CN107519239A

CN107519239A - 黄芩提取物在制备激活hsp70药物中的应用

Info

Publication number: CN107519239A
Application number: CN201710279231.4A
Authority: CN
Inventors: 李红玉; 王亚军; 裴月娟; 朱红梅; 李洋; 支德娟; 余兰; 蒋云龙
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2017-04-25
Filing date: 2017-04-25
Publication date: 2017-12-29

Abstract

本发明公开了一种黄芩提取物的新用途，具体为黄芩提取物在制备激活HSP70启动子药物中的应用，属于生物医药领域。本发明所述的黄芩提取物为黄芩水煎液，本发明通过将黄芩水煎液作用于构建的HSP70启动子细胞筛选模型，发现黄芩水煎液能激活HSP70启动子，可在制备激活HSP70启动子激活剂或药物中应用，具有治疗神经退行性疾病的潜力。

Description

黄芩提取物在制备激活HSP70药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种中药提取物在制备HSP70启动子激活剂中的应用以及在制备激活HSP70药物中的应用。

背景技术

热休克蛋白(HSP)是广泛存在于原核细胞和真核细胞中，在进化上非常保守的一类热应激蛋白，按照分子量的大小分为HSP90(83-90KD)、HSP70(66-78KD)、HSP60和小HSP等4个家族，其中HSP70为热休克蛋白家族中最保守和最重要的一族，同时是最受关注、研究最为深入的一种(Kiang and Tsokos,1998)。人HSP70家族至少包含八个基因表达产物蛋白，分别为HSP70-1a、HSP70-1b、HSP70-1t、HSP70-2、HSP70-5、HSP70-6、HSC70、HSP70-9，它们都是HSP70基因不同位置表达的产物，结构上具有高度保守的氨基酸序列和结构域，结构域包括ATP结合域、蛋白酶敏感域、多肽结合域、可变域、富含G/P的C端域(Daμgaard et al.,2007)。其中HSP70-1a、HSP70-1b是两种应激可诱导蛋白，其对应的启动子为诱导型启动子，分别为HSPA1A和HSPA1B。在各种应激环境下(包括高温、氧化应激、损伤等)，这两种启动子被迅速激活，使HSP70-1a和HSP70-1b高水平表达，与蛋白质的疏水残基结合，稳定蛋白质的结构，防止蛋白质的错误折叠和聚集，进而保护细胞。

在不同组织和细胞中，HSPA1A和HSPA1B基因的表达量有所不同，一般情况下，HSPA1A的表达要高于HSPA1B。HSPA1A的启动子区位于转录起始位点-1000bp到100bp处，其中包括两个TATA-box、三个CCAAT-box、四个GC-box,还包括多个nGAAn区，称为热休克元件(heat responseelement，HSE)。HSE是热应激应答中必不可少的功能区，它的存在使启动子高水平活化转录，从而使热休克蛋白具有可诱导性。在HSPA1A启动子中含有184个转录因子结合位点，其中最重要的有HSF1、NF-kappaB1、STAT3等。在高温、氧化应激、细胞内环境pH发生变化以及细胞受到损伤时，HSF1与HSE结合从而激活HSPA1A启动子，诱导产生大量的HSP70，从而保护细胞免受损伤。因此可以将HSPA1A启动子作为研究对象，根据HSPA1A启动子被诱导的情况，筛选出能明显激活HSPA1A启动子进而产生大量的HSP70的激活剂，以用于和HSP70相关的疾病治疗中。

HSP70具有多种生物学功能，主要包括以下几个方面：(1)分子伴侣功能：HSP70与新生、未折叠、错误折叠或聚集的蛋白质结合，使某些蛋白质解离，帮助需要折叠的蛋白质正确折叠。许多神经退行性疾病都与蛋白质错误折叠和聚集密切相关，例如阿尔兹海默、帕金森症、肌萎缩侧索硬化症。目前认为错误折叠的α-synuclein的聚集和细胞毒性在帕金森氏病和带有Lewy小体的痴呆的发病过程中起到十分关键的作用，HSP70可以在体内和体外减少错误折叠和聚集的α-synuclein的种类，并使机体免受α-synuclein的毒害作用。此外过表达的HSP70能够抑制Aβ早期的聚集，促进Aβ在小胶质细胞中的降解，使错误折叠的蛋白质重新折叠从而减少低聚物，过表达的HSP70还能够降低过度磷酸化的难溶的Tau蛋白，减少Tau蛋白的积累。(2)抗细胞凋亡作用：HSP70的过量表达能够抑制有害应激所导致的JNK、p38等应激激酶的激活，从而防止细胞凋亡，例如一种HSP70合成诱导剂肝细胞生长因子HGF能够通过诱导HSP70的合成，来抑制肿瘤坏死因子TNF-α所致的肝细胞凋亡。(3)免疫作用：过量表达的HSP70能够提高细胞内的总谷胱甘肽的含量，防止细胞受TNF等细胞因子的攻击，能够通过抑制IL-1及干扰素对NO合成酶的诱导作用，从而保护胰腺的生理功能。(4)细胞保护作用：当机体细胞受到各种应激刺激时，如高热、氧化、机械损伤等，细胞会产生异常蛋白，同时产生的HSP70能够加速异常蛋白的降解，或者使蛋白质肽链重新折叠，恢复蛋白质原来的构象，增强细胞内稳态，从而起到细胞保护的作用，此外，HSP70被认为是损伤后脑组织产生的一种重要的内源性保护因子。

HSP70的生物学功能十分广泛，在疾病中的作用和意义非常重大，成为解决众多疾病的关键点，所以寻找HSP70激活剂将成为亟待解决的问题。目前已经发现了一些HSP70的激活剂，如有用于治疗胃溃疡的替普瑞酮、用于神经退行性疾病中的蛋白酶抑制剂，用于组织转移的氯化亚锡等等，但这些激活剂的毒性较大，副作用多，而中药的毒副作用相对较小，靶点多，所以从中药库中筛选出显著激活HSP70的激活剂将对治疗或预防与HSP70有关的疾病大有裨益。

参考文献

Daμgaard,M.,Rohde,M.,and Jaattela,M.(2007).The heat shock protein70family:Highly homologous proteins with overlapping and distinctfunctions.FEBS letters 581,3702-3710.

Kiang,J.G.,and Tsokos,G.C.(1998).Heat shock protein 70kDa:molecμLarbiology,biochemistry,and physiology.Pharmacol Ther 80,183-201.

发明内容

本发明的目的在于提供一种黄芩提取物在制备HSP70启动子激活剂中的应用。

本发明中所用的黄芩又名山茶根，黄金茶，拉丁学名为Scutellaria baicalensisGeorgi，为唇形科植物黄芩的根，味苦、性寒，有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效，研究显示黄芩具有抗病毒、抗菌、抗氧化、抗过敏、保护神经元等多方面的药理作用。

其中，所述的黄芩提取物为黄芩水煎液。

进一步地，所述的黄芩水煎液是通过下述方法制备的：称取黄芩药材，加蒸馏水浸泡30分钟，煮沸后煎煮30分钟；纱布过滤取滤液，滤渣加蒸馏水后浸泡30分钟，煮沸后煎煮30分钟；纱布过滤后合并两次滤液，浓缩；待自然冷却后1000rpm离心10分钟，用滤纸过滤除杂，定容，制得黄芩水煎液。

其中，所述的黄芩水煎液的生药浓度为0.61mg/mL-6.25mg/mL。

其中，所述的与HSP70启动子有关的疾病为神经退行性疾病，心血管疾病。

进一步地，所述的神经退行性疾病为阿尔兹海默、帕金森症、肌萎缩侧索硬化症中的任一种。

本发明的目的还在于提供一种黄芩提取物在制备预防或治疗与HSP70启动子有关的神经退行性疾病药物中的应用。

其中，所述的黄芩提取物能够通过激活HSP70启动子激活HSP70。

其中，所述的神经退行性疾病为阿尔兹海默、帕金森症、肌萎缩侧索硬化症。

其中，所述的黄芩水煎液的生药浓度为125μg/mL-500μg/mL。

在本发明中，通过构建HSP70启动子激活剂高通量筛选细胞模型，对黄芩水煎液进行检测后发现，黄芩水煎液能明显激活HSP70启动子，并通过构建AD细胞模型，对能激活HSP70启动子的黄芩水煎液进行抗AD效果验证，发现黄芩水煎液在AD细胞模型中能够减轻由Aβ_25-35引起的细胞损伤程度。

附图说明

图1为阳性药物HSP70启动子激活剂替普瑞酮对HSP70启动子的激活情况

图2为黄芩水煎液对HSP70启动子激活的半定量结果

图3为黄芩水煎液HSP70启动子激活的定量结果

图4为黄芩水煎液对PC12细胞生长抑制作用结果

图5为Aβ25-35对PC12细胞生长抑制作用结果

图6为MTT检测黄芩水煎液对Aβ25-35引起PC12细胞损伤模型的作用结果

图7为LDH法检测黄芩水煎液对Aβ25-35引起PC12细胞损伤模型的作用结果

图8为黄芩水煎液对Aβ25-35引起的PC12细胞活性氧含量的影响

图9为Hoechst 33258染色法检测黄芩水煎液对PC12细胞凋亡的影响

图10为Annexin-V/PI双染法检测黄芩水煎液对PC12细胞凋亡的影响

具体实施方式

以下提供具体实施例以实现本发明所述的黄芩提取物在制备激活HSP70启动子药物中的应用，但不限于这些实施例。

主要实验仪器

PCR仪(美国ABI veriti)；Image Quant 300型凝胶成像仪(GE)；HZQ-F16OA型恒温振荡培养箱(上海一恒)；HDB-PLUS型恒温金属浴(Thermo Fisher)；DYY-8B型电泳仪(伯乐)；超纯水仪(Millipore)；制冰机、离心机(Hitachi)；倒置荧光显微镜(Olympus 1X71)；多功能酶标仪(Varioskan Flash)。

主要实验材料

限制性内切酶HindⅢ-HF(NEB公司产品)；血液DNA提取试剂盒；无内毒素质粒大提试剂盒购于天根生化科技有限公司；PrimeSTAR GXL DNA polymerase；SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒；DNA胶回收试剂盒；PCR产物纯化试剂盒；rTaq酶；卡那霉素；氨苄青霉素；pMD^TM19-T Vector Cloning Kit均购于上海生工生物工程股份有限公司；质粒pEGFP-1购于优宝生物；pGL3-Enhancer由上海交通大学生命科学学院金卫林教授惠赠；Lipofectamine2000购于Invitrogen；胎牛血清购于四季青；DMEM/HIGH GLUCOSE；Penicillin-Streptomycin Solution购于HyClone；Luciferase Assay System购于Promega。

大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5α和大肠杆菌TOP10购买自天根生化科技(北京)有限公司。

HEK 293T购自于中国科学院细胞库。

实施例1基于HSPA1A Promter筛选细胞模型的建立

1.HSPA1A Promoter基因的克隆

(1)设计合成HSPA1A Promoter PCR引物

P1：CCCAAGCTTCGGATCAGCCAACGCCCACATACCTC

P2：CGCGGATCCCGGTTCCCTGCTCTCTGTCGGCTCC

(2)PCR扩增

采集人血液，按照血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，以人DNA为模板，以P1和P2分别作为上下游引物进行PCR扩增。PCR体系(25μL)如下：

表1 PCR反应体系

PCR反应条件：98℃：10s；60℃：15s；68℃：1min；循环40次。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果显示扩增出约1000bp大小的HSPA1A Promoter DNA条带。

(3)HSPA1A Promote的TA克隆

PCR产物经胶回收后对其进行加“A”处理，反应体系如下：纯化的PCR产物HSPA1APromoter10μL，dNTPs 2μL，10X PCR Buffer 1μL，rTaq酶0.2μL。在PCR仪器上72℃反应30min。用PCR产物纯化试剂盒纯化加“A”尾的HSPA1A Promoter基因片段。按照pMD^TM19-TVector Cloning Kit的说明书进行TA克隆，从而构建含有HSPA1A Promoter基因的重组质粒pMD19-T-HSPA1A Promoter载体，连接产物热激转化入感受态E.coli DH5α，涂于含有100μg/mL氨苄青霉素(AMP)的LB平板上，37℃培养12小时，挑取单个菌落培养进行菌液PCR检测，并提取质粒后进行质粒DNA限制性酶切分析和DNA测序确定插入的目的基因序列的准确性。

2.pHSPA1A-EGFP重组载体的构建

本实验以pMD19-T-HSPA1A Promoter载体为模板进行扩增HSPA1A Promoter基因片段，引物设计如下：

P3：TCTCGAGCTCAAGCTTCGGATCAGCCAACGCCCACATACC

P4：GCAGAATTCGAAGCTTCGGTTCCCTGCTCTCTGTCGGCTCC

PCR反应体系(25μL)如下：

表2 PCR反应体系

ddH₂O	15μL
		5xprimeSTAR GXL Buffer	5μL
dNTP Mixture(2.5mM)	2μL
		P3(10μM)	0.75μL
P4(10μM)	0.75μL
		pMD19-T-HSPA1A Promoter	1μL
PrimeSTAR GXL DNA polymerase	0.5μL

PCR反应条件：98℃：10s；60℃：15s；68℃：1min；循环40次。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果显示扩增出约1000bp大小的HSPA1A Promoter DNA条带。通过琼脂糖凝胶电泳以及胶回收试剂盒回收HSPA1A Promoter DNA片段，用HindⅢ-HF酶切质粒pEGFP-1质粒，酶切反应体系如下：pEGFP-110μL，Cutsmart 5μL，HindⅢ-HF 1μL，ddH₂O 34μL，总体积为50μL，37℃金属浴反应30分钟后，用胶回收试剂盒回收线性化的pEGFP-1片段。本次实验采用无缝克隆技术进行连接，按照Takara公司的HD Cloning Kit操作手册进行，具体如下：In-Fusion反应液的配置：纯化的HSPA1A Promoter DNA片段73ng，线性化的pEGFP-1载体100ng，5X In-Fusion HD Enzyme Premix 2μL，总体积为10μL，将混合液置于50℃金属浴上反应30分钟，反应结束后瞬时离心，将离心管置于冰上冷却5分钟，进行后续的转化反应，转化反应如下：取3μL反应混合液，加入50μL TOP10感受态细胞，轻轻混匀后置于冰山30分钟；42℃热激45秒，冰上放置2分钟；加150μL无抗生素的空LB培养基，37℃150rpm复苏1小时；将复苏后的细胞全部均匀涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃孵育20小时。挑取单个菌落到900μL含卡那霉素的LB培养液中，置于37℃摇床上200rpm培养6.5小时后，进行菌液PCR检测，并提取质粒后进行质粒DNA限制性酶切分析和DNA测序确定插入的目的基因序列的准确性。

3.pGL3-E-HSPA1A Promoter重组载体的构建

本实验以pMD19-T-HSPA1A Promoter为模板，进行扩增HSPA1A Promoter基因片段，引物设计如下：

P5：CGATCTAAGTAAGCTTCGGATCAGCCAACGCCCACATAC

P6：CCGGAATGCCAAGCTTCGGTTCCCTGCTCTCTGTC

PCR反应体系(25μL)如下：

表3 PCR反应体系

ddH₂O	15μL
		5xprimeSTAR GXL Buffer	5μL
dNTP Mixture(2.5mM)	2μL
		P5(10μM)	0.75μL
P6(10μM)	0.75μL
		pMD19-T-HSPA1A Promoter质粒	1μL
PrimeSTAR GXL DNA polymerase	0.5μL

PCR反应条件：98℃10s；60℃15s；68℃1min；循环40次。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果显示扩增出约1000bp大小的HSPA1A Promoter DNA条带。通过琼脂糖凝胶电泳以及胶回收试剂盒回收HSPA1A Promoter DNA片段，用HindⅢ-HF酶切质粒pGL3-Enhancer,酶切反应体系如下：pGL3-Enhancer 10μL，Cutsmart 5μL，HindⅢ-HF 1μL，ddH₂O34μL，总体积为50μL，37℃金属浴反应30分钟后，用胶回收试剂盒回收线性化的pGL3-Enhancer片段。采用无缝克隆技术进行连接，实验方法同步骤2所述。

4.基于HSPA1A Promter筛选细胞模型的建立

将293T细胞复苏后，传代4次，观察细胞状态良好，备用。

(1)pHSPA1A-EGFP重组载体的瞬时转染

a.细胞铺板：转染24小时，使用0.25％胰酶消化细胞并计数，将细胞以1×10⁶个细胞/mL的密度接种于6cm培养皿中，总体积为4mL。转染时要求细胞汇合度为70-80％；

b.转染前吸掉细胞培养液上清，使用无血清的DMEM培养基清洗一遍后，加入3mLopti-MEM减血清培养基；

c.将4μg的pHSPA1A-EGFP质粒和4μg的pDsRed-Express-N1质粒加至500μL的Opti-MEM减血清培养基中，轻轻摇晃均匀；

d.将16μL的Lipofectamine 2000加至另外500μL的opti-MEM减血清培养基中，轻轻摇晃均匀，室温静置5分钟；

e.将DNA悬液和Lipofectamine 2000悬液混合，总体积为1mL，轻轻混匀，室温静置20分钟；

f.将DNA和Lipofectamine 2000混合液加至6cm皿中，前后左右摇晃均匀，置于细胞培养箱中培养；

h.转染6小时后，先用PBS清洗2次后，加300μL 0.25％胰酶消化细胞1分钟，转移至无菌蓝盖瓶中，再加24mL 10％FBS培养液，进行96孔板铺板，每孔200μL；培养12小时后，进行药物处理，继续培养24小时后，用倒置荧光显微镜观察并拍照绿色荧光和红色荧光。利用ImageJ分别求一组中绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的平均荧光强度，用绿色荧光蛋白的平均荧光强度比红色荧光蛋白的平均荧光强度，再与对照组相比求得相对荧光强度。即相对荧光强度＝(药物处理组中绿色荧光蛋白的平均荧光强度/药物处理组中相对应的红色荧光蛋白的平均荧光强度)/(对照组中绿色荧光蛋白的平均荧光强度/对照组中相对应的红色荧光蛋白的平均荧光强度)

(2)pGL3-E-HSPA1A Promoter重组载体的瞬时转染

转染的方法同步骤(1)中的pHSPA1A-EGFP重组载体的瞬时转染。

待转染的为pGL3-E-HSPA1A Promoter和pRL-TK，质量比为23:1，DNA总质量为8μg。加药处理后，继续培养24小时，用Luciferase Assay System检测荧光素酶的活性。具体方法如下：从细胞培养箱中取出96孔板，平衡至室温，吸去上清；每孔加入80μLPassitive(1X)Lysis裂解细胞1分钟；吹打细胞使之充分裂解，每孔取40μL转移至CorningCostar全白96孔板中；每孔加入40μL Dual-Glo Luciferase Reagent，摇晃2分钟，室温孵育10分钟，用多功能酶标仪检测萤火虫荧光素酶的活性；每孔再加入40μL Dual-Glo Stop&Glo Reagent，室温孵育10分钟，其中摇晃2分钟，多功能酶标仪检测海肾荧光素酶的活性。

实施例2基于HSPA1A Promter筛选细胞模型的验证

1.热激对HSPA1A Promter的作用

转染6小时后，进行96孔板铺板，培养12小时后，进行热激处理，具体操作如下：取3孔细胞作为热激处理组，同时设置空白对照孔。吸掉上清后，用PBS清洗细胞一次，加20μL的胰酶消化1分钟，再加200μL完全培养液，转移至1.5mL EP管中，放在金属浴上41℃热激处理1小时后，再转移到96孔板中，放到细胞培养箱中继续培养24小时后，用倒置荧光显微镜观察并拍照绿色荧光和红色荧光，或者用Luciferase Assay System检测荧光素酶的活性。结果：如图1所示，41℃能够明显激活HSP70启动子，说明HSP70启动子细胞筛选模型构建成功。(*表示和cotrol相比P<0.05，**表示和cotrol相比P<0.01)

2.替普瑞酮对HSPA1A Promter的作用

替普瑞酮为文献报道的HSPA1A Promter激活剂，所以用替普瑞酮作为阳性对照。

替普瑞酮的配制：精密称取0.3305g替普瑞酮，溶于5mL 5％阿拉伯胶溶液中，制得200mmol/L的替普瑞酮储备液，使用时稀释至所需浓度。

加药处理：转染6小时后，进行96孔板铺板，培养12小时后，分别添加不同浓度的替普瑞酮，继续培养24小时后，用倒置荧光显微镜观察并拍照绿色荧光和红色荧光，或者用Luciferase Assay System检测荧光素酶的活性。替普瑞酮作为HSP70激活剂的阳性药物，在3.90μmol/L-125.0μmol/L浓度范围内能激活HSP70启动子，进一步说明已成功构建HSP70启动子激活剂筛选细胞模型，结果如图1所示(*表示和cotrol相比P<0.05，**表示和cotrol相比P<0.01)。

实施例3黄芩水煎液对HSPA1A Promter的作用

1.黄芩水煎液的制备

称取25g黄芩药材，加入200mL蒸馏水浸泡30分钟；武火煮沸后文火煎煮30分钟；用纱布过滤取滤液，滤渣添加150mL蒸馏水后浸泡30分钟；武火煮沸后再文火煎煮30分钟；纱布过滤后合并两次滤液，文火浓缩至25mL左右；待自然冷却后1000rpm离心10分钟，用滤纸过滤除杂，用25mL容量瓶定容，从而制备1g/mL的黄芩水煎液储备液，使用时稀释至所需浓度。

2.MTT法确定黄芩水煎液的有效药物作用浓度范围

加药处理前一天进行96孔板铺板，每孔1×10⁴个细胞，培养24小时后，添加不同浓度的黄芩水煎液，每组三孔，处理24小时后，加入5mg/mL的MTT，使其终浓度为0.5mg/mL，放到细胞培养箱中培养4小时后，吸掉上清，每孔加入150μL DMSO，置于摇床上低速震荡10分钟，用酶标仪检测490nm处的吸光值。计算得到黄芩水煎液的有效药物作用浓度范围为：0.61mg/mL-6.25mg/mL。

3.黄芩水煎液对HSPA1A Promter的作用

转染6小时后，进行96孔板铺板，培养12小时后，用DMEM稀释黄芩水煎液后，分别添加不同浓度的黄芩水煎液，空白对照为DMEM培养液，继续培养24小时，倒置荧光显微镜观察并拍照绿色荧光和红色荧光，或者用Luciferase Assay System检测荧光素酶的活性。定性和定量筛选的结果显示，在0.61mg/mL-6.25mg/mL浓度范围内，黄芩水煎液能够激活HSP70启动子，如图2和图3所示(*表示和cotrol相比P<0.05，**表示和cotrol相比P<0.01)。

实施例4黄芩水煎液对Aβ_25-35引起PC12细胞损伤模型的作用

1.黄芩水煎液对PC12细胞生长抑制作用

本实验采用MTT法检测黄芩水煎液对PC12细胞的生长抑制作用，方法同实施例3中的步骤2。实验结果显示黄芩水煎液在小于0.5mg/mL时对PC12细胞没有毒性，故选择小于等于0.5mg/mL的浓度范围来检测黄芩水煎液对Aβ_25-35引起的PC12细胞损伤模型的作用，如图4所示(*表示和cotrol相比P<0.05，**表示和cotrol相比P<0.01)。

2.Aβ_25-35对PC12细胞生长抑制作用

精密称取Aβ_25-35粉末溶于过滤灭菌去离子双蒸水，配成1mmol/L的储备液，0.22μM滤膜过滤除菌后，于37℃环境中孵育7天，使其形成聚集态Aβ25-35,然后用DMEM培养液稀释成不同浓度梯度(10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L、30μmol/L)后进行加药处理细胞，用MTT的方法检测不同浓度梯度的Aβ_25-35对PC12细胞生长抑制作用，以确定Aβ25-35对PC12细胞损伤的最佳浓度，具体方法同实施例3中的步骤2。实验结果显示，Aβ_25-35对PC12细胞的毒性作用呈现梯度依赖关系，在30μmol/L时细胞生存率为54.3％，选择此浓度作为随后实验中的模型组Aβ_25-35的浓度，如图5所示(*表示和cotrol相比P<0.05，**表示和cotrol相比P<0.01)。

3.MTT检测黄芩水煎液对Aβ_25-35引起PC12细胞损伤模型的作用

加药处理前一天进行96孔板铺板，每孔1×10⁴个细胞，培养24小时后，对照组加入空培养基，模型组中加入30μmol/L Aβ_25-35，实验组加入30μmol/L Aβ_25-35和不同浓度(125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL)的黄芩水煎液，每组三孔，处理24小时后用MTT的方法检测，方法同实施例3中的步骤2。实验结果显示，与空白对照相比，黄芩水煎液能够明显抑制由Aβ_25-35引起的PC12细胞死亡，并出现浓度梯度依赖关系，说明黄芩水煎能通过激活HSP70启动子，产生HSP70热休克蛋白，以此减轻由Aβ_25-35导致的细胞毒害作用，如图6所示(*表示和0μg/ml组相比P<0.05，**表示和和0μg/ml组相比P<0.01)。

4.LDH(lactate dehydrogenase,乳酸脱氢酶)法检测黄芩水煎液对Aβ_25-35引起PC12细胞损伤模型的作用

加药处理前一天进行96孔板铺板，每孔1×10⁴个细胞，每孔200μL，培养24小时，使细胞密度不超过80％-90％，将各培养孔分成如下几组：无细胞的培养孔(背景空白对照孔)，未经药物处理的对照细胞孔(样品对照孔)，未经药物处理的用于后续裂解的细胞孔(细胞最大酶活性对照孔)，以及药物处理的细胞孔(药物处理样品孔)，其中包括模型组(加入30μmol/L Aβ_25-35)和实验组(加入30μmol/L Aβ_25-35和不同浓度的黄芩水煎液)，每组三孔，处理24小时，到预定的检测时间点前1小时，从细胞培养箱中取出细胞培养板，在“样品最大酶活性对照孔”中加入20μL LDH释放剂，反复吹打数次混匀，然后在细胞培养箱中孵育。到达预定时间后，将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。分别取各孔中的上清液120μL，加入到新的96孔板相应孔中，随即进行样品检测。样品检测如下：各孔中分别加入60μL LDH检测工作液；混匀，室温(约25℃)避光孵育30min，然后在490nm处测定吸光度，以600nm波长作为参考波长进行双波长测定。细胞死亡率％＝(处理样品吸光度-样品对照孔)/(细胞最大酶活性的吸光度-样品对照孔吸光度)×100。实验结果显示，Aβ_25-35引起细胞释放的LDH升高，导致细胞死亡增高，而加入黄芩水煎后，细胞内释放的LDH明显降低，细胞死亡率降低，说明黄芩水煎液能抑制由Aβ_25-35引起的细胞死亡，进一步证明黄芩水煎液能通过激活HSP70启动子，生成HSP70热休克蛋白，以此减轻Aβ_25-35所导致的细胞毒害作用，如图7所示(*表示和0μg/ml组相比P<0.05，**表示和和0μg/ml组相比P<0.01)。

5.活性氧含量检测

加药处理前一天进行96孔板铺板，每孔1×10⁴个细胞，每孔200μL，培养24小时，使细胞密度不超过80％-90％，将各培养孔分成如下几组：空白对照组(DMEM)、模型组(加入30μmol/L Aβ_25-35)和实验组(加入30μmol/L Aβ_25-35和不同浓度的黄芩水煎液)，每组三孔,处理24小时后，吸出上清，加入100μL 10μM的DCFH-DA(2,7-dichlorofluorescin diacetate,2',7'-二氯荧光素二乙酸酯)，37℃细胞培养箱中避光孵育30分钟后，用PBS洗涤细胞2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA,然后用多功能酶标仪在488nm激发波长和525nm发射波长下进行检测。实验结果显示，Aβ_25-35能够引起细胞内的活性氧上升，加入黄芩水煎液后，由Aβ_25-35引起的活性氧降低，说明黄芩水煎液能够抑制由Aβ_25-35引起的细胞内活性氧的产生，进一步证明黄芩水煎液能够通过激活HSP70启动子，生成HSP70热休克蛋白，以此减轻由Aβ_25-35导致的细胞毒害作用，如图8所示(*表示和0μg/ml组相比P<0.05，**表示和和0μg/ml组相比P<0.01)。

6.Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡

加药处理前一天进行6孔板爬片(先在6孔板孔内放入洁净的灭菌盖玻片，再进行细胞铺板)，每孔2×10⁶个细胞，每孔2mL,培养24小时，使细胞密度不超过80％-90％，将各培养孔分成如下几组：空白对照组、模型组(加入200μmol/L H₂O₂)和实验组(加入200μmol/LH₂O₂和不同浓度的黄芩水煎液)，每组三孔，处理24小时后，用PBS洗涤细胞一次后加1mL卡诺氏液(3份无水乙醇，1份冰醋酸)在常温下固定15分钟，再用PBS洗涤细胞3次，每次1分钟，然后每孔加入1.5mL 0.5μg/mL Hoechst 33258,置于细胞培养箱中染色5分钟，用PBS洗涤细胞3次，每次2分钟，在正置荧光显微镜下观察拍照。每组取五个视野，进行统计每个视野中的细胞总数和凋亡细胞总数，细胞凋亡率(％)＝(计数细胞凋亡总数/计数细胞总数)×100％。实验结果显示，在空白对照中，正常细胞呈蓝色均匀荧光，模型组中出现了凋亡细胞的明显特点：大量细胞呈缩小凝固状蓝色明亮荧光，并出现了凋亡小体。实验组中，随着加入的黄芩浓度增大，凋亡细胞呈浓度梯度依赖减少，说明黄芩水煎液能够通过激活HSP70启动子，生成HSP70热休克蛋白，以此减少PC12细胞的凋亡，如图9所示(*表示和0μg/ml组相比P<0.05，**表示和0μg/ml组相比P<0.01)。

7.Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡

收集PC12细胞，将其以2×10⁶个/孔的密度接种于6孔培养板上，培养24小时后，按处理方式不同分为：空白对照组、200μmol/L H₂O₂处理组、200μmol/L H₂O₂+不同浓度黄芩水煎液处理组，每组3孔。培养24小时后，上清培养液全部转移到一个洁净的EP管待用，然后PBS洗涤细胞一次并弃掉，加入适量无EDTA的胰酶细胞消化液，室温孵化至细胞变圆且轻轻吹打可脱落时，加入刚刚收集的培养液终止消化。用移液枪轻轻把细胞吹散。取10⁵个重悬细胞，室温1000g离心5min,弃上清，加入100μL Annexin V-FiTC结合液轻轻重悬细胞；接着加入5μLAnnexin-FiTC，轻轻混匀；然后加入5μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀；室温(20-25℃)避光孵育20分钟；最后加入400μLAnnexin V-FiTC结合液，轻轻混匀，1小时内用流式细胞进行检测。实验结果显示，200μmol/L H₂O₂引起PC12细胞凋亡，凋亡主要发生在凋亡晚期，加入黄芩后，在一定浓度(125μg/mL-500μg/mL)范围内，随着黄芩浓度的递增，晚期凋亡的细胞明显减少，说明黄芩水煎液能够通过激活HSP70启动子，生成HSP70热休克蛋白，以此减少PC12细胞凋亡。如图10所示。

综上所述，黄芩水煎液能够通过激活HSP70启动子，生成HSP70热休克蛋白，减少Aβ引起的PC12细胞死亡，降低Aβ引起的PC12细胞内乳酸脱氢酶的释放，降低Aβ引起的PC12细胞内活性氧的上升，并且能够抑制PC12细胞的凋亡，因此，黄芩水煎液能够抑制Aβ导致的神经毒性，具有一定的抗AD的潜力。

Claims

1.黄芩提取物在制备HSP70启动子激活剂中的应用。

2.黄芩提取物在制备激活HSP70药物中的应用。

3.如权利要求2所述的黄芩提取物在制备激活HSP70药物中的应用，其特征在于：激活HSP70药物是通过激活HSP70启动子从而激活HSP70。

4.如权利要求3所述的黄芩提取物在制备激活HSP70药物中的应用，其特征在于，所述的药物为神经退行性疾病药物、心血管药物。

5.如权利要求4所述的黄芩提取物在制备激活HSP70药物中的应用，其特征在于，所述的神经退行性疾病为阿尔兹海默、帕金森症、肌萎缩侧索硬化症中的任一种。

6.如权利要求2-5中所述的黄芩提取物在制备激活HSP70药物中的应用，其特征在于，所述黄芩提取物为黄芩水煎液。

7.如权利要求6所述的黄芩提取物在制备激活HSP70药物中的应用，其特征在于，所述黄芩水煎液是通过下述方法制备的：称取黄芩药材，加蒸馏水浸泡，煮沸后煎煮；纱布过滤取滤液，滤渣加蒸馏水后浸泡，煮沸后煎煮；纱布过滤后合并两次滤液，浓缩；待自然冷却后离心，用滤纸过滤除杂，定容，制得黄芩水煎液。