CN107529771B - 包含与麦芽糖糊精和/或NaCl组合的、具有转半乳糖基化活性的β-半乳糖苷酶的喷雾干燥的组合物及该组合物的应用 - Google Patents

包含与麦芽糖糊精和/或NaCl组合的、具有转半乳糖基化活性的β-半乳糖苷酶的喷雾干燥的组合物及该组合物的应用 Download PDF

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Abstract

披露了一种喷雾干燥的组合物，该组合物包含酶和麦芽糖糊精和/或氯化钠，该酶是具有转半乳糖基化活性的β‑半乳糖苷酶。

Description

包含与麦芽糖糊精和/或NaCl组合的、具有转半乳糖基化活性 的β-半乳糖苷酶的喷雾干燥的组合物及该组合物的应用
技术领域
本发明涉及含多肽的颗粒，涉及制备含多肽的颗粒的方法，并且涉及含 肽的颗粒的用途。
发明背景
低聚半乳糖(GOS)是在人和动物中不易消化的碳水化合物，其包括通 过糖苷键连接的两个或更多个(通常多达九个)半乳糖分子。GOS还可以包 括一个或多个葡萄糖分子。GOS的有益作用之一是作为益生元化合物通过选 择性地刺激有益的结肠微生物(例如细菌)的增殖为消费者提供生理益处的 能力。已经确定的健康作用导致对作为各种类型食物的食物成分的GOS的兴 趣日益增加。
酶β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)通常将乳糖水解成单糖D-葡萄糖和D-半 乳糖。在β-半乳糖苷酶的正常酶反应中，该酶水解乳糖并瞬时结合在半乳糖- 酶复合体中的半乳糖单糖，其将半乳糖转移到水的羟基基团上，导致D-半乳 糖和D-葡萄糖的释放。然而，在高乳糖浓度下，在称为转半乳糖基化的过程 中，一些β-半乳糖苷酶能够将半乳糖转移到D-半乳糖或D-葡萄糖的羟基中， 由此产生低聚半乳糖。同样，在高乳糖浓度下，一些β-半乳糖苷酶能够将半 乳糖转移到乳糖或更高级寡糖的羟基基团上。
双歧杆菌是乳业中最常用类型的细菌培养物之一，用于发酵各种乳制 品。另外，摄入含双歧杆菌的产品具有促进健康的作用。这种作用不仅通过 降低肠内容物的pH值而且通过双歧杆菌在个体中重新填充肠道菌群的能力来 实现，这些个体的肠道菌群受到例如抗生素的摄入的干扰。双歧杆菌还具有 战胜潜在有害肠道微生物的潜力。
已知低聚半乳糖可增强双歧杆菌的生长。这种作用可能通过双歧杆菌利 用低聚半乳糖作为碳源的独特能力来实现。还考虑了低聚半乳糖的膳食补充 剂具有许多长期的疾病保护作用。例如，已经显示出低聚半乳糖摄入对大鼠 结肠直肠癌发展具有高度保护作用。因此，有兴趣开发用于生产在工业中使 用以改进膳食补充剂和乳制品的低聚半乳糖的廉价且有效的方法。
已经将来自两歧双歧杆菌DSM20215的具有约580个氨基酸的截短的细 胞外乳糖酶(BIF3-d3)描述为在包含溶解在水中的乳糖的溶液中的转糖半乳 糖酶(乔根森
Figure RE-GDA0001412206280000011
等人，(2001)，应用微生物学和生物技术 (Appl.Microbiol.Biotechnol.)，57:647-652)。WO 01/90317还描述了作为 转半乳糖基化酶的截短变体(OLGA347)，并且在WO 2012/010597中显示 OLGA347将半乳糖部分转移到D-岩藻糖、N-乙酰基-半乳糖胺和木糖。
在WO 2009/071539中，与BIF3-d3相比，不同的截短片段被描述为在乳 中测试时导致GOS的高效水解和非常低的产量。
在WO 2013/182686中，我们描述了一种具有转半乳糖基化与水解活性 的有用比率的多肽，因此当与例如在基于乳的产品中即使在低乳糖水平与乳 糖一起孵育时也是GOS的有效生产者。
然而，仍然需要提供用于此类酶的改善的配制品。这些产品应为酶产品 提供希望的性质，例如酶储存稳定性。本发明解决了这一需要。
本发明的令人惊讶的特征和优点
目前的商业乳糖酶产品被配制成液体，例如在多元醇如甘油中。据信此 类配制品在物理上是稳定的，因为该酶在产品的可接受保存期限内是稳定 的。
我们研究了在甘油中配制具有转半乳糖基化活性的多肽。使用浊度作为 沉淀的量度，我们发现这样的配制品的物理稳定性是可接受的。
然而，当我们调查这样的配制品的活性时，我们发现与预期相反，多元 醇(例如甘油)的存在扰乱了酶的转半乳糖基化活性。具体地，我们发现在 多元醇的存在下，存在产生半乳糖基-甘油而不是希望的GOS的倾向。令人惊 奇的是，我们发现包含其中麦芽糖糊精(或麦芽糖糊精的组合)或氯化钠用 作载体的乳糖酶的喷雾干燥的产品在物理上是稳定的并且保留了允许希望的 GOS的合成的酶的转半乳糖基化活性。
发明内容
本发明的实施例的目的是提供一种具有转半乳糖基化与水解活性的有用 比率的多肽的配制品，并且在一些实施例中，其中当与例如在基于乳的产品 中即使在低乳糖水平下与乳糖一起孵育时，多肽是GOS的有效生产者。
根据本发明的一个方面，提供了一种包含多肽和麦芽糖糊精的喷雾干燥 的组合物，该多肽是具有转半乳糖基化活性的β-半乳糖苷酶。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包含多肽和氯化钠的喷雾干燥的 组合物，该多肽是具有转半乳糖基化活性的β-半乳糖苷酶。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包含多肽和麦芽糖糊精和/或氯化 钠的喷雾干燥的组合物，该多肽是具有转半乳糖基化活性的β-半乳糖苷酶。
在一个实施例中，其中该多肽是一种酶，该酶被分类在酶分类法 (EnzymeClassification，E.C.)3.2.1.23中。
在一个实施例中，该多肽在处于或高于3％w/w初始乳糖浓度的浓度下 具有至少0.5、至少1、至少2、至少2.5、至少3、至少4、至少5、至少6、 至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、或至少12的转半乳糖基化活性: β-半乳糖苷酶活性的比率。
在一个实施例中，具有转半乳糖基化活性的多肽选自由以下各项组成的 组：
a.包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多 肽，其中所述多肽由至多980个氨基酸残基组成，
b.包含与SEQ ID NO:2具有至少97％序列同一性的氨基酸序列的多 肽，其中所述多肽由至多975个氨基酸残基组成，
c.包含与SEQ ID NO:3具有至少96.5％序列同一性的氨基酸序列的 多肽，其中所述多肽由至多1300个氨基酸残基组成，
d.由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在至少低严格条件下与以下各 项杂交：i)包含在SEQ ID NO:9、10、11、12或13中的编码SEQ ID NO: 1、2、3、4或5的多肽的核酸序列；或ii)i)的互补链，
e.由包含如下各项的多核苷酸编码的多肽：与编码SEQ ID NO:1、 2、3、4或5的多肽的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列，或包含 在SEQ ID NO:9、10、11、12或13中的编码成熟多肽的核苷酸序列，和
f.包含SEQ ID NO:1、2、3、4或5的一个或多个氨基酸残基的缺 失、插入和/或保守取代的多肽。
在一个实施例中，具有转半乳糖基化活性的多肽选自由以下各项组成的 组：
a.包含与SEQ ID NO:3具有至少96.5％序列同一性的氨基酸序列的 多肽，其中所述多肽由至多1300个氨基酸残基组成，
b.包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多 肽，其中所述多肽由至多980个氨基酸残基组成，
c.由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在至少低严格条件下与以下各 项杂交：i)包含在SEQ ID NO:9、10、11、12或13中的编码SEQ ID NO: 1、2、3、4或5的多肽的核酸序列；或ii)i)的互补链，
d.由包含如下各项的多核苷酸编码的多肽：与编码SEQ ID NO:1、 2、3、4或5的多肽的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列，或包含 在SEQ ID NO:9、10、11、12或13中的编码成熟多肽的核苷酸序列，和
e.包含SEQ ID NO:1、2、3、4或5的一个或多个氨基酸残基的缺 失、插入和/或保守取代的多肽。
在一个实施例中，具有转半乳糖基化活性的多肽包含以下各项或由以下 各项组成：SEQ ID NO:1、2、3、4或5的氨基酸序列。
在一个实施例中，组合物包含0.1wt％或更少的多元醇。
在一个实施例中，组合物包含0.1wt％或更少的甘油。
在一个方面，喷雾干燥的组合物的颗粒具有大于30μm的平均容积径。 在本发明上下文中，粉末的粒度可以测量为“平均容积径”，例如由罗尔 (Rawle，A.)所描述的：“粒度分析的基本原理(Basic principles of particle size analysis)”，国际表面涂覆(Surface Coating International)，2003，第 86卷，第2期，pp.58-65。使用来自英国莫尔文(Malvern)有限公司的粒度 分析仪模型Mastersizer S，通过激光衍射(也称为低角度激光散射或 LALLS)已经进行了在导致本专利的工作中的粒度的测量。
在一个实施例中，多肽具有转半乳糖基化活性，该多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中当为在包含编码所述 多肽的核酸序列的合适的宿主菌株(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)) 中的表达产物时，所述多肽是所述核酸序列的唯一表现出转半乳糖基化活性 的多肽表达产物。
在一个实施例中，多肽是SEQ ID NO:22的具有转半乳糖基化活性的C 末端截短的片段，并且当在合适的生物体例如枯草芽孢杆菌中产生时该片段 针对进一步截短(例如通过蛋白水解降解)是稳定的和/或该片段在最终配制 后储存期间针对进一步截短是稳定的。
在一个实施例中，该多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性 的氨基酸序列，其中所述多肽由至多980个氨基酸残基组成。
在一个实施例中，该多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少97％序列同一性 的氨基酸序列，其中所述多肽由至多975个氨基酸残基组成。
在一个实施例中，该多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少96.5％序列同一 性的氨基酸序列，其中所述多肽由至多1300个氨基酸残基组成。
在一个方面，本文披露了一种组合物，该组合物包含本文所述的喷雾干 燥的组合物、优选地是食品组合物、更优选地是乳制品。
在一个方面，本文披露了一种通过使用如本文所述的喷雾干燥的组合物 处理包含乳糖的基于乳的底物来生产食物产品例如乳制品的方法。
在一个方面，本文披露了通过使用如本文所述的喷雾干燥的组合物处理 包含乳糖的底物获得的低聚半乳糖或其组合物。
在一个方面，本文披露了一种喷雾干燥液体组合物的方法，该方法包 括：
(a)将液体组合物引入喷雾干燥装置中，其中该液体组合物包含本文定义 的酶和麦芽糖糊精；并且
(b)喷雾干燥该液体组合物以产生颗粒。
在一个方面，本文披露了一种喷雾干燥液体组合物的方法，该方法包 括：
(a)将液体组合物引入喷雾干燥装置中，其中该液体组合物包含本文定义 的酶和氯化钠；并且
(b)喷雾干燥该液体组合物以产生颗粒。
附图简述
图1显示了实例1的结果。
图2和图3显示了实例2的结果。
图4显示了实例3的结果。
图5显示了实例4的结果。
序列表
SEQ ID NO:1(在此又称为(BIF_917))是SEQ ID NO:22的887个氨 基酸的截短的片段。
SEQ ID NO:2(在此又称为(BIF_995))是SEQ ID NO:22的965个氨 基酸的截短的片段。
SEQ ID NO:3(在此又称为(BIF_1068))是SEQ ID NO:22的1038个 氨基酸的截短的片段。
SEQ ID NO:4(在此又称为(BIF_1172))是SEQ ID NO:22的1142个 氨基酸的截短的片段。
SEQ ID NO:5(在此又称为(BIF_1241))是SEQ ID NO:22的1211个 氨基酸的截短的片段。
SEQ ID NO:6(在此又称为(BIF_1326))是SEQ ID NO:22的1296个 氨基酸的截短的片段。
SEQ ID NO:7是两歧双歧杆菌糖苷水解酶催化核心
SEQ ID NO:8是编码来自两歧双歧杆菌DSM20215的胞外乳糖酶的核苷 酸序列
SEQ ID NO:9是编码BIF_917的核苷酸序列
SEQ ID NO:10是编码BIF_995的核苷酸序列
SEQ ID NO:11是编码BIF 1068的核苷酸序列
SEQ ID NO:12是编码BIF_1172的核苷酸序列
SEQ ID NO:13是编码BIF_1241的核苷酸序列
SEQ ID NO:14是编码BIF_1326的核苷酸序列
SEQ ID NO:15是用于生成上述BIF变体的正向引物
SEQ ID NO:16是BIF917的反向引物
SEQ ID NO:17是BIF995的反向引物
SEQ ID NO:18是BIF1068的反向引物
SEQ ID NO:19是BIF1241的反向引物
SEQ ID NO:20是BIF1326的反向引物
SEQ ID NO:21是BIF1478的反向引物
SEQ ID NO:22是来自两岐双岐杆菌DSM20215的细胞外乳糖酶
SEQ ID NO:23是来自两歧双歧杆菌DSM20215的胞外乳糖酶的信号序 列。
发明详细披露
定义
根据此详细描述，适用下列简称和定义。应当注意，如在此所用，单数 形式“一种(a)”、“一种(an)”以及“该”包括复数个指示物，除非上 下文中另外明确指明。因而，例如，提及“一个/种多肽”时包括多个/种此类 多肽，并且提及“所述/该配制品”时包括提及一个或多个配制品和本领域技 术已知的其等效物，等等。
除非另外定义，否则在此使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通 技术人员通常所理解的相同的含义。下文中提供了下述术语。
除其他事项之外，“转半乳糖基酶”意指能够将半乳糖转移到D-半乳糖 或D-葡萄糖的羟基基团的酶，由此产生低聚半乳糖。在一方面，通过酶在乳 糖上的反应来鉴定转半乳糖基酶，其中产生的半乳糖的量小于在任何给定时 间产生的葡萄糖的量。
在上下文中，术语“转半乳糖基化活性”意指将半乳糖部分转移至除水 以外的分子。可以将活性测量
为[葡萄糖]-在反应期间的任何给定时间处产生的[半乳糖]，或通过在反 应期间的任何给定时间处产生的GOS的直接定量来测量。该测量可以以若干 种方式进行，如通过实例中所示的HPLC方法进行。当比较转半乳糖基化活 性的测量值时，它们已经在给定的初始乳糖浓度下进行，例如像，3％、4％、 5％、6％、7％、8％、9％或10％(w/w)。
在上下文中，术语“β-半乳糖苷酶活性”意指酶将β-半乳糖苷例如像乳 糖水解成单糖、葡萄糖和半乳糖的能力。
在计算转半乳糖基化活性:β-半乳糖苷酶活性的情况下，β-半乳糖苷酶活 性被测量为在反应期间的任何给定时间产生[半乳糖]。该测量可以以若干种方 式进行，如通过实例中所示的HPLC方法进行。
在上下文中，使用邻硝基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)，如下计算 术语“转半乳糖基化活性的比率”：将比率计算为具有存在的受体的Abs420 除以没有存在的受体的Abs420之间的比率乘以100。指数100的或以下的变 体是纯水解变体，而上述水平描绘了相对的转半乳糖基化活性。
转半乳糖基化活性的比率＝(Abs420+纤维二糖/Abs420-纤维二糖)*100％，其 中Abs420+纤维二糖是使用以下描述的方法3在420nm处读取的吸光度，在反应 中包括纤维二糖，并且Abs420-纤维二糖是使用以下描述的方法3在420nm处读 取的吸光度，而在反应中没有纤维二糖。以上方程仅适用于吸光度在0.5和 1.0之间的稀释。
在一个方面，在15min反应、30min反应、60min反应、90min反应、 120min反应或180min反应后测量活性。因此，在一方面，作为实例，在添 加酶后15分钟，如添加酶后30分钟，如添加酶后60分钟，如添加酶后90 分钟，如添加酶后120分钟或如添加酶后180分钟，测量相对转半乳糖基化 活性。
在上下文中，术语“转半乳糖基化活性:β-半乳糖苷酶活性的比率”意 指([葡萄糖]-[半乳糖]/[半乳糖])。
在上下文中，术语[葡萄糖]意指如通过HPLC测量的以重量％计的葡萄 糖浓度。
在上下文中，术语[半乳糖]意指如通过HPLC测量的以重量％计的半乳 糖浓度。
在本发明上下文中，术语“乳糖已经是转半乳糖基化的”意指半乳糖分 子已经共价连接到乳糖分子上，例如像共价连接到乳糖分子中的任何游离羟 基基团上，或者通过内部转半乳糖基化(例如形成别乳糖)产生。
在上下文中，在“基于乳的测定”(酸奶应用模拟物)中测试了在低聚 半乳糖(GOS)生产中在此披露的多肽的性能评估。使用由98,60％(w/v) 新鲜巴氏杀菌低脂乳(爱氏晨曦迷你乳(Arla
Figure RE-GDA0001412206280000071
))和1.4％(w/v) Nutrilac YQ-5075乳清成分(爱氏晨曦)组成的酸奶混合物在96孔MTP板中 进行体积为100μl的分批实验。为了完全使Nutrilac YQ-5075与水化合，将 混合物搅拌20h，并且然后添加20mM磷酸钠(pH 6.5)，以确保pH为 6.5。将这种酸奶基简单地使用或与各种补充剂如另外的乳糖、海藻糖、麦芽 糖、木糖或盐一起使用。将90μl酸奶与10μl纯化的酶或粗制酵素混合，用 胶带密封并在43℃下孵育3小时。通过100μl 10％Na2CO3终止反应。将样 品储存于-20℃下。通过HPLC定量低聚半乳糖(GOS)、乳糖、葡萄糖和半 乳糖。在Dionex ICS 3000上进行样品分析。IC参数如下：流动相：150mM NaOH，流速：等速，0,25ml/min，柱：Carbopac PA1，柱温：RT，注射体 积：10μl，检测器：PAD，积分：手动，样品制备：在Milli-Q水中稀释100 倍(0,1ml样品+9,9ml水)，并通过0.45ìm针筒式滤器过滤，定量：标准 品的峰面积的百分比中的峰面积。将GOS糖浆(Vivanal GOS，菲仕兰坎皮 纳公司(Friesland Campina))用作GOS定量的标准品。这样的评估的结果 显示于图4中，并在实例2中进一步描述。
在上下文中，术语“将该多肽喷雾干燥”意指已经通过将处于溶液或悬 浮液状态的多肽在合适的温度下喷雾干燥并且持续适当的时间除去水而获得 多肽。
在本发明上下文中，术语“该多肽处于溶液状态”涉及可溶于溶剂而不 会从溶液中沉淀出的多肽。用于此目的的溶剂包括其中可以存在多肽的任何 环境(milieu)，例如水性缓冲液或盐溶液、发酵液或表达宿主的细胞质。
在上下文中，术语“稳定剂”意指用于稳定多肽的任何稳定剂，例如， 多元醇，例如像甘油或丙二醇、糖或糖醇，乳酸，硼酸或硼酸衍生物(例如 芳族硼酸酯)。在一方面，稳定剂不是多元醇，或该多元醇以0.1wt％或更 低水平存在。
术语“分离的”意指该多肽至少实质上不含与该序列在自然界中天然缔 合或者在自然界中存在的至少一种其他组分。在一方面，如在此所用“分离 的多肽”是指如通过SDS-PAGE确定的是至少30％纯、至少40％纯、至少 60％纯、至少80％纯、至少90％纯、和至少95％纯的多肽。
术语“基本上纯的多肽”在此意指包含按重量计至多10％，优选至多 8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，至多3％，甚至更优 选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然缔合的其 他多肽材料的多肽制剂。因此，优选的是该基本上纯的多肽是按制剂中存在 的所有的多肽材料的重量计至少92％纯，优选至少94％纯，更优选至少95％ 纯，更优选至少96％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，更优选至 少98％纯，甚至更优选至少99％纯，最优选至少99.5％纯，并且甚至最优选100％纯的。在此披露的多肽优选为基本上纯的形式。特别地，优选的是这些 多肽是“基本上纯的形式”，即多肽制剂基本上不含与其天然缔合的其他多 肽材料。例如，这可以通过熟知的重组方法或通过经典的纯化方法制备多肽 来完成。在此，术语“基本上纯的多肽”与术语“分离的多肽”和“分离形 式的多肽”同义。
术语“纯化”或“纯”意指给定的组分以高水平状态存在-例如，至少 约51％纯如至少51％纯，或至少约75％如至少75％纯，或至少约80％如至少 80％纯，或至少约90％如至少90％纯，或至少约95％如至少95％纯，或至少 约98％如至少98％纯。希望的是，所述组分是组合物中存在的主要活性组 分。
关于本发明的术语“微生物”包括任何“微生物”，该任何“微生物” 可以包括根据本发明所述的核苷酸序列或编码具有如在此定义的特定特性的 多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物。在上下文中，“微生物”可以包括 能够发酵乳基质的任何细菌或真菌。
关于本发明的术语“宿主细胞”包括任何细胞，该任何细胞包括编码具 有如在此定义的特定特性的多肽的核苷酸序列或如上所述的并用于生产具有 如在此定义的特定特性的多肽的表达载体。在一方面，生产是重组生产。
在本发明的上下文中，术语“乳”应理解为从任何哺乳动物如牛、绵 羊、山羊、水牛或骆驼获得的乳状分泌物。
在上下文中，术语“基于乳的底物”意指任何生的和/或加工的乳材料或 衍生自乳成分的材料。有用的基于乳的底物包括但不限于包括乳糖的任何乳 或乳样产品的溶液/悬浮液，如全脂或低脂乳、脱脂乳、酪乳、复原乳粉、炼 乳、奶粉溶液、UHT乳、乳清、乳清渗透物、酸乳清或奶油。优选地，基于 乳的底物是乳或脱脂乳粉的水溶液。基于乳的底物可以比生乳更浓。在一个 实施例中，基于乳的底物的蛋白质与乳糖的比率为至少0.2，优选至少0.3， 至少0.4，至少0.5，至少0.6，或最优选至少0.7。可以根据本领域已知的方 法对基于乳的底物进行均化和/或巴氏杀菌。
如在此所用“均质化”意指强烈混合以获得可溶性悬浮液或乳液。可以 进行该均质化以便将乳脂分解成更小的尺寸，这样使得乳脂不再与该乳分 离。这可以通过在高压下使该乳通过小孔来实现。
如在此所用“巴氏杀菌”意指减少或消除活生物体如微生物在基于乳的 底物中的存在。优选地，通过将规定温度保持规定的时间来实现巴氏杀菌。 指定的温度通常通过加热来实现。可以选择温度和持续时间以便杀灭或使某 些细菌，如有害细菌失活，和/或使该乳中的酶失活。可以遵循快速冷却步 骤。本发明上下文中的“食品”或“食物组合物”可以是适合于动物或人类 消费的任何可食用食品或饲料产品。
在本发明的上下文中的“乳制品”可以是主要成分之一是基于乳的的任 何食品。优选地，主要成分是基于乳的。更优选地，主要成分是已经用具有 转半乳糖基化活性的酶处理过的基于乳的底物。
麦芽糖糊精是可以用作食物添加剂的多糖。麦芽糖糊精由以可变长度的 链连接的D-葡萄糖单元组成。葡萄糖单元主要由α(1→4)糖苷键连接。典型 地，麦芽糖糊精由从三至十七个葡萄糖单元长度变化的链的混合物组成。
麦芽糖糊精通过DE(右旋糖当量)分类，并且具有在3至20之间的 DE。DE值越高，葡萄糖链越短，甜度越高，溶解度越高，并且耐热性越 差。在DE 20以上，欧盟的CN代码称它为葡萄糖浆，在DE 10或以下，惯 例CN代码命名法将麦芽糖糊精分类为糊精。本发明可以使用此类麦芽糖糊 精的混合物。
在上下文中，“主要成分之一”意指干物质的成分，该干物质占乳制品 总干物质的20％以上，优选30％以上或40％以上，而“主要成分”意指干物 质的成分，该干物质占乳制品总干物质的50％以上、优选60％以上或70％以 上。
在上下文中，“发酵的乳制品”应被理解为任何乳制品，其中任何类型 的发酵形成生产过程的一部分。发酵的乳制品的实例是产品像酸奶、酪乳、 鲜奶油、奶渣和清爽干酪。发酵的乳制品的另一个实例是奶酪。发酵的乳制 品可以通过本领域已知的任何方法来生产。
术语“发酵”意指通过微生物如起子培养物的作用将碳水化合物转化为 醇或酸。在一方面，发酵包括将乳糖转化为乳酸。
在上下文中，“微生物”可以包括能够发酵乳基质的任何细菌或真菌。
在本发明上下文中，术语“Pfam结构域”意指基于多重序列比对和隐马 尔可夫基序在蛋白质序列内被鉴定为Pfam-A或Pfam-B的区域(Hidden Markov Motif)的存在(“Pfam 蛋白质家族数据库(The Pfam protein families database)”：芬恩(R.D.Finn)、米斯特里(J.Mistry)、塔特(J. Tate)、科吉尔(P.Coggill)、赫格尔(A.Heger)、波林格登(J.E.Pollington)、加文(O.L.Gavin)、古内塞克伦(P.Gunesekaran)、塞里克 (G.Ceric)、福斯朗德(K.Forslund)、霍尔姆(L.Holm)、桑哈梅尔 (E.L.Sonnhammer)、埃迪(S.R.Eddy)、贝特曼(A.Bateman)，核酸研 究(Nucleic Acids Research)(2010)数据库第38期：D211-222)。作为 Pfam结构域的实例，可以提及Glyco_hydro2N(PF02837)、Glyco_hydro (PF00703)、Glyco_hydro 2C(PF02836)和细菌Ig样结构域(组4) (PF07532)。
如本文所使用的，“与位置......相对应的位置”意指在特定查询多肽和 参比多肽之间进行如本文所述的比对。然后将与参比多肽中的特定位置相对 应的位置鉴定为具有最高序列同一性的比对中的相应氨基酸。
“变体(variant或variants)”是指多肽或核酸。术语“变体”可以与术 语“突变体”互换地使用。变体包括分别在氨基酸或核苷酸序列中的一个或 多个位置的插入、取代、易位、截短和/或倒位。短语“变体多肽”、“多肽 变体”、“多肽”、“变体”和“变体酶”意指具有氨基酸序列的多肽/蛋白 质，该氨基酸序列具有或包含例如SEQ ID NO:1、2、3、4或5的所选氨基 酸序列或与该所选氨基酸序列例如SEQ ID NO:1、2、3、4或5相比是经修 饰的。
如本文所使用的，“参比酶”、“参比序列”、“参比多肽”意指任何 变体多肽所基于的酶和多肽，例如SEQ ID NO:1、2、3、4或5。“参比核 酸”意指编码参比多肽的核酸序列。
如本文所使用的，术语“参比序列”和“主题序列”可互换地使用。
如本文所使用的，“查询序列”意指与参比序列比对以便看看其是否属 于本发明的范围内的外来序列。因此，这样的查询序列可以例如是现有技术 序列或第三方序列。
如本文所使用的，取决于上下文，术语“序列”可以是指多肽序列或核 酸序列。
如本文所使用的，术语“多肽序列”和“氨基酸序列”可互换地使用。
“变体”的信号序列可以相同或可以不同于野生型芽孢杆菌属信号肽的 信号序列或将分泌多肽的任何信号序列。变体可被表示为含有异源多肽的融 合蛋白。例如，该变体可以包含另一个蛋白质的信号肽或被设计为辅助鉴别 或纯化所表达的融合蛋白的序列，例如His-Tag序列。
为了描述本公开所预期包含的各种变体，将使用下列命名以方便引用。 在取代包括数字和字母的情况下(例如，592P)，那么其是指{根据编号系统 的位置/取代的氨基酸}。因此，例如，将位置592处的氨基酸被脯氨酸取代表 示为592P。在取代包括字母、数字、和字母时，例如D592P，则这是指{原 始氨基酸/根据编号系统的位置/取代的氨基酸}。
因此，例如，用脯氨酸取代位置592处的丙氨酸被表示为A592P。
在具体位置处可能有两个或更多个取代时，这将由连续的字母表示，其 可以任选地用斜线符号“/”分隔，例如，G303ED或G303E/D。
参考例如SEQ ID NO:1、2、3、4或5列出了一个或多个位置和取代。 例如，在另一个序列中的等同位置可以通过如下找到：将该序列与SEQ ID NO:1、2、3、4或5比对以发现具有最高百分比同一性的比对，然后确定哪 个氨基酸比对对应于SEQ ID NO:1、2、3、4或5的特定位置的氨基酸。此 种比对和使用一个序列作为第一参比对于本领域技术人员来说只是例行事 件。
如在此所用，术语“表达”是指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。 此过程包括转录和翻译。
如本文所使用的，“多肽”与术语“氨基酸序列”、“酶”、“肽”和/ 或“蛋白质”可互换地使用。如本文所使用的，“核苷酸序列”或“核酸序 列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列及其变体、同源物、片段和衍生物。 核苷酸序列可以是基因组的、合成的或重组来源的并且可以是双链的或单链 的，不论其代表有义链还是反义链。如本文所使用的，术语“核苷酸序列” 包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。
“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定程度的同 一性或“同源性”的实体。在一方面，主题氨基酸序列是SEQ ID NO:1、2、 3、4或5，并且主题核苷酸序列优选地是SEQ ID NO:9、10、11、12或13。
“同源序列”包括与另一个序列具有一定百分比(例如80％、85％、 90％、95％或99％)的序列同一性的多核苷酸或多肽。百分比同一性是指，比 对时，当比较两个序列时相同的碱基或氨基酸残基的百分比。当与主题序列 相比，取代、缺失或添加了氨基酸时氨基酸序列是不同一的。通常是关于主 题蛋白质的成熟序列(即，例如去除了信号序列之后)来测量百分比序列同 一性。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点残基。同源物 还保持酶促活性，虽然同源物可能具有不同于野生型的酶促特性。
如本文所使用的，“杂交”包括一条核酸链与互补链通过碱基配对接合 的过程以及在聚合酶链反应(PCR)技术中所进行的扩增过程。变体核酸可 作为单链或双链DNA或RNA、RNA/DNA异源双链或RNA/DNA共聚物存 在。如本文所使用的，“共聚物”是指包含核糖核苷和脱氧核糖核苷的单一 核酸链。变体核酸可以是经密码子优化的以进一步增加表达。
如本文所使用的，“合成的”化合物是由体外化学或酶促合成产生的。 其包括但不限于由用于宿主生物体(例如酵母细胞宿主或其他所选择的表达 宿主)的最佳密码子使用产生的变体核酸。
如在此所用，“转化的细胞”包括已经通过使用重组DNA技术转化的 细胞，包括细菌和真菌细胞。转化通常通过向细胞中插入一个或多个核苷酸 序列而发生。所插入的核苷酸序列可以是异源的核苷酸序列，即对于待转化 的细胞而言不是天然的序列，例如融合蛋白。
如在此所用，“可操作地连接”意指所描述的组分处于允许它们以其预 期方式起作用的关系。例如，与编码序列可操作地连接的调控序列被连接的 方式使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
如本文所使用的，术语“片段”在此定义为从氨基和/或羧基末端缺失一 个或多个(若干个)氨基酸的多肽，其中该片段具有活性。
在一方面，术语“片段”在此定义为从SEQ ID NO:1、2、3、4或5的 多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(若干个)氨基酸的多肽；其中该 片段具有转半乳糖基化活性。
如本文所使用的术语“半乳糖结合结构域样”被缩写为术语“GBD”并 可与术语“GBD”互换。
同一性程度
两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联性由参数“同一性” 描述。
在一个实施例中，通过以下方式来确定查询序列与参考序列之间的序列 同一性程度：1)通过使用默认评分矩阵和默认空位罚分的任何合适的比对程 序来比对两种序列，2)鉴别精确匹配的数量，其中精确匹配是比对程序已经 在比对的给定位置处鉴别出两个比对序列中的同一的氨基酸或核苷酸，以及 3)将精确匹配的数目除以参考序列的长度。
在一个实施例中，通过以下方式来确定查询序列与参考序列之间的序列 同一性程度：1)通过使用默认评分矩阵和默认空位罚分的任何合适的比对程 序来比对两种序列，2)鉴别精确匹配的数量，其中精确匹配是其中比对程序 已经在比对的给定位置处鉴别出两个比对序列中的同一的氨基酸或核苷酸， 以及3)将精确匹配的数目除以两个序列中最长的长度。
在另一个实施例中，通过以下方式来确定查询序列与参考序列之间的序 列同一性程度：1)通过使用默认评分矩阵和默认空位罚分的任何合适的比对 程序来比对两种序列，2)鉴别精确匹配的数量，其中精确匹配是其中比对程 序已经在比对的给定位置处鉴别出两个比对序列中的同一的氨基酸或核苷 酸，以及3)将精确匹配数目除以“比对长度”，其中该比对长度是包括序列 的空位和突出部分的整个比对的长度。
可通过眼睛，或更经常是借助容易获得的序列比较程序来进行序列同一 性比较。这些商业可得的计算机程序使用复杂的比较算法来比对两个或更多 个序列，其最好地反映出可能导致两个或更多个序列之间的差异的进化事 件。因此，这些算法以评分系统运行，所述评分系统奖励同一的或相似的氨 基酸的比对而惩罚缺口的插入、缺口延伸和不相似氨基酸的比对。比较算法 的评分系统包括：
i)每当插入空位时指定罚分(空位罚分)，
ii)每当现有的空位用额外的位置扩大时指定罚分(延伸罚分)，
iii)当比对同一的氨基酸时指定高分，以及
iv)当比对非同一的氨基酸时指定可变分数。
大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，优选的是当使用此类软件进 行序列比较时使用默认值。
对于非同一的氨基酸的比对给出的得分是根据评分矩阵(也称作取代矩 阵)指定的。在所述取代矩阵中提供的得分所反映的事实是：进化过程中一 个氨基酸被另一个所取代的可能性是变化的并且其取决于将被取代的氨基酸 的物理/化学性质。例如，与被疏水性氨基酸所取代相比，极性氨基酸被另一 个极性氨基酸所取代的可能性更大。因此，评分矩阵将为同一的氨基酸指定 最高分数，为非同一但相似的氨基酸指定较低分数，并且为非同一的不相似 氨基酸指定甚至更低分数。最常用的评分矩阵是PAM矩阵(戴霍夫(Dayhoff)等人，(1978)，琼斯(Jones)等人，(1992))、BLOSUM 矩阵(亨尼科夫(Henikoff)和亨尼科夫(1992))和贡内特(Gonnet)矩阵 (贡内特等人，(1992))。
用于进行这样的比对的合适的计算机程序包括但不限于Vector NTI(英 杰公司(Invitrogen Corp.))以及ClustalV、ClustalW和ClustalW2程序(希 金斯(Higgins DG)和夏普(Sharp PM)(1988)，希金斯(Higgins)等人 (1992)，汤普森(Thompson)等人(1994)，拉金(Larkin)等人 (2007))。从ExPASy蛋白质组服务器(www.expasy.org)可获得不同比对工具的汇集。可以执行序列比对的软件的另一个实例是BLAST(基本局部比 对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))，该BLAST可从美国国 家生物技术信息中心的网页获得，该网页目前可以在 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/找到，并且该BLAST首先在阿尔丘尔等人 (1990)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215；403-410中进行了描述。
在本发明的一个优选实施例中，该比对程序正在执行全局比对程序，其 优化了全长序列的比对。在进一步的优选实施例中，全局比对程序是基于德 尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(德尔曼(Needleman)，索尔 (Saul)B.；和翁施(Wunsch)，克里斯蒂安)D.(1970)，“适用于搜索两种蛋白质氨基酸序列相似性的一般方法(A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins)”，分子生物 学杂志(Journal of Molecular Biology)48(3):443-53)。使用德尔曼-翁施算法 执行全局比对的当前程序的实例是EMBOSS Needle和EMBOSS Stretcher程序，这两者可以从http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/上获得。
EMBOSS Needle使用德尔曼-翁施比对算法执行最佳全局序列比对，以 沿其整个长度找到两个序列的最佳比对(包括空位)。
EMBOSS Stretcher使用德尔曼-翁施算法的修改版，该修改版允许更大序 列进行全局比对。
在一个实施例中，通过全局比对程序对序列进行比对，并且通过鉴别由 程序鉴别的精确匹配数目除以“比对长度”来计算序列同一性，其中比对长 度是包括序列的空位和突出部分的整个比对的长度。
在另一个实施例中，全局比对程序使用德尔曼-翁施算法，并且通过鉴别 由程序鉴别的精确匹配数目除以“比对长度”来计算序列同一性，其中比对 长度是包括序列的空位和突出部分的整个比对的长度。
在又另一个实施例中，全局比对程序选自由以下各项组成的组： EMBOSS Needle和EMBOSS stretcher，并且通过鉴别由程序鉴别的精确匹配 数目除以“比对长度”来计算序列同一性，其中比对长度是包括序列的空位 和突出部分的整个比对的长度。
一旦软件生成了比对，就可以计算出相似度％和序列同一性％。该软件 通常进行这种计算作为序列比较的一部分，并产生数值结果。
在一个实施例中，优选使用ClustalW软件来进行序列比对。优选地，使 用以下成对比对的参数进行采用ClustalW的比对：
取代矩阵： Gonnet 250
空位开放罚分： 20
空位延伸罚分： 0.2
空位终止罚分： 无
ClustalW2例如可以在互联网上在欧洲生物信息学研究所(EuropeanBioinformatics Institute)的EMBL-EBI网页www.ebi.ac.uk的工具-序列分析-ClustalW2下获得。目前，ClustalW2工具的确切地址是 www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2。
在另一个实施例中，优选使用Vector NTI(英杰公司)中的程序Align X 进行序列比对。在一个实施例中，Exp10可以与默认设置一起使用：
空位开放罚分：10
空位延伸罚分：0.05
空位分离罚分范围：88
在另一个实施例中，通过使用分数矩阵：blosum62mt2和VectorNTI成 对比对设置来确定一个氨基酸序列与，或相对于，另一个氨基酸序列的比对
Figure RE-GDA0001412206280000151
在一个实施例中，通过使用字号为3并且使用BLOSUM 62作为取代矩 阵的Blast来确定一个氨基酸序列与，或相对于，另一个氨基酸序列的同一性 的百分比。
多肽
在一方面，在此披露的本发明使用等于或高于3％w/w初始乳糖浓度浓 度的具有如下转半乳糖基化活性:β-半乳糖苷酶活性的比率的多肽：至少 0.5、至少1、至少2、至少2.5、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、 至少8、至少9、至少10、至少11、或至少12。
在一方面，在此披露的本发明使用多肽，其中糖苷水解酶催化核心具有 SEQ IDNO:7的氨基酸序列。
在一方面，在此披露的本发明使用包含Glyco_hydro2N(PF02837)、 Glyco_hydro(PF00703)和/或Glyco_hydro 2C(PF02836)结构域的多肽。
在一方面，在此披露了包含细菌Ig样结构域(组4)(PF07532)的多 肽。
在一方面，在此披露了选自由以下各项组成的组的、具有转半乳糖基化 活性的多肽：
a.包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多 肽，其中所述多肽由至多980个氨基酸残基组成，
b.包含与SEQ ID NO:2具有至少97％序列同一性的氨基酸序列的多 肽，其中所述多肽由至多975个氨基酸残基组成，
c.包含与SEQ ID NO:3具有至少96.5％序列同一性的氨基酸序列的 多肽，其中所述多肽由至多1300个氨基酸残基组成，
d.由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在至少低严格条件下与以下各 项杂交：i)包含在SEQ ID NO:9、10、11、12或13中的编码SEQ ID NO: 1、2、3、4或5的多肽的核酸序列；或ii)i)的互补链，
e.由包含如下各项的多核苷酸编码的多肽：与编码SEQ ID NO:1、 2、3、4或5的多肽的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列，或包含 在SEQ ID NO:9、10、11、12或13中的编码成熟多肽的核苷酸序列，和
f.包含SEQ ID NO:1、2、3、4或5的一个或多个氨基酸残基的缺 失、插入和/或保守取代的多肽。
在另一方面，在此披露的本发明使用选自由以下各项组成的组的、具有 转半乳糖基化活性的多肽：
a.包含与SEQ ID NO:3具有至少96.5％序列同一性的氨基酸序列的 多肽，其中所述多肽由至多1300个氨基酸残基组成，
b.包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多 肽，其中所述多肽由至多980个氨基酸残基组成，
c.由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在至少低严格条件下与以下各 项杂交：i)包含在SEQ ID NO:9、10、11、12或13中的编码SEQ ID NO: 1、2、3、4或5的多肽的核酸序列；或ii)i)的互补链，
d.由包含如下各项的多核苷酸编码的多肽：与编码SEQ ID NO:1、 2、3、4或5的多肽的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列，或包含 在SEQ ID NO:9、10、11、12或13中的编码成熟多肽的核苷酸序列，和
e.包含SEQ ID NO:1、2、3、4或5的一个或多个氨基酸残基的缺 失、插入和/或保守取代的多肽。
f.
在一方面，在此披露的本发明使用多肽，其中氨基酸序列与SEQ ID NO: 1、2、3、4或5的成熟氨基酸序列具有至少68％、70％、72％、74％、76％、 78％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、或99％序列同一性。
在一方面，在此披露的本发明使用与SEQ ID NO:1的成熟氨基酸序列具 有90％序列同一性的多肽。
在一方面，在此披露的本发明使用与SEQ ID NO:2的成熟氨基酸序列具 有90％序列同一性的多肽。
在一方面，在此披露的本发明使用与SEQ ID NO:3的成熟氨基酸序列具 有96.5％序列同一性的多肽。
在一方面，在此披露的本发明使用与SEQ ID NO:4的成熟氨基酸序列具 有96.5％序列同一性的多肽。
在一方面，在此披露的本发明使用与SEQ ID NO:5的成熟氨基酸序列具 有96.5％序列同一性的多肽。
在一方面，在此披露的本发明使用包括SEQ ID NO:1、2、3、4或5的 氨基酸序列的或由其组成的多肽。
在一方面，在此披露的本发明使用衍生自两歧双歧杆菌的多肽。
在一方面，在此披露的本发明使用pH最佳值为6.5-7.5的多肽。
在一个方面，本文披露的发明使用温度最适宜条件为30-60摄氏度例如 42-60摄氏度的多肽。
可以将对碳水化合物具有活性的多肽使用基于其底物特异性的IUBMB 分类系统或CaZy指定分类为当前125个糖苷水解酶家族之一。在CaZy数据 库中，指定是基于序列和结构信息，结合底物和产品的立体化学知识而进行 的。
本文披露了多肽的用途，当在包含编码所述多肽的核酸序列的合适宿主 菌株(例如枯草芽孢杆菌)中是表达产物时，这些多肽是所述核酸序列的展 现转半乳糖基化活性的唯一多肽表达产物。这可以通过使用本领域技术人员 已知的以下技术来评估。使待评估的样品进行SDS-PAGE，并使用适合于蛋 白质定量的染料例如像伯乐标准(Bio-RadCriterion)系统进行可视化。然后 使用适当的光密度扫描仪(例如像伯乐标准系统)扫描凝胶，并确保所得图 像处于动态范围内。对与衍生自SEQ ID NO:8的任何变体/片段相对应的条带 进行定量，并且如下计算多肽的百分比：所讨论的多肽的百分比＝所讨论的 多肽/(表现出转半乳糖基化活性的所有多肽的总和)*100。组合物中衍生自 SEQ ID NO:8的多肽变体/片段的总数可以通过本领域技术人员已知的方法使 用多克隆抗体通过蛋白质印迹检测衍生自SEQ ID NO:8的片段来确定。
在此披露的多肽包括酶内包含的至少两个分离的功能结构域。首先，如 下所述，多肽应包含糖苷水解酶催化核。催化核心应属于相关糖苷水解酶家 族的GH-A族。GH-A族的特征在于通过保留机制切割糖苷键，并具有基于 TIM桶折叠的催化结构域(维伦加(Wierenga)，2001，欧洲生化学会联合 会快报(FEBS Letters)，492(3)，第193-8页)。源于桶结构域的链4和7， 催化结构域含有作为质子供体和亲核试剂的两个谷氨酸残基(詹金斯(Jenkins)，1995，欧洲生物学化学会联盟通讯(FEBS Letters)，362(3)， 第281-5页)。TIM桶的总体结构是由8个β链和8个α-螺旋组成的(β/α)8 折叠。在一方面，在此披露的糖苷水解酶催化核心属于糖苷水解酶家族GH-2 和-35之一，这些糖苷水解酶家族GH-2和-35都是属于GH-A族的TIM-桶 酶。在另一方面，糖苷水解酶催化核心属于家族GH-2或GH-35。在另一方 面，糖苷水解酶催化核心属于家族GH-2。一个共同特点是这些酶是所谓的保 留酶，使得底物的立体化学在产品中是保守的(亨利萨特(Henrissat)， 1997，结构生物学当前观点(Curr Opin Struct Biol)，7(5),637-44)。
在一方面，在此披露的多肽对具有β(1→4)构象的碳水化合物键具有 活性。这有效地将该酶归入β-半乳糖苷酶的IUBMB EC 3.2.1.23类。该活性 可以但不限于通过利用合成底物如对硝基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷(PNPG)、 邻硝基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)或具有显色糖苷配基的β-D-吡喃半 乳糖苷(XGal)来确定。作为确定酶是否属于β-半乳糖苷酶的EC 3.2.1.23类 的替代方法是与底物如乳糖一起孵育，并通过方法如酶测定、HPLC、TLC或 本领域技术人员已知的其他方法测量葡萄糖的释放。
为了预测多肽的功能实体，可以应用若干个可用的公共储存库，例如像 Pfam(核酸研究(Nucl.Acids Res.)(2010)38(增刊1):D211-D222.doi: 10.1093/nar/gkp985)和Interpro(核酸研究(2009)37(增刊1):D211-D215. doi:10.1093/nar/gkn785)。应当指出，当进行这种分析时，应该在从公共储 存库数据库中获得的多肽的全长序列上进行分析。
在另一方面，提供了包含选自以下的一种或多种Pfam结构域的多肽： Glyco_hydro2N(PF02837)、Glyco_hydro(PF00703)、Glyco_hydro 2C (PF02836)和细菌Ig样结构域(组4)(PF07532)。在又另一方面，提供 包含Pfam结构域Glyco_hydro2N(PF02837)、Glyco_hydro(PF00703)、 Glyco_hydro 2C(PF02836)和细菌Ig样结构域(组4)(PF07532)的多 肽。在又另一方面，使用包含构成多肽催化结构域的Glyco_hydro2N (PF02837)、Glyco_hydro(PF00703)和Glyco_hydro 2C(PF02836)结构 域的多肽。
在另一方面，该多肽衍生自两歧双歧杆菌。
在另一方面，使用如在此披露的并具有如下转半乳糖基化活性:β-半乳 糖苷酶活性比率的多肽，如在100ppm浓度下，在基于乳的测定中，在37℃ 和5w/w％乳糖下，在15、30或180如180分钟反应后所测量的，该比率为 至少1、至少2.5、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少 9、至少10、至少11、或至少12。
在一方面，在此所披露的一种或多种多肽具有转半乳糖基化活性，这样 使得如在100ppm的浓度下，在基于乳的测定中，在37℃和5w/w％乳糖 下，在15、30或180如180分钟反应后所测量的，超过20％、超过30％、超 过40％、高达50％的初始乳糖发生了转半乳糖基化。在本发明的优选实施例 中，上述转半乳糖基化活性保留在本发明的喷雾干燥的组合物中。在一个实 施例中，转半乳糖基化活性在整个喷雾干燥的组合物的储存期在喷雾干燥的组合物中保留。该储存期可以是至少1、至少2、至少3、至少4、至少6、至 少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少18、或至少24个 月。
在另一方面，在此披露的一种或多种多肽具有β-半乳糖苷酶活性，这样 使得如在100ppm的浓度下，在基于乳的测定中，在37℃和5w/w％乳糖 下，在15、30或180如180分钟反应后所测量的，小于80％、小于70％、小 于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％的乳糖已被水解。在本 发明的优选实施例中，上述β-半乳糖苷酶活性在本发明的喷雾干燥的组合物 中保留。在一个实施例中，β-半乳糖苷酶活性在整个喷雾干燥的组合物的储 存期在喷雾干燥的组合物中保留。该储存期可以是至少1、至少2、至少3、 至少4、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少 18、或至少24个月。
在一方面，按照方法4中规定的，在对应于2.13LAU的100ppm的浓度 下测量β-半乳糖苷酶活性和/或转半乳糖基化活性。一般而言，酶的活性单位 可以根据如在WO 2003/186286中披露为方法4的测定来测量并且在本文中如 在方法4中再现。
在另一方面，在此披露的一种或多种多肽具有以下特征中的一个或多 个：
a)如在100ppm浓度下，在基于乳的测定中，在37℃和5w/w％乳糖 下，在15、30或180如180分钟反应后所测量的，为至少1、至少2.5、至少 3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、或 至少12的转半乳糖基化活性:β-半乳糖苷酶活性比率，和/或
b)具有转半乳糖基化活性，这样使得如在100ppm的浓度下，在基于乳 的测定中，在37℃和5w/w％乳糖下，在15、30或180如180分钟反应后所 测量的，超过20％、超过30％、超过40％、以及高达50％的初始乳糖已经发 生了转半乳糖基化。
在一方面，提供了包含与SEQ ID NO:3具有至少96.5％序列同一性的氨 基酸序列的多肽，其中所述多肽由至多1300个氨基酸残基组成。在另一方 面，提供了包含与SEQ IDNO:1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多 肽，如其中所述序列同一性是至少95％，例如像至少96％、至少97％、至少 98％、至少99％或至少100％序列同一性，并且其中所述多肽由至多980个氨 基酸残基组成。在另一方面，提供了包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列 同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽由至多980个氨基酸残基组成。 在又另一方面，提供了一种多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:1具有至少 90％序列同一性，如其中所述多肽与SEQ ID NO:1具有至少90％，例如像至 少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、或至少99％序列同一性。在另一方面，提供了与SEQ ID NO:2具有至少96,5％序列同一性的多肽，如其中所述多肽与SEQ ID NO:2 具有至少97％，例如像至少98％或至少99％序列同一性。在一方面，提供了 在此披露的多肽，这些多肽由至多975个氨基酸残基，例如像，至多970个 氨基酸残基、如至多950个氨基酸残基、如至多940个氨基酸残基、至多930 个氨基酸残基、至多920个氨基酸残基、至多910个氨基酸残基、至多900 个氨基酸残基、至多895个氨基酸残基或至多890个氨基酸残基组成。在一方面，提供了由887或965个氨基酸残基组成的特定的多肽。在一方面，提 供了一种多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少97％序列同一性的氨基 酸序列，如其中所述序列同一性为至少98％，例如像至少99％或至少100％序 列同一性，其中所述多肽由至多975个氨基酸残基，例如像，至多970个或 至少965个氨基酸残基组成。在一方面，使用包含与SEQ ID NO:2具有至少 97％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽由至多975个氨基酸残基组成。
在另一优选的方面，提供了包括SEQ ID NO:1、2、3、4或5的多肽。 在又一优选方面，使用由SEQ ID NO:1、2、3、4或5的氨基酸序列组成的 多肽，特别是由SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列组成的多肽。
在另一方面，使用包含与SEQ ID NO:3具有至少96.5％序列同一性的氨 基酸序列的多肽，如其中所述序列同一性是至少97％，例如像至少98％、至 少99或至少100％序列同一性，其中所述多肽由至多1300个氨基酸残基组 成。
在另一方面，提供一种多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:5具有至少 98.5％，如至少99％或至少99.5％序列同一性。在一个方面，提供了这样的多 肽：该多肽由至多1290个氨基酸残基，例如像至多1280个、至多1270个、 至多1260个、至多1250个、至多1240个、至多1230个、至多1220个、或 至多1215个氨基酸残基组成。在一优选方面，使用由1211个氨基酸残基组 成的多肽。
在另一方面，提供一种多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:4具有至少 96％，如至少97％，例如像至少98％或至少99％序列同一性。在一方面，使 用一种多肽，该多肽由至多1210个氨基酸残基，例如像至多1200、至多 1190、至多1180、至多1170、至多1160、至多1150或至多1145个氨基酸残 基，如1142个氨基酸残基组成。
在另一方面，提供一种多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:3具有至少 96.5％，如至少97％，例如像至少98％或至少99％序列同一性。在一方面， 提供了一种多肽，该多肽由至多1130个氨基酸残基，例如像至多1120、至多 1110、至多1100、至多1090、至多1080、至多1070、至多1060、至多 1050、至多1055或至多1040个氨基酸残基组成。在一优选方面，使用由 1038个氨基酸残基组成的多肽。
在另一方面，在此披露的多肽具有高于100％，如高于150％，175％或 200％的转半乳糖基化活性比率。
蛋白质通常由一个或多个功能区域(通常称为结构域)组成。不同结构 域在不同蛋白质的不同组合中的存在产生了在自然界中发现的蛋白质的多样 性谱。描述结构域的一种方式是借助于Pfam数据库，该Pfam数据库是如以 下描述的蛋白质结构域家族的大集合：“Pfam蛋白家族数据库”：R.D.芬 恩，J.米斯特里，J.塔特，P.柯吉尔，A.赫格尔，J.E.普林顿，O.L.加文，P.古 恩赛卡伦，G.赛利克，K.福斯隆德，L.霍尔姆，E.L.松哈默，S.R.艾迪，A.贝 特曼，核酸研究(2010)，数据库专辑38:D211-222。每个家族由多个序列 比对和隐马尔可夫模型(HMM)表示。在此提供的一种或多种多肽优选包含 Pfam结构域Glyco_hydro2N(PF02837)、Glyco_hydro(PF00703)、 Glyco_hydro 2C(PF02836)和细菌Ig样结构域(组4)(PF07532)中的一 种或多种。在一方面，在此提供的一种或多种多肽包含Glyco_hydro2N(PF02837)、Glyco_hydro(PF00703)、Glyco_hydro 2C(PF02836)和细 菌Ig样结构域(组4)(PF07532)。
在一方面，在此使用的多肽在4-9，如5-8、如5.5-7.5、如6.5-7.5的pH 范围内具有有益的转半乳糖基化活性。
本发明涵盖与在此定义的一种或多种氨基酸序列或与具有如在此定义的 具体特性的多肽具有一定程度的序列同一性或序列同源性的多肽的用途。具 体地而言，本发明涵盖与以下定义的SEQ ID NO:1、2、3、4或5中任一个 或其同源物具有一定程度的序列同一性的肽的用途。
同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应提供和/或编码一种多肽，与SEQ ID NO:1、2、3、4或5的多肽相比，该多肽保留了功能性转半乳糖基化活性和/ 或增强了转半乳糖基化活性。
在上下文中，同源序列被认为包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列可以 与主题序列具有至少66％、70％、75％、78％、至少80％、至少85％、至少 90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。通 常，所述同源物与主题氨基酸序列将包括相同的活性位点等。尽管同源性也 可以根据相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)来考虑，但在本 发明的上下文中，优选的是根据序列同一性来表示同源性。
因此，本发明还涵盖如本文定义的蛋白质或多肽的任何氨基酸序列(特 别是如下文定义的SEQ ID NO:1、2、3、4或5的那些)的变体、同源物和 衍生物的用途。
这些序列，特别是以下定义的SEQ ID NO:1、2、3、4或5的变体、同 源物和衍生物，还可以具有氨基酸残基的缺失、插入或取代，这产生沉默变 化并且形成功能上等效的物质。可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水 性、亲水性和/或两亲性性质的相似性进行有意的氨基酸取代，只要保留底物 的次要结合活性即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带 正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且具有类似亲水性值的含不带电荷的 极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、 天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
本发明还涵盖可能出现的保守取代(取代和替换两者在本文中用于意指 现有氨基酸残基与替代性残基的互换)，即对等取代，例如碱性对碱性、酸 性对酸性、极性对极性等。也可能发生非保守取代，即从一类残基至另一类 氨基酸或可替代地包含非天然氨基酸例如鸟氨酸(以下称为Z)、二氨基丁 酸鸟氨酸(以下称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(以下称为O)、吡喃丙氨酸、 噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯基甘氨酸。
可进行的保守取代在例如下列组中：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组 氨酸)，酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)，脂肪族氨基酸(丙氨酸、缬氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸)，极性氨基酸(谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、苏 氨酸)，芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，羟基氨基酸(丝氨 酸、苏氨酸)，大氨基酸(苯丙氨酸和色氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸，丙 氨酸)。
在一方面，本发明中使用的多肽序列处于纯化形式。
在一方面，用于本发明的多肽或蛋白质处于分离形式。
在一方面，本发明的多肽是重组生产的。
变体多肽包含与SEQ ID NO:1或2具有一定百分比，例如至少90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽。
变体多肽包含与SEQ ID NO:3、4或5具有一定百分比，例如至少 96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽。
在一个方面，本文使用的多肽包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与由 编码转半乳糖基酶的核苷酸序列编码的、包含在两歧双歧杆菌DSM20215 中、在此示为SEQ ID NO:22的成熟多肽的氨基酸序列具有至少90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。根据SEQ ID NO:1、2、3、4或5讨论的与序列同一性和功能有关的所有考虑和限制比照 适用于这些多肽和核苷酸的序列同一性和官能度。
在一方面，主题氨基酸序列是SEQ ID NO:1、2、3、4或5，并且主题 核苷酸序列优选地是SEQ ID NO:9、10、11、12或13。
在一方面，多肽是从SEQ ID NO:1、2、3、4或5的多肽的氨基和/或羧 基末端缺失的一个或多个(若干个)氨基酸的片段；其中该片段具有转半乳 糖基化活性。
在一方面，片段包含至少500、550、600、650、700、750、800、850、 900、950或1000个氨基酸残基。
在另一方面，多肽变体的长度为500至1300个氨基酸残基。在另一方 面，多肽变体的长度为600至1300个氨基酸。在另一方面，多肽变体的长度 为700至1300个氨基酸。在另一方面，多肽变体的长度为800至1300个氨 基酸。在另一方面，多肽变体的长度为800至1300个氨基酸。
SEQ ID NO:1、2、3、4或5的多肽变体
在一方面，使用相对于SEQ ID NO:1、2、3、4或5在一个或多个位置 处具有取代的SEQ ID NO:1、2、3、4或5的变体，该取代影响改变的特 性，如改进的转半乳糖基化。在本文件中为了方便起见，这样的变体多肽又 称为“变体多肽”、“多肽变体”或“变体”。在一方面，与SEQ ID NO: 1、2、3、4或5的多肽相比，在此定义的多肽具有改进的转半乳糖基化活 性。在另一方面，与SEQ ID NO:1、2、3、4或5的多肽相比，如在此所定 义的多肽具有改进的反应速度。
在此使用的多肽和变体多肽包括转半乳糖基化活性。
在一方面，在如高于3％w/w初始乳糖浓度的浓度下30min反应后，转 半乳糖基化活性:β-半乳糖苷酶活性的比率为至少0.5，如至少1，如至少 1.5，或如至少2。
在一方面，在如高于3％w/w初始乳糖浓度的浓度下30min反应后，转 半乳糖基化活性:β-半乳糖苷酶活性的比率为至少2.5、如至少3、如至少4、 如至少5、如至少6、如至少7、如至少8、如至少9、如至少10、如至少 11、或如至少12。
在一方面，如在此定义的多肽和变体可衍生自微生物来源，特别是可衍 生自丝状真菌或酵母，或可衍生自细菌。该酶可以例如衍生自如下各项的菌 株：伞菌属，例如双孢蘑菇；Ascovaginospora；曲霉属，例如黑曲霉、泡盛 曲霉、臭曲霉、日本曲霉、米曲霉；念珠菌属；毛壳菌属；Chaetotomastia； 网柄菌属，例如盘基网柄菌；克鲁维酵母菌属，例如脆壁克鲁维酵母、乳酸 克鲁维酵母；毛霉属，例如爪哇毛霉、高大毛霉、细小毛霉；脉孢菌属，例 如粗糙脉孢菌；根毛霉属，例如微小根毛霉；根霉属，例如少根根霉、日本 根霉、匍枝根霉；核盘霉属，例如白腐核盘霉；圆酵母属；球拟酵母属；毛 癣菌属，例如红色毛癣菌；维氏核盘菌属，例如大豆维氏核盘菌；芽孢杆菌 属，例如凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、诺瓦利斯芽孢杆菌 (B.novalis)、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、苏云金 芽孢杆菌；双歧杆菌属，例如长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌； 金黄杆菌属；柠檬酸杆菌属，例如弗氏柠檬酸杆菌；梭菌属，例如产气荚膜 梭菌；色二孢属，例如棉色二孢；肠杆菌属，例如产气肠杆菌，阴沟肠杆 菌；爱德华菌属，迟钝爱德华菌；欧文氏菌属，例如草生欧文氏菌；埃希氏 菌属，例如大肠杆菌；克雷伯氏菌属，例如肺炎克雷伯氏菌；多球菌属 (Miriococcum)；漆斑菌属；毛霉属；脉孢菌属，例如粗糙脉孢菌；变形杆 菌属，例如普通变形杆菌；普罗维登斯菌属，例如斯氏普罗威登斯菌；密孔 菌属，例如朱红密孔菌、血红密孔菌；瘤胃球菌属，例如扭链瘤胃球菌；沙 门氏菌属，例如鼠伤寒沙门菌；沙雷氏菌属，例如液化沙雷氏菌、粘质沙雷 氏菌；志贺菌属，例如弗氏志贺菌；链霉菌属，例如抗菌素链霉菌、栗色球 孢链霉菌(S.castaneoglobisporus)、紫红链霉菌(S.violeceoruber)；栓菌属；木霉属，例如里氏木霉、绿色木霉；耶尔森氏菌属，例如小肠结肠炎耶 尔森氏菌。
提供包括如在此定义的多肽或变体多肽的分离的和/或纯化的多肽。在一 个实施例中，变体多肽是多肽(SEQ ID NO:1、2、3、4或5)的成熟形式。 在一方面，这些变体包括C端结构域。
在一方面，如在此定义的变体多肽包括变体，其中相对于SEQ ID NO: 1、2、3、4或5已经添加或缺失了在一个和约25个之间的氨基酸残基。在一 方面，如在此定义的变体多肽包括变体，其中相对于SEQ ID NO:1、2、3、4 或5已经取代、添加或缺失了在一个和25个之间的氨基酸残基。在一方面， 该变体具有SEQ ID NO:1、2、3、4或5的氨基酸序列，其中已经取代了在 一个和约25个之间任何数目的氨基酸。在另一方面，该变体具有SEQ ID NO: 1、2、3、4或5的氨基酸序列，其中已经取代了在三个和十二个之间任何数 目的氨基酸。在另一方面，该变体具有SEQ ID NO:1、2、3、4或5的氨基 酸序列，其中已经取代了在五个和九个之间任何数目的氨基酸。
在一方面，SEQ ID NO:1、2、3、4或5中的至少两个，在另一方面， 至少三个，并且在又另一方面，至少五个氨基酸已经被取代。
在一方面，在此披露的一个或多个多肽具有1、2、3、4或5的序列。
在一方面，在此披露的一个或多个多肽具有SEQ ID NO:1、2、3、4或 5的序列，其中N末端中的10，如9、如8、如7、如6、如5、如4、如3、 如2、如1个氨基酸被取代和/或缺失。
酶及其酶变体可以通过其核酸和一级多肽序列、通过三维结构建模和/或 通过其比活性来表征。如在此所定义的多肽或多肽变体的另外的特征包括例 如稳定性、pH范围、氧化稳定性和热稳定性。可利用本领域技术人员已知的 标准测定来评估表达水平和酶活性。在另一方面，变体表现出相对于具有 SEQ ID NO:1、2、3、4或5的多肽的改进的性能特征，如在高温，例如， 65℃-85℃下改进的稳定性。
提供如在此定义的具有如下氨基酸序列的多肽变体，该氨基酸序列与 SEQ IDNO:1、2、3、4或5的多肽具有至少约66％、68％、70％、72％、 74％、78％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％、100％同一性。
核苷酸
在一个方面，本发明使用如上所述的具有转半乳糖基化活性的分离的多 肽，这些多肽由如下多核苷酸编码，这些多核苷酸在非常低严格条件，优选 低严格条件，更优选中严格条件，更优选中-高严格条件，甚至更优选高严格 条件以及最优选非常高严格条件下，与以下各项杂交：i)包含在SEQ ID NO: 9、10、11、12或13中的编码SEQ ID NO:1、2、3、4或5的成熟多肽的核酸序 列；ii)i)的cDNA序列或iii)i)或ii)的互补链(萨姆布鲁克(J.Sambrook)、 弗里奇(E.F.Fritsch)、和马尼亚蒂斯(T.Maniatis)，1989，分子克隆实验手册(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)，第2版，纽约冷泉港出版社 (ColdSpring Harbor,New York))。SEQ ID NO:9、10、11、12或13的子序 列含有至少100个连续核苷酸或优选至少200个连续核苷酸。此外，子序列可 以编码具有乳糖酶活性的多肽片段。
可以使用SEQ ID NO:9、10、11、12或13的核苷酸序列或其子序列、连 同SEQ IDNO:1、2、3、4或5的氨基酸序列或其片段来设计核酸探针，以根 据本领域众所周知的方法来鉴定并克隆对来自不同属或物种的菌株的具有转 半乳糖基酶活性的多肽进行编码的DNA。具体地说，这类探针可以用于按照 标准DNA印迹程序与感兴趣的属或物种的基因组或cDNA杂交，以便鉴定并分 离其中的相应基因。这些探针可以比完整序列短得多，但是长度应当是至少 14个、优选至少25个、更优选至少35个、且最优选至少70个核苷酸。然而， 优选的是核酸探针的长度是至少100个核苷酸。例如，核酸探针的长度可以是 至少200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少400个核苷酸，或最优 选至少500个核苷酸。可使用甚至更长的探针，例如长度为至少600个核苷 酸，至少优选至少700个核苷酸，更优选至少800个核苷酸，或最优选至少900 个核苷酸的核酸探针。DNA和RNA探针都可以使用。通常将探针标记以探测 相应的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白标记)。这类探 针涵盖于本发明中。
因此，可以针对与以上所描述的探针杂交并且编码具有乳糖酶活性的多 肽的DNA对由这类其他生物体制备的基因组DNA文库进行筛选。可通过琼脂 糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、或其他分离技术分离来自这类其他生物的基因组 或其他DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移并且固定在硝酸纤维 素(nitrocellulose)或其他适合的载体材料上。为鉴定与SEQ ID NO:9、10、 11、12或13或其子序列同源的克隆或DNA，在DNA印迹法中使用载体材料。
出于本发明的目的，杂交表明该核苷酸序列在非常低到非常高严格条件 下与一种被标记的核酸探针杂交，该探针对应于SEQ ID NO:9、10、11、12 或13中所示的核苷酸序列、其互补链、或其子序列。可以使用X射线胶片检测 在这些条件下与核酸探针杂交的分子。
该核酸探针可以是SEQ ID NO:9、10、11、12或13的成熟多肽编码区 域。
对于至少100个核苷酸长度的长探针，非常低至非常高严格性条件被定 义为最佳地按照标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200 g/ml剪切和变性的鲑鱼精子DNA中，以及对于非常低和低严格性在25％甲酰 胺中，对于中和中-高严格性在35％甲酰胺中，或对于高和非常高严格性在 50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针而言，载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，优选至少在45℃下(非常低严格性)，更优选至少在50℃ 下(低严格性)，更优选至少在55℃下(中严格性)，更优选至少在60℃下 (中-高严格性)，甚至更优选至少在65℃下(高严格性)，并且最优选至少 在70℃下(非常高严格性)洗涤三次，每次15分钟。
在一个具体实施例中，洗涤使用0.2X SSC、0.2％SDS，优选至少在45℃ 下(非常低严格性)，更优选至少在50℃下(低严格性)，更优选至少在 55℃下(中严格性)，更优选至少在60℃下(中高严格性)，甚至更优选至 少在65℃下(高严格性)，并且最优选至少在70℃下(非常高严格性)进 行。在另一个具体实施例中，洗涤使用0.1X SSC、0.2％SDS，优选至少在45℃下(非常低严格性)，更优选至少在50℃下(低严格性)，更优选至少 在55℃下(中严格性)，更优选至少在60℃下(中高严格性)，甚至更优选 至少在65℃下(高严格性)，并且最优选至少在70℃下(非常高严格性)进 行。
对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针而言，严格条件被定 义为根据标准DNA印迹程序，在比使用根据博尔顿(Bolton)和麦卡锡 (McCarthy)(1962，美国国家科学院院刊(Proceedings of the National Academy of Sciences USA)48:1390)的计算计算的Tm低约5℃至约10℃下，在 0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl(pH 7.6)、6mM EDTA、0.5％NP-40、1X登哈 特氏溶液(Denhardt's solution)、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mMATP、以及每ml 0.2mg的酵母RNA中预杂交、杂交及杂交后洗涤。
对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针而言，将载体材料在 比计算的Tm低5℃至10℃下，在6X SCC加0.1％SDS中洗涤一次，持续15分 钟，并且使用6X SSC洗涤两次，每次15分钟。
在含盐杂交条件下，有效的Tm是控制成功杂交的探针和过滤器结合DNA 之间所需的同一性程度的Tm。可以使用以下公式确定有效Tm，以确定两种 DNA在各种严格条件下杂交所需的同一性程度。
有效Tm＝81.5±16.6(log M[Na+])+0.41(G+C％)-0.72(甲酰胺％)
(参见www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6.htm)
SEQ ID NO:10的G+C含量为42％，并且SEQ ID NO:11的G+C含量为 44％。对于中严格性，甲酰胺为35％，并且5X SSPE的Na+浓度为0.75M。
另一个相关关系是两个DNA的1％错配将Tm降低1.4℃。为了确定两个 DNA在42℃的中严格条件下杂交所需的同一性程度，使用下列公式：
同源性％＝100-[(有效Tm-杂交温度)/1.4]
(参见www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6.htm)
变体核酸包括与编码SEQ ID NO:1、2、3、4或5的核酸具有一定百分 比，例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％序列同 一性的多核苷酸。在一方面，提供了能够编码如在此披露的多肽的核酸。在 另一方面，在此披露的核酸具有与SEQ ID NO:9、10、11、12或13具有至 少60％，如至少65％，如至少70％，如至少75％，如至少80％，如至少85％，如至少90％，如至少95％，如至少99％同一性的核酸序列。
在一个方面，可以使用包含如本文所述的核酸的质粒。
在另一个方面，可以使用包含如本文所述的核酸或能够表达如本文所述 的多肽的表达载体。
提供了与编码本文中所定义的任意多肽变体的核酸互补的核酸。此外， 提供了能够与所述补体杂交的核酸。在另一个实施例中，用于本文中所描述 的方法和组合物中的序列是合成的序列。其包括但不限于以用于在宿主生物 体(例如酵母)中表达的最佳密码子构成的序列。
本文所提供的多肽变体可根据本领域公知的程序被合成地生产或通过在 宿主细胞中重组表达生产。在一方面，在此披露的一种或多种多肽是一种或 多种重组多肽。所表达的本文中所定义的变体多肽任选地在使用之前是经分 离的。
在另一个实施例中，本文中所定义的多肽变体是在表达后经纯化的。例 如，在美国专利号7,371,552、7,166,453、6,890,572、和6,667,065；以及美国 公开申请号2007/0141693、2007/0072270、2007/0020731、2007/0020727、 2006/0073583、2006/0019347、2006/0018997、2006/0008890、 2006/0008888、和2005/0137111中描述了多肽变体的遗传修饰和重组生产方 法。这些披露的相关教导通过引用并入本文，这些相关教导包括编码多肽的 多核苷酸序列、引物、载体、选择方法、宿主细胞、所表达的多肽变体的纯 化和重构以及如在此定义的多肽变体的表征，包括有用的缓冲液、pH范围、 Ca2+浓度、底物浓度和用于酶法测定的酶浓度。
提供编码SEQ ID NO:1、2、3、4或5的蛋白质的核酸序列或与编码 SEQ ID NO:1、2、3、4或5的蛋白质的核酸具有至少约66％、68％、70％、 72％、74％、78％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％ 序列同一性的核酸序列。在一个实施例中，核酸序列与SEQ ID NO:9、10、 11、12或13的核酸具有至少约60％、66％、68％、70％、72％、74％、78％、 80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
载体
在一方面，本发明使用包括多核苷酸的载体。在一方面，细菌细胞包括 载体。在一些实施例中，将包括编码变体的核酸的DNA构建体在包括与编码 序列可操作地连接的调节序列的表达载体中转移到宿主细胞。所述载体可以 是可被整合到真菌宿主细胞基因组中并在引入了宿主细胞时能被复制的任何 载体。密苏里大学的resc菌株目录列出了合适的载体。合适的表达和/或整合 载体的另外的实例提供于萨姆布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆：实验手 册(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第3版，冷泉港实验 室出版(Spring Harbor Laboratory Press)，纽约州冷泉港(2001)；班尼特 (Bennett)等人，更多在真菌中的基因操作(MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI)，学术出版社(AcademicPress)，圣地亚哥(1991)，pp.396- 428；以及美国专利号5,874,276。示例性载体包括pFB6、pBR322、PUC18、 pUC100和pENTR/D、pDONTM201、pDONRTM221、pENTRTM、
Figure RE-GDA0001412206280000281
3Z以 及
Figure RE-GDA0001412206280000282
4Z。用于细菌细胞的示例包括允许在大肠杆菌中复制的pBR322和 pUC19，以及例如允许在芽孢杆菌属中复制的pE194。
在一些实施例中，编码变体的核酸可操作地连接到合适的启动子，其允 许在宿主细胞中转录。所述启动子可源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白 的基因。启动子的合适的非限制性实例包括cbh1、cbh2、egl1、和egl2启动 子。在一个实施例中，该启动子是对宿主细胞天然的启动子。例如，当宿主 为嗜糖假单胞菌时，启动子为天然的嗜糖假单胞菌启动子。“诱导型启动 子”是指在环境调节或发育调节下具有活性的启动子。在另一个实施例中， 该启动子是对宿主细胞异源的启动子。
在一些实施例中，将编码序列可操作地连接到编码信号序列的DNA序 列上。在另一方面，代表性的信号肽是SEQ ID NO:27。代表性的信号肽是 SEQ ID NO:9，该SEQ ID NO:9是枯草芽孢杆菌aprE前体的天然信号序列。 在其他实施例中，将编码信号序列的DNA用编码来自其他细胞外枯草芽孢杆 菌前体的信号序列的核苷酸序列替代。在一个实施例中，编码信号序列的多 核苷酸紧邻编码多肽的多核苷酸的上游并在框内。所述信号序列可选自与宿 主细胞相同的物种。
在另外的实施例中，包扩待引入真菌宿主细胞的DNA构建体或载体的 信号序列和启动子序列衍生自相同的来源。在一些实施例中，表达载体还包 括终止序列。在一个实施例中，终止序列和启动子序列衍生自相同的来源。 在另一个实施例中，终止序列与宿主细胞是同源的。
在一些实施例中，表达载体包括选可选择的标志物。合适的可选择的标 志物的实例包括赋予抗微生物剂抗性的那些，例如潮霉素或腐草霉素。营养 选择性标志物也是合适的，并且包括amdS、argB和pyr4。在一个实施例中， 选择性标志物是编码乙酰胺酶的amdS基因；其允许经转化的细胞在作为氮源 的乙酰胺上生长。在凯利(Kelley)等人，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)4:475-479(1985)和彭蒂拉(Penttila)等人，基因(Gene)61:155-164 (1987)中描述了构巢曲霉amdS基因作为选择性标志物的用途。
包含具有编码变体的多核苷酸的DNA构建体的合适表达载体可以是能 够在给定的宿主生物体中自主复制或能够整合到宿主DNA中的任何载体。在 一些实施例中，表达载体是质粒。在一些实施例中，考虑了两种类型的表达 载体，用于获得基因表达。第一种表达载体包含这样的DNA序列，其中启动 子、编码区和终止子均来自待表达的基因。在一些实施例中，在其自身的转 录和翻译调节序列的控制下，通过删除不想要的DNA序列以留下待表达的结 构域而获得基因截短。预先组装第二种类型表达载体，并且包含高水平转录 所需的序列和可选择的标志物。在一些实施例中，将基因或其部分的编码区 插入到该通用表达载体中，这样使得它处于表达构建体启动子和终止子序列 的转录控制下。在一些实施例中，将基因或其部分插入强cbh1启动子的下 游。
表达宿主/宿主细胞
在另一方面，使用包括如在此所述的质粒或如在此所述的表达载体的， 优选经其转化的，宿主细胞。
在另一方面，使用能够表达如在此所述的多肽的细胞。
在一方面，如在此所述的宿主细胞或如在此所述的细胞是细菌、真菌或 酵母细胞。
在另一方面，宿主细胞选自由以下各项组成的组：瘤胃球菌属、双歧杆 菌属、乳球菌属、乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属、埃希氏杆菌属、芽孢 杆菌属、链霉菌属、酵母菌属、克鲁维酵母菌属、念珠菌属、圆酵母属、球 拟酵母属和曲霉属。
在另一方面，宿主细胞选自由以下各项组成的组：汉逊瘤胃球菌 (Ruminococcushansenii)、短双岐杆菌、长双歧杆菌、婴儿双岐杆菌、两歧 双歧杆菌和乳酸乳球菌。
在另一个实施例中，合适的宿主细胞包括选自由以下各项组成的组的革 兰氏阳性细菌：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆 菌、嗜热芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状 芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、变铅青链霉菌、或鼠灰链霉 菌；或革兰氏阴性细菌，其中所述革兰氏阴性细菌为大肠杆菌或假单胞菌属 物种。在一方面，宿主细胞是枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。在一个实施例中，宿主细胞是枯草芽孢杆菌，并且所表达的蛋白质被工程化以包括枯草芽 孢杆菌信号序列，如以下进一步详细阐述的。一方面，宿主细胞表达如权利 要求中所示的多核苷酸。
在一些实施例中，宿主细胞被遗传工程化以表达如在此定义的具有如下 氨基酸序列的多肽变体，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、4或5的多 肽具有至少约66％、68％、70％、72％、74％、78％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性。在 一些实施例中，编码如在此定义的多肽变体的多核苷酸将具有编码SEQ ID NO:1、2、3、4或5的蛋白质的核酸序列或与编码SEQ ID NO:1、2、3、4 或5的蛋白质的核酸具有至少约66％、68％、70％、72％、74％、78％、 80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸 序列。在一个实施例中，核酸序列与SEQ ID NO:9、10、11、12或13的核 酸具有至少约60％、66％、68％、70％、72％、74％、78％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
用于生产多肽的方法
在另外的方面，表达如本文所述的多肽的方法包括获得如本文所述的宿 主细胞或细胞，并且从该细胞或宿主细胞表达该多肽，以及任选地纯化该多 肽。可以在本发明中使用这样的多肽。
表达特征指当变体在特定的宿主细胞中产生时，所述变体改变的表达水 平。表达通常涉及在一定量的时间中，使用本领域已知的标准技术可从发酵 培养液中回收的活性变体的量。表达也可涉及在宿主细胞内产生的、或由宿 主细胞分泌的变体的量或速度。表达也可以涉及编码变体多肽的mRNA的翻 译速度。
转化、表达和宿主细胞的培养
将DNA构建体或载体引入宿主细胞中包括技术例如转化；电穿孔；核 显微注射；转导；转染，例如脂质转染介导的和DEAE-右旋糖酐介导的转 染；与磷酸钙DNA沉淀一起孵育；用DNA包被的微粒高速轰击；和原生质 体融合。通用转化技术是本领域已知的。参见例如奥苏贝尔(Ausubel)等人 (1987)，同上，第9章；萨姆布鲁克(Sambrook)等人(2001)，同上； 以及坎贝尔(Campbell)，现代遗传学(Curr.Genet.)16:53-56(1989)。 异源蛋白质在木霉属中的表达描述于例如美国专利号6,022,725；美国专利号 6,268,328；哈尔基(Harkki)等人，酶与微生物技术(Enzyme Microb. Technol.)13:227-233(1991)；哈尔基(Harkki)等人，生物技术 (BioTechnol.)7:596-603(1989)；EP 244,234；和EP 215,594。在一个实 施例中，用载体系统构建了遗传上稳定的转化体，由此编码变体的核酸被稳 定地整合到宿主细胞染色体中。然后通过已知的技术纯化所述转化体。
在一个非限制性实例中，包括amdS标志物的稳定转化体通过其更快的 生长速率和在包含乙酰胺的固体培养基上形成具有光滑而不是粗糙轮廓的圆 形菌落而区别于不稳定的转化体。此外，在一些情况下，如下进一步进行稳 定性的测试：在固体非选择性培养基上(例如缺少乙酰胺的培养基)培养转 化体、从所述培养基中收获孢子和测定随后萌芽并在含有乙酰胺的选择性培 养基上生长的孢子的百分比。可使用本领域已知的其它方法来选择转化体。
活性的鉴别
为了评估变体在宿主细胞中的表达，测定可以测量所表达的蛋白质、相 应的mRNA或β-半乳糖苷酶活性。例如，合适的测定包括使用适当标记的杂 交探针的RNA印迹法和DNA印迹法、RT-PCR(逆转录酶聚合酶链式反应) 和原位杂交。合适的测定还包括测量样品中的活性。该变体的活性的合适的 测定包括但不限于基于ONPG的测定或确定例如像在此的方法和实例中所描 述的反应混合物中的葡萄糖。
纯化本文披露的多肽的方法
通常，在细胞培养物中生产的变体被分泌到培养基中并且可被纯化或分 离，例如通过从细胞培养基中去除不需要的组分。在一些情况下，可从细胞 裂解物中回收变体。在此种情况中，使用本领域技术人员常规采用的技术从 产生酶的细胞中纯化所述酶。实例包括但不限于，例如：亲和层析、离子交 换层析法(包括高分辨率离子交换)、疏水相互作用层析、两相分配、乙醇 沉淀、反相HPLC、在二氧化硅或阳离子交换树脂上进行层析(如DEAE)、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和使用Sephadex G-75的凝胶过滤。将本 文披露的一种或多种多肽喷雾干燥。
喷雾干燥
一般而言，喷雾干燥是从液体中产生粉末的方法，其中悬浮液或溶液被 供给到雾化器并且形成的液滴与热气体混合。通常，本发明的多肽处于溶液 状态。液滴的溶剂因此蒸发，留下干的颗粒。常规的喷雾干燥技术可以用于 本发明的加工，例如在喷雾干燥手册(Spray-Drying Handbook)，第4版， 马斯特斯(K.Masters)(1985)(其通过引用结合在此)中讨论的那些。简 单的喷雾干燥器工厂设计具有表示喷雾干燥的特征的三个工艺阶段：
1)进料雾化；
2)通过混合干燥气体和喷雾进行液滴干燥；以及
3)干燥气体和喷雾的分离。
用于制备喷雾干燥的粉末的方法通常首先包括载体在水中的分散，然后 是该分散体的混合。然后将混合物喷雾干燥以产生粉末状产品。
因此，根据本发明的颗粒干燥通过喷雾干燥工艺来进行。在其最基本的 形式中，该工艺涉及以下各项：将液体或悬浮液通过雾化装置输送到干燥室 中；将雾化的液体或悬浮液的液滴与加热的空气流混合；在留下干燥颗粒的 空气流中蒸发液滴的挥发性成分。
雾化器可以是任何合适的类型。雾化器的非限制性实例包括高速旋转盘 雾化器、压力喷嘴雾化器、气动喷嘴雾化器和声波喷嘴雾化器。
本发明的喷雾干燥粉末也可以有利地用作用于双重包封方法的中间产物 或起始产品，即作为一种固体产品，该固体产品易于经历进一步包封，例如 在玻璃态基质中挤出以提供粒状递送系统，或在不同或类似的基质中经历第 二喷雾干燥操作，并且本发明还涉及组合物的该用途。
用于本发明的工艺中的喷雾干燥装置可以是各种的可商购的设备中的任 何一种。喷雾干燥装置的实例是脱水干燥器(起源：马萨诸塞州阿特尔伯勒 市的安海达诺公司(Anhydro Corp.of Attleboro Falls,Mass.))、尼罗干燥器 (Niro Dryer)(由尼罗喷雾器有限公司(Niro Atomizer Ltd.)，哥本哈根， 丹麦制造)或利弗拉什(Leaflash)装置(来源：CCM苏尔寿公司(CCM Sulzer))。优选地，使用具有压力喷嘴的喷雾干燥器。
喷雾干燥工艺的典型参数是本领域公知的，并且可以由本领域技术人员 容易地调整。
典型地本发明的颗粒具有在50至70μm之间包含的尺寸和在0.4g/cm3至 0.6g/cm3之间包含的体积密度。
然而，可以通过特别地选择喷嘴(孔口尺寸/直径)和雾化压力来调节所 得干燥粉末的粒度测定和体积密度，以便获得所希望的粉末流动性。
除了麦芽糖糊精和/或氯化钠之外，本发明的组合物还可以含有任选的成 分。
进入喷雾干燥器的流体的组合物可以被配制成使得在喷雾干燥工艺的初 始阶段中形成的通常为水性组合物的雾化液体包括至少一种多肽，该多肽典 型地以大于0.01或大于0.5重量百分比的浓度存在于液体组合物中。
在方法方面，本发明提供了用于增加喷雾干燥工艺的产率的方法
。该工艺提供了包含浓度典型地大于0.5重量百分比的多肽的颗粒。该 方法包括以下步骤：a)将水性组合物进料到喷雾干燥装置中，其中该水性组 合物包含麦芽糖糊精和/或氯化钠以及至少一种多肽，并且其中该至少一种多 肽典型地以20g/L至80g/L的浓度存在于水性组合物中；和b)喷雾干燥该组 合物。在水性组合物中，氯化钠应优选以一定水平存在，以便为最终的喷雾 干燥的组合物提供微生物稳定性，因此在水性组合物中10％-20％的范围是适 合的，最大为约25％。麦芽糖糊精能以5％-40％的范围、优选10％-30％的范 围用于水性组合物中。在一个实施例中，麦芽糖糊精以约17％使用。
含酶的液体或悬浮液可以用于本发明中，并且可以是例如发酵液或经加 工的发酵液。
发酵液包括微生物细胞和/或相关的细胞碎片(即生物质)。可以从发酵 液中除去一些或大部分的生物质以改变用于喷雾干燥的该液的性质。典型 地，在喷雾干燥之前，从该液中除去至少10重量百分比至20重量百分比的生 物质。通常，除去至少30％、40％、50％或60％的生物质，并且在某些情况 下，除去至少70％、80％、90％或95％的生物质。
可以使用各种技术从发酵液中除去生物质。
此类技术包括过滤、离心、絮凝及其组合。典型地，发酵液包含在0％和 35％之间的重量/重量干物质。通常，该液包括在0％和20％之间的重量/重量干 物质或在0％和15％之间的重量/重量干物质。在某些情况下，该发酵液含有在 5％和15％之间的重量/重量干物质。高达90％重量/重量的干物质是生物质。通 常，高达75％、50％或25％的重量/重量的干物质是生物质。在某些情况下，高 达10％重量/25％重量的干物质是生物质。
该发酵液可以通过去除粗颗粒或物体而除去淤渣。这样的颗粒/物体包括 通常来源于在发酵过程中添加到该液中的营养素的稻草、碎石、大豆粗磨粉 和其他非生物质不溶物。典型地通过以下方法之一来实现去除：滤除、过 滤、沉淀、离心和/或倾析该液。
在将含有酶的溶液或悬浮液用于本发明的情况下，该液体介质通常是 水。例如，含酶的材料可以是从发酵滤液加工获得的酶浓缩物。用于浓缩发 酵液的加工方法包括但不限于：超滤以减少含水量和低分子成分；将酶从发 酵滤液中提取到第二液体中；酶的结晶或沉淀，然后重悬浮，并且可以使用 通过柱色谱法进行的纯化，例如，通过泵送5倍发酵滤液穿过包含树脂的柱。
可以将材料添加到含酶的液体中以改善从液体中获得的喷雾干燥产品的 性质。这些添加剂的非限制性实例包括：盐(例如碱金属盐、碱土金属盐、 另外的氯化物盐、硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐，其中示例性的抗衡离子是钙、 钾和钠)；无机矿物或粘土(例如沸石、高岭土、膨润土、滑石和/或硅酸 盐)；碳水化合物(例如蔗糖和/或淀粉)；着色颜料(例如二氧化钛)；杀 生物剂(例如，
Figure RE-GDA0001412206280000331
)；分散剂；消泡剂；酸剂；碱剂；酶稳 定剂(例如甲硫氨酸或硫代硫酸盐)；酶抑制剂(例如硼酸蛋白酶抑制 剂)；粘合剂；其他酶及其组合。典型地聚合物添加剂是低的MW 15(< 250,000道尔顿)材料，或作为浆料添加，其中该添加剂为溶液状态。
优选的是提供其中以最低限度水平产生粉尘的工艺。我们已经发现，通 过在该工艺中使用马铃薯淀粉可以有利地降低粉尘水平。因此，在一个实施 例中，将马铃薯淀粉添加到含酶的液体中以改善从液体获得的喷雾干燥产品 的尺寸分布。在这样的实施例中，根据喷雾干燥工艺制备的组合物可以包含 5％-50％以重量计的麦芽糖糊精或氯化钠，25％-95％的马铃薯淀粉和20％-45％ 以重量计的酶，其中在任何一种配制品中组分(其可以在上述那些中包括另 外的组分)的总量等于以重量计的100％。
在喷雾干燥之前，含酶的液体也可以经历物理处理。这样的物理处理包 括但不限于加热液体和/或冷却液体和/或使液体散热、混合液体、对液体充 气、以及液体的超声处理。
典型地，用于本发明中的含酶液体包含至少1mg的“活性”酶/升液体， 例如催化活性的感兴趣的蛋白质。
典型地，液体包含约20g/L至80g/L活性多肽，其对应于约500LAU/g至 2000LAU/g活性多肽。
喷雾干燥颗粒的后加工
根据本发明形成的喷雾干燥颗粒可以使用各种方法进一步加工。此类方 法的非限制性实例包括混合器颗粒化、造粒、挤出、流化床工艺、涂覆、以 及碾磨/研磨和筛选。混合器颗粒化涉及将喷雾干燥的颗粒与水和另外的组分 混合。典型地，另外的组分是粘合剂、纤维、盐、水不溶性矿物质、颜料、 酶稳定剂或其组合。以足以将固体组分聚集成适合的平均尺寸的颗粒的量添 加水。随后使用合适的干燥方法除去水。用于本发明颗粒的混合器颗粒化工 艺中的粘合剂本质上是聚合体的。示例性粘合剂包括聚乙烯吡咯烷酮、糊精 和纤维素衍生物(例如羟丙基纤维素、甲基纤维素或羧甲基纤维素)。 Glucidex 21D，可获自法国罗盖特公司(Roquette Freres,France)，通常是合 适的粘合剂。用于混合器颗粒化工艺中的纤维包括纯的和/或不纯的纤维状纤 维素，例如锯屑、纯纤维状纤维素和棉花。还可以使用基于纤维状纤维素的 助滤剂。可商购的纤维状纤维素的实例包括CepoTM和ArbocellTM。可以使用如 在EP 304331 B1中所讨论的合成纤维，包括由聚乙烯、聚丙烯、聚酯，特别 是尼龙、聚乙烯基甲酸酯、聚(甲基)丙烯酸化合物制成的纤维。在混合器颗粒 化工艺中使用的盐包括水溶性和/或不溶性盐，例如硫酸盐、氯化物、碳酸盐 和磷酸盐的碱和/或碱土碱盐。
用于混合器颗粒化工艺的水不溶性矿物质包括沸石、粘土如高岭土和膨 润土、滑石和/或硅酸盐。用于混合器颗粒化工艺中的颜料包括二氧化钛。
用于混合器颗粒化工艺的酶稳定剂包括碱性或中性物质(例如金属硅酸 盐、碳酸盐或碳酸氢盐)；还原剂(例如亚硫酸盐、硫代亚硫酸盐或硫代硫 酸盐)；抗氧化剂(例如甲硫氨酸、丁基化羟基甲苯、或丁基化羟基茴香 醚)和/或第一过渡系金属离子的盐。这些试剂可以与相同或不同类别的其他 保护剂一起使用。许多混合器颗粒化工艺在本领域中是已知的，包括以下文 献中讨论的那些：美国专利号4,106,991；EP 170360 B1；EP 304332B1；EP 304331；WO 90/09440；和WO 90/09428。
造粒涉及将干燥颗粒悬浮在熔融的蜡中，然后喷雾冷却悬浮液。该工艺 在迈克尔(Michael)S.肖维尔(Showell)(编辑)；粉末状洗涤剂 (Powdered detergents)；表面活性剂科学系列；1998；第71卷，第140-142 页，马塞尔·德克尔出版社(Marcel Dekker)；和DK-PA 1999中讨论。造粒工 艺中使用的蜡具有在25℃和125℃之间的熔点，并且典型地是有机化合物或有 机化合物的盐。它通常在中性或碱性溶液中是水溶性的或水分散性的。水溶性蜡的非限制性实例是聚乙二醇(例如，PEG 1000)。
挤出涉及向颗粒中添加水分(单独地或与如所描述的用于混合器颗粒化 的添加剂混合地)以提供糊状物。将糊状物压制成小球，或在压力下通过小 开口挤出；然后将其切割成进行干燥的颗粒。挤出工艺在以下文献中讨论： 迈克尔(Michael)S.肖维尔(Showell)(编辑)；粉末状洗涤剂(Powdered detergents)；表面活性剂科学系列；1998；第71卷，第140-42页，马塞尔·德 克尔出版社(Marcel Dekker)；以及美国专利号4,661,452。
流化床工艺涉及将喷雾干燥的颗粒流体化在流化床中。使含有粘合剂的 溶液雾化并与流体化的颗粒接触。这导致颗粒结合在一起，形成更大、更强 的颗粒。本发明的喷雾干燥颗粒可以涂覆有一层或多层涂层。涂层可以包括 如上所述在混合器颗粒化部分中的材料，例如粘合剂、纤维、盐、水不溶性 材料、颜料、酶稳定剂或其组合。
上述工艺可以在任何阶段用碾磨/研磨和/或筛选工艺进行补充。例如， 可能希望在随后的加工步骤之前研磨喷雾干燥的颗粒并筛选最终产物以获得 希望的尺寸级分。
组合物、应用和用途
下面给出本发明的多肽或含有多肽的组合物的优选用途的实例。
在一个方面，本文披露了通过如本文所述用喷雾干燥的组合物处理包含 乳糖的底物来生产食物产品的方法。
在一个方面，本文披露了通过如本文所述用喷雾干燥的组合物处理包含 乳糖的基于乳的底物来生产乳制品的方法。
在一方面，将包括乳糖的底物进一步用水解的β-半乳糖苷酶处理。
在一方面，提供了一种组合物，优选地是食物组合物，更优选地是包含 如本文所述的细胞或多肽的乳制品。
此外，基于在组合物中与SEQ ID NO:22具有至少70％，例如像72％、 74％、74％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％序列同一性的多肽的 总量，在此披露了包括至少5％，例如像，10％、15％、20％、25％、30％、 35％、40％、45％、50％w/w的一种或多种多肽的组合物。这可以通过使用本 领域技术人员已知的以下技术来评估。使待评估的样品进行SDS-PAGE，并 使用适合于蛋白质定量的染料例如像伯乐标准(Bio-Rad Criterion)系统进行 可视化。然后使用适当的光密度扫描仪(例如像伯乐标准系统)扫描凝胶， 并确保所得图像处于动态范围内。对与衍生自SEQ ID NO:8的任何变体/片段 相对应的条带进行定量，并且如下计算多肽的百分比：所讨论的多肽的百分 比＝所讨论的多肽/(表现出转半乳糖基化活性的所有多肽的总和)*100。组 合物中衍生自SEQ ID NO:8的多肽变体/片段的总数可以通过本领域技术人员 已知的方法使用多克隆抗体通过蛋白质印迹检测衍生自SEQ IDNO:8的片段 来确定。
在一方面，根据本发明的组合物包含选自由以下各项组成的组的一种或 多种多肽：由SEQ ID NO:1、2、3、4和5组成的多肽。在另一方面，组合 物包含选自由以下各项组成的组的一种或多种多肽：由SEQ ID NO:1、2和3 组成的多肽。在又另一方面，组合物包含选自由以下各项组成的组的一种或 多种多肽：由SEQ ID NO:1和2组成的多肽。
在一个方面，本发明提供了包含根据本发明的酶复合物、处于麦芽糖糊 精和/或氯化钠形式的酶载体以及任选的稳定剂和/或防腐剂的酶复合物制剂。
在本发明的又另外的方面，组合物不包括多元醇例如甘油或水。
在另一方面，制剂/组合物包括稳定剂。在一个方面，稳定剂选自由以下 各项组成的组：无机盐类、糖类及其组合。在一个方面，稳定剂是无机盐如 氯化钾。在另一个方面，稳定剂不是多元醇，例如甘油、丙二醇或山梨糖 醇。在又另一方面，糖是小分子碳水化合物，特别是若干种甜味碳水化合物 如葡萄糖、半乳糖、果糖和蔗糖中的任何一种。
在还又一个方面，制剂包含防腐剂。在一个方面，防腐剂是对羟基苯甲 酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸盐、山梨酸盐或者其他食品批准的防腐 剂或者它们的混合物。
可用于制剂/组合物的赋形剂包括麦芽糖、蔗糖、葡萄糖(包括葡萄糖浆 或干葡萄糖浆)、预煮的淀粉、糊化淀粉、L-乳酸、抗坏血酸棕榈酸酯、生 育酚、卵磷脂、柠檬酸、柠檬酸盐、磷酸、磷酸盐、藻酸钠、角叉菜胶、刺 槐豆胶、瓜尔胶、黄原胶、果胶、羧甲基纤维素钠、甘油单酯和甘油二酯、 甘油二酯和甘油二酯的柠檬酸酯、蔗糖酯、二氧化碳、氩气、氦气、氮气、 一氧化二氮、氧气、氢气和辛基琥珀酸淀粉钠。
在一个方面，提供了通过如本文所述用喷雾干燥的组合物处理包含乳糖 的基于乳的底物来生产乳制品的方法。在另一方面，提供了通过将包括乳糖 的基于乳的底物用一种多肽处理用于生产乳制品的方法，该多肽在15min反 应后具有高于60％、如高于70％、如高于75％的相对转半乳糖基化活性。在 一方面，在30min反应后相对转半乳糖基化活性高于3。在另一方面，在30 min反应后相对转半乳糖基化活性高于6。在又另一方面，在30min反应后相 对转半乳糖基化活性高于12。在一个方面，提供了一种方法，其中用如本文 所述的多肽的处理在酶的活性的最佳温度下发生。在另外的方面，将多肽以 0.01-1000ppm的浓度添加到基于乳的底物中。在又另外的方面，将多肽以 0.1-100ppm的浓度添加到基于乳的底物中。在另外的方面，将多肽以1-10 ppm的浓度添加到基于乳的底物中。在一方面，提供了一种进一步包括用微 生物发酵底物如乳制品的方法。在另一方面，该乳制品是酸奶。在另外的方 面，基本上同时进行使用多肽和微生物的处理。在一个方面，基本上同时将 多肽和微生物添加到基于乳的底物中。
在一个方面，提供了包含如本文所述的喷雾干燥的组合物的乳制品。在 一个方面，将如本文定义的多肽以0.01-1000ppm的浓度添加。在一个方面， 提供了包含如本文定义的灭活多肽的乳制品。在一个方面，提供了包含通过 如本文定义的多肽原位形成的GOS的乳制品。在一方面，提供了包括如在此 定义的细胞的乳制品。
如在此所述的乳制品可以是例如脱脂乳、低脂乳、全脂乳、奶油、UHT 乳、具有延长的保质期的乳、发酵的乳制品、奶酪、酸奶、黄油、乳质涂抹 料(dairy spread)、黄油乳、酸化乳饮料、酸奶油、乳清基饮料、冰淇淋、 炼乳、牛奶焦糖酱(dulce de leche)或风味乳饮料。乳制品可以通过本领域已 知的任何方法制造。
乳制品还可以包括非乳组分，例如，植物组分如植物油、植物蛋白和/或 植物碳水化合物。乳制品还可以包括另外的添加剂，如酶、调味剂、微生物 培养物如益生菌培养物、盐、甜味剂、糖、酸、水果、果汁或本领域已知的 可作为乳制品的组分或添加到乳制品中的任何其他组分。
在本发明的一个实施例中，一种或多种乳组分和/或乳馏分占乳制品的至 少50％(重量/重量)，如至少70％，例如至少80％，优选地至少90％。
在本发明的一个实施例中，已经用如在此定义的具有转半乳糖基化活性 的酶处理的一种或多种基于乳的底物占乳制品的至少50％(重量/重量)，如 至少70％，例如至少80％，优选地至少90％。
在本发明的一个实施例中，该乳制品是未通过添加预先生产的低聚半乳 糖而被浓缩的乳制品。
在本发明的一个实施例中，经多肽处理的基于乳的底物在用作乳制品中 的成分之前未进行干燥。
在本发明的一个实施例中，该乳制品是冰淇淋。在上下文中，冰淇淋可 以是任何种类的冰淇淋，如全脂冰淇淋、低脂冰淇淋或基于酸奶或其他发酵 的乳产品的冰淇淋。冰淇淋可以通过本领域已知的任何方法制造。
在本发明的一个实施例中，该乳制品是乳或炼乳。
在本发明的一个实施例中，该乳制品是UHT乳。在本发明的上下文中 的UHT乳是已经进行灭菌程序的乳，其旨在杀死包括细菌孢子在内的所有微 生物。UHT(超高温)处理可以是例如在130℃下热处理30秒，或者在 145℃下热处理1秒。
在本发明的一个优选实施例中，该乳制品是ESL乳。在上下文中，ESL 乳是由于微量过滤和/或热处理而具有延长的保质期，并且能够在2℃-5℃的 商店架上保持新鲜至少15天，优选至少20天的乳。
在本发明的另一个优选实施例中，该乳制品是发酵的乳制品，例如酸 奶。
用于大多数发酵的乳产品的微生物选自由通常称为乳酸菌的细菌组成的 组。如在此所用，术语“乳酸菌”是指革兰氏阳性、微量需氧或厌氧细菌， 该细菌发酵糖，并且产生酸，这些酸包括作为主要产生的酸的乳酸、乙酸和 丙酸。工业上最有用的乳酸菌可在“乳杆菌(Lactobacillales)”目中找到， 其中包括乳球菌属物种、链球菌属物种、乳杆菌属物种、明串珠菌属物种、 假明串珠菌属物种、片球菌属物种、短杆菌属物种、肠球菌属物种和丙酸菌 属物种。此外，乳酸菌组中通常包括属于厌氧细菌的组的产乳酸细菌，双歧 杆菌，即双歧杆菌属物种，这些产乳酸细菌常单独或与乳酸菌组合用作食品 培养物。
乳酸菌通常作为冷冻或冻干培养物供应给奶业，用于进行起子增殖 (bulkstarter propagation)或者所谓的“直投式”(DVS)培养物，旨在直接 接种入发酵容器或桶中用于产生发酵乳制品。这种培养物通常称作“起子培 养物”或“起子”。
常用的乳酸菌的起子培养物菌株通常分成嗜常温生物体(其最适生长温 度约30℃)，和嗜热生物体(其最适生长温度在约40℃至约45℃的范围 内)。属于嗜常温组的典型生物体包括乳酸乳球菌、乳酸乳球菌乳脂亚种 (Lactococus lactis subsp.cremoris)、肠膜状明串珠菌乳脂亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris)、肠膜状假明串珠菌乳脂亚种 (Pseudoleuconostoc mesenteroides subsp.cremoris)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸乳球菌乳酸亚种双乙酰生物突变株 (Lactococuslactis subsp.lactis biovar.diacetylactis)、干酪乳杆菌干酪亚种 (Lactococuscasei subsp.casei)和副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactococus paracaseisubsp.paracasei)。嗜热乳酸细菌物种包括例如嗜热链球菌、屎肠球 菌、德氏乳杆菌乳酸亚种、瑞士乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜酸乳 杆菌。
此外，属于双歧杆菌属的厌氧细菌，包括两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌 和长双歧杆菌常用作乳品起子培养物，并且通常包括在乳酸菌组中。此外， 丙酸杆菌属物种用作乳品起子培养物，特别是在奶酪的制造中。此外，属于 双歧杆菌属的生物体通常用作食物起子培养物。
另一组微生物起子培养物是真菌培养物，包括丝状真菌的酵母培养物和 培养物，其具体用于制造某些类型的奶酪和饮料。真菌的实例包括娄地青 霉、白青霉(Penicilliumcandidum)、白地霉、开菲尔圆酵母、开菲尔酵母 和酿酒酵母。
在本发明的一个实施例中，用于基于乳的底物发酵的微生物是干酪乳杆 菌、或嗜热链球菌和德氏乳酸杆菌保加利亚亚种的混合物。
本发明的方法中使用的发酵方法是众所周知的，并且本领域的技术人员 知道如何选择合适的工艺条件，如温度、氧、微生物的量和特征、添加剂如 碳水化合物、调味剂、矿物质、酶、和处理时间。显然，选择发酵条件以便 支持本发明的实现。
作为发酵的结果，将降低基于乳的底物的pH。本发明的发酵乳制品的 pH可以是，例如，在3.5-6的范围内，如在3.5-5的范围内，优选在3.8-4.8的 范围内。
在一个方面，提供了使用喷雾干燥的组合物的方法来生产低聚半乳糖，
在本发明的一个实施例中，通过将喷雾干燥的组合物在包含乳糖底物的 培养基中孵育来生产GOS。在生产GOS的条件下进行孵育。
在一个方面，提供了本文披露的喷雾干燥的组合物用于生产选自由以下 各项组成的组的产品的用途：酸奶、奶酪、发酵的乳产品、膳食补充剂和益 生菌可食用产品。
在一个方面，本文所述的喷雾干燥的组合物可以用于制备奶酪产品并且 可以在制作奶酪产品的方法中使用。例如，奶酪产品可以选自由以下各项组 成的组：奶油奶酪、松软奶酪、和精制奶酪。通过添加多肽，奶酪可能含有 显著增加的低聚半乳糖的水平和降低的乳糖水平。在一方面，最终奶酪产品 中的乳糖水平可以降低至少约25％，优选至少约50％，并且更优选至少约 75％。多肽可用于将奶酪产品中的乳糖降低至每份小于约1克，这是大多数乳 糖不耐个体可以耐受的量。
在此提供的奶酪产品是具有增加的可溶性纤维含量、降低的热量含量、 优异的感官特性、改进的质地和风味的营养增强的奶酪产品。此外，在此所 述的多肽可以降低奶酪产品的血糖指数，因为GOS比乳糖或其水解产物更慢 地吸收。最后，多肽可以降低奶酪产品，特别是奶油奶酪产品的生产成本， 因为GOS意外地为奶油奶酪产品提供改善的质地，从而允许减少稳定剂的使 用，或通过允许增加水分含量而无需脱水。
在另外的方面，提供了包含如本文所述的喷雾干燥的组合物和碳水化合 物底物的组合物。在另一方面，该碳水化合物底物是二糖。另一方面，该二 糖是例如乳果糖、海藻糖、鼠李糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖或纤维二糖。在又 另一方面，该碳水化合物底物是乳糖。制备组合物，这样使得产生寡糖。如 在此所述的多肽可以是选自由以下各项组成的组的产物的一部分：酸奶、奶 酪、发酵的乳产品、膳食补充剂和益生菌食物产品。在一方面，提供了包括 如在此所述的多肽和稳定剂的组合物。稳定剂的实例是糖或糖醇、乳酸、硼 酸或硼酸衍生物(例如芳香族硼酸酯)。优选地，稳定剂不是多元醇，例如 像甘油或丙二醇。
在一个方面，提供了在本文披露的组合物中的转半乳糖基化多肽用于生 产低聚半乳糖的用途。在一个方面，提供了喷雾干燥的组合物用于生产低聚 半乳糖的用途，该低聚半乳糖将成为选自由以下各项组成的组的产品的一部 分：酸奶、奶酪、发酵乳制品、膳食补充剂和益生菌可食用产品。在一方 面，该产品是酸奶、奶酪或发酵的乳制品。在一个方面，提供了如本文披露 的喷雾干燥的组合物用于生产低聚半乳糖以增强双歧杆菌的生长的用途。在 一个方面，提供了如本文披露的喷雾干燥的组合物或如本文披露的细胞在混合培养发酵中用于生产低聚半乳糖以增强双歧杆菌的生长的用途。
用将乳糖转化为单糖或GOS的酶处理乳产品具有若干个优点。首先，产 品可以被患有乳糖不耐症的人消耗，否则会出现症状如胃肠气胀和腹泻。其 次，与乳糖相比，用乳糖酶处理的乳制品将比类似的未处理产品具有更高的 甜度，这是因为葡萄糖和半乳糖的更高的感知甜度。这种效果对于应用如酸 奶和冰淇淋尤为有益，其中最终产品的高甜度是所希望的，并且这允许所消 耗的产品中的碳水化合物的净减少。第三，在冰淇淋生产中，经常看到称为 沙质的现象，其中乳糖分子由于乳糖的相对低的溶解度而结晶。当乳糖转化 为单糖或GOS时，冰淇淋的口感比未处理产品大大改进。可以消除由于乳糖 结晶引起的沙感的存在，并且可以通过用乳清粉替代脱脂乳粉来降低原料成 本。酶处理的主要作用是增加甜味。
在一个方面，如本文披露的喷雾干燥的组合物可以与其他酶一起使用， 这些酶例如是：蛋白酶(例如凝乳酶(chymosin)或肾素(rennin))、脂酶 (例如磷脂酶)、淀粉酶、转移酶和乳糖酶。在一方面，如在此披露的一种 或多种转半乳糖基化多肽可与乳糖酶一起使用。当用如在此披露的一种或多 种转半乳糖基化多肽处理后，特别是在低乳糖水平下希望减少残留的乳糖 时，这可以是特别有用的。在本发明的上下文中，乳糖酶是具有将二糖乳糖 水解成为成分半乳糖和葡萄糖单体的能力的任何糖苷水解酶。乳糖酶的组包 括但不限于分配在EC 3.2.1.108亚类的酶。分配到其他亚类的酶，例如像EC 3.2.1.23，也可以是本发明上下文中的乳糖酶。在本发明的上下文中的乳糖酶 可以具有除乳糖水解活性之外的其他活性，例如转半乳糖基化活性。在本发 明的上下文中，乳糖酶的乳糖水解活性可以称为其乳糖酶活性或其β-半乳糖 苷酶活性。具有用于本发明的方法中的乳糖酶活性的酶可以是动物、植物或 微生物来源的。优选的酶是从微生物来源获得，特别是从丝状真菌或酵母或 从细菌获得的。该酶可以例如衍生自如下各项的菌株：伞菌属，例如双孢蘑 菇；Ascovaginospora；曲霉属，例如黑曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲 霉、米曲霉；念珠菌属；毛壳菌属；Chaetotomastia；网柄菌属，例如盘基网 柄菌；克鲁维酵母菌属，例如脆壁克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母；毛霉属， 例如爪哇毛霉、高大毛霉、细小毛霉；脉孢菌属，例如粗糙脉孢菌；根毛霉 属，例如微小根毛霉；根霉属，例如少根根霉、日本根霉、匍枝根霉；核盘霉属，例如白腐核盘霉；圆酵母属；球拟酵母属；毛癣菌属，例如红色毛癣 菌；维氏核盘菌属，例如大豆维氏核盘菌；芽孢杆菌属，例如凝结芽孢杆 菌、环状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、诺瓦利斯芽孢杆菌(B.novalis)、枯草 芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌；双歧杆菌 属，例如长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌；金黄杆菌属；柠檬酸 杆菌属，例如弗氏柠檬酸杆菌；梭菌属，例如产气荚膜梭菌；色二孢属，例 如棉色二孢；肠杆菌属，例如产气肠杆菌，阴沟肠杆菌；爱德华菌属，迟钝 爱德华菌；欧文氏菌属，例如草生欧文氏菌；埃希氏菌属，例如大肠杆菌； 克雷伯氏菌属，例如肺炎克雷伯氏菌；多球菌属(Miriococcum)；漆斑菌 属；毛霉属；脉孢菌属，例如粗糙脉孢菌；变形杆菌属，例如普通变形杆 菌；普罗维登斯菌属，例如斯氏普罗威登斯菌；密孔菌属，例如朱红密孔 菌、血红密孔菌；瘤胃球菌属，例如扭链瘤胃球菌；沙门氏菌属，例如鼠伤 寒沙门菌；沙雷氏菌属，例如液化沙雷氏菌、粘质沙雷氏菌；志贺菌属，例 如弗氏志贺菌；链霉菌属，例如抗菌素链霉菌、栗色球孢链霉菌(S. castaneoglobisporus)、紫红链霉菌(S.violeceoruber)；栓菌属；木霉属，例 如里氏木霉、绿色木霉；耶尔森氏菌属，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌。在一 个实施例中，乳糖酶是微生物像克鲁维酵母属和芽孢杆菌属微生物的细胞内 组分。克鲁维酵母属(特别是脆壁克鲁维酵母和乳酸克鲁维酵母)以及其他 真菌例如假丝酵母属、圆酵母和球拟酵母属的那些是真菌乳糖酶的常见来 源，而凝结芽孢杆菌和环状芽孢杆菌是细菌乳糖酶的公知来源。从这些生物 体来源的若干种商业乳糖酶制剂是可获得的，例如Lactozym.RTM.(可获自 诺维信公司(Novozymes)，丹麦)、HA-Lactase(可获自Chr.Hansen公 司，丹麦)和Maxilact.RTM.(可获自DSM公司，荷兰)，全部来自乳酸克 鲁维酵母。所有这些乳糖酶都是所谓的中性乳糖酶，该中性乳糖酶具有在pH 6和pH 8之间的最佳pH。当这样的乳糖酶用于生产例如低乳糖酸奶时，酶处 理将必须在发酵前的单独步骤中进行，或者必须使用相当高的酶剂量，因为 在发酵过程中它们的活性随着pH降低而降低。而且，这些乳糖酶不适合于在 高温下进行的乳中的乳糖的水解，这在一些情况下对于保持低的微生物数 量，从而确保良好的乳质量而言是有益的。
在一个实施例中，酶是来自细菌的乳糖酶，例如来自双歧杆菌科的乳糖 酶，例如来自双歧杆菌属的乳糖酶，例如尤其在WO 2009/071539和WO 2013/182686中所述的乳糖酶。
材料与方法
方法1
多肽的生产
被设计成用于编码两歧双歧杆菌全长(1752个残基)基因的、具有针对 在枯草芽孢杆菌中表达所优化的密码子的合成基因购自GeneART(雷根斯 堡，德国)SEQ ID No.8。
采用反向引物，使用聚合酶链式反应构建两歧双歧杆菌截短突变体，其 允许合成基因的所选择的区域的特异性扩增。
正向引物：GGGGTAACTAGTGGAAGATGCAACAAGAAG(加下划线 的SpeI)(SEQ ID NO:15)。
截短突变体和相应的反向引物的SEQ ID如下表2所示。
Figure RE-GDA0001412206280000421
表2
使用独特的限制性位点SpeI和PacI(图1)将合成基因克隆到pBNspe 枯草芽孢杆菌表达载体中，并且将分离的质粒转化到枯草芽孢杆菌菌株中。 作为选择，将转化体重新划线到包含10μg/mL新霉素的LB平板上。
在含有10μg/mL新霉素的LB培养基中建立预培养，并且在37℃和180 rpm振摇下培养7小时。将500μL该预培养物用于接种包含10μg/mL新霉素 的50mL格兰特氏(Grant′s)改良培养基，以允许在33℃和180rpm震荡下 生长68小时。
通过直接添加到1mg/ml溶菌酶(西格玛-奥德里奇公司(Sigma- Aldrich))和10U/ml核酸酶(默克公司(Merck))终浓度的培养基中将细 胞裂解，并在33℃、180RPM下孵育1hr。通过以10.000x g离心20分钟清 除溶解产物，随后无菌过滤。
格兰特氏改良培养基按照以下指示制备：
第I部分(高压釜)
Soytone 10g
使达到 每升500mL
第II部分
1M K2HPO4 3mL
葡萄糖 75g
尿素 3.6g
格兰特氏10X MOPS 100mL
使达到每升400mL
制备第I部分(2w/w％大豆蛋白胨)，并且在121℃下高压灭菌25分 钟。
制备第II部分，并且与第I部分混合，并且用HCl/NaOH将pH调节至 pH 7.3。
使体积达到全体积并通过0.22-μm PES过滤器灭菌。
按照以下指示制备10xMOPS缓冲液：
Figure RE-GDA0001412206280000431
用水使达到大约900mL并且溶解。用KOH调节pH至7.4，装填至1L 并且将溶液通过0.2μm PES过滤器无菌过滤。
按照以下指示制备100x微量营养素：
Figure RE-GDA0001412206280000432
Figure RE-GDA0001412206280000441
用水溶解并调节体积至1L。
通过0.2μm PES过滤器进行灭菌。
在4℃下避光储存。
方法2
纯化和酶制剂
将经过滤的酶分离物使用具有10kDa MW截留的VivaSpin超滤装置 (Vivaspin20，赛多利斯(Sartorius)，Lot#12VS2004)浓缩，并且将浓缩物 加载到PD10脱盐柱(GE医疗公司(GE Healthcare)，Lot#6284601)上并在 20mM Tris-HCl(pH 8.6)中洗脱。在
Figure RE-GDA0001412206280000442
FPLC系统(GE医疗集团)上手 动进行色谱分析法。将4mL包含约20mg蛋白质的脱盐样品加载到2mL HyperQ柱(HyperCelTM，Q吸附剂)上，该柱用20mM Tris-HCl(pH 8.6) 以1ml/min的流速平衡。将该柱用30CV(柱体积)洗涤缓冲液彻底洗涤， 并且将结合的β半乳糖苷酶用100CV长梯度洗脱到20mM Tris-HCl(pH 8.6)250mM NaCl中。使用20mM Tris-HCl pH 8.6 500mMNaCl，通过一步 洗脱除去柱上剩余的杂质。针对β-半乳糖苷酶活性并且通过SDS-page分析流 过液和洗脱液中的蛋白。
根据制造商规程，用英杰公司
Figure RE-GDA0001412206280000443
Novex 4％-12％Bis-Tris凝胶1.0 mm、10孔(Cat#NP0321box)、
Figure RE-GDA0001412206280000444
Plus2预染标准品(Cat# LC5925)和
Figure RE-GDA0001412206280000445
MES SDS运行缓冲液(Cat#NP0002)运行SDS-page 凝胶。凝胶用简蓝安全染料(Simply BlueSafestain，英杰公司，目录# LC6060)染色(图2)。
方法3
测量β-半乳糖苷酶活性
使用市售的底物2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)(西格玛 (Sigma)N1127)测量酶活性。
ONPG w/o受体
100 mM KPO4pH 6.0
12,3 mM ONPG
补充有受体的ONPG
100 mM KPO4pH 6.0
20 mM纤维二糖
12,3 mM ONPG
终止溶液
10％Na2CO3
将10μl稀释系列的纯化的酶添加到包含90μl ONPG缓冲液的具有或没 有受体的微量滴定板的孔中。将样品混合并在37℃下孵育10min，然后向每 个孔中添加100μl终止溶液以终止反应。在由Softmax软件包控制的分子装 置SpectraMax平板读数器上在420nm下记录吸光度测量值。
如下计算转半乳糖基化活性的比率：
对于其中吸光度在0.5和1.0之间的稀释液，转半乳糖基化活性比率＝ (Abs420+纤维二糖/Abs420-纤维二糖)*100(图3)。
方法4
LAU活性的确定
原理：
该测定方法的原理是乳糖酶在37℃下将2-邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)水解成2-邻硝基苯酚(ONP)和半乳糖。用碳酸钠停止反应，并在 分光光度计或色度计在420nm下测量释放的ONP。
试剂：
MES缓冲液pH 6.4(100mM MES pH 6.4，10mM CaCl2)：将19,52g MES水合物(Mw：195.2g/mol，西格玛-奥德里奇(Sigma-aldrich)#M8250- 250G)和1.470g CaCl2二水合物(Mw：147.01g/mol，西格玛-奥德里奇)溶 解在1000ml ddH2O中，通过10M NaOH将pH调节至6.4。通过0.2μm滤器过滤 溶液，并在4℃下储存1个月。
ONPG底物pH 6.4(12.28mM ONPG，100mM MES pH 6.4，10mM CaCl2)：将0.370g 2-邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG，Mw：301.55 g/mol，西格玛-奥德里奇#N1127)溶解在100ml MES缓冲液pH 6.4中，并在 4℃下黑暗保存长达7天。
终止试剂(10％Na2CO3)：将20.0g Na2CO3溶解在200ml ddH2O中，通 过0.2μm滤器过滤溶液，并在室温下保存1个月。
程序：
在MES缓冲液(pH 6.4)中制备稀释系列的酶样品，并且将10μL每个 样品稀释液转移到包含90μl ONPG底物(pH 6.4)的微量滴定板(96孔格 式)的孔中。将样品混合并使用恒温混匀仪(舒适型恒温混匀仪(Comfort Thermomixer)，艾本德(Eppendorf))在37℃下孵育5min，并且随后向每 个孔中添加100μl终止试剂以终止反应。使用MES缓冲液(pH 6.4)代替酶 样品构建空白。在ELISA读数器(SpectraMax平板读数器，分子装置公司 (MolecularDevice))上针对空白测量在420nm处的吸光度的增加。
酶活性计算：
确定MES缓冲液(pH 6.4)中2-邻硝基苯酚(西格玛-奥德里奇#33444- 25G)的摩尔消光系数(0.5998x 10-6M-1x cm-1)。一个单位(U)的乳糖酶 活性(LAU)被定义为对应于每分钟1nmol的ONPG水解的量。使用总反应体 积为200μL(光路径为0.52cm)的微量滴定板，可以使用以下公式计算每mL 酶样品的乳糖酶活性：
Figure RE-GDA0001412206280000461
计算在此示为SEQ ID NO:1的BIF917的比活度：
BIF917浓度的确定：
使用Criterion Stain free SDS-page系统(伯乐公司(BioRad))确定靶 酶(BIF917)和截短产物的定量。将任何kD Stain free预制凝胶4％-20％Tris- HCl，18孔(康贝公司(Comb)#345-0418)与塞尔瓦(Serva)Tris-甘氨酸 /SDS缓冲液(伯乐公司目录号42529)一起使用。使用以下参数运行凝胶： 200V、120mA、25W、50min。使用BSA(1,43mg/ml)(西格玛-奥德里 奇，目录号500-0007)作为蛋白质标准品，并且将Criterion Stain Free成像仪 (伯乐公司)与Image Lab软件(伯乐公司)一起使用，用于使用与色氨酸含 量相关的带强度进行定量。
从两种独立发酵(如方法1中所述)的粗制酵素(超滤浓缩物)并且使 用5种不同稀释度(参见表1)确定BIF917的特异性LAU活性。
发现BIF917比活度为21.3LAU/mg或0.0213LAU/ppm。
表1：BIF917比活度的确定
Figure RE-GDA0001412206280000462
Figure RE-GDA0001412206280000471
实例1
进行实验以测试透析过滤(DF)、膨润土处理(BT)和热处理(HT) 对用甘油配制的BIF917的物理稳定性的影响。
配制品详情在下表中给出：
Figure RE-GDA0001412206280000481
将样品在5℃、20℃和37℃的以下储存条件下孵育。
结果示于图1。
实例2
还研究了配制品对实际GOS形成的对应用相关底物乳糖的酶促活性的影 响。令人惊讶地发现，由于不希望的半乳糖基-甘油而不是应用中所希望的 GOS的产生，甘油在应用中的存在对GOS产生活性具有显著的负面影响。仅 当通过例如HPLC而不是通过发色底物ONPG分析实际反应产物时才能检测 到半乳糖基-甘油的存在，因为该测定法仅测量ONP的释放。特别地，令人惊 讶地发现(如在图2和图3中所示)使用大于0.1wt％的甘油干扰转半乳糖基 化反应，导致所希望的GOS的较低产率。少量的甘油需要扰乱GOS产生， 表明该酶在游离甘油存在下是有效的产生半乳糖基-甘油的酶。
实例3
将BIF917酶混合以提供根据下表的并且随后喷雾干燥的中间体配制 品。
Figure RE-GDA0002624958120000011
Figure RE-GDA0001412206280000501
在以下各种储存条件中的每一个下研究配制品对活性的影响：5℃、 20℃和37℃。样品#1、3和5的结果显示在图4中，并且它们表明在配制后 保留良好的转半乳糖基化活性。
实例4
马铃薯淀粉对粉尘减少的影响如图5所示。
上述说明书中提及的所有出版物通过引用结合在此。本发明的所描述的 方法和系统的各种修改和变化对于本领域的技术人员将是显而易知的，而不 背离本发明的范围和精神。尽管本发明已经结合特定的优选实施例进行了说 明，但应该理解受权利要求书保护的本发明不应该不当地受限于此类特定的 实施例。事实上，对于化学、生物化学、生物学、或相关领域的技术人员而 言显而易见的、用于执行本发明的所述模式的各种修改预期在以下权利要求 的范围内。
序列表
>SEQ ID NO:1(BIF_917)
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>SEQ ID NO:2(BIF_995)
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>SEQ ID NO:3(BIF_1068)
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>SEQ ID NO:4(BIF_1172)
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>SEQ ID NO:5(BIF_1241)
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>SEQ ID NO:6(BIF_1326)
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>SEQ ID NO:7两歧双歧杆菌糖苷水解酶催化核心
qnrtsdfdanwkfmlsdsvqaqdpafddsawqqvdlphdysitqkysqsneaesaylpggtgwyrksftidrdla gkriainfdgvymnatvwfngvklgthpygyspfsfdltgnakfggentivvkvenrlpssrwysgsgiyrdvtltv tdgvhvgnngvaiktpslatqnggdvtmnlttkvandteaaanitlkqtvfpkggktdaaigtvttasksiaagasad vtstitaaspklwsiknpnlytvrtevlnggkvldtydteygfrwtgfdatsgfslngekvklkgvsmhhdqgslgav anrraierqveilqkmgvnsirtthnpaakalidvcnekgvlvveevfdmwnrskngntedygkwfgqaiagdn avlggdkdetwakfdltstinrdrnapsvimwslgnemmegisgsvsgfpatsaklvawtkaadstrpmty
>SEQ ID NO:8编码全长的核苷酸序列
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>SEQ ID NO:9编码BIF_917的核苷酸序列
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>SEQ ID NO:10编码BIF_995的核苷酸序列
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>SEQ ID NO:11编码BIF_1068的核苷酸序列
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>SEQ ID NO:12编码BIF_1172的核苷酸序列
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>SEQ ID NO:14编码BIF_1326的核苷酸序列
gttgaagatgcaacaagaagcgatagcacaacacaaatgtcatcaacaccggaagttgtttattcatcagcggtcgatag caaacaaaatcgcacaagcgattttgatgcgaactggaaatttatgctgtcagatagcgttcaagcacaagatccggcatt tgatgattcagcatggcaacaagttgatctgccgcatgattatagcatcacacagaaatatagccaaagcaatgaagcag aatcagcatatcttccgggaggcacaggctggtatagaaaaagctttacaattgatagagatctggcaggcaaacgcatt gcgattaattttgatggcgtctatatgaatgcaacagtctggtttaatggcgttaaactgggcacacatccgtatggctattc accgttttcatttgatctgacaggcaatgcaaaatttggcggagaaaacacaattgtcgtcaaagttgaaaatagactgcc gtcatcaagatggtattcaggcagcggcatttatagagatgttacactgacagttacagatggcgttcatgttggcaataat ggcgtcgcaattaaaacaccgtcactggcaacacaaaatggcggagatgtcacaatgaacctgacaacaaaagtcgc gaatgatacagaagcagcagcgaacattacactgaaacagacagtttttccgaaaggcggaaaaacggatgcagcaat tggcacagttacaacagcatcaaaatcaattgcagcaggcgcatcagcagatgttacaagcacaattacagcagcaag cccgaaactgtggtcaattaaaaacccgaacctgtatacagttagaacagaagttctgaacggaggcaaagttctggata catatgatacagaatatggctttcgctggacaggctttgatgcaacatcaggcttttcactgaatggcgaaaaagtcaaact gaaaggcgttagcatgcatcatgatcaaggctcacttggcgcagttgcaaatagacgcgcaattgaaagacaagtcgaa atcctgcaaaaaatgggcgtcaatagcattcgcacaacacataatccggcagcaaaagcactgattgatgtctgcaatga aaaaggcgttctggttgtcgaagaagtctttgatatgtggaaccgcagcaaaaatggcaacacggaagattatggcaaat ggtttggccaagcaattgcaggcgataatgcagttctgggaggcgataaagatgaaacatgggcgaaatttgatcttaca tcaacaattaaccgcgatagaaatgcaccgtcagttattatgtggtcactgggcaatgaaatgatggaaggcatttcaggc tcagtttcaggctttccggcaacatcagcaaaactggttgcatggacaaaagcagcagattcaacaagaccgatgacat atggcgataacaaaattaaagcgaactggaacgaatcaaatacaatgggcgataatctgacagcaaatggcggagttgt tggcacaaattattcagatggcgcaaactatgataaaattcgtacaacacatccgtcatgggcaatttatggctcagaaac agcatcagcgattaatagccgtggcatttataatagaacaacaggcggagcacaatcatcagataaacagctgacaagc tatgataattcagcagttggctggggagcagttgcatcatcagcatggtatgatgttgttcagagagattttgtcgcaggca catatgtttggacaggatttgattatctgggcgaaccgacaccgtggaatggcacaggctcaggcgcagttggctcatg gccgtcaccgaaaaatagctattttggcatcgttgatacagcaggctttccgaaagatacatattatttttatcagagccagt ggaatgatgatgttcatacactgcatattcttccggcatggaatgaaaatgttgttgcaaaaggctcaggcaataatgttcc ggttgtcgtttatacagatgcagcgaaagtgaaactgtattttacaccgaaaggctcaacagaaaaaagactgatcggcg aaaaatcatttacaaaaaaaacaacagcggcaggctatacatatcaagtctatgaaggcagcgataaagattcaacagc gcataaaaacatgtatctgacatggaatgttccgtgggcagaaggcacaatttcagcggaagcgtatgatgaaaataatcgcctgattccggaaggcagcacagaaggcaacgcatcagttacaacaacaggcaaagcagcaaaactgaaagcagatgcggatcgcaaaacaattacagcggatggcaaagatctgtcatatattgaagtcgatgtcacagatgcaaatggccata ttgttccggatgcagcaaatagagtcacatttgatgttaaaggcgcaggcaaactggttggcgttgataatggctcatcac cggatcatgattcatatcaagcggataaccgcaaagcattttcaggcaaagtcctggcaattgttcagtcaacaaaagaa gcaggcgaaattacagttacagcaaaagcagatggcctgcaatcaagcacagttaaaattgcaacaacagcagttccg ggaacaagcacagaaaaaacagtccgcagcttttattacagccgcaactattatgtcaaaacaggcaacaaaccgattct gccgtcagatgttgaagttcgctattcagatggaacaagcgatagacaaaacgttacatgggatgcagtttcagatgatc aaattgcaaaagcaggctcattttcagttgcaggcacagttgcaggccaaaaaattagcgttcgcgtcacaatgattgatg aaattggcgcactgctgaattattcagcaagcacaccggttggcacaccggcagttcttccgggatcaagaccggcagt cctgccggatggcacagtcacatcagcaaattttgcagtccattggacaaaaccggcagatacagtctataatacagca ggcacagtcaaagtaccgggaacagcaacagtttttggcaaagaatttaaagtcacagcgacaattagagttcaaagaa gccaagttacaattggctcatcagtttcaggaaatgcactgagactgacacaaaatattccggcagataaacaatcagat acactggatgcgattaaagatggctcaacaacagttgatgcaaatacaggcggaggcgcaaatccgtcagcatggaca aattgggcatattcaaaagcaggccataacacagcggaaattacatttgaatatgcgacagaacaacaactgggccaga tcgtcatgtatttttttcgcgatagcaatgcagttagatttccggatgctggcaaaacaaaaattcagatcagcgcagatgg caaaaattggacagatctggcagcaacagaaacaattgcagcgcaagaatcaagcgatagagtcaaaccgtatacata tgattttgcaccggttggcgcaacatttgttaaagtgacagtcacaaacgcagatacaacaacaccgtcaggcgttgtttg cgcaggcctgacagaaattgaactgaaaacagcgacaagcaaatttgtcacaaatacatcagcagcactgtcatcactt acagtcaatggcacaaaagtttcagattcagttctggcagcaggctcatataacacaccggcaattatcgcagatgttaaa gcggaaggcgaaggcaatgcaagcgttacagtccttccggcacatgataatgttattcgcgtcattacagaaagcgaag atcatgtcacacgcaaaacatttacaatcaacctgggcacagaacaagaattt
>SEQ ID NO:15用于生成BIF变体的正向引物
GGGGTAACTAGTGGAAGATGCAACAAGAAG
>SEQ ID NO:16BIF917的反向引物
GCGCTTAATTAATTATGTTTTTTCTGTGCTTGTTC
>SEQ ID NO:17BIF995的反向引物
GCGCTTAATTAATTACAGTGCGCCAATTTCATCAATCA
>SEQ ID NO:18BIF1068的反向引物
GCGCTTAATTAATTATTGAACTCTAATTGTCGCTG
>SEQ ID NO:19BIF1241的反向引物
GCGCTTAATTAATTATGTCGCTGTTTTCAGTTCAAT
>SEQ ID NO:20BIF1326的反向引物
GCGCTTAATTAATTAAAATTCTTGTTCTGTGCCCA
>SEQ ID NO:21BIF1478的反向引物
GCGCTTAATTAATTATCTCAGTCTAATTTCGCTTGCGC
>SEQ ID NO:22两歧双歧杆菌BIF1750
vedatrsdsttqmsstpevvyssavdskqnrtsdfdanwkfmlsdsvqaqdpafddsawqqvdlphdysitqkys qsneaesaylpggtgwyrksftidrdlagkriainfdgvymnatvwfngvklgthpygyspfsfdltgnakfggent ivvkvenrlpssrwysgsgiyrdvtltvtdgvhvgnngvaiktpslatqnggdvtmnlttkvandteaaanitlkqtv fpkggktdaaigtvttasksiaagasadvtstitaaspklwsiknpnlytvrtevlnggkvldtydteygfrwtgfdats gfslngekvklkgvsmhhdqgslgavanrraierqveilqkmgvnsirtthnpaakalidvcnekgvlvveevfd mwnrskngntedygkwfgqaiagdnavlggdkdetwakfdltstinrdrnapsvimwslgnemmegisgsvs gfpatsaklvawtkaadstrpmtygdnkikanwnesntmgdnltanggvvgtnysdganydkirtthpswaiyg setasainsrgiynrttggaqssdkqltsydnsavgwgavassawydvvqrdfvagtyvwtgfdylgeptpwngt gsgavgswpspknsyfgivdtagfpkdtyyfyqsqwnddvhtlhilpawnenvvakgsgnnvpvvvytdaak vklyftpkgstekrligeksftkkttaagytyqvyegsdkdstahknmyltwnvpwaegtisaeaydennrlipegs tegnasvtttgkaaklkadadrktitadgkdlsyievdvtdanghivpdaanrvtfdvkgagklvgvdngsspdhds yqadnrkafsgkvlaivqstkeageitvtakadglqsstvkiattavpgtstektvrsfyysrnyyvktgnkpilpsdv evrysdgtsdrqnvtwdavsddqiakagsfsvagtvagqkisvrvtmideigallnysastpvgtpavlpgsrpavl pdgtvtsanfavhwtkpadtvyntagtvkvpgtatvfgkefkvtatirvqrsqvtigssvsgnalrltqnipadkqsdt ldaikdgsttvdantggganpsawtnwayskaghntaeitfeyateqqlgqivmyffrdsnavrfpdagktkiqisa dgknwtdlaatetiaaqessdrvkpytydfapvgatfvkvtvtnadtttpsgvvcaglteielktatskfvtntsaalsslt vngtkvsdsvlaagsyntpaiiadvkaegegnasvtvlpahdnvirvitesedhvtrktftinlgteqefpadsderdy paadmtvtvgseqtsgtategpkkfavdgntstywhsnwtpttvndlwiafelqkptkldalrylprpagskngsvt eykvqvsddgtnwtdagsgtwttdygwklaefnqpvttkhvrlkavhtyadsgndkfmsaseirlrkavdttdisg atvtvpakltvdrvdadhpatfatkdvtvtlgdatlrygvdylldyagntavgkatvtvrgidkysgtvaktftielkna papeptltsvsvktkpskltyvvgdafdpaglvlqhdrqadrppqplvgeqadergltcgtrcdrveqlrkhenreah rtgldhlefvgaadgavgeqatfkvhvhadqgdgrhddaderdidphvpvdhavgelaraachhviglrvdthrlkasgfqipaddmaeidritgfhrferhvg
>SEQ ID NO:23来自两歧双歧杆菌DSM20215的胞外乳糖酶的信号序列
Vrskklwisllfalaliftmafgstssaqa
Figure IDA0001340509920000011
Figure IDA0001340509920000021
Figure IDA0001340509920000031
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Claims (5)

1.一种喷雾干燥的组合物，该组合物包含多肽和麦芽糖糊精和山梨酸盐，该多肽是SEQID NO:1所示的具有转半乳糖基化活性的β-半乳糖苷酶，其中所述组合物通过喷雾干燥的方法制备，该方法包括：
a.将组合物引入喷雾干燥装置中，其中该组合物包含SEQ ID NO:1所示的具有转半乳糖基化活性的β-半乳糖苷酶和麦芽糖糊精和山梨酸盐，并且其中所述组合物中的麦芽糖糊精和山梨酸盐的重量比为28.6:71.4；并且
b.喷雾干燥该组合物以产生颗粒。
2.一种对组合物进行喷雾干燥的方法，该方法包括：
a.将组合物引入喷雾干燥装置中，其中该组合物包含SEQ ID NO:1所示的具有转半乳糖基化活性的β-半乳糖苷酶和麦芽糖糊精和山梨酸盐，并且其中所述组合物中的麦芽糖糊精和山梨酸盐的重量比为28.6:71.4；并且
b.喷雾干燥该组合物以产生颗粒。
3.一种方法，用于通过用如在权利要求1中所定义的组合物来处理包含乳糖的底物以生产食物产品。
4.根据权利要求3所述的方法，用于通过用如在权利要求1中所定义的组合物来处理包含乳糖的基于乳的底物以生产乳制品。
5.一种用于生产低聚半乳糖的方法，该方法包括使如权利要求1中所述的组合物与包含乳糖的基于乳的溶液接触。
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