对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯，苯甲醇，苯乙醇，山梨酸及其盐，硫柳汞和氯丁醇。增溶剂(稳定剂)可以选自但不限于下组：环糊精及其衍生物，水溶性聚合物如聚(乙烯基吡咯烷酮)，以及表面活性剂如聚山梨酯80(商品名：吐温80)。pH调节剂可以选自但不限于下组：盐酸，乙酸，磷酸，氢氧化钠，氢氧化钾和氢氧化铵。增稠剂可以选自但不限于下组：羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素和其盐。螯合剂可以选自但不限于下组：乙二胺四乙酸钠，柠檬酸钠和缩聚磷酸钠。此类局部制剂可以进一步含有相容的眼科载体，例如眼霜或软膏基料，橄榄油，花生油，蓖麻油，聚氧乙烯蓖麻油，矿物油，凡士林，二甲基亚砜，乙醇(乙醇或油醇)，脂质体，硅油和由美国专利号6,254,860教导的组合。
或者，可以通过脂质体将miR-96，miR-182和miR-183激动剂施用于眼。在某些实施方案中，用于递送的脂质体是美国预授权公开号20110076322中详细描述的两性脂质体，如(Marina Biotech,Inc.)。的表面电荷是完全可逆的，这使得它们特别适合于递送核酸。可以经由注射递送，保持稳定，和无聚集并跨越细胞膜以递送核酸。
此外，激动剂可以通过泵-导管系统输注到泪膜中。本发明的另一实施方案涉及包含在连续或选择性释放装置(例如膜)内的模拟化合物，所述膜例如但不限于那些在毛果芸香碱(pilocarpine)(OCUSERTTM)系统(Alza Corp.,Palo Alto,Calif.)中使用的那些。作为另外的实施方案，模拟化合物可以内含于置于眼上的隐形眼镜的内部，由所述隐形眼镜携带，或附接于所述隐形眼镜。本发明的另一实施方案涉及包含于可以应用到眼表面的拭子或海绵中的模拟化合物。本发明的又一实施方案涉及模拟化合物，其包含于可以应用到眼表面的液体喷雾中。
通过以下附加实施例进一步说明本发明，所述实施例不应被解释为限制。鉴于本公开，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变，并且仍然获得相似或相似的结果。
为了所有目的，贯穿本公开引用的所有专利和非专利文献的全部内容通过引用并入本文。
实施例：
实施例1：视网膜中miRNA模拟物的摄取和清除
将用于小鼠miR-96,miR-182,和miR-183的裸(未缀合至胆固醇)miRNA模拟物重悬于盐水中。将三个双链体以每个双链体3.3μg/μl合并以获得10μg/μl合并的双链体。将靶向小鼠视紫质(NM_145383)的裸siRNA用作阳性对照并且以10μg/μl的浓度重悬于盐水中。为了测定miRNA模拟物在视网膜中的摄取和清除，对野生型C57Bl/6小鼠每只眼的玻璃体内注射1μl(10μg)的合并的miRNA双链体或视紫质siRNA。每个时间点后分离出视网膜，并且通过分离RNA并通过夹心ELISA法测量miRNA水平来测定视网膜分布和清除。对于siRNA的分布和清除，分离RNA，并且通过qRT-PCR测量靶物抑制。
研究设计：
2个研究分组：
1)miR-96/182/183模拟物的合并物，总共10μg(n＝14)
2)靶向视紫质的siRNA(n＝14)
7个时间点：(2只小鼠/研究分组/时间点)
1)未处理(基线)
2)4h
3)8h
4)24h
5)48h
6)72h
7)168h(第7天)
评估寡核苷酸生物分布的miRNA模拟/siRNA定量测定
如之前由Efler等人(“Quantitation of oligodeoxynucleotides in humanplasma with a novel hybridization assay offers greatly enhanced sensitivityover capillary electrophoresis,”Oligonucleotides 15(2),119–131(2005))描述的，使用夹心杂交测定定量组织样品中的miR-183，miR-96，miR-182或rho siRNA。简言之，用2’-O-甲基修饰的核苷酸合成杂交测定的探针，并标记为5’bTEG-sup-3’(捕获探针)和5’-6FAM-sup-3’(检测探针)。使用抗荧光过氧化物酶，Fab片段(Roche)，和TMB过氧化物酶底物(KPL)完成检测。用4参数的非线性逻辑回归分析(4-PL)生成标准曲线。测定的工作浓度范围为1至536ng/mL。通过以下制备100mg/mL的组织样品：在3mol/L GITC缓冲液(3mol/L异硫氰酸胍，0.5mol/L NaCl，0.1mol/L Tris，pH7.5和10mmol/L EDTA)中用MP FastPrep-24速度设置为6.0下匀质化2次，持续30秒。将组织匀浆在1mol/L GITC缓冲液(1mol/L异硫氰酸胍，0.5mol/L NaCl,0.1mol/L Tris,pH 7.5,和10mmol/L EDTA)中稀释用以测试。
小鼠视紫质的定量实时聚合酶链式反应分析。
对于体内实时聚合酶链反应(RT-PCR)分析，用Trizol(Invitrogen)从视网膜组织提取RNA；然后用MultiScribe反转录酶(Life Technologies)根据制造商的说明，使用来自每个样品的100ng总RNA产生cDNA。使用Life Technologies Taqman基因表达测定法测量基因表达。相对于持家基因如GAPDH将基因表达标准化并计算为相较于对照组的平均值的相对表达。
对于用miRNA模拟物合并物处理的动物，合并来自每只动物的2个视网膜用于生物分布分析。对于用Rho siRNA处理的动物，每只动物的一个视网膜用于生物分布，并且另一个视网膜用于RNA分离以定量靶物敲低。
单次玻璃体内注射后，所有3个miRNA模拟物和Rho siRNA分布到视网膜。每个miRNA模拟物的量约为视网膜中检测到的siRNA的量的三分之一，与miRNA模拟物合并物中含有3.3μg每种miRNA模拟物(10μg总寡聚物)的事实一致，而将siRNA以10μg总浓度给药。在给药后4h和8h检测到所有三种miRNA模拟物并且在8小时后迅速清除(图1)。在注射后4h和8h检测到Rho siRNA并在24h后清除。
Rho(视紫质)siRNA在注射后72h产生靶基因的60％沉默，并且注射后7天，沉默保持在～50％(图2)。视紫质在视网膜的光感受器中表达。因此当前数据说明了siRNA双链体有功能地分布于光感受器。注射后沉默保持约1周，尽管siRNA本身在24小时后在视网膜中是检测不到的。
实施例2：在大鼠视网膜细胞系统中施用微小RNA模拟物(miR-96，miR-182，和miR- 183)
对于本研究，使用了胆固醇缀合的，miR-96，miR-182，和miR-183的模拟物以及大鼠视紫质siRNA。
表3：用于本研究中的miR-96/182/183模拟物：
将3个微小RNA的每个的胆固醇缀合的模拟物施用至购自Lonza(R-RET-508)的大鼠视网膜细胞。分离自新生(P3或P4)Sprague-Dawley大鼠的Lonza的大鼠视网膜细胞包含通常在视网膜中发现的7种细胞类型(视杆细胞,视锥细胞,Müller细胞,水平细胞,双极细胞,无长突细胞,和神经节细胞)。虽然这是混合细胞群，但是关于大鼠视网膜中细胞类型的比例的数据说明杆细胞是主要细胞类型，并且杆细胞也是miR-183簇通常最高度表达的细胞类型。研究miRNA模拟物在其他视网膜神经元细胞类型环境中的作用可以提供相较于分离的单个细胞类型更为相关的，背景依赖的生物学。此外，该混合细胞系统可以对随后的体内研究中鉴定的基因表达变化提供更直接的比较。在大鼠的P3/P4新生阶段，miR-183/96/182簇中的微小RNA是相对低表达的(成年视网膜中水平的约1％)，从而为外源添加的模拟物提供了低背景和更为强健的标签(signature)。
用胆固醇缀合的微小RNA模拟物被动转染培养物中的大鼠视网膜细胞(R-Ret细胞)以确定各种参数：miRNA模拟物的毒性，使用Rho siRNA下调Rho mRNA，R-Ret细胞的最佳接种密度，培养R-Ret细胞的最大持续时间，和牵涉使用real-tile PCR光传导途径的基因表达序型分析。
实验设计：
A.测定由R-Ret细胞耐受的胆固醇缀合的miRNA模拟物的最高剂量，10μM是最高施用剂量。
B.通过使用胆固醇缀合siRNA合并物测量Rho敲低来评估功能性摄取。
C.测定生成至少800ng总RNA(Affymetrix平台上进行微阵列序型分析所需的最低量)的R-Ret细胞的最佳接种密度。
D.测定可以培养细胞的最大时间量。
E.对功能上涉及光传导通路的基因的选择进行实时PCR。
端点(End points)：
A.毒性/活力测定和视觉评估
B.Rho的qPCR
C.紫外/可见RNA定量
D.miRNA qPCR
E.Rho、Sag、Arr3、Rcvrn、Nrl、Pdc、Gnat1、Gnat2、Opn1mw的qPCR
用胆固醇缀合的miR-206模拟物被动转染R-Ret细胞，并且在转染后72小时观察所述细胞。转染后72小时和培养开始后1周，10μM剂量的胆固醇缀合的miRNA模拟物似乎引起细胞分化(图3)。使用腺苷酸激酶测定法测量miRNA模拟物对R-Ret细胞的毒性。在无血清培养基中发现毒性随时间降低(图4)并且未发现用10μM miRNA模拟物处理细胞是有毒的。
用各种浓度的胆固醇缀合的Rho siRNA或非靶向对照(NTC)siRNA被动转染R-Ret细胞。分离RNA并进行Rho mRNA的real-time PCR分析。图5显示了1,5,和10μM胆固醇缀合的Rho siRNA合并物产生相当的Rho敲低。
从培养了1周的R-Ret细胞中分离RNA并且使用紫外/可见分光光度计测定产率(表4)。
表4
为了测定可以培养细胞的最大时间，将R-Ret细胞接种在多聚L赖氨酸上。细胞在培养物中存活了至少两周，其中细胞在5％血清培养基中培养前四天，并然后将培养基更换为无血清培养基。
用各种浓度的合并的或单个的miR-183,miR-96,和miR-182模拟物和Rho siRNA转染R-Ret细胞。在转染后72小时分离RNA，并且进行实时PCR分析以测定牵涉光传导途径的基因的mRNA表达谱。图6和图7显示了在PCR测定范围内表达的基因的相对表达水平。与未处理组相比，在用于多重比较的Newman-Keuls检验的情况下通过两因素ANOVA计算计算差异的P值。图8显示了图7中所示处理的log2变换平均倍数变化值的热图。
表5：通过实时PCR检测的基因
表6显示了miR-183簇敲除小鼠中所选基因的表达数据与用胆固醇缀合的miR-183簇miRNA模拟物处理的大鼠视网膜细胞中所选基因的表达数据之间的比较。
表6
实施例3：视网膜中鉴定微小RNA模拟物(miR-96,miR-182,miR-183)的直接和下游靶物
用胆固醇缀合的微小RNA模拟物(miR-183,miR-96,miR-182)单个或合并或用胆固醇缀合的Rho siRNA被动转染培养中的R-Ret细胞。在转染后的各个时间点，分离RNA并经受微阵列分析来鉴定显著调控的转录物。
实施例4：施用微小RNA模拟物预防视力丧失和视网膜变性
检查了微小RNA模拟化合物(miR-96和miR-182的微小RNA模拟物的合并物，和对照双链体)对色素性视网膜炎小鼠模型中视力丧失和视网膜变性的影响。Rho siRNA用作阳性对照。
黑暗处饲养Rd10/rd10小鼠至P31，此时将它们移动到12小时光/暗循环以诱导视网膜变性。在P31，以10μg(Rho siRNA)或2μg和10μg(miR-96和miR-182的微小RNA合并物，和对照双链体)的浓度经由双侧玻璃体内(IVT)注射来施用测试试剂(微小RNA合并物或RhosiRNA)。对照组包括在P31接受载体双侧施用的rd10/rd10小鼠，或从P29至P35每日接受苯基-N-叔丁基硝酮(PBN)腹膜内(i.p.)施用的动物。为了通过眼运动追踪(OKT)和视网膜电描记术(ERG)评价视力丧失，包括了未处理的C57Bl/6J小鼠的额外对照组。通过视敏度测量(P38和P45)以及ERG(P39和P46)两者来评价视力丧失。通过测定小鼠能够区分存在于视觉环境中的视觉刺激的平均空间频率阈值(SFT)来评价视敏度。
向rd10/rd10小鼠施用10μg合并的模拟物(miR-96和miR-182模拟物，和对照双链体)和PBN导致视敏度的统计学显著保留，如在P45下由OKT测定的。
实验设计
rd10/rd10小鼠
·P1-P30：出生时黑暗处饲养的动物
·P29-P35：每日腹膜内给予PBN(分组5)
·P31：转移到正常的循环光下饲养(housing)的动物(在白天小时数期间约200lux)
·P31：载体或测试试剂的双侧玻璃体内给药(分组1-4)
·P38：OKT分析以量化空间频率阈值
·P45：OKT分析以量化空间频率阈值
动物
品种：rd10/rd10小鼠
性别：雄性/雌性
年龄范围：新生幼兽(pubs)
重量范围：n/a
供应商：内部育种
研究动物数：48
备用动物数量：0
哨兵动物(Sentinel Animals)数量：0
测试化合物和载体
表7
研究分组(Study Arms)
表8
动物饲养
在标准动物护理条件下，所有动物以3-5只的组饲养于放置在通风架上的大笼子内。Rd10/rd10妊娠母兽(pregnant dams)在观察到粘液塞后被安置在黑暗中。新生幼兽(pups)从出生后第1天至出生后第30天与母兽在完全黑暗中饲养。在出生后第31天，将动物转移至由12小时光照(<500lux)，接着12小时黑暗组成的正常循环光照环境中维持。
制剂制备和储存
测试试剂以10μg/μl等分试样提供，并准备注射。对于分组2，将测试试剂(合并的模拟物)在0.9％NaCl中1:5稀释以达到2μg/μl的最终浓度。递送总体积1μl，用于所有玻璃体内注射。将等分试样储存在-20℃直至使用。初始解冻后，剩下的所有材料都保存在4℃，并且不被冷冻。在使用前立即在0.9％NaCl中制备PBN的15mg/ml溶液(目录#S4041,Teknova)。如3.2节所示，基于动物的体重，以75-150μl总体积中100mg/kg的剂量每日递送PBN。
腹膜内(IP)施用
通过IP注射的标准技术递送总体积≤150μl的镇静剂和阳性对照测试剂(PBN)，所述IP注射的标准技术利用附接有8mm 31号针头(BD#328438)的0.3cc胰岛素注射器。
玻璃体内施用
使用利用氯胺酮(85mg/kg)和赛拉嗪(14mg/kg)的U-100注射器将动物用氯胺酮/赛拉嗪麻醉。然后局部施用赛克罗奇(Cyclogyl)和Ak-Dilate扩大瞳孔。镇静和扩张后，使用汉密尔顿注射器和33号针头将1μl每只眼的总体积注射入在平坦部(pars plana)处的玻璃体中。
眼运动追踪(OKT)
使用为啮齿动物使用而设计的Optomotry(Cerebral Mechanics Inc.)来进行所有眼运动追踪实验。在这种非侵入性评估中，将小鼠放置在由4个LCD屏幕围绕的平台中，该屏幕位于光保护盒内。然后通过LCD屏幕向小鼠呈现视觉刺激，并且掩蔽的观察者从安装在盒子顶部的数字摄像机显现并评分眼运动追踪反射。对于空间频率阈值的测量，在0.034至0.514个循环/度的空间频率范围内测试小鼠。Optomotry设备采用专有算法来接受来自掩蔽观察者的输入，并根据动物是否显示正确或不正确的追踪反射来自动调整测试刺激。
组织收集
氯胺酮/赛拉嗪镇静后，用致死剂量的戊巴比妥对动物实施安乐死。用带火焰的针烧焦所有动物的右眼，以区分眼的上部，摘除，在Z-fix(锌缓冲的中性福尔马林)中固定，并加工用于H&E组织学。从所有动物的左眼，视网膜被单独分离，并且立即快速冷冻在液氮中，并分别储存在-70℃的2mL螺旋盖聚丙烯管中，直至进一步处理。
数据和统计分析
使用Prism软件(Graphpad Inc.)确定统计学的显著性，以p<0.05的阈值进行t-检验(OKT和ERG)或单因素方差分析(ANOVA)计算(视网膜厚度)以确定任何变化是否是统计学显著的。
图9显示了色素性视网膜炎小鼠模型中测试剂对视敏度损失的影响。通过小鼠能够区分视觉刺激的平均SFT对视敏度进行评估。在P38和P45两者中，相对于C57Bl/6J对照小鼠，视敏度在rd10小鼠的所有组中是更低的。在P38，载体处理组与接收合并的模拟物的两组的视敏度是相当的。相对于在P38的载体处理组，接受10μg Rho siRNA的组具有统计学显著更低的视敏度(p＝0.0185；未配对t检验)，而相对于载体，PBN处理的阳性对照组显示出统计学显著更高的视敏度测量(p＝0.0224；未配对t检验)。在P45，对于接受合并模拟物的两组，存在视力丧失的剂量依赖性改善，10μg合并的模拟物与载体之间具有统计学显著性差异(p＝0.0258；未配对t检验)。在P45，PBN处理的动物相对于载体还显示出统计学显著更好的视敏度(p＝0.0416；未配对t检验)。10μg Rho siRNA组的视敏度仍然远低于年龄匹配的载体组，但差异不是统计学显著的。
图10显示了色素性视网膜炎的小鼠模型中测试试剂对视敏度下降的影响。视敏度损失发生在从P38到P45的所有组。从P38至P45，载体处理的动物展现出视敏度减少48％。在接受10μg Rho siRNA测试试剂的组中发生两个时间点间的视敏度下降最大(59％)。接受10μg合并的模拟物的组在两个时间点间具有最微不足道的损失(11％)。相对于载体，2μg合并的模拟物的组和PBN组两者的视敏度损失都不太显著(分别为35％和39％)。
在检查的两个出生后时间点，相对于对照C57Bl/6J小鼠和暴露于光照前的rd10/rd10小鼠两者，由OKT评估的视觉丧失在光照暴露的rd10/rd10小鼠中统计学显著更低。载体处理组在其SFT上低于除了10μg Rho siRNA处理组外的所有组。双侧玻璃体内施用10μg合并的模拟物(miR-96,miR-182,和对照双链体)证明了对视敏度的积极影响，如由在P45时SFT测量的统计学显著保留，和在所有组中从P38至P45的SFT的最低百分率下降证明(图9和图10)。相对于载体对照组，PBN阳性对照处理组在P45处还保留统计学显著更高的SFT，然而，PBN组中SFT从P38至P45的损失比10μg合并的模拟物组更大。合并的模拟物的2μg处理组在P45处比载体对照组具有更高的SFT，但差异不是统计学显著的。接受10μg Rho siRNA的组在P38和P45两者的SFT测量中具有最大的损失，并且还在两个时间点之间具有SFT的最大百分率下降。基于该数据，双侧玻璃体内施用10μg的合并的模拟物改善后期时间点的视力丧失，通过OKT测量到视敏度的统计学显著差异。
序列表
<110> 米拉根医疗公司
Jackson, Aimee L.
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<120> MIRNA模拟物和它们在治疗感觉病患中的用途
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<160> 55
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<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 小鼠
<400> 1
uuuggcacua gcacauuuuu gcu 23
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<400> 2
uuuggcacua gcacauuuuu gcu 23
<210> 3
<211> 23
<212> RNA
<213> 大鼠
<400> 3
uuuggcacua gcacauuuuu gcu 23
<210> 4
<211> 25
<212> RNA
<213> 小鼠
<400> 4
uuuggcaaug guagaacuca caccg 25
<210> 5
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人
<400> 5
uuuggcaaug guagaacuca cacu 24
<210> 6
<211> 25
<212> RNA
<213> 大鼠
<400> 6
uuuggcaaug guagaacuca caccg 25
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> 小鼠
<400> 7
uauggcacug guagaauuca cu 22
<210> 8
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<400> 8
uauggcacug guagaauuca cu 22
<210> 9
<211> 22
<212> RNA
<213> 大鼠
<400> 9
uauggcacug guagaauuca cu 22
<210> 10
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-96 模拟化合物反义_mods_96
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(9)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(20)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(23)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(25)
<223> 可以通过硫代磷酸酯键连接
<400> 10
uuuggcacua gcacauuuuu gcuuu 25
<210> 11
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-96 模拟化合物正义_SS_3MM_96
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(9)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(14)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<400> 11
agcaaaauug agcuagugcg aaa 23
<210> 12
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-96 模拟化合物正义_mods__96
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(14)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(20)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<400> 12
agcaaaaaug ugcuagugcc aaa 23
<210> 13
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-96 模拟化合物正义_SS_3MM_96_Chol_PO
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(9)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(14)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 可以用胆固醇部分修饰
<400> 13
agcaaaauug agcuagugcg aaa 23
<210> 14
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-96 模拟化合物正义_SS_3MM_96_Chol_PS
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(9)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(14)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> 可以通过硫代磷酸酯键用胆固醇部分修饰
<400> 14
agcaaaauug agcuagugcg aaa 23
<210> 15
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-182 模拟化合物反义_mods_182
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(19)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(24)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(26)
<223> 可以通过硫代磷酸酯连接来连接
<400> 15
uuuggcaaug guagaacuca cacuuu 26
<210> 16
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-182 模拟化合物正义_SS_3MM_182
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(11)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(15)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(18)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<400> 16
agugugagau caaccauugc gaaa 24
<210> 17
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-182 模拟化合物正义_mods_182
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(12)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(15)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(18)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(21)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<400> 17
agugugaguu cuaccauugc caaa 24
<210> 18
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-182 模拟化合物正义_SS_3MM_182_Chol_PO
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(11)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(15)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(18)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (24)..(24)
<223> 可以用胆固醇部分修饰
<400> 18
agugugagau caaccauugc gaaa 24
<210> 19
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-182 模拟化合物正义_SS_3MM_182_Chol_PS
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(11)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(15)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(18)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (24)..(24)
<223> 可以通过硫代磷酸酯连接用胆固醇部分修饰
<400> 19
agugugagau caaccauugc gaaa 24
<210> 20
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-183 模拟化合物反义_mods_183
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(9)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(19)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(22)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(24)
<223> 可以通过硫代磷酸酯连接来连接
<400> 20
uauggcacug guagaauuca cuuu 24
<210> 21
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-183 模拟化合物正义_SS_3MM_183
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(9)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(13)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<400> 21
agugaaauca accagugcga ua 22
<210> 22
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-183 模拟化合物正义_mods_183
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(10)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(13)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(19)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<400> 22
agugaauucu accagugcca ua 22
<210> 23
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-183 模拟化合物正义_SS_3MM_183_Chol_PO
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(9)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(13)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(22)
<223> 可以用胆固醇部分修饰
<400> 23
agugaaauca accagugcga ua 22
<210> 24
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-183 模拟化合物正义_mods_183_Chol_PO
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(10)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(13)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(19)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(22)
<223> 可以用胆固醇部分修饰
<400> 24
agugaauucu accagugcca ua 22
<210> 25
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-183 模拟化合物正义_SS_3MM_183_Chol_PS
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(9)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(13)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(22)
<223> 可以通过硫代磷酸酯连接用胆固醇部分修饰
<400> 25
agugaaauca accagugcga ua 22
<210> 26
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-96 模拟化合物反义_blunt_96
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(9)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(20)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(23)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<400> 26
uuuggcacua gcacauuuuu gcu 23
<210> 27
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-96 模拟化合物反义_mods_5P_96
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 可以用磷酸部分修饰
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(9)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(20)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(23)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(25)
<223> 可以通过硫代磷酸酯连接来连接
<400> 27
uuuggcacua gcacauuuuu gcuuu 25
<210> 28
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-96 模拟化合物反义_unmod_96
<400> 28
uuuggcacua gcacauuuuu gcuuu 25
<210> 29
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-96 模拟化合物反义_2'OMe_96
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(9)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(20)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(23)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(25)
<223> 可以通过硫代磷酸酯连接来连接
<400> 29
uuuggcacua gcacauuuuu gcuuu 25
<210> 30
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-96 模拟化合物正义_OH_96
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(9)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(25)
<223> 可以通过硫代磷酸酯连接来连接
<400> 30
agcaaaauug agcuagugcg aaauu 25
<210> 31
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-96 模拟化合物正义_SS_3MM_5'Chol_96
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 可以用经由6碳接头附接至寡聚物的胆固醇修饰
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(9)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(14)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<400> 31
agcaaaauug agcuagugcg aaa 23
<210> 32
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-96 模拟化合物正义_OT_96
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(2)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<400> 32
agcaaaaaug ugcuagugcc aaauu 25
<210> 33
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-96 模拟化合物正义_SS_3MM_96_Chol
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(9)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(14)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> 可以通过硫代磷酸酯连接用胆固醇部分修饰
<400> 33
agcaaaauug agcuagugcg aaa 23
<210> 34
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-96 模拟化合物正义_SS_3MM_96_Chol_PO
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(9)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(14)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> 可以用胆固醇部分修饰
<400> 34
agcaaaauug agcuagugcg aaa 23
<210> 35
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-182 模拟化合物反义_blunt_182
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(19)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(24)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<400> 35
uuuggcaaug guagaacuca cacu 24
<210> 36
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-182 模拟化合物反义_mods_5P_182
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 可以用磷酸部分修饰
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(19)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(24)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(26)
<223> 可以通过硫代磷酸酯连接来连接
<400> 36
uuuggcaaug guagaacuca cacuuu 26
<210> 37
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-182 模拟化合物反义_unmod_182
<400> 37
uuuggcaaug guagaacuca cacuuu 26
<210> 38
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-182 模拟化合物反义_2'Ome_182
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(19)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(24)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(26)
<223> 可以通过硫代磷酸酯连接来连接
<400> 38
uuuggcaaug guagaacuca cacuuu 26
<210> 39
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-182 模拟化合物正义_OH_182
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(11)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(15)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(18)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(26)
<223> 可以通过硫代磷酸酯连接来连接
<400> 39
agugugagau caaccauugc gaaauu 26
<210> 40
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-182 模拟化合物正义_SS_3MM_5'chol_182
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 可以用经由6碳接头附接至寡聚物的胆固醇修饰
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(11)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(15)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(18)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<400> 40
agugugagau caaccauugc gaaa 24
<210> 41
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-182 模拟化合物正义_OT_182
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(2)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<400> 41
agugugaguu cuaccauugc caaauu 26
<210> 42
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-182 模拟化合物正义_SS_3MM_182_Chol
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(11)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(15)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(18)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (24)..(24)
<223> 可以通过硫代磷酸酯连接用胆固醇部分修饰
<400> 42
agugugagau caaccauugc gaaa 24
<210> 43
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-182 模拟化合物正义_SS_3MM_182_Chol_PO
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(11)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(15)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(18)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (24)..(24)
<223> 可以用胆固醇部分修饰
<400> 43
agugugagau caaccauugc gaaa 24
<210> 44
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-183 模拟化合物反义_blunt_183
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(9)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(19)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(22)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<400> 44
uauggcacug guagaauuca cu 22
<210> 45
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-183 模拟化合物反义2_mods_5P_183
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 可以用磷酸部分修饰
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(9)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(19)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(22)
<223> 可以是2'-含氟核苷酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(24)
<223> 可以通过硫代磷酸酯连接来连接
<400> 45
uauggcacug guagaauuca cuuu 24
<210> 46
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-183 模拟化合物反义2_unmod_183
<400> 46
uauggcacug guagaauuca cuuu 24
<210> 47
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-183 模拟化合物反义_2'Ome_183
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(9)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(19)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(22)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(24)
<223> 可以通过硫代磷酸酯连接来连接
<400> 47
uauggcacug guagaauuca cuuu 24
<210> 48
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-183 模拟化合物正义_OH_183
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(10)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(13)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(19)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(24)
<223> 可以通过硫代磷酸酯连接来连接
<400> 48
agugaauucu accagugcca uauu 24
<210> 49
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-183 模拟化合物正义2_SS_3MM_5'chol_183
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 可以用经由6碳接头附接至寡聚物的胆固醇修饰
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(9)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(13)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<400> 49
agugaaauca accagugcga ua 22
<210> 50
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-183 模拟化合物正义_OT_183
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(2)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<400> 50
agugaauucu accagugcca uauu 24
<210> 51
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-183 模拟化合物正义2_SS_3MM_183_Chol_PO
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(9)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(13)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(22)
<223> 可以用胆固醇部分修饰
<400> 51
agugaaauca accagugcga ua 22
<210> 52
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-183 模拟化合物正义2_SS_3MM_183_Chol
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(9)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(13)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> 可以是2'-O-甲基修饰的核苷酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(22)
<223> 可以通过硫代磷酸酯连接用胆固醇部分修饰
<400> 52
agugaaauca accagugcga ua 22
<210> 53
<211> 110
<212> DNA
<213> 智人
<400> 53
gagctgcttg cctccccccg tttttggcaa tggtagaact cacactggtg aggtaacagg 60
atccggtggt tctagacttg ccaactatgg ggcgaggact cagccggcac 110
<210> 54
<211> 110
<212> DNA
<213> 智人
<400> 54
ccgcagagtg tgactcctgt tctgtgtatg gcactggtag aattcactgt gaacagtctc 60
agtcagtgaa ttaccgaagg gccataaaca gagcagagac agatccacga 110
<210> 55
<211> 78
<212> DNA
<213> 智人
<400> 55
tggccgattt tggcactagc acatttttgc ttgtgtctct ccgctctgag caatcatgtg 60
cagtgccaat atgggaaa 78

Claims (68)

1.微小RNA模拟化合物，其包含：
约22至约26个核糖核苷酸的第一链，其包含成熟的miR-96，miR-182或miR-183序列；和
约20至约26个核糖核苷酸的第二链，其包含基本上与所述第一链互补的序列并具有至少一个经修饰的核苷酸。
2.权利要求1的微小RNA模拟化合物，其中所述第一链具有一个或多个2’含氟核苷酸。
3.权利要求1的微小RNA模拟化合物，其中所述第一链不具有经修饰的核苷酸。
4.权利要求1至3中任一项的微小RNA模拟化合物，其中所述第二链中至少一个经修饰的核苷酸是2’-O-甲基修饰的核苷酸。
5.权利要求1至4中任一项的微小RNA模拟化合物，其中所述第二链不与第一链完全互补。
6.权利要求5的微小RNA模拟化合物，其中所述第二链具有相对于所述第一链的1、2或3个错配。
7.权利要求1至6中任一项的微小RNA模拟化合物，其中所述第二链在其3’或5’末端连接至胆固醇分子。
8.权利要求7的微小RNA模拟化合物，其中所述胆固醇分子通过至少6碳接头连接至所述第二链。
9.权利要求1至8中任一项的微小RNA模拟化合物，其中所第一链具有5’末端单磷酸。
10.权利要求1至9中任一项的微小RNA模拟化合物，其中所述第一链或所述第二链具有相对于另一条链的3’核苷酸突出端(overhang)。
11.权利要求1至10中任一项的微小RNA模拟化合物，其中包含所述3’突出端的所述核苷酸通过硫代磷酸酯连接来连接。
12.权利要求1至11中任一项的微小RNA模拟化合物，其中所述3’核苷酸突出端包含两个核糖核苷酸。
13.权利要求1至12中任一项的微小RNA模拟化合物，其中所述第一链包含成熟的miR-96序列。
14.权利要求13的微小RNA模拟化合物，其中所述第一链包含SEQ ID NO:10的序列。
15.权利要求13或14的微小RNA模拟化合物，其中所述第二链包含选自下组的序列：SEQID NO:11,SEQ ID NO:12,和SEQ ID NO:13。
16.权利要求13的微小RNA模拟化合物，其中所述第一链包含选自下组的序列：SEQ IDNO:10和26-29，并且所述第二链包含选自下组的序列：SEQ ID NO:11-14和30-34。
17.权利要求1至12中任一项的微小RNA模拟化合物，其中所述第一链包含成熟的miR-182序列。
18.权利要求17的微小RNA模拟化合物，其中所述第一链包含SEQ ID NO:15的序列。
19.权利要求17或18的微小RNA模拟化合物，其中所述第二链包含选自下组的序列：SEQID NO:16,SEQ ID NO:17,和SEQ ID NO:18。
20.权利要求17的微小RNA模拟化合物，其中所述第一链包含选自下组的序列：SEQ IDNO:15和35-38，并且所述第二链包含选自下组的序列：SEQ ID NO:16-19和39-43。
21.权利要求1至12中任一项的微小RNA模拟化合物，其中所述第一链包含成熟的miR-183序列。
22.权利要求21的微小RNA模拟化合物，其中所述第一链包含SEQ ID NO:20的序列。
23.权利要求21或22的微小RNA模拟化合物，其中所述第二链包含选自下组的序列：SEQID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,和SEQ ID NO:24。
24.权利要求21的微小RNA模拟化合物，其中所述第一链包含选自下组的序列：SEQ IDNO:20和44-47，并且所述第二链包含选自下组的序列：SEQ ID NO:21-25和48-52。
25.药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1至24中任一项的微小RNA模拟化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
26.药物组合物，其包含治疗有效量的至少两种权利要求1的微小RNA模拟化合物，其中第一微小RNA模拟化合物的第一链包含成熟的miR-96序列并且第二微小RNA模拟化合物的第一链包含成熟的miR-182或miR-183序列。
27.权利要求26的药物组合物，其中所述第二微小RNA模拟化合物的第一链包含成熟的miR-182序列。
28.权利要求27的药物组合物，其还包括第三微小RNA模拟化合物，其中所述第三微小RNA模拟化合物的第一链包含成熟的miR-183序列。
29.权利要求28的药物组合物，其中所述第一，第二和第三微小RNA模拟化合物以等摩尔浓度存在。
30.在有需要的受试者中治疗或预防眼科病患的方法，包括向受试者施用治疗有效量的miR-96，miR-182和/或miR-183的至少一种激动剂，其中所述激动剂是双链寡核苷酸，其包含含有成熟的miR-96，miR-182或miR-183序列的第一链和含有基本上与第一链互补的序列的第二链，其中所述链中的至少一个包含一个或多个修饰的核苷酸。
31.权利要求30的方法，其中所述治疗有效量是足以维持或改善受试者视敏度的量。
32.权利要求30的方法，其中所述治疗有效量是足以减少或防止受试者中感光细胞损伤和/或死亡的量。
33.权利要求30至32中任一项的方法，其中所述第一链为约22至约26个核苷酸的长度并且所述第二链为约20至约26个核苷酸的长度。
34.权利要求30至33中任一项的方法，其中所述第一链具有一个或多个2’含氟核苷酸。
35.权利要求30至34中任一项的方法，其中所述第二链具有一个或多个2'-O-甲基修饰的核苷酸。
36.权利要求30至35中任一项的方法，其中所述第二链相对于所述第一链具有1、2或3个错配。
37.权利要求30至35中任一项的方法，其中所述第一链或所述第二链具有相对于另一条链的3’核苷酸突出端。
38.权利要求37的方法，其中包含所述3’突出端的所述核苷酸通过硫代磷酸酯连接来连接。
39.权利要求37或38的方法，其中所述3’核苷酸突出端包含两个核糖核苷酸。
40.权利要求30至39中任一项的方法，其中所述第二链在其3’或5’末端连接至胆固醇分子。
41.权利要求40的方法，其中所述胆固醇分子通过至少6碳接头连接至所述第二链。
42.权利要求30至41中任一项的方法，其中所述激动剂是miR-96激动剂并且所述双链寡核苷酸的所述第一链包含成熟的miR-96序列。
43.权利要求42的方法，其中所述第一链包含选自下组的序列：SEQ ID NO:10和26-29，并且所述第二链包含选自下组的序列：SEQ ID NO:11-14和30-34。
44.权利要求30至41中任一项的方法，其中所述激动剂是miR-182激动剂并且所述双链寡核苷酸的所述第一链包含成熟的miR-182序列。
45.权利要求44的方法，其中所述第一链包含选自下组的序列：SEQ ID NO:15和35-38，并且所述第二链包含选自下组的序列：SEQ ID NO:16-19和39-43。
46.权利要求30至41中任一项的方法，其中所述激动剂是miR-183激动剂并且所述双链寡核苷酸的所述第一链包含成熟的miR-183序列。
47.权利要求46的方法，其中所述第一链包含选自下组的序列：SEQ ID NO:20和44-47，并且所述第二链包含选自下组的序列：SEQ ID NO:21-25和48-52。
48.权利要求42的方法，其还包括向受试者施用miR-182激动剂，其中所述miR-182激动剂是双链寡核苷酸，其包含含有成熟的miR-182序列的第一链和含有基本上与所述第一链互补的序列的第二链，其中所述链中的至少一个包含一个或多个修饰的核苷酸。
49.权利要求42或48的方法，其还包括向受试者施用miR-183激动剂，其中所述miR-183激动剂是双链寡核苷酸，其包含含有成熟的miR-183序列的第一链和含有基本上与所述第一链互补的序列的第二链，其中所述链中的至少一个包含一个或多个修饰的核苷酸。
50.权利要求49的方法，其中将miR-96，miR-182和miR-183激动剂以单独的组合物向受试者施用。
51.权利要求49的方法，其中将miR-96，miR-182和miR-183激动剂以相同的组合物向受试者施用。
52.权利要求51的方法，其中miR-96，miR-182和miR-183激动剂以等摩尔浓度存在于所述组合物中。
53.权利要求30至52中任一项的方法，其中所述至少一种激动剂眼部施用于所述受试者。
54.权利要求53的方法，其中所述眼部施用包括玻璃体内，眼周围，前房内(intracameral)，结膜下，或经巩膜(transcleral)施用。
55.权利要求30至54中任一项的方法，其中所述受试者具有色素性视网膜炎(retinitis pigmentosa)。
56.权利要求30至54中任一项的方法，其中所述受试者具有夜盲的体征。
57.权利要求30至54中任一项的方法，其中所述受试者具有选自下组的眼科(ophthalamological)病患：视网膜脱离、视网膜变性、黄斑变性和斯特格氏病(Stargardtdisease)。
58.权利要求30至57中任一项的方法，其中所述治疗有效量是足以增加受试者的感光细胞中一种或多种光转导基因表达的量。
59.权利要求58的方法，其中所述一种或多种光转导基因选自下组：恢复蛋白(Recoverin，Revrn)、NRL、抑制蛋白(Arrestin，Sag)、视紫红质(Rho)、转导蛋白(Gnat2)，和光传感因子(Phosducin，PDC)。
60.在有需要的受试者中治疗和或预防耳部病症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的miR-96，miR-182和/或miR-183的至少一种激动剂，其中所述激动剂是双链寡核苷酸，其包含含有成熟的miR-96，miR-182或miR-183序列的第一链和含有基本上与所述第一链互补的序列的第二链，其中所述链中的至少一个包含一个或多个修饰的核苷酸。
61.权利要求60的方法，其中所述耳部病症选自下组：听力损失、耳鸣、美尼尔氏病(Meniere's disease)，和耳部感染。
62.表达载体，其包含用于在哺乳动物细胞中表达的编码miR-96、miR-182或miR-183的多核苷酸。
63.权利要求62的表达载体，其中所述载体是病毒表达载体。
64.权利要求63的表达载体，其中所述病毒载体是腺伴随病毒载体。
65.权利要求63的表达载体，其中所述腺伴随病毒载体是自身互补的腺伴随病毒载体。
66.权利要求64或65的表达载体，其中所述腺伴随病毒载体选自下组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8，和AAV9。
67.权利要求62的表达载体，其中所述表达载体包含选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:53-55。
68.在有需要的受试者中治疗或预防眼科病患或耳部病患的方法，其包括向所述受试者施用有效量的编码miR-96，miR-182和/或miR-183的表达载体。
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