CN105121618A

CN105121618A - 制备酶片剂的方法

Info

Publication number: CN105121618A
Application number: CN201480023557.5A
Authority: CN
Inventors: J.达姆加亚尔德
Original assignee: Danisco US Inc
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS; Danisco US Inc
Priority date: 2013-04-30
Filing date: 2014-04-30
Publication date: 2015-12-02
Also published as: BR112015027308A2; US20160081356A1; WO2014177644A1; EP2992077A1

Abstract

本发明涉及酶片剂的制备方法，所述酶片剂包含高酶量（具有高有效载荷），用于在例如饲料或食品工业中使用。

Description

制备酶片剂的方法

技术领域

本发明涉及包含高酶量（具有高有效载荷）的酶片剂的制备方法，所述片剂用于在例如饲料或食品工业中使用，诸如适合直接销售给面包店的片剂。

发明背景

片剂形式的酶已被面包师在生面团中使用多年，所述片剂增强面包比传统的抗陈化解决方案大大延长的保持柔软、潮湿的面包屑的能力。消费者在选择面包购买时将这种柔软度当作是新鲜度。与此同时，酶保证高度回弹性，确保商店货架上的面包产品在外形上保持吸引力。WO9500121公开了通过使用湿法制粒原理混合液体酶制剂与合适的载体生产可直接压制的酶粉末，由此可避免冷冻干燥和喷雾干燥的步骤。WO07008776公开了单剂量的酶片剂，用于直接销售给消费者以提高使用传统去垢剂的自动洗衣和洗碗操作的性能。

然而，生产用于在例如面包房中使用的酶片剂的传统的方法并不总是合适的，由于要求该片剂应同时是强健的，能自崩解于水中，并同时含有高酶量。这是特别困难的，因为酶是蛋白质，其充当粘合剂使其难以让具有高酶有效载荷的酶片剂自崩解在例如水中。因此，对用于制备含有高酶量（具有高有效载荷）的酶片剂的方法存在需求，所述酶片剂确保例如每批次面团更少的片剂和对于终端用户更少的储存成本和储存空间。在使用液体酶产品的行业中对于高有效载荷的酶片剂也有需求。使用只是可以崩解并产生所需要的液体酶产品的片剂可以最大限度地减少储存空间，运输成本，并增加保质期。此外，对于用于制备一种或多种酶片剂的方法也存在需求，所述方法获得这样的片剂，其非常强健，即对于加工和运输具有低的脆碎度，并同时能够自崩解于水中，优选在3分钟之内。

发明概述

本发明人已发现包含高酶量（高有效载荷）的酶片剂可以通过如下制备：干燥所需一种或多种酶和不溶性载体的浆料以获得酶粉末，任选地所述酶粉末被进一步团聚，随后直接压制所述粉末或团聚的粉末。还已经发现通过本文公开的方法生产的酶片剂非常强健，即，对于加工和运输具有低脆碎度，并同时能够自崩解于水中，优选在3分钟内。

因此，在第一方面，本发明涉及通过包含以下步骤的方法制备酶片剂的方法：

a) 混合一种或多种酶和不溶性载体，以获得浆料，

b) 干燥所述浆料以获得干燥的酶粉末，其颗粒具有大于30 µm的体积平均直径，并且其中干燥的酶粉末中不溶性载体的含量基于干燥的酶粉末的重量为至少10％（w/w），并至多50％（w/w），和

c) 直接压缩所述干燥的酶粉末，以获得所述片剂，其中所述片剂包含至少10％（w/w）所述酶。

发明详述

本文公开了用于制备酶片剂的方法，所述方法包括下列步骤：

a) 混合酶和不溶性载体，以获得浆料，

c) 直接压缩所述干燥的酶粉末成片剂，其中所述片剂包含至少10％（w/w）所述酶。

在一方面，以酶溶液形式添加所述酶以获得浆料。

在本上下文中，术语“酶溶液”在本文定义为包含一种或多种酶的液体酶溶液，所述酶均匀分布在整个液体中。

在一方面，酶溶液能够在铺有滤布和涂有助滤剂的传统板框式压滤器上过滤以去除可见颗粒，得到具有小于10 NTU浊度的澄清的滤液。在进一步的方面，在过滤中所述酶溶液可以在填有涂敷助滤剂的滤垫的板框式压滤器上过滤，过滤导致细菌减少例如以满足食品和/或饲料的质量要求。如果使用过滤，则它们优选地应被执行而不会损失大量酶活性（优选小于10％的损失），如通过用于有关一种或多种酶的合适的测试所测量的。

在本上下文中，术语“干燥的酶粉末”是指该粉末的干物质是>90％（w/w），如根据“一般方法”中所述的方法“干物质确定测试”所测量。在一方面，干燥的酶粉末的干物质是> 92 % (w/w)、> 94 % (w/w)，或优选>96 % (w/w)。

在一方面，干燥的酶粉末的颗粒具有大于30 µm的体积平均直径。在本上下文中，粉末的粒径测量为“体积平均直径”（D[4,3]），诸如描述于Rawle, A.: “Basic principles of particle size analysis” Surface Coating International 2003, vol.86, n°2, pp. 58-65。导致本专利的工作中粒径的测量已经通过使用来自Malvern Ltd, UK公司的粒径分析仪型号Mastersizer S，通过激光衍射（也称为低角度激光散射，或LALLS）进行。

在一方面，所述酶溶液或酶浆料的酶纯度在50-100％（w/w）纯酶的区间，诸如50-90％（w/w）纯酶。在本上下文中，术语酶溶液的“酶纯度”被定义为在溶液中或浆料中酶的干物质（W_干酶）除以溶液的干物质含量（W_干溶液）。因此，它可以写为纯度（％）= W_干_酶/ W_干_溶液；例如仅含有酶并且没有其它物质的溶液具有100％的纯度。

酶的干物质（W_干酶）通过样品的酶活性（单位/g样品）除以比活性（单位/mg酶）来确定。在本上下文中，术语样品的“酶活性”可以通过对一种或多种有关酶的适当的测试来测量。作为适合于测量大部分淀粉酶的酶活性的测试的实例，可以提及例如在实施例中“一般方法”下本文所述测试，提供了以单位/g样品的结果。在“一般方法”下本文所述淀粉酶测试是测量G4淀粉酶（诸如在实施例中使用的G4淀粉酶）的酶活性的方案/测试。此测试也是质量控制测试，可用于标准化/量化此酶用于商业销售。具体用于测量不同的酶的酶活性的目的的其它测试将是本领域技术人员已知的。典型地，这种测试是可用于质量控制的有效测试。用于测量酶活性的测试通常还会包含对于被测量的酶特异性的底物，并且在缓冲液、pH、温度和时间的帮助下控制反应。所述反应将针对相同类型的标准酶进行量化。使用如上述底物保证仅活性蛋白被测量，因而这是业界普遍的。理论上可以使用其它蛋白定量测试。

在本上下文中，术语酶的“比活性”定义为每酶蛋白质量的酶活性。其定义为单位/mg。举例来说，如果G4淀粉酶的样品被纯化含有100％的酶蛋白并且如在“一般方法”下所述通过使用淀粉酶活性测试确定活性，则每毫克样品所报告的BMK值根据定义是比活性。例如如实施例中所用的G4淀粉酶被确定为具有3.0 BMK/mg的比活性。

在本上下文中，术语酶溶液的“总干物质”如“一般方法”下的“干物质确定测试”中所述测量。

在本上下文中，术语酶片剂的“片剂性能”在本文中用于描述片剂或一批片剂关于一个或多个有用的片剂参数的性能。有用的片剂参数的实例是脆碎度，崩解和/或自崩解，如在分别针对脆碎度，崩解和/或自崩解的测试所测量，例如如在“一般方法”下本文所述。通过“良好的”片剂性能在本文中是指在一个或所有三个测试中在行业规范内执行或以本文所定义的其它方式执行的片剂性能。片剂或片剂批次在本文中认为具有改进的片剂性能，如果其在三次测试的至少一次测试中显示改进的结果，诸如降低的脆碎度，降低的崩解或降低的自身崩解时间。在一方面，制造具有降低的脆碎度的片剂（或片剂批次）在本上下文中被认为是提供改进的片剂性能，如果崩解不受影响。例如，导致片剂或片剂批次具有180秒的自崩解和4％（w/w）的脆碎度的片剂配方可以通过优化片剂赋形剂进行改进，但相比具有2％的脆碎度（w/w）的片剂或片剂批次保持相同的酶含量，但具有180s的相同自崩解时间。这是例如本文理解为改进的片剂性能。对于降低的崩解时间，但是保持参数脆碎度恒定，可以进行类似的推理。片剂或片剂批次也可以被认为具有改善的片剂性能，如果脆碎度降低，并且同时崩解时间减少。改善两个参数脆碎度和崩解之一以另一个为代价的片剂配方的优化更难定义为改进，除非给出片剂应用的非常清楚的理解。相反建议通过保持脆碎度或者崩解（崩解或自崩解）恒定和比较其它参数来比较片剂性能（例如比较不同类型和水平的赋形剂）。通常，这可以通过调整压片机完成，通过比较压片机的活塞施加不同水平的压力生产的片剂。如果不能轻易地从两个不同的片剂制剂的第二个获得恒定水平（目标水平），则可以施加两个或更多个不同的压力并且可以使用简单的内插以在目标水平计算。

酶

对于在如本文所述的片剂中使用，酶可以是任何酶，例如可以在食品和/或饲料的制备中使用的酶、药用酶、用作消化助剂的酶、可用于技术应用或需要或期望精确和安全（诸如非粉尘）的酶剂量的任何应用的酶。片剂可包含一种或多种酶。

最终片剂可包含一种或多种酶。在一方面，几种酶与不溶性载体混合在一起以获得浆料，并且最终浆料因而包含一种或多种酶。另外，也可以准备几种不同浆料，每种浆料包括一种或多种酶，并然后在干燥前混合这些浆料。获得包含几种不同酶的片剂的另一种方法是通过制备几种酶粉末和/或团聚的粉末并混合这些粉末然后直接压缩。

本文的片剂尤其可用于酶的应用，其中期望酶的高有效载荷。在一方面，片剂中酶的有效载荷或酶的量是至少10％（w/w）酶。在进一步的方面，所述片剂包含至少10％（w/w）的酶，诸如至少15％（w/w）的酶，和最多45％（w/w）的酶，诸如至多40％（w/w）的酶或至多20％（w/w）的酶。在进一步的方面，片剂包含10％（w/w）和45％（w/w）之间的酶，诸如10％（w/w）和40％（w/w）之间的酶，诸如15 ％（w/w）和20％（w/w）之间的酶。

在一方面，所述酶是食品酶，诸如烘焙酶。在进一步的方面，所述酶是酿造用酶。在进一步的方面，所述酶是乳业用酶。在进一步的方面，所述酶是油脂加工用酶。在进一步的方面，所述酶是肉类加工用酶。

在进一步的方面，所述酶是动物饲料用酶。

在一方面，饲料材料选自包括下列的组：a）谷物，诸如小籽粒（例如，小麦、大麦、黑麦、燕麦和其组合），和/或大籽粒，诸如玉米或高粱；b）来自谷物的副产品，诸如玉米蛋白粉、蒸馏干酒糟颗粒残液（DDGS）（特别是基于玉米的蒸馏干酒糟颗粒残液（cDDGS）、小麦麸、粗麦粉、小麦粉头、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘果肉；c）获自下列来源的蛋白：大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、油菜、鱼粉、干燥血浆蛋白、肉骨粉、土豆蛋白、乳清、椰子核、芝麻；或d）从植物和动物来源获得的油和脂肪。

在一方面，食物材料选自包括用于烘焙的面团的组。

酿造用酶可以有助于天然原料如小麦和大麦的最佳提取。所述酶也可有助于改进酿造产量。乳业用酶可有助于给予乳制品更好的质地或风味。其可延长保质期或者是有利于生产UHT奶的加工酶。

用于油和脂肪的酶可提高提取率，降低能耗或改进油的质量。

肉类加工用酶可以帮助增加蛋白产量，将副产品转换成更有价值的产品，增强蛋白水解产物的香味或减少蛋白水解产物的苦味。

所述酶可以选自淀粉酶、脂解酶、氧化还原酶（诸如葡萄糖氧化酶和己糖氧化酶）、水解酶（诸如脂肪酶和酯酶以及糖苷酶样α-淀粉酶、支链淀粉酶和木聚糖酶）。

可以包括的其它酶的实例可以选自纤维素酶，半纤维素酶，淀粉降解酶，蛋白酶，脂肪氧合酶。

氧化还原酶的实例包括氧化酶，诸如葡萄糖氧化酶（EC1.1.3.4）、糖类氧化酶、丙三醇氧化酶、吡喃糖氧化酶、半乳糖氧化酶（EC1.1.3.10）、麦芽糖氧化酶诸如己糖氧化酶（EC1.1.3.5）。

可以包括的其它有用的淀粉降解酶是葡糖淀粉酶和支链淀粉酶。

在一方面，本文所用的术语“木聚糖酶”是指木聚糖酶类（诸如EC3.2.1.32），其水解木糖苷键。

在一方面，如本文所用的术语“淀粉酶”是指淀粉酶如α-淀粉酶（EC3.2.1.I）、β-淀粉酶（EC3.2.1.2）和γ-淀粉酶（EC3.2.1.3）。

在一方面，所述酶是选自淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙酰酯酶、植酸酶、氧化酶、脂肪酶和葡糖淀粉酶的一种或多种。

在一方面，所述酶是选自淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、氧化酶和脂肪酶的一种或多种。

在一方面，所述酶是植酸酶。

在一方面，所述酶选自木聚糖酶（EC3.2.1.8），诸如β-1,4-D-木聚糖酶、内切-1,4-β-木聚糖酶、内切-1,4-β-木聚糖酶、内切-（1,4）-β-木聚糖酶 4-木聚糖水解酶、内切-1,4-木聚糖酶、β-1,4-木聚糖酶、内切-1,4-β-D-木聚糖酶、1,4-β-木聚糖木聚糖水解酶、β-木聚糖酶、β-1,4-木聚糖木聚糖水解酶、4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶和β-D-木聚糖酶。

在一方面，所述酶选自内切-1,3-β-木聚糖酶（EC3.2.1.32），诸如β-1,3-木聚糖酶、β-1,3-D-木聚糖酶、内切-1,3-木聚糖酶、内切-1,3-β-木聚糖酶、内切-1,3-β-D-木聚糖酶、1,3-β-木聚糖木聚糖水解酶、β-1,3-木聚糖木聚糖水解酶、内切-（1,3）-β-木聚糖木聚糖水解酶和3-β-D-木聚糖木聚糖水解酶。

在一方面，所述酶选自纤维素酶，特别是内切-1,4-β葡聚糖酶（EC 3.2.1.4）、纤维二糖水解酶（EC3.2.1.176和EC3.2.1.91）、内切-1,3-β葡聚糖酶（3.2.1.6）、半纤维素酶、α-半乳糖苷酶（EC3.2.1.22）、聚半乳糖醛酸酶（EC3.2.1.15）、β-葡糖苷酶（EC 3.2.1.21）、葡聚糖1,4-β-葡糖苷酶（EC3.2.1.74）和纤维素-1,4-β-纤维二糖苷酶（EC3.2.1.91）。

在一方面，所述酶选自内切葡聚糖酶，特别是内切-1,6-6葡聚糖酶（EC3.2.1.75）、内切-1,2-β葡聚糖酶（EC3.2.1.71）、内切1，3-β-葡聚糖酶（EC3.2.1.39）、内切-1,4-β-葡聚糖酶（EC 3.2.1.4）、内切-1,3（4）-β-葡聚糖酶（EC3.2.1.6）和内切-1,3-α葡聚糖酶（EC3.2.1.59）。

在一方面，所述酶选自蛋白酶，特别是枯草杆菌蛋白酶（EC3.4.21.62）、bacillolysins（EC3.4.24.28）、碱性丝氨酸蛋白酶（EC3.4.21.x）、角蛋白酶（EC3.4.x.x）和金属蛋白酶。

在一方面，所述酶选自甘露聚糖酶，特别是内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶和半乳聚糖酶。

在一方面，所述酶选自转移酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、角质酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂氧合酶、氧化酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、聚半乳糖醛酸酶、支链淀粉酶、聚鼠李半乳糖醛酸酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木葡聚糖酶（xyloglucanases）和木糖苷酶。

在一方面，所述酶是一种或多种淀粉酶，诸如形成麦芽四糖的麦芽四糖水解酶，也称为EC3.2.1.60；形成G4的淀粉酶；G4-淀粉酶或葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶。在本上下文中，“G4淀粉酶”指形成麦芽四糖的麦芽四糖水解酶（EC 3.2.1.60）。这些淀粉酶的实例例如描述于WO05/003339、WO04/111217、WO05/007867、WO05/007818、WO06/003461、WO07/007053、WO07/148224和WO2010/133644。在一方面，所述淀粉酶是来自嗜糖假单胞菌（Pseudomonas saccharophila）的麦芽四糖水解酶。在进一步的方面，所述酶具有SEQ ID NO：1或是其变体。在一方面，所述变体具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，其中1和25之间任何数目的氨基酸被取代。在进一步的方面，所述变体具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，其中3和12之间任何数目的氨基酸已被取代。在进一步的方面，所述酶具有SEQ ID NO：2或是其变体。在一方面，所述变体具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其中1和25之间任何数目的氨基酸被取代。在进一步的方面，所述变体具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其中3和12之间任何数目的氨基酸已被取代。

用于获得所述浆料的酶本身可以以酶溶液或酶浆料或更多酶溶液/浆料的掺合物的形式。酶溶液或浆料可以例如通过过滤或离心从发酵液除去生产菌株，之后液体例如通过超滤或通过蒸发浓缩到所需的酶强度来生产。如果期望甚至更高的纯度，则可以调整所述pH以使得酶沉淀形成浆料，之后将沉淀物与上清液分离。可再次调整pH，以使酶进入溶液。然后此酶溶液将通常比初始酶溶液具有更高的纯度。取决于所需的纯度，可以执行此方法的一个或多个步骤。在一方面，所述酶以酶溶液形式添加。也可以通过盐析所述酶来改进纯度，通过改变pH或加入导致沉淀的化学物质，像硫酸铵或丙酮。纯化也可通过层析法像吸附层析或亲和层析完成。纯化也可通过渗滤进行；其是酶制造使用的典型工艺，其中所述浓缩通过超滤进行，通过将水加入工艺中，由此更小的分子可以被洗出。酶溶液或浆料可以通过加入防腐剂诸如山梨酸盐或苯甲酸盐和/或通过加入稳定剂，诸如多元醇（例如丙二醇）、硼酸、盐、糖（例如葡萄糖和蔗糖）或糖醇（例如山梨糖醇）或低分子量的碳水化合物来稳定化。可以调整和稳定pH，例如用缓冲盐，诸如有机酸盐，例如柠檬酸钠和乳酸钠。导致细菌减少以满足食品和/或饲料质量的过滤对于在中性pH下的酶溶液是特别有利的，否则酶溶液可能会难以用食品和/或饲料级防腐剂保存以避免微生物污染。具有较低pH的酶溶液可以用典型的食品和/或饲料级防腐剂诸如山梨酸盐和苯甲酸盐保存。

为了获得具有高有效载荷的片剂，优选使用如下的酶溶液，其具有在50-100％（w/w）纯酶区间的酶纯度，诸如在60-100％（w/w）纯酶区间，诸如在65-100％（w/w）纯酶区间，诸如在70-100％（w/w）纯酶区间，诸如在75-100％（w/w）纯酶区间。在进一步的方面，优选使用如下的酶溶液，其具有在50-100％（w/w）纯酶区间的酶纯度，诸如在60-95%（w/w）纯酶区间，诸如在65-90%（w/w）纯酶区间，诸如在70-90%（w/w）纯酶区间，诸如在75-90%（w/w）纯酶区间。

在一方面，本文使用的酶溶液通常可以是清澈的，测量为NTU<10（NTU：浊度单位）。酶溶液的NTU可以在HACH浊度计上测量。

在一方面，为了获得具有高酶有效载荷的片剂，优选使用如下酶溶液，其具有至少65％（w/w）纯酶的酶纯度，诸如至少75％（w/w）纯酶。

纯度定义为W_干酶/W_干溶液。如本文“一般方法”中所述，可以得到溶液的干物质含量。

在另一方面，所述酶溶液具有4-20%的干物质含量，例如5-20% w/w，诸如4-15%，例如5-15%（w/w）或4-12%，例如6-12%（w/w）。

在另一方面，所述酶溶液具有5-20% w/w的干物质含量，诸如5-15%（w/w）或6-12%（w/w）。

通常通过膜过滤（超滤（UF）），而不是通过干燥除去水实质上更便宜。对于稀溶液（<20％（w/w）干物质（在下文中也称为DM））差异特别明显。对于很多不能被浓缩到很高的干物质含量的酶溶液，因为这些酶随后将有析出溶液的倾向，本发明是特别有利的。本方法也可关于这样的酶溶液使用：其中酶已部分地从溶液中析出以产生浆料；但是继续进一步浓缩以去除水在技术上可以是困难的，例如在超滤单元，因为沉淀物可以开始阻塞膜。进一步在浓缩到高DM水平的困难也是干燥的问题。酶（取决于类型）可以给出更低的回收率，如果它以浆料而不以溶液的形式被干燥的话。这些问题可导致这样的结论，纯酶优选作为具有低DM的酶溶液（或浆料）进行干燥。所公开的本发明也可以在更低的DM水平像2％、3％或4％（w/w）上工作，但对于很多商业产品来说干燥的成本变高。例如，具有4％（w/w）DM的溶液将需要蒸发几乎24kg的水以生产1kg粉末。以5％（w/w）DM则只有19kg。因此，在给定的情况下通常优选在尽可能高的DM水平进行干燥。对于不可能获得超过20％诸如15％或诸如12％的干物质含量（w/ w）的酶溶液，本文所公开的本发明是特别有用的。

要加入的酶溶液的pH值取决于酶。当酶是淀粉酶诸如G4淀粉酶时，例如，pH一般在4-8的范围内，诸如pH为5-7，或诸如pH为5.5-6.5。

在一方面，酶溶解在食品和/或饲料允许的溶剂诸如水中。

不溶性载体

在一方面，“不溶性”载体理解为不溶于水的载体。在一方面，小于1％（w/w）的所述不溶性载体是水溶性的。在该方面中，当载体的一小部分是可溶的，在酶溶液或浆料中的载体的可溶部分将包括在酶浆料或溶液的干物质含量中。在一方面，5-20％ w/w诸如5-15％（w/w）或6-12％（w/w）的酶溶液或浆料的干物质含量，如本文“一般方法”下测量。

在一方面，所述不溶性载体选自微晶纤维素（诸如任选涂覆有二氧化硅）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）、羧甲基纤维素、藻酸盐、粘土、天然淀粉以及改性淀粉诸如羟基乙酸淀粉钠或交联淀粉。在一方面，所述不溶性载体选自聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）、微晶纤维素和小麦淀粉。在一方面，所述不溶性载体选自微晶纤维素和小麦淀粉。作为商业产品的实例可提及Avicel PH 101、Avicel PH 102、Avicel PH 200、Avicel PH 301、Vivapur 101、Vivapur 102、Vivapur 302。

在一方面，所述不溶性载体是微晶纤维素诸如颗粒状微晶纤维素。在一方面，颗粒状微晶纤维素的体积平均直径为25-150 µm，诸如30-75 µm。

颗粒状微晶纤维素是白色自由流动的粉末。它不溶于水和耐受大多数试剂。微晶纤维素由1-4 β糖苷键连接的葡萄糖单元构成。这些线性纤维素链作为微纤维捆绑在一起。每个微纤维显示导致晶体结构的高度的三维内部键合。通常，所述结晶区域从木浆分离和纯化。

小麦淀粉是通过从小麦粉除去蛋白包括面筋而生产的粉末。小麦淀粉是白色、无嗅无味粉末，其不溶于冷水。它由两种类型的分子组成：直链和螺旋直链淀粉和支链淀粉。

浆料

在一方面，在干燥的酶粉末中的载体以基于干燥的酶粉末的重量至少10％（w/w），并至多50％（w/w）的量存在。实施例13显示，如果使用不溶性载体，则不能生产具有良好片剂性能的片剂L2（具有FNA蛋白酶）。同样的实施例显示含有12.5％酶具有良好的片剂性能的N1。这由含有18％（w/w）不溶性载体的粉末生产。实施例8显示如果片剂无载体则不可生产具有G4淀粉酶粉末的片剂。实施例10显示相同的G4淀粉酶的酶溶液可制成具有16％（w/w）酶的性能良好的片剂。用于该实施例的粉末在实施例3中生产，并含有22％（w/w）的不溶性载体。

酶溶液可泵入具有搅拌的槽。该过程典型地在环境温度下进行。酶典型地被存储在5-10℃，所以这个过程取决于槽的尺寸、生产时间和环境温度通常是在5-25℃下运行。若为了保持酶在溶液中，更高的温度是必要的，则所述槽也可以被加热到范围为25-50℃。温度范围25-50℃可以是这样的范围，其容易导致微生物污染，所以如果所述酶是稳定的，其也可以提高温度到范围50-75℃以具有更好的微生物控制。如果使用酶浆料与沉淀的酶来代替酶溶液，则可以进行槽中的pH值和温度调节以在加入载体之前使酶进入溶液。不溶性载体可以作为粉末逐渐添加以避免该材料的太多结块。所述槽可以不断搅拌，以保持在载体和酶溶液为均匀的悬浮液，并避免在槽底部的载体沉积物。

干燥

该悬浮液通常泵送到干燥器。如果使用雾化器，则液体悬浮液将典型地满足雾化器。其可以例如是旋转喷雾器或加压喷嘴。在这种情况下，产生液滴，其在干燥器中遇到热风，并且水（或挥发物）从液滴蒸发导致颗粒形成和颗粒干燥。

从干燥器底部排出的粉末可以例如被直接包装，或者它可以通过筛子气动输送，并然后包装或掺合其它粉末并包装。来自干燥器的出口空气可以通过旋风分离器除去细粉（非常细的粉末）。包装的粉末可以贮存周，月或年，或者其可以直接发送到压片生产线并在压片之前掺合其它赋形剂。

在一方面，所述干燥可以作为单级喷雾干燥进行或在二级干燥系统中进行，所述二级干燥系统中喷雾干燥步骤之后是流化床或桨式/螺杆混合器，如SprayDryConsult International ApS, Krathusparken2, 2920 Charlottenlund (www.spraydryconsult.com)出版的由Keith Masters, 2002在“Spray drying in practice”中所述。喷雾干燥随后通过流化床诸如GEA Niro VIBRO-FLUIDIZER™可以具有细粉再循环到喷雾干燥器并由此产生团聚的优点。在一方面，作为冷冻干燥进行干燥。冷冻干燥对于更多热敏感的酶避免活性酶的损失是有利的。

在一方面，干燥的酶粉末的颗粒具有大于30 µm的体积平均直径。为了获得这种尺寸的颗粒，本领域技术人员可例如使用喷雾干燥。

在一方面，可以操作所述喷雾干燥器以使得所产生的可能的最大液滴在它们到达干燥器的壁之前仍然可以被干燥。这些液滴也导致最大的粒径，而这对于压片又是最佳的。对于装配有旋转喷雾器（例如喷雾轮）的喷雾干燥器，酶溶液（或浆料）的进料速率和轮的速度被控制。如本领域技术人员将认识到的，较低的速度会导致更大的液滴和从而更大的颗粒。类似地在其中雾化器是压力喷嘴的喷雾干燥器中，液滴也可以通过施加不同的压力来控制。除了液滴的大小之外，粒径也是在浆料中干物质含量（可溶和不可溶）的结果。如实施例2中所说明的，在干燥期间用于稳定酶的传统的载体（如盐和糖），不提供必要的粒径增大；即使以每1000kg酶UF（超滤）浓缩物超过150kg的量使用时也是如此。如本发明所示，使用少量的不溶性载体帮助干燥期间在高有效载荷的酶颗粒粉末中的粒径形成，所述酶粉末可用于压片，并进一步导致具有改进的压片性能的片剂。

上述问题对于单级喷雾干燥（诸如Niro常规喷雾干燥器 - SD）特别成问题，其中典型的干燥器设计将限制技术上可以产生的液滴的大小。可以使用定做的干燥器提供更长的行进距离。通常具有旋转喷雾器的干燥器将更宽（塔的直径更大）并因此可以产生更大的液滴和更大的颗粒。然而，由于酶不是热稳定的，所以延长的干燥时间（产品停留时间）将导致酶活性的损失。这限制了对于酶干燥最优的干燥器设计的尺寸。

本发明在这样的过程中也是有利的，其中来自步骤b的粉末在步骤c（直接压制）之前进一步团聚。该粉末可在流化床中被水润湿并团聚成更大的颗粒。这具有相对于载体内容物保持相同颗粒组成，但对于改进的片剂性能优化粒径的优点。在实施例11（表6）中显示，使用团聚的粉末可以获得关于脆碎度和崩解的甚至进一步的改进。其中使用喷雾干燥以产生粉末，并然后将粉末在简单的团聚过程中处理的两步法，是液体诸如水蒸发的一种非常成本有效的方式，以达到高有效载荷而不必使用流化床容量从具有低干物质含量的酶溶液蒸发所有的液体。

在喷雾干燥之后流化床的两步法也可以提供喷雾干燥器的高效率，如果从喷雾干燥器排出的粉末仍包含水分。然后在流化床中最后干燥。

在一方面，使用装有旋转喷雾器或压力喷嘴以产生液体微滴进入干燥器的单级喷雾干燥器进行干燥。对于喷雾干燥典型的温度可以对于入口温度在150-250℃的范围和对于出口温度70-120℃，取决于干燥器的设计。应选择出口温度使得该粉末具有典型的5％的所需湿度水平，取决于酶的类型。也应选择入口温度不使酶失活，尽管更高的温度可导致干燥器更高的能量效率。

在一方面，步骤b）的酶颗粒具有30–250 µm体积平均直径，诸如30-150 µm，或诸如35-75 µm或40-75 µm。

任选的团聚

在一方面，步骤c）的酶颗粒在直接压缩之前进一步团聚。团聚过程在本文中定义为使各个颗粒彼此粘附的过程。可以通过如下来区分团聚和制粒：仍然能够观察到进入团聚的各个颗粒，而制粒产生更强的更集成的颗粒，其中个别颗粒不再能观察到，尽管在某些情况下，两个术语可以在一定程度上互换使用。团聚和制粒是控制粉末特征像流动性、粉尘释放、密度、粒径分布的一种方式。在本上下文中，其还是用于改进片剂性能的工具。在一方面，团聚在单级喷雾干燥器中获得，在其中将例如来自旋风分离器的细粒返回进入雾化区，并且可以粘附到液滴或湿润颗粒。

在一方面，团聚在已经喷雾干燥的粉末上进行。这可以在流化床中通过简单地将水喷入粉末床或水加少量的粘合剂例如糖来完成。

在另一方面，所述团聚也可以作为制粒过程描述。在一方面，本文中团聚是制粒。一个例子是湿法制粒，其中酶粉末连续混合，并加入少量的水或水与粘合剂（像糖）。这可以在许多不同混合器类型中例如在来自Lodige的Ploughshare®食品搅拌器中来完成。混合器也可用于干燥所形成的颗粒，以为了酶的长期贮存稳定性而降低水活性。湿法制粒具有提供准备好用于压片而无进一步处理的酶颗粒的优点。在另一方面，其中也可以作为制粒过程描述的团聚是使用碾压随后研磨的过程。这具有是高容量和低成本过程并且无需添加水或其它液体的优点，这对于热敏感材料（如酶）是有利的。

在一方面，如本文所公开的，本文团聚和制粒是提供来自步骤b）的酶粉末的正确粉末特征以具有更优化的片剂性能（过程c：压片）的工具。

在一方面，团聚的酶颗粒具有40-1000 µm，或40-500 µm，或40–250 µm，或40-200 µm，诸如50 – 150 µm的平均体积平均直径。

直接压片

本文所述的片剂通过直接压缩干燥的酶粉末制成，所述酶粉末任选已经进一步团聚，或加入了进一步团聚的部分。

在一方面，任选已经进一步团聚或部分进一步团聚的干燥的酶粉末，与一种或多种任选的片剂赋形剂在进入压片机之前彻底混合。赋形剂在任何合适的混合装置中掺合，诸如双壳掺合器或类似装置，或者使用导致片剂赋形剂掺合的任何混合方法。混合物然后被压成片剂，使用任何压片装置，诸如自动旋转压片机Kilian E 150，或Stokes R4单冲压片机。压片机通常具有上部和下部形状对应的冲头，其从模具上下适配入模具。混合的片剂材料填充到模具腔并且至少一个冲头，通常为上冲头，进入模具腔中。压力被施加到上和下冲头两者。上和下冲头彼此相向移动的作用，将压力施加于冲头之间的材料，从而形成片剂。

可制成各种各样的药片的形状。通过冲头的加工来确定片剂形状。压紧力取决于冲头几何形状、仪器类型和使用的制剂而变化。典型压紧力的范围可以从0.2 kN到22 kN。

片剂

本文所述的片剂可以是任何形状，诸如圆形或球形、细长的、椭圆形、立方体形或其它几何形状。片剂在本文中理解为是指，终端用户容易操作的任何固体酶制剂，其包括但不限于胶囊、丸剂、凝胶片剂和可溶性材料的可溶性纸或片。片剂的大小也可以变化，并且通常应选择为终端用户容易操作的大小。例如，在一个实施方案中所述片剂是具有约18mm直径的圆球。通常，使片剂容易操作的直径是约5-50mm诸如15mm至约40mm。在另一个实施方案中，所述片剂是具有至少圆形端的矩形。矩形实施方案是约25mm长，约9mm宽，并且约5-20mm厚。通常，这样的椭圆形和矩形片剂容易操作，其中长度是从约15至50mm，宽度为约5至30mm，并且厚度为约3.5-20mm。片和布（cloth）片剂实施方案可以是薄的和在长度和/或宽度上更大。在使用中，终端用户可以用手将片剂从包装中取出并然后将其丢入例如具有水的玻璃烧杯，其中其自崩解并然后将烧杯内容物倾倒入食品，诸如面团或饲料产品，并且所述片剂应容易调整大小以适应这种预期的使用。包装像泡罩包装可便于易于操作；尤其是操作如0.5-1g的小片剂。

片剂的重量可为约0.4克至10克，1克至10克，2至15克，约2至20克，约2至25克，和约2至30克。片剂的密度可为约0.5至1.7g/cm³。在另一方面，所述密度为约0.6至1.4g/cm³。在更优选方面，所述片剂的密度为约0.8至约1.2g/cm³。

该片剂可以是盘状（pan），或喷涂有水溶性成膜材料，诸如聚乙二醇（PEG500），以减少粉尘并改进外观。本领域技术人员将认识到，所述片剂可以涂覆定时释放材料。此外，具有超过一种酶的片剂可以涂覆不同酶组分，并且选择涂层以在不同时间释放不同的酶。

本文所述的片剂通常稳定，然而，包装材料可用于进一步延长保质期，保护免于环境中潮湿，提高装运的耐久性，或增强终端用户的便利。本文所述的片剂可以包装在1kg片剂的桶中并填充有减震材料以在运输过程中保护片剂。片剂也可被单独置于可溶解的包装材料内，例如，聚乙烯醇薄膜，其允许片剂在不去除包装的情况下直接溶解。

片剂可以在收缩包裹过程被覆盖，或者它们可以提供为泡罩包装，其是具有背衬材料的模制的塑料片，例如金属箔层压体，其允许用户通过按下片剂使其从包装中释放而取回片剂。片剂也可以在密封的盒、瓶或坛中提供，其中任何一个可以配有分配器特征。外包装可以包括使用片剂的标识。

在本上下文中，具有优选一年的“保存稳定性”意味着，如果片剂在0-25℃的温度下储存在标准包装中，则一年后测量的酶活性是在第0天（或在生产后一周内）测量的90％以上。一年后测量的脆碎度和和崩解值不应该改变相当大，或至少应该是在生产时的产品规范内。

在一方面，从步骤a）至步骤b）之后的活性损失是小于20％。活性损失被定义为（A_tot_in - A_tot_out）/ A_tot_in，其中A_tot_in是来自要进入过程的液体酶的总酶单位，并且A_tot_out是在干燥的粉末中测量的总酶单位。

总单位根据用于标准化有关商品酶的QC方法测量。对于在实施例2中所述G4淀粉酶，使用见于“一般方法”部分中的G4淀粉酶的活性测试。

对于在实施例13中所述FNA蛋白酶，使用见于“一般方法”部分中的FNA蛋白水解活性测试。

本文所述片剂的脆碎度应优选低于5％（w/w）（测量为片剂的重量％），其是通过如本文所述“一般方法”中以25RPM在滚筒中旋转片剂4分钟的破碎。在一方面，所述脆碎度低于3％（w/w），诸如低于2％（w/w）或低于1％（w/w）。

对于片剂的典型的规范是180s的崩解时间。这并不保证片剂的自崩解，如在见于“一般方法”的“自崩解测试”中所述。

如“一般方法”部分中所述的传统的崩解测试是用于药品生产广泛接受的测试。然而，测试并不总是与例如食品和/或饲料工业内顾客使用片剂的方式良好关联。顾客通常将片剂添加至具有水的烧杯中并使其在那里自崩解，然后返回并添加内容物到例如食品和/或饲料材料，如烘焙用面团。使用本文所述崩解测试在不到180s内崩解的传统片剂可以通常使用更长时间以自崩解。具有180s的崩解时间的片剂甚至可以具有600s（10分钟）或更长的自崩解时间。

例如硅化MCC作为片剂崩解剂成分连同以如本文所述干燥粉末形式的团聚的酶的组合，提供了这样的片剂制剂，其一般提供在崩解和自崩解之间好得多的关联。根据本发明的具有小于100秒崩解时间的片剂通常在180秒内自崩解。

如本文所述的片剂应优选在240秒内，诸如120秒内崩解。可以如在“一般方法”下本文所述测量崩解时间。在一方面，崩解时间在180秒内，诸如100秒内，诸如90秒内，诸如80秒内，诸如70秒内，诸如60秒内，诸如50秒内。

如本文所述的片剂应优选在300秒内，诸如优选地180秒内自崩解。可以如在“一般方法”下本文所述测量自崩解时间。在一方面，自崩解时间在180秒内，诸如150秒内，诸如120秒内，诸如80秒内，诸如60秒内，诸如50秒内。

其它片剂赋形剂

在一方面，将干燥的酶颗粒或干燥的团聚的酶颗粒在步骤c）之前与另外的片剂赋形剂混合。

在一方面，另外的片剂赋形剂是选自粘合剂、填充剂、稀释剂、助流剂、润滑剂和崩解剂的一种或多种。

在一方面，本文公开的片剂包含崩解剂。

崩解剂用来确保片剂崩解以释放酶来执行其功能。可以使用任何已知的崩解剂，诸如微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）、羧甲基纤维素、藻酸盐、粘土、天然淀粉和改性淀粉诸如羟乙酸淀粉钠或交联淀粉。在一方面，崩解剂是不溶性载体。在一方面，崩解剂与步骤a）中不溶性载体是相同的。在一方面，所述崩解剂是任选涂覆有二氧化硅的颗粒状微晶纤维素。在一方面，作为片剂赋形剂加入的崩解剂的量是20-80％（w/w），诸如30-65％（w/w），诸如40-60％（w/w）或50-60％（w/w）。

在很大程度上，酶粉末本身充当粘合剂，并且因此对于粘合剂和/或填充剂的需要在某些片剂中是没有必要的。然而，在使用粘合剂和/或填充剂的情况下，其可以是淀粉，例如改性淀粉，诸如小麦淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉，其任何一种可以以天然形式、预凝胶化的形式、或者部分预凝胶化的形式使用。适合用于本发明的其它粘合剂/填充剂，包括糊精、麦芽糖糊精、糖（诸如乳糖、果糖、右旋糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、海藻糖和麦芽糖），以及糖醇（诸如山梨糖醇、甘露糖醇和肌醇）。在一方面，所使用的粘合剂是山梨糖醇。在一方面，粘合剂以1-20％w/w，诸如1-10％w/w，或1-5％（w/w）的量加入到片剂中。

适用于片剂的其它粘合剂/填充剂是纤维素、微晶纤维素和改性的纤维素材料，诸如羟丙基甲基纤维素（HPMC）、甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟乙基甲基纤维素、羟基乙基纤维素、丙烯酸聚合物、胶乳和聚乙烯吡咯烷酮。磷酸盐和硫酸盐也可以充当粘合剂或填充剂，例如磷酸氢钙、磷酸二氢钙、或硫酸钙二水合物。可在本文所述的片剂中使用两种或更多种粘合剂/填料的组合。额外的粘合剂/填充剂包括角叉菜胶、阿拉伯树胶、瓜尔胶、黄原胶、刺槐豆胶、壳聚糖、明胶、胶原、酪蛋白、聚天冬氨酸和聚谷氨酸，所有这些都可以是在低水平以尽量减少费用的有效的粘合剂。

增强片剂制造的润滑剂和助流剂可以添加到片剂。将润滑剂添加到片剂制剂，以确保在压片机中活塞的良好的润滑，并确保在压缩后片剂从活塞的释放。如本文所用的“润滑剂和助流剂”是指任何试剂，其降低表面摩擦，润滑片剂的表面，减小静电或降低片剂的脆碎度。润滑剂和助流剂还可以在片剂制造中充当抗结块剂。合适的润滑剂包括，但不限于，这样的试剂如二氧化硅（silica）、二氧化硅（silicon dioxide）、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸、硬脂酸钙、硬脂酰富马酸钠和聚乙二醇（PEG）。可用的其它润滑剂包括粉末形式的甘油三酯和单酸甘油酯。最广泛使用的润滑剂是硬脂酸镁。在一方面，润滑剂以0.1-5％（w/w），诸如0.2-2％（w/w），或0.3-1.5%（w/w）的量加入到片剂中。

在一方面，本文公开的片剂包括助流剂。在一方面，助流剂是熔融二氧化硅（商品名是Aerosil），其已被发现促进粉末良好的流动性。这在片剂生产中为了获得每个片剂的恒定重量是重要的。在一方面，助流剂以0.1-5％（w/w），诸如0.2-2％（w/w），或0.3-1.5%（w/w）的量加入到片剂中。在一方面，酶粉末和崩解剂之外的其它片剂赋形剂是填料的混合物（诸如例如山梨糖醇、小麦淀粉和氯化钠）、润滑剂（例如0.4％的硬脂酸镁（片剂的w/w）），和助流剂（诸如例如0.5％的aerosil（片剂的w/w））。如果发现填料对片剂的性能是中性，通常是有利的，这意味着它可以用于将片剂的活性标准化到一定的水平。如果所述酶粉末具有每克的高活性，则可以使用更多填料，如果酶粉末的活性较低则使用较少填料。如果填料水平的此变化仅在很小的程度影响崩解和脆碎度，则在商业化生产中很容易操作。

其它任选赋形剂，诸如香料、香味剂和着色剂也可以加入到片剂。例如，着色剂可以是染料诸如红色淀＃40或蓝色淀＃1，其在压片之前通常以小于0.01％（w/w）的量与片剂赋形剂混合。为了用户方便，本文公开的片剂可以是颜色编码的，并且对于那些包含多于一种类型的酶片剂的实施方案，包装材料可包括匹配针对每个片剂特定目的的颜色的图例。

辅助赋形剂可以加入到本发明的片剂，包括但不限于：金属盐、抗氧化剂、酶保护剂/清除剂（诸如硫酸铵、柠檬酸铵、尿素、盐酸胍、碳酸胍、磺酸胍、二氧化硫脲、monethyanolamine、二乙醇胺、三乙醇胺）、氨基酸（诸如甘氨酸、谷氨酸钠等）、蛋白（诸如牛血清白蛋白、酪蛋白等）。

本发明的进一步的实施方案

实施方案1. 用于制备酶片剂的方法，所述方法包括下列步骤：

a) 混合酶和不溶性载体，以获得浆料，

实施方案2. 根据实施方案1的方法，其中在干燥的酶粉末中不溶性载体的含量为基于干燥的酶粉末的重量至少10％（w/w）并至多50％（w/w），诸如基于干燥的酶粉末的重量至少10％（w/w）并至多40％（w/w），诸如基于干燥的酶粉末的重量至少10％（w/w）并至多30％（w/w），或者诸如基于干燥的酶粉末的重量至少10％（w/w）并至多20％（w/w）。

实施方案3. 根据实施方案1-2任一项的方法，其中以酶溶液形式添加所述酶以获得浆料。

实施方案4. 根据实施方案3的方法，其中所述酶溶液具有在50-100％（w/w）纯酶区间的酶纯度，诸如在60-100%（w/w）纯酶区间，诸如在65-100%（w/w）纯酶区间，诸如在70-100%（w/w）纯酶区间，诸如在75-100%（w/w）纯酶区间。

实施方案5. 根据实施方案3的方法，其中所述酶溶液具有在50-95%（w/w）纯酶区间的酶纯度，诸如在60-95%（w/w）纯酶区间，诸如在65-95%（w/w）纯酶区间，诸如在70-95%（w/w）纯酶区间，诸如在75-95%（w/w）纯酶区间。

实施方案6. 根据实施方案3的方法，其中所述酶溶液具有在50-90%（w/w）纯酶区间的酶纯度，诸如在60-90%（w/w）纯酶区间，诸如在65-90%（w/w）纯酶区间，诸如在70-90%（w/w）纯酶区间，诸如在75-90%（w/w）纯酶区间。

实施方案7. 根据实施方案1-6任一项的方法，其中所述酶溶液具有4-20% (w/w)，诸如5-20% w/w，诸如5-15% (w/w)或6-12% (w/w)的干物质含量。

实施方案8. 根据实施方案1-7任一项的方法，其中所述酶溶液具有4-8的pH，诸如5-7的pH或诸如5.5-6.5的pH。

实施方案9. 根据实施方案1-8任一项的方法，其中所述酶是选自淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、氧化酶和脂肪酶的一种或多种。

实施方案10. 根据实施方案1-9任一项的方法，其中所述酶溶解于食品和/或饲料允许的溶剂诸如水中。

实施方案11. 根据实施方案1-10任一项的方法，其中所述片剂包含10％（w/w）和45％（w/w）之间的酶，诸如10％（w/w）和40％（w/w）之间的酶，诸如15 ％（w/w）和20％（w/w）之间的酶。

实施方案12. 根据实施方案1-11任一项的方法，其中所述不溶性载体选自聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）、微晶纤维素和小麦淀粉，诸如选自微晶纤维素和小麦淀粉。

实施方案13. 根据实施方案1-12任一项的方法，其中所述不溶性载体是微晶纤维素。

实施方案14. 根据实施方案1-13任一项的方法，其中所述不溶性载体是任选地涂覆有二氧化硅的颗粒状微晶纤维素。

实施方案15. 根据实施方案1-14任一项的方法，其中所述不溶性载体是颗粒状微晶纤维素。

实施方案16. 根据实施方案1-15任一项的方法，其中所述颗粒状微晶纤维素具有25-150 µm，诸如30-75 µm的体积平均直径。

实施方案17. 根据实施方案1-16任一项的方法，其中步骤b）中不溶性载体与酶浆料中总干物质的比例是10-50 % (w/w)，诸如10-40% (w/w)，诸如10-30 % (w/w)，或诸如10-20 %(w/w)。

实施方案18. 根据实施方案1-17任一项的方法，其中所述干燥是喷雾干燥，诸如单级喷雾干燥。

实施方案19. 根据实施方案1-18任一项的方法，其中步骤b）的所述酶颗粒具有30-250 µm，诸如30-150 µm，或诸如35-75 µm或40-75 µm的体积平均直径。

实施方案20. 根据实施方案1-19任一项的方法，其中步骤b）的所述酶颗粒在直接压片之前进一步被团聚。

实施方案21. 根据实施方案20的方法，其中所述团聚通过流化床或湿法制粒。

实施方案22. 根据实施方案20的方法，其中所述团聚通过流化喷雾干燥。

实施方案23. 根据实施方案1-22任一项的方法，其中所述团聚的酶颗粒具有40–250 µm，诸如50–150 µm的体积平均直径。

实施方案24. 根据实施方案1-23任一项的方法，其中所述干燥的酶颗粒或干燥的团聚的酶颗粒在步骤c）之前与另外的片剂赋形剂混合。

实施方案25. 根据实施方案1-24任一项的方法，其中所述片剂赋形剂是选自粘合剂、填充剂、稀释剂、助流剂、润滑剂和崩解剂的一种或多种。

实施方案26. 根据实施方案1-25任一项的方法，其中一种或多种片剂赋形剂是崩解剂。

实施方案27. 根据实施方案26的方法，其中所述崩解剂与步骤a）中不溶性载体是相同的。

实施方案28. 根据实施方案1-27任一项的方法，其中所述崩解剂是任选地涂覆有二氧化硅的颗粒状微晶纤维素。

实施方案29. 根据权利要求1-28任一项的方法，其中作为片剂赋形剂加入的崩解剂的量是20-80％（w/w），诸如30-65％（w/w），诸如40-56%（w/w）或50-60％（w/w）。

实施方案30. 根据实施方案1-29任一项的方法，其中所述片剂在300秒内，诸如180秒内自崩解。

实施方案31. 根据实施方案1-30任一项的方法，其中所述片剂在180秒内，诸如100秒内崩解。

实施方案32. 通过实施方案1-31任一项的方法获得的或可通过实施方案1-31任一项的方法获得的酶片剂。

实施方案33. 根据实施方案32的酶片剂在食品、饲料或烘焙应用中的用途。

一般方法

G4淀粉酶活性测试

一个Betamyl Kilo单位（BMK）指具有限定活性的G4淀粉酶的内部标准酶。

G4淀粉酶的底物是封闭的对硝基苯-α-D-麦芽七糖苷（BPNPG7）。在G4淀粉酶作用后，底物进一步通过葡糖淀粉酶和α-葡糖苷酶降解成PNP，其在410nm下分光光度测量。

该反应在30℃在pH=5.6进行5分钟。

底物BPNPG7可以源自“Megazyme.com”具有商业名称ceralpha®底物。

FNA蛋白水解活性测试

相对指定的标准品校准该测定。所述测定是比色法并监测N-琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对-硝基苯胺底物的降解速率。底物对-硝基苯胺的释放使用Konelab分析器在405nm测量。相对指定的标准品校准该测定。

使用此标准品，测定的单位是每克样品的mg FNA。这意味着，可以计算液体样品的纯度，如果还已知样品的干物质含量。

脆碎度测试

本文所用的脆碎度测试是片剂稳定性的量度，并以片剂重量％表示，所述片剂通过在滚筒中以25 RPM旋转片剂4分钟折断。此测试应类似于使片剂掉落13.9cm进行100次的测试。

该测试的原理遵循USP药典（USP35，一般信息/（1216）片剂脆碎度 867-868，2012年12月）并且所述测试使用例如Vankel 脆碎度测定器。

崩解测试

如本文所用的崩解测试（也称为溶解性测试）是片剂崩解于水中并通过筛的能力的量度。测试的原理遵循USP药典（USP35，物理测试/（701）崩解 293-295，2012年12月）。该测试例如使用VanKel，VK100可编程崩解测试仪进行。其原理是在水浴中上下移动的钢丝篮。时间计数为30秒的步骤，直到片剂消失。

自崩解测试

原理

三个片剂放置在具有100ml温水（15℃±5℃）的烧杯中。没有搅动或移动180s后，检查片剂是否具有自崩解。这通过轻轻倒出浆料通过茶筛（=茶滤器）（孔径0.5-1mm）检查。另外75-100 ml的水轻轻地倒在筛上，以通过去除泡沫和更小的颗粒，进行快速清洗。没有片剂片段必须保留在筛上。

酶溶液或酶浆料纯度

酶溶液的“酶纯度”被定义为在溶液中或浆料中酶的干物质含量（W_干酶）除以溶液的干物质含量（W_干溶液）。因此，其可以写作纯度%= W_干_酶/W_干_溶液。

干物质测定测试

酶溶液或酶粉末样品的干物质含量根据这样的测试确定，其使用烘干采样的原理，在105℃下孵育之前和之后4小时称重。

结果以百分比报告。

松散粉末密度确定

称量空的玻璃量筒（w_前），其生产为准确的100 ml。

使用勺子和大漏斗用粉末轻轻地装填至边沿。避免摇动或拍打玻璃。

去除顶部和刮去粉末，直到它与玻璃量筒的边沿齐平。应注意不要挤压或振动玻璃。从量筒的外侧边缘刷掉多余的粉末。

称重满的量筒（W_后）

松散粉密度目前计算为（W_后- W_前）/100（g/cm³）。

G4 淀粉酶的比活性

比活性的确定（还见上文的定义）可通过纯化蛋白，表明它是纯的并进行总蛋白确定（典型的氮法确定如Kjeldal确定）来完成。可以通过应提供一致结果的两个或更多不同的方法进行纯化和总蛋白测定。知道酶的序列，氮含量可以转化成酶蛋白（如在实施例中使用的淀粉酶G4具有5.61g蛋白/g氮的换算）。测量活性（例如如在实施例中使用的G4淀粉酶采用在“一般方法”部分中的G4淀粉酶活性测试）并且比活性可以计算并报告为U/mg。如实施例中所使用的G4淀粉酶比活性确定为3.0 BMK/mg酶。

FNA 蛋白酶的比活性

FNA蛋白酶的比活性的确定可以按照上述相同原理测量，或者可以获得自蛋白酶的生产商。

材料

术语“其它混合物”在本文中关于压片使用以描述不包括MCC和酶的压片的粉末掺合物部分。

“其它混合物”是助流剂、润滑剂和填充剂。

第一步是计算基于片剂的总重量的润滑剂和助流剂。

润滑剂：0.4％硬脂酸镁（片剂的w/w），

　　　助流剂：0.5％aerosil（片剂的w/w）

第二步是计算“其它混合物”的剩余部分的赋形剂。

在所有的下列实施例中，三种赋形剂之间的比例是相同的：

山梨糖醇：10％（“其它混合物”的w/w）

小麦淀粉：75％（w/w“其它混合物”）

NaCl：15％（w/w“其它混合物”）

例如，如果“其它混合物”是10%，并且片剂混合物的总重是1 kg，则可以计算“其它混合物”的组成。

“其它混合物”是1 kg的10%=100g

　　　硬脂酸镁：4g

　　　Aerosil：5g

　　　剩余物是100-4-5=91g。

山梨糖醇：9.1g

　　　小麦淀粉：68.25g

　　　NaCl：13.65g。

如下列实施例中使用的术语“G4淀粉酶片段”是具有SEQ ID No: 1的淀粉酶片段，并且其可以通过枯草芽孢杆菌的发酵生产，例如如WO2010/133644中所述。

如实施例13中所用术语FNA蛋白酶酶片段是具有SEQ ID No: 2的蛋白酶的片段，也描述于美国专利号4,760,025。其可以通过枯草芽孢杆菌的发酵生产，例如如WO2010/133644中所述。

G4或FNA的大量发酵也可以通过使用更大的发酵罐生产；通常如果需要超过1000kg酶溶液，则可使用10 m³或更大的发酵罐大小。

底物可以与WO2010/133644中所述类似，或其可以通过用大豆粉或粗粉和各种盐如硫酸亚铁、硫酸锰和硫酸镁替换酵母提取物进行优化。发酵罐应当装配有空气流（例如1VVM=每体积发酵罐每分钟体积空气）并搅拌以保持溶氧在20%的空气饱和或更高，并维持足够的混合。可以应用分批方法，其中在发酵罐的接种之前添加碳源右旋糖，或可以使用更优选的限制碳的补料分批方法，其中连续加入糖。

温度控制在37℃，但也可以在范围33-40℃进行优化，并且pH为6.8（或在6.3和7.3之间）通过使用28％（w/v）氢氧化铵溶液。可以通过在660nm的光密度测量跟踪生物质浓度并且使用G4淀粉酶活性测试跟踪G4淀粉酶生产。

实施例

实施例1

本实施例显示酶溶液的制备。

通过使用旋转真空过滤器或类似物从枯草芽孢杆菌的G4的淀粉酶发酵物分离细胞，并且无细胞发酵液在横流超滤设备上用10千道尔顿膜浓缩以产生更浓缩的G4淀粉酶溶液。所述酶浓缩物（称为UFC1）随后用乙酸调节到pH =4.6并且酶析出形成浆液。在离心机上将沉淀物与上清液分离。上清液现在具有小于2％的在UFC1中的G4淀粉酶的浓度，但上清液仍包含从发酵带入的其它可溶性物质。

含有酶沉淀物的浆液调节至pH =6，以使G4淀粉酶进入溶液。作为微生物保护加入0.1％的山梨酸钾并加入碳以除去颜色。然后将溶液过滤以除去碳并降低微生物计数。此酶溶液现在具有高于UFC1的纯度，因为没有酶可溶性材料与上清液一起被除去。现在将这种产品放置在1000kg的周转箱（或槽）中，并在下面的实施例中被称为“酶溶液”。

实施例2

本实施例显示具有不溶性载体的酶溶液的干燥以产生粉末。

具有5.6％（w/w）的干物质含量和148 BMK/g的酶活性并且pH 6的，如实施例1中所述制备的1000kg以酶溶液形式的G4淀粉酶（纯度=148（BMK/g溶液）/ 3（BMK/mg G4）/56（g干物质/1000g溶液=88.1％）加入到槽中并搅拌。添加35kg MCC（Avicel PH 101）溶液。槽被不断搅拌，以保持其为均匀的悬浮液。然后将悬浮液输送到具有雾化轮的喷雾干燥器形成液滴。调节喷雾干燥器以得到仍可导致具有高酶回收率的干燥粉末的最大液滴尺寸。送液速度调整至350kg/小时，轮速到7000 RPM，并且热输入调整至喷雾干燥器的空气入口200℃和空气出口78℃。干燥的粉末具有96.3％的干物质含量（使用见于“一般方法”部分的干物质测试进行测量）。收集具有1240 BMK/g活性的粉末。粉末的粒径D [4,3]为52.7 µm。基于酶溶液中的干物质含量和加入的MCC的量，粉末中载体含量百分比可计算为（（35/（35+1000 *0.056））×0.963）=37％。

根据上面的数字和干重平衡，粉末的理论活性（如果没有酶损失）是1578 BMK/g或回收率为1240/1578 = 79%。

实施例3

具有5.6％（w/w）的干物质含量和148 BMK/g的酶活性的，如实施例1中所述制备的1000kg以酶溶液形式的G4淀粉酶（纯度=88.1％）加入到槽中并搅拌。添加17 kg MCC（Avicel PH 101）。

然后将浆料如实施例2中所述喷雾干燥。

粉末的干物质是95.7%。粒径D[4,3]是38.3 µm。活性是1750 BMK/g。粉末中载体含量（MCC含量）是22%。

实施例4

具有5.6％（w/w）的干物质含量和148 BMK/g的酶活性的，如实施例1中所述制备的1000kg以酶溶液形式的G4淀粉酶（纯度=88.1％）加入到槽中并搅拌。添加37 kg MCC（Avicel PH 101）+17 kg NaCl。然后将浆料如实施例2中所述喷雾干燥。

粉末的干物质是95.7%。粒径D[4,3]是40 µm。活性是1350 BMK/g。粉末中载体含量（MCC含量）是38%。

实施例5

本实施例显示使用即使高可溶性载体量也远不如用不溶性MCC载体有效增加粒径。

具有5.6％（w/w）的干物质含量和148 BMK/g的酶活性的，如实施例1中所述制备的1000kg以酶溶液形式的G4淀粉酶（纯度=88.1％）加入到槽中并搅拌。加入60 kg NaCl和125 kg麦芽糊精。搅拌进行30分钟以使NaCl和麦芽糊精进入溶液。然后将溶液泵到喷雾干燥器并如实施例2所述进行干燥。

粉末的干物质是96.4%。粒径（Ps）D[4,3]是26.5 µm。活性是472 BMK/g。

下表1显示是不溶性载体帮助增加粒径。即使高可溶性载体量对粒径也没有帮助。

实施例编号	Ps D[4,3] (µm)	活性(BMK/g)	不溶性载体（kg）	可溶性载体（kg）	载体
						2	52.7	1240	35	0	Avicel 35 kg
3	38.3	1750	17	0	Avicel 17 kg
						4	40.0	1350	17	17	Avicel 17 kg + NaCl 17 kg
5	26.5	472	0	185	NaCl 60 kg + 麦芽糊精 125 kg

表1。

实施例6

下表2显示编号1、2和3的粉末如何团聚成相应的编号1G、2G和3G的粉末。这在流化床中完成，其中粉末用水轻微润湿。例如，编号1的粉末在团聚前具有53.2 µm的粒径D[4,3]并且在团聚后目前称为1G的粉末的粒径D[4,3]是81.6 µm。使用如实施例3所述类似的方法生产粉末1、2和3。

粉末编号	简称	粒径D[4,3] µm
			1	喷雾干燥的G4粉末	53.2
2	喷雾干燥的G4粉末	52.1
			3	喷雾干燥的G4粉末	54.6
1G	团聚的G4粉末	81.6
			2G	团聚的G4粉末	82.2
3G	团聚的G4粉末	88.3

表2。

实施例7

本实施例显示喷雾干燥的粉末如何可以用于生产片剂。

下面的赋形剂在Nauta混合器中混合45分钟。

420 kg的Avicel PH 101（微晶纤维素），140 kg Prosolv SMCC50（硅化微晶纤维素），150kg来自实施例2的粉末和150 kg来自实施例3的粉末，120 kg Neosorb P 60 W（山梨糖醇）5 kg的aerosil 200（气相二氧化硅）

混合45分钟后，加入3.5 kg 硬脂酸镁并混合5分钟。

掺合物被倒入一个大袋子。大袋子转移到压片机Kilian E 150的上方（掺合物接近压片机以避免粉末离析）。

压片机进行调节以提供粉末的恒定体积，以得到3克的恒定重量的片剂。调整片剂的高度直至获得必要的强度。更低（更压缩）的片剂更强。然后可以通过如“一般方法”部分所述的脆碎度测试和崩解测试来测量强度。

实施例8

本实施例显示如何可以通过干燥酶而无载体生产粉末。由此粉末生产的片剂包含13.7%（w/w）G4淀粉酶，但是所述片剂不崩解并因此在应用中是无用的。

将具有5.6％（w/w）的干物质含量和148 BMK/g的酶活性的1000kg G4淀粉酶（纯度=88.1％）加入到槽中并搅拌。不添加载体或任何其它物质。然后将溶液泵到喷雾干燥器并如实施例2所述进行干燥。

粉末的活性是2050 BMK/g。如实施例7所述将粉末制成片剂。生产由56%MCC（2.8kg）、20%G4淀粉酶粉末（1kg）、24%其它混合物（1.2kg“其它混合物”在“材料”部分进行定义）组成的5kg粉末掺合物。则片剂的酶活性为410 BMK/g等于13.7%（w/w）G4淀粉酶。所述片剂不能根据规范生产；所述规范是脆碎度（如“一般方法”部分所述）最大5%，并且崩解时间（如“一般方法”部分所述）最大180s。片剂压缩到5.2mm高度导致2.3%脆碎度，其在规范内，但是，崩解>600s或远高于180s。尝试使片剂更松散以降低崩解时间导致片剂具有6mm高度和6.3%脆碎度，这现在超出5%的规范。所述片剂仍然不在600s内崩解。

崩解（s）	脆碎度（%）	片剂高度（mm）	强度
				>600	2.3	5.2	14.5
>600	6.3	6	8.3

表3。

实施例9

本实施例显示具有12.4%酶蛋白的片剂的成功生产。

实施例2中生产的粉末如实施例7中压缩成片剂。粉末（实施例2）的活性是1240 BMK/g。混合5 kg粉末。56%MCC（2.8kg）、30%G4淀粉酶粉末（1kg）、14%其它混合物（“其它混合物”在“材料”部分进行定义）（1.2kg）。则片剂的酶活性为372 BMK/g等于12.4%（w/w）G4淀粉酶。下表显示在生产片剂中有一些灵活性，因为获得两种不同的压缩（片剂的不同高度）。

崩解时间（s）	脆碎度（%）	片剂高度（mm）	强度
				240	1.80%	6	13.8
150	2.90	7.2	14.1

表4。

实施例10

本实施例显示具有16%酶蛋白的片剂的成功生产。

从实施例3生产的粉末如实施例7中压缩成片剂。粉末的活性是1600 BMK/g。混合5 kg粉末。56%MCC（2.8kg）、30%G4淀粉酶粉末（1kg）、14%其它混合物（“其它混合物”在“材料”部分进行定义）（1.2kg）。则粉末混合物的酶活性为480 BMK/g，等于16%（w/w）G4淀粉酶。生产了片剂。下表显示对崩解时间和脆碎度的分析数据。

崩解（s）	脆碎度（%）	片剂高度（mm）	强度
				120	1.91%	6	13.8

表5。

实施例11

本实施例显示用具有1860BMK/g活性的G4淀粉酶粉末和具有1615BMK/g活性的如实施例6中那样团聚的G4淀粉酶生产的两种片剂。

片剂A和片剂B两者包含15.2%（w/w）G4淀粉酶蛋白；测量为456 BMK/g。所述片剂使用如实施例7中所述相同类型的赋形剂，但是一些G4粉末已用如实施例6所述团聚的G4粉末替换，并且一些MCC已用Prosolv SMCC 50形式的硅化的MCC替换。

片剂A具有这样的组成（参见表7），其中25%的MCC已用SMCC替换并且50%的G4粉末已用团聚的G4粉末替换。这产生了具有相对低崩解时间和良好的强健性的片剂，所述强健性测量为生产不同高度的片剂而不过分影响崩解时间和脆碎度百分比的能力。对于生产重要的是具有可以允许在一定范围的高度上的片剂，以便在生产中具有灵活性。如果该范围缩小，可能批次到批次的变化生产落入规范之外的片剂。

仍然可以改进片剂A；特别是关于脆碎度，这是在可接受的范围的较高端。

片剂B增大SMCC水平至SMCC的总量的50％，并增加团聚的G4粉末到100％，这意味着没有使用G4粉末。片剂B具有与片剂A相同的G4淀粉酶蛋白含量15.2%（w/w）。

现在的结果是片剂具有甚至更低的崩解时间和更低的脆碎度并且相对宽范围的片剂高度。

	崩解（s）	脆碎度（%）	片剂高度（mm）
				片剂A	90	1.52	6
	90	2.2	6.4
					90	3.27	6.8
片剂B	90	0.39	6.2
					60	0.96	6.6
	60	1.56	7

表6。

	Avicel	Prosolv SMCC 50	G4 粉末	团聚的G4粉末	山梨糖醇	NaCl	其它混合物
								片剂A	42	14	12.3	14.1	6.6	5	6
片剂B	28	28	0	28.2	4.8	5	6

表7. 本表显示片剂A和片剂B的% (w/w)组成。

实施例12

本实施例显示在干燥期间如何使用不溶性载体增加粉末的密度并因此可以生产更高高度的片剂。

通过使用1000kg具有5.6%（w/w）干物质含量和148 BMK/g酶活性的G4淀粉酶（纯度=88.1%）生产粉末A。将其添加到槽中并搅拌。不添加载体或任何其它物质。然后将酶溶液泵到喷雾干燥器并如实施例2所述进行干燥。

通过使用1000kg具有5.6%（w/w）干物质含量和148 BMK/g酶活性的G4淀粉酶（纯度=88.1%）生产粉末B。将其添加到槽中并搅拌。添加17 kg MCC（Avicel PH 101）。然后将浆料如实施例2中所述喷雾干燥。

混合物A

生产5kg粉末掺合物，其由56% MCC（2.8kg）、25%粉末A（1kg）、19%其它混合物（1.2kg）组成。“其它混合物”在“材料”部分定义。在生产片剂之前，如上文在“一般方法”下所述测量的片剂混合物的松散粉末密度是0.336 g/cm³。

混合物B

生产5kg粉末掺合物，其由56% MCC（2.8kg）、25%粉末A（1kg）、19%其它混合物（1.2kg）组成。“其它混合物”在“材料”部分定义。在生产片剂之前，片剂混合物的松散粉末密度是0.403 g/cm³。

使用混合物B（其中粉末与MCC载体一起喷雾干燥）以在Kilian E压片机上生产片剂，获得比使用混合物A（其中粉末在不使用载体的情况下喷雾干燥）生产片剂重23%的片剂。对于Killian机器的具体设定，来自混合物A的片剂具有2.78g的重量，并且来自混合物B的片剂具有3.43g的重量。

实施例13

本实施例显示酶溶液与不溶性载体（MCC）一起干燥得到可以被压缩成高有效载荷片剂（>10 % (w/w) 酶蛋白）的粉末。此片剂容易在水中崩解。本实施例还显示无MCC载体的情况下干燥导致不容易在水中崩解的片剂。

在几乎类似于实施例1的过程中制备酶溶液。

通过使用旋转真空过滤器或类似物从枯草芽孢杆菌的FNA蛋白酶酶发酵物分离细胞，并且无细胞发酵液在横流超滤设备上用10千道尔顿膜浓缩以生产更浓缩的FNA蛋白酶溶液。所述酶浓缩物中加入5％甲酸钠/甲酸至pH=5.5并且FNA酶在15℃下24-48小时经历结晶过程。在离心机上将晶体与上清液分离。为获得更高的纯度，晶体用冷水洗涤一次。

通过在45℃使用1重量份晶体和3份水随后搅拌30分钟重溶解晶体。此溶液现在称为FNA酶溶液。

具有MCC的粉末N1

将具有8.2%干物质含量和93%纯度（如在“一般方法”部分定义）的4.68kg FNA酶溶液添加到槽中并搅拌，连同0.094 kg不溶性MCC载体Vivapur 101。酶浆料在Niro 喷雾干燥器尺寸6.3上进行喷雾干燥。干燥的粉末（这里称为N1）分析具有FNA蛋白酶含量585 mg/g (= 58.5 % (w/w))和DM=93.5%。计算的不溶性载体含量是(0,094 / (0,082 x 4,68 + 0,094) x 0,935 = 18,4%。

无MCC的粉末L2

具有7.%的干物质含量和82%的纯度的4.6kg FNA酶溶液在与N1类似但不使用载体的过程中喷雾干燥。干燥的粉末（这里称为L2）分析具有FNA蛋白酶含量611 mg/g (= 61.1 % (w/w))和DM=95%。

粉末N1和L2具有如下表8所示的下列粒径：

粉末 ID	酶 %(w/w)	粒径D[4,3]
			N1	58.5	41.1 µm
L2	61.1	25.4 µm

表8。

从如下表9所示的两种粉末酶N1和L2制备粉末掺合物。

掺合物 ID	酶%(w/w)	Vivapur 101% (w/w)	天然小麦淀粉{来自Amilina} %(w/w)	气相二氧化硅{CAB-O-SIL EH-5} %(w/w)
					具有N1的掺合物	22	60	17.5	0.5
片剂L2	20	60	19.5	0.5

表9：该表显示用于从N1粉末和L2粉末制造片剂的粉末掺合物的组成。

使用具有压力控制的手动单冲压片机将粉末混合物压制成片剂。将压力调节至达到片剂脆碎度刚好在5％以下的水平，这将产生最容易崩解的片剂。

表10显示关于生产的片剂的数据。具有粉末N1的片剂含有12.5％的酶并容易崩解（160s），而具有粉末L2的片剂花费远超过6分钟崩解（>>360秒）。

片剂 ID	每片剂的重量g	片剂尺寸	脆碎度（%）	自崩解（s）	FNA酶 %(w/w)
						具有N1的片剂	5	3.47	160	12.5
具有L2的片剂	5		3.56	>> 360	13.3

表10：该表显示如何从N1生产片剂；具有MCC载体的粉末获得良好质量的片剂，其可以崩解，而从粉末L2生产的片剂未使用载体，获得不能在合理的时间框架中崩解的片剂。

序列表

SEQ ID NO: 1. pMS382的成熟蛋白序列

SEQ ID NO: 2. FNA的成熟蛋白序列

序列表

<110> DuPont Nutrition Biosciences ApS

<120> 制备酶片剂的方法

<130> 19435PCT00

<160> 2

<170> PatentIn 版本n 3.5

<210> 1

<211> 429

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PMS382的成熟蛋白序列

<400> 1

Asp Gln Ala Gly Lys Ser Pro Ala Gly Val Arg Tyr His Gly Gly Asp

1 5 10 15

Glu Ile Ile Leu Gln Gly Phe His Trp Asn Val Val Arg Glu Ala Pro

20 25 30

Tyr Asn Trp Tyr Asn Ile Leu Arg Gln Gln Ala Ser Thr Ile Ala Ala

35 40 45

Asp Gly Phe Ser Ala Ile Trp Met Pro Val Pro Trp Arg Asp Phe Ser

50 55 60

Ser Trp Thr Asp Gly Asp Lys Ser Gly Gly Gly Glu Gly Tyr Phe Trp

65 70 75 80

His Asp Phe Asn Lys Asn Gly Arg Tyr Gly Ser Asp Ala Gln Leu Arg

85 90 95

Gln Ala Ala Gly Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val Lys Val Leu Tyr Asp

100 105 110

Val Val Pro Asn His Met Asn Arg Phe Tyr Pro Asp Lys Glu Ile Asn

115 120 125

Leu Pro Ala Gly Gln Arg Phe Trp Arg Asn Asp Cys Pro Asp Pro Gly

130 135 140

Asn Gly Pro Asn Asp Cys Asp Asp Gly Asp Arg Phe Leu Gly Gly Glu

145 150 155 160

Ala Asp Leu Asn Thr Gly His Pro Gln Ile Tyr Gly Met Phe Arg Asp

165 170 175

Glu Phe Thr Asn Leu Arg Ser Gly Tyr Gly Ala Gly Gly Phe Arg Phe

180 185 190

Asp Phe Val Arg Gly Tyr Ala Pro Glu Arg Val Asp Ser Trp Met Ser

195 200 205

Asp Ser Ala Asp Ser Ser Phe Cys Val Gly Glu Leu Trp Lys Glu Pro

210 215 220

Ser Glu Tyr Pro Pro Trp Asp Trp Arg Asn Thr Ala Ser Trp Gln Gln

225 230 235 240

Ile Ile Lys Asp Trp Ser Asp Arg Ala Lys Cys Pro Val Phe Asp Phe

245 250 255

Ala Leu Lys Glu Arg Met Gln Asn Gly Ser Val Ala Asp Trp Lys His

260 265 270

Gly Leu Asn Gly Asn Pro Asp Pro Arg Trp Arg Glu Val Ala Val Thr

275 280 285

Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gly Tyr Ser Pro Gly Gln Asn Gly Gly

290 295 300

Gln His Lys Trp Pro Leu Gln Asp Gly Leu Ile Arg Gln Ala Tyr Ala

305 310 315 320

Tyr Ile Leu Thr Ser Pro Gly Thr Pro Val Val Tyr Trp Pro His Met

325 330 335

Tyr Asp Trp Gly Tyr Gly Asp Phe Ile Arg Gln Leu Ile Gln Val Arg

340 345 350

Arg Thr Ala Gly Val Arg Ala Asp Ser Ala Ile Ser Phe His Ser Gly

355 360 365

Tyr Ser Gly Leu Val Ala Thr Val Ser Gly Ser Gln Gln Thr Leu Val

370 375 380

Val Ala Leu Asn Ser Asp Leu Ala Asn Pro Gly Gln Val Ala Ser Gly

385 390 395 400

Ser Phe Ser Glu Ala Val Asn Ala Ser Asn Gly Gln Val Arg Val Trp

405 410 415

Arg Ser Gly Ser Gly Asp Gly Gly Gly Asn Asp Gly Gly

420 425

<210> 2

<211> 275

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FNA的成熟蛋白序列

<400> 2

Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu

1 5 10 15

His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp

20 25 30

Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala

35 40 45

Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His

50 55 60

Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly

65 70 75 80

Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu

85 90 95

Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu

100 105 110

Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly

115 120 125

Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala

130 135 140

Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly

145 150 155 160

Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala

165 170 175

Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val

180 185 190

Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr

195 200 205

Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser

210 215 220

Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn

225 230 235 240

Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys

245 250 255

Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala

260 265 270

Ala Ala Gln

275

Claims

1.用于制备酶片剂的方法，所述方法包括下列步骤：

a) 混合酶和不溶性载体，以获得浆料，

2.根据权利要求1的方法，其中以酶溶液形式添加所述酶以获得浆料。

3.根据权利要求2的方法，其中所述酶溶液具有在50-90%（w/w）纯酶区间的酶纯度，诸如在60-90%（w/w）纯酶区间，诸如在65-90%（w/w）纯酶区间，诸如在70-90%（w/w）纯酶区间，诸如在75-90%（w/w）纯酶区间。

4.根据权利要求2-3任一项的方法，其中所述酶溶液具有4-20% (w/w)，5-20% w/w，诸如5-15% (w/w)或6-12% (w/w)的干物质含量。

5.根据权利要求1-4任一项的方法，其中所述酶是选自淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、氧化酶和脂肪酶的一种或多种。

6.根据权利要求1-5任一项的方法，其中所述片剂包含10％（w/w）和45％（w/w）之间的酶，诸如10％（w/w）和40％（w/w）之间的酶，诸如15 ％（w/w）和20％（w/w）之间的酶。

7.根据权利要求1-6任一项的方法，其中所述不溶性载体选自聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）、微晶纤维素和小麦淀粉，优选微晶纤维素。

8.根据权利要求1-7任一项的方法，其中所述不溶性载体是颗粒状微晶纤维素诸如任选地涂覆有二氧化硅。

9.根据权利要求1-8任一项的方法，其中所述颗粒状微晶纤维素具有25-150 µm，诸如30-75 µm的体积平均直径。

10.根据权利要求1-9任一项的方法，其中干燥的酶粉末中不溶性载体的含量是基于干燥的酶粉末的重量至少10%（w/w）且至多40（w/w），诸如10-35% (w/w)或10-30% (w/w)或10-20% (w/w)。

11.根据权利要求1-10任一项的方法，其中所述干燥是喷雾干燥，诸如单级喷雾干燥。

12.根据权利要求1-11任一项的方法，其中步骤b）的所述酶颗粒具有30-250 µm，诸如30-150 µm，诸如35-75 µm或诸如40-75 µm的体积平均直径。

13.根据权利要求1-12任一项的方法，其中步骤b）的所述酶颗粒在直接压缩之前进一步团聚，诸如通过诸如流化喷雾干燥。

14.根据权利要求13的方法，其中所述团聚的酶颗粒具有40–250 µm，诸如50–150 µm的体积平均直径。

15.根据权利要求1-14任一项的方法，其中所述干燥的酶颗粒或干燥的团聚的酶颗粒在步骤c）之前与另外的片剂赋形剂诸如崩解剂混合。

16.根据权利要求15的方法，其中作为片剂赋形剂加入的崩解剂的量是20-80％（w/w），诸如30-65％（w/w），诸如40-56%（w/w）或50-60％（w/w）。

17.根据权利要求1-16任一项的方法，其中所述片剂在300秒内，诸如180秒内自崩解和/或其中所述片剂在180秒内诸如100秒内崩解。