CN108795874B - 一种将成纤维细胞体外重编为Sertoli细胞的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种将成纤维细胞体外重编为Sertoli细胞的方法及其应用。该方法包括如下步骤：向成纤维细胞中导入在Sertoli细胞中特异表达的荧光蛋白报告系统；再导入提高NR5A1蛋白的表达量和/或活性的物质；加入G418，培养3‑7d；弃液相，加入用于培养成纤维细胞的培养基，继续培养3‑7d；从培养体系中分离Sertoli细胞。实验证明，采用上述方法制备的细胞完全获得了Sertoli细胞的特征，如具有吸引内皮细胞、形成脂滴、与生殖细胞互作、抑制淋巴细胞的生长及白细胞介素的产生、免疫豁免能力等特性。本发明在不孕不育的治疗、异体移植和细胞治疗等领域具有重要的应用价值。

Description

一种将成纤维细胞体外重编为Sertoli细胞的方法及其应用
技术领域
本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种将成纤维细胞体外重编为Sertoli细胞的方法及其应用。
背景技术
根据世界卫生组织的统计，不孕不育困扰着世界上15％左右的夫妇。其中，男性因素占据40％-60％的比重，具体反映在精细胞数量或者质量的缺陷上。人类多能性干细胞，具有分化为人体各种细胞类型的潜力。体外分化干细胞为有功能的精细胞，为不孕不育的治疗提供了一种切实可行的途径。
Sertoli细胞是睾丸体细胞的一种，与生殖细胞一起存在于生精小管中，对精子发生的触发和调控具有举足轻重的作用。对于精子体外分化体系的构建，Sertoli细胞将是不可或缺的组成成分。此外，睾丸中的Sertoli细胞还演化出了特殊的免疫豁免属性，可以保护生殖细胞免遭免疫系统的攻击。Sertoli细胞的这个特性已被应用于细胞、组织、器官异体移植等治疗领域，用以减轻宿主对移植细胞的免疫排斥，从而提高细胞的存活率。另外，Sertoli细胞本身还可以用作基因工程细胞，用于携带和表达特定的治疗蛋白或者药物。由此可见，Sertoli细胞是一种非常有应用潜力的细胞；但受来源和伦理等的制约，从人体内大规模获取Sertoli细胞也并不现实。
成纤维细胞是动物结缔组织中常见的细胞，可从动物个体获取。在细胞谱系重编程研究中，成纤维细胞常被用作起始细胞；然而，目前还没有成纤维细胞体外重编为Sertoli细胞的相关报道。
发明内容
本发明的目的是制备Sertoli细胞。
本发明首先提供了一种制备Sertoli细胞的方法，可包括步骤a2)：增加成纤维细胞中NR5A1蛋白的表达量和/或活性。
上述方法中，所述“增加成纤维细胞中NR5A1蛋白的表达量和/或活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到增加成纤维细胞中NR5A1蛋白的表达量和/或活性的效果。
上述方法中，所述“增加成纤维细胞中NR5A1蛋白的表达量和/或活性”可为向成纤维细胞中导入提高NR5A1蛋白的表达量和/或活性的物质。
上述方法中，所述“向成纤维细胞中导入提高NR5A1蛋白表达量和/或活性的物质”可通过向成纤维细胞中导入编码NR5A1蛋白的核酸分子(即NR5A1基因)实现。所述“向成纤维细胞中导入编码NR5A1蛋白的核酸分子”具体可通过慢病毒侵染成纤维细胞实现；所述慢病毒可表达NR5A1蛋白。
在本发明的一个实施例中，所述慢病毒可为重组慢病毒a(表达NR5A1蛋白)。所述重组慢病毒a可为慢病毒载体a包装而成。具体的，可将慢病毒载体a、帮助质粒vsvg和慢病毒载体包装质粒pCMVΔR8.9共转染293FT细胞，获得重组慢病毒a。所述慢病毒载体a的制备方法可为：向pENTR/1A质粒的多克隆位点(如限制性内切酶EcoRI)插入NR5A1基因，得到载体pENTR/1A-NR5A1；向pENTR/5’topo质粒的多克隆位点(如限制性内切酶EcoRI)插入序列表中序列2所示的双链DNA分子(EF1α启动子的核苷酸序列)，得到载体pENTR/5’topo-EF1α；所述载体pENTR/1A-NR5A1、所述载体pENTR/5’topo-EF1α和慢病毒质粒p2K7-NEO，通过同源重组制备慢病毒载体a。
上述方法中，所述步骤a2)可为：增加成纤维细胞中“NR5A1蛋白的表达量和/或活性”和“蛋白质组合的表达量和/或活性”；所述蛋白质组合为GATA4蛋白、WT1蛋白、SOX9蛋白和DMRT1蛋白中的至少一种。
上述方法中，所述“增加成纤维细胞中‘NR5A1蛋白的表达量和/或活性’和‘蛋白质组合的表达量和/或活性’”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到增加成纤维细胞中“NR5A1蛋白的表达量和/或活性”和“蛋白质组合的表达量和/或活性”的效果。
上述方法中，所述“增加成纤维细胞中‘NR5A1蛋白的表达量和/或活性’和‘蛋白质组合的表达量和/或活性’”可为向成纤维细胞中导入“提高NR5A1蛋白的表达量和/或活性的物质”和“提高蛋白质组合的表达量和/或活性的物质”。
所述“向成纤维细胞中导入‘提高NR5A1蛋白的表达量和/或活性的物质’和‘提高蛋白质组合的表达量和/或活性的物质’可通过向成纤维细胞中导入编码NR5A1蛋白的核酸分子(即NR5A1基因)、和、编码所述蛋白质组合的核酸分子实现。编码GATA4蛋白的核酸分子即GATA4基因。编码WT1蛋白的核酸分子即WT1基因。编码SOX9蛋白的核酸分子即SOX9基因。编码DMRT1蛋白的核酸分子即DMRT1基因。所述“向成纤维细胞中导入编码NR5A1蛋白的核酸分子、和、编码所述蛋白质组合的核酸分子”具体可通过慢病毒侵染成纤维细胞实现；所述慢病毒可表达NR5A1蛋白和所述蛋白质组合。
在本发明的一个实施例中，表达NR5A1蛋白的慢病毒具体可为所述重组慢病毒a。
在本发明的一个实施例中，表达GATA4蛋白的慢病毒具体可为重组慢病毒b。所述重组慢病毒b可为慢病毒载体b包装而成。具体的，可将慢病毒载体b、帮助质粒vsvg和慢病毒载体包装质粒pCMVΔR8.9共转染293FT细胞，获得重组慢病毒b。所述慢病毒载体b的制备方法可为：向pENTR/1A质粒的多克隆位点(如限制性内切酶EcoRI)插入GATA4基因，得到载体pENTR/1A-GATA4；所述载体pENTR/1A-GATA4、所述载体pENTR/5’topo-EF1α和所述慢病毒质粒p2K7-NEO，通过同源重组制备慢病毒载体b。
在本发明的一个实施例中，表达WT1蛋白的慢病毒具体可为重组慢病毒c。所述重组慢病毒c可为慢病毒载体c包装而成。具体的，可将慢病毒载体c、帮助质粒vsvg和慢病毒载体包装质粒pCMVΔR8.9共转染293FT细胞，获得重组慢病毒c。所述慢病毒载体c的制备方法可为：向pENTR/D-topo质粒的多克隆位点(如限制性内切酶NotI和AscI之间)插入WT1基因，得到载体pENTR/D-toppo-WT1；所述载体pENTR/D-topo-WT1、所述载体pENTR/5’topo-EF1α和所述慢病毒质粒2K7-BSD，通过同源重组制备慢病毒载体c。
在本发明的一个实施例中，表达SOX9蛋白的慢病毒具体可为重组慢病毒d。所述重组慢病毒d可为慢病毒载体d包装而成。具体的，可将慢病毒载体d、帮助质粒vsvg和慢病毒载体包装质粒pCMVΔR8.9共转染293FT细胞，获得重组慢病毒d。所述慢病毒载体d的制备方法可为：向pENTR/D-topo质粒的多克隆位点(如限制性内切酶NotI和AscI之间)插入SOX9基因，得到载体pENTR/D-topo-SOX9；所述载体pENTR/D-topo-SOX9、所述载体pENTR/5’topo-EF1α和所述慢病毒质粒p2K7-NEO，通过同源重组制备慢病毒载体d。
在本发明的一个实施例中，表达DMRT1蛋白的慢病毒具体可为重组慢病毒e。所述重组慢病毒e可为慢病毒载体e包装而成。具体的，可将慢病毒载体e、帮助质粒vsvg和慢病毒载体包装质粒pCMVΔR8.9共转染293FT细胞，获得重组慢病毒e。所述慢病毒载体e的制备方法可为：向pENTR/1A质粒的多克隆位点(如限制性内切酶EcoRI)插入DMRT1基因，得到载体pENTR/1A-DMRT1；所述载体pENTR/1A-DMRT1、所述载体pENTR/5’topo-EF1α和所述慢病毒质粒p2K7-NEO，通过同源重组制备慢病毒载体e。
上述任一所述“向成纤维细胞中导入编码NR5A1蛋白的核酸分子”或上述任一所述“向成纤维细胞中导入编码NR5A1蛋白的核酸分子和编码所述蛋白质组合的核酸分子”具体可采用相应的慢病毒侵染实现。所述侵染的时间可为6-28h(如6-20h、20-24h、24-28h、6h、20h、24h或28h)。侵染完毕后，需加入用于培养成纤维细胞的培养基，35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、5％CO2培养20-28h(如20-24h、24-28h、20h、24h或28h)。
上述任一所述方法还可包括步骤a1)：向成纤维细胞中导入在Sertoli细胞中特异表达的荧光蛋白报告系统；所述在Sertoli细胞中特异表达的荧光蛋白报告系统中，由在Sertoli细胞中特异表达的启动子启动荧光蛋白的表达；在进行所述步骤a2)前先进行所述步骤a1)。
上述荧光蛋白报告系统中，所述在Sertoli细胞中特异表达的启动子可为AMH基因的启动子。所述AMH基因的启动子的核苷酸序列具体可如序列表中的序列1所示。
上述荧光蛋白报告系统中，所述荧光蛋白可为绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白或红色荧光蛋白。
上述任一所述用于培养成纤维细胞的培养基具体可为含8-12％(如8-10％、10-12％、8％、10％或12％)(v/v)FBS、0.7-1.3％(如0.7-1.0％、1.0-1.3％、0.7％、1.0％或1.3％)(m/v)谷氨酸、1％(如0.7-1.0％、1.0-1.3％、0.7％、1.0％或1.3％)(m/v)非必需氨基酸的DMEM培养基。
上述任一所述方法还可包括步骤a3)-a6)：
a3)完成步骤a2)后，向成纤维细胞的培养体系中加入G418，得到药筛体系；
a4)完成步骤a3)后，取所述药筛体系，培养3-7d(如3-5d、5-7d、3d、5d或7d)；
a5)完成步骤a4)后，弃液相，加入所述用于培养成纤维细胞的培养基，继续培养3-7d(如3-5d、5-7d、3d、5d或7d)；
a6)从完成步骤a5)后培养体系中分离Sertoli细胞。
上述步骤a3)中，G418的浓度可为0.7-1.3mg/mL(如0.7-1.0mg/mL、1.0-1.3mg/mL、0.7mg/mL、1.0mg/mL或1.3mg/mL)。
上述步骤a5)中，所述用于培养成纤维细胞的培养基还可为含8-12％(如8-10％、10-12％、8％、10％或12％)(v/v)FBS的DMEM/F12培养基。
上述步骤a6)中，所述分离Sertoli细胞可通过分离可以发出荧光的细胞实现。
上述任一所述培养的温度可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)。
上述任一所述在Sertoli细胞中特异表达的荧光蛋白报告系统也属于本发明的保护范围。
本发明还保护上述任一所述在Sertoli细胞中特异表达的荧光蛋白报告系统的应用，可为c1)-c4)中的至少一种：
c1)作为Sertoli细胞的指示标记；
c2)作为Sertoli细胞的分离标记；
c3)作为Sertoli细胞的富集标记；
c4)制备Sertoli细胞。
本发明还保护S1)或S2)：
S1)NR5A1蛋白在制备Sertoli细胞中的应用；
S2)NR5A1蛋白和蛋白质组合在制备Sertoli细胞中的应用；所述蛋白质组合为GATA4蛋白、WT1蛋白、SOX9蛋白和DMRT1蛋白中的至少一种。
本发明还保护T1)或T2)：
T1)编码NR5A1蛋白的核酸分子在制备Sertoli细胞中的应用；
T2)编码NR5A1蛋白的核酸分子和编码所述蛋白质组合的核酸分子在制备Sertoli细胞中的应用；所述蛋白质组合为GATA4蛋白、WT1蛋白、SOX9蛋白和DMRT1蛋白中的至少一种。
本发明还保护成纤维细胞在制备Sertoli细胞的应用。
本发明还保护用于制备Sertoli细胞的产品；所述产品可含有NR5A1蛋白。
所述产品还可含有蛋白质组合；所述蛋白质组合可为GATA4蛋白、WT1蛋白、SOX9蛋白和DMRT1蛋白中的至少一种。
所述产品还可含有成纤维细胞。
所述产品还可含有上述任一所述在Sertoli细胞中特异表达的荧光蛋白报告系统。
所述产品还可含有已导入在Sertoli细胞中特异表达的荧光蛋白报告系统的成纤维细胞。
上述任一所述产品还可含有G418和/或所述用于培养成纤维细胞的培养基和/或含8-12％(如8-10％、10-12％、8％、10％或12％)(v/v)FBS的DMEM/F12培养基。
本发明还保护序列表中的序列1所示的特异DNA分子。
所述特异DNA分子在启动目的基因表达中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述目的基因表达具体可为目的基因在Sertoli细胞中表达。
本发明还保护一种表达目的基因的方法，包括如下步骤：将所述特异DNA分子插入到任何目的基因的上游，以此来启动目的基因表达。
上述方法中，所述目的基因表达具体可为目的基因在Sertoli细胞中表达。
上述任一所述成纤维细胞具体可为人源成纤维细胞。所述人源成纤维细胞具体可为dH1成纤维细胞株或人肺成纤维细胞株。
所述dH1成纤维细胞株的制备方法可如下：
(1)将人胚胎干细胞转移至1％Matrigel原液包被的培养板，加入ES培养基，置于37℃、5％CO2恒温培养箱培养5d；ES培养基具体可为含20％(v/v)KSR、1％(m/v)谷氨酸、1％(m/v)非必需氨基酸和4ng/mLbFGF的Knockout DMEM培养基；
(2)完成步骤(1)后，弃培养基，加入分化培养基，置于37℃、5％CO2恒温培养箱继续培养7-10d，直至胚胎干细胞分化为成纤维细胞，即获得dH1成纤维细胞株；所述分化培养基具体可为含10％(v/v)FBS、1％(m/v)谷氨酸、1％(m/v)非必需氨基酸的Knockout DMEM培养基。
上述任一所述慢病毒质粒p2K7-NEO、上述任一所述pENTR/1A质粒和上述任一所述pENTR/5’topo质粒均可为invitrogen公司的产品。上述任一所述DMEM/F12培养基可为康宁公司的产品。
上述任一所述帮助质粒vsvg和上述任一所述慢病毒载体包装质粒pCMVΔR8.9均可为invitrogen公司的产品。上述任一所述非必需氨基酸具体可为Gibco公司的产品。
上述任一所述NR5A1蛋白的Gene ID为2516。上述任一所述NR5A1基因的Refseq号为NC_000009.12。上述任一所述GATA4蛋白的Gene ID为2626。上述任一所述GATA4基因的Refseq号为NC_000008.11。上述任一所述WT1蛋白的Gene ID为7409。上述任一所述WT1基因的Refseq号为NC_000011.10。上述任一所述SOX9蛋白的Gene ID为6662。上述任一所述SOX9基因的Refseq号为NC_000017.11。上述任一所述DMRT1蛋白的Gene ID为1761。上述任一所述DMRT1基因的Refseq号为NC_000009.12。
上述任一所述绿色荧光蛋白为荧光蛋白eGFP(Gene ID为20473140)。编码荧光蛋白eGFP的基因(eGFP基因)的Refseq号为NC_025025.1。
实验证明，采用本发明提供的方法制备的hiSC高表达KRT18且呈现上皮化外观，其基因在Sertoli细胞重要的生物学过程中出现富集，且具有吸引内皮细胞、形成脂滴、与生殖细胞互作、抑制淋巴细胞的生长及白细胞介素的产生、免疫豁免能力等特性，完全获得了Sertoli细胞的特征。本发明为构建完整的体外精子分化体系以及研究Sertoli细胞与雄性生殖细胞间的互作机制提供丰富的细胞来源。本发明在不孕不育的治疗、异体移植和细胞治疗等领域具有重要的应用价值。
附图说明
图1为重组慢病毒中AMH:GFP报告系统和灭瘟素(BSD)的位置示意图。
图2为人源成纤维细胞体外重编为hiSCs的流程示意图。
图3为实施例2中步骤一的流式细胞术分析结果。
图4为部分待测细胞的转录图谱。
图5为转录图谱的GO分析。
图6为细胞免疫荧光染色检测2F-hiSCs(dH1)中KRT18的表达水平。
图7为2F-hiSCs(dH1)吸引人脐静脉内皮细胞能力的检测。
图8为2F-hiSCs(dH1)脂滴形成能力的检测。
图9为2F-hiSCs(dH1)和生殖细胞互作能力的检测。
图10为2F-hiSCs(dH1)可以抑制淋巴细胞生长和白细胞介素产生。
图11为2F-hiSCs(dH1)免疫豁免能力的检测。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
慢病毒质粒p2K7-NEO、pENTR/1A质粒和pENTR/5’topo质粒均为invitrogen公司的产品。人肺成纤维细胞株为协和细胞库的产品。帮助质粒vsvg和慢病毒载体包装质粒pCMVΔR8.9均为Invitrogen公司的产品。WST-1溶液和RIPA溶液均为碧云天公司的产品。Matrigel原液和DMEM/F12培养基均为康宁公司的产品。bFGF和Polybrene均为R&D公司的产品。非必需氨基酸为Gibco公司的产品。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为ATCC公司的产品。迁移小室(孔径为8μm)为康宁公司的产品。ECM培养基(即迁移培养基)为ScienCell公司的产品。BODIPY染料为thermofishe公司的产品。ELASA试剂盒为Cusabio公司的产品。
ES培养基：含20％(v/v)KSR、1％(m/v)谷氨酸、1％(m/v)非必需氨基酸和4ng/mLbFGF的Knockout DMEM培养基。
分化培养基：含10％(v/v)FBS、1％(m/v)谷氨酸、1％(m/v)非必需氨基酸的Knockout DMEM培养基。
MEF培养基：含10％(v/v)FBS、1％(m/v)谷氨酸、1％(m/v)非必需氨基酸的DMEM培养基。MEF培养基用于培养MEF。
制备dH1成纤维细胞株的步骤如下：
(1)将人胚胎干细胞转移至1％Matrigel原液包被的培养板，加入ES培养基，置于37℃、5％CO2恒温培养箱培养5d；
(2)完成步骤(1)后，弃培养基，加入分化培养基，置于37℃、5％CO2恒温培养箱继续培养7-10d，直至胚胎干细胞分化为成纤维细胞，即获得dH1成纤维细胞株。
NR5A1蛋白的GeneID为2516。NR5A1基因的Refseq号为NC_000009.12。
GATA4蛋白的GeneID为2626。GATA4基因的Refseq号为NC_000008.11。
WT1蛋白的GeneID为7409。WT1基因的Refseq号为NC_000011.10。
SOX9蛋白的GeneID为6662。SOX9基因的Refseq号为NC_000017.11。
DMRT1蛋白的GeneID为1761。DMRT1基因的Refseq号为NC_000009.12。
荧光蛋白eGFP的GeneID为20473140。eGFP基因的Refseq号为NC_025025.1。
实施例1、构建含AMH:GFP报告系统的成纤维细胞株
成纤维细胞株为dH1成纤维细胞株或人肺成纤维细胞株。
一、AMH:GFP报告系统的构建
1、本发明的发明人从人类基因组DNA克隆了AMH基因的启动子甲。AMH基因的启动子甲长约1.6kb，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。
2、完成步骤1后，向AMH基因的启动子甲的3’末端连接荧光蛋白eGFP的编码基因(即eGFP基因)，得到AMH:GFP报告系统。AMH:GFP报告系统中，由AMH基因的启动子甲驱动荧光蛋白eGFP的表达。
AMH(GeneID：268)是在Sertoli细胞发育早期特异表达的一个标记蛋白。如果导入AMH:GFP报告系统的细胞中形成Sertoli细胞，则将发出绿色荧光。
二、含AMH:GFP报告系统的重组慢病毒的构建
1、向pENTR/1A质粒的限制性内切酶EcoRI的识别位点插入eGFP基因，得到载体pENTR/1A-eGFP。
2、向pENTR/5’topo质粒的限制性内切酶EcoRI的识别位点插入序列表中序列1所示的双链DNA分子，得到载体pENTR/5’topo-AMH。
3、取载体pENTR/1A-eGFP、载体pENTR/5’topo-AMH和慢病毒质粒p2K7-NEO，通过同源重组制备慢病毒载体。
4、将步骤3制备的慢病毒载体、帮助质粒vsvg和慢病毒载体包装质粒pCMVΔR8.9共转染293FT细胞，获得含AMH:GFP报告系统的重组慢病毒。
含AMH:GFP报告系统的重组慢病毒中，AMH:GFP报告系统和灭瘟素(BSD)的位置示意图见图1。
三、构建含AMH:GFP报告系统的成纤维细胞株
通过慢病毒侵染的方式，将步骤二得到的含AMH:GFP报告系统的重组慢病毒整合至成纤维细胞株(以含AMH:GFP报告系统的重组慢病毒携带的灭瘟素为筛选标记)，得到含AMH:GFP报告系统的成纤维细胞株。
在下文中，含AMH:GFP报告系统的dH1成纤维细胞株简称dH1·AMH:GFP。含AMH:GFP报告系统的HPF成纤维细胞株简称HPF·AMH:GFP。
实施例2、人源成纤维细胞体外重编为AMH:GFP+Sertoli细胞(以下简称hiSCs)
人源成纤维细胞体外重编为hiSCs的流程示意图见图2。
一、dH1成纤维细胞株体外重编为hiSCs(dH1)
1、重组慢病毒的制备
(1)向pENTR/1A质粒的限制性内切酶EcoRI的识别位点插入NR5A1基因，得到载体pENTR/1A-NR5A1。向pENTR/1A质粒的限制性内切酶EcoRI的识别位点插入GATA4基因，得到载体pENTR/1A-GATA4。向pENTR/D-topo质粒的限制性内切酶NotI和AscI的识别位点之间插入WT1基因，得到载体pENTR/D-topo-WT1。向pENTR/D-topo质粒的限制性内切酶NotI和AscI的识别位点之间插入SOX9基因，得到载体pENTR/D-topo-SOX9。向pENTR/1A质粒的限制性内切酶EcoRI的识别位点插入DMRT1基因，得到载体pENTR/1A-DMRT1。
(2)向pENTR/5’topo质粒的限制性内切酶EcoRI的识别位点插入序列表中序列2所示的双链DNA分子(EF1α启动子的核苷酸序列)，得到载体pENTR/5’topo-EF1α。
(3)取载体pENTR/1A-NR5A1、载体pENTR/5’topo-EF1α和慢病毒质粒p2K7-NEO，通过同源重组制备慢病毒载体a。将慢病毒载体a、帮助质粒vsvg和慢病毒载体包装质粒pCMVΔR8.9共转染293FT细胞，获得重组慢病毒a。
按照步骤(3)的方法，将载体pENTR/1A-NR5A1分别替换为载体pENTR/1A-GATA4、载体pENTR/1A-WT1、载体pENTR/1A-SOX9和载体pENTR/1A-DMRT1，其它步骤均不变，依次得到重组慢病毒b、重组慢病毒c、重组慢病毒d和重组慢病毒e。
重组慢病毒a表达NR5A1蛋白。重组慢病毒b表达GATA4蛋白。重组慢病毒c表达WT1蛋白。重组慢病毒d表达SOX9蛋白。重组慢病毒e表达DMRT1蛋白。
2、将dH1·AMH:GFP接种至T175培养瓶(接种密度为30％-60％)，然后加入1mL含重组慢病毒和Polybrene的病毒液(病毒液中重组慢病毒表达的蛋白质组合分别见表1中编号1至31，每种病毒加200μL，总体积不足1mL的用MEF培养基补齐)，得到侵染体系。侵染体系中，dH1·AMH:GFP的密度为40-70％，Polybrene的浓度为8ng/mL。
将dH1·AMH:GFP接种至T175培养瓶(接种密度为30％-60％)，然后加入1mL含Polybrene的MEF培养基，得到侵染体系(作为对照，即表1中编号32)。侵染体系中，dH1·AMH:GFP的密度为40-70％，Polybrene的浓度为8ng/mL。
表1
Figure BDA0001716859220000101
注：+表示含有，-表示不含有。
3、完成步骤2后，分别取侵染体系，置于37℃、5％CO2恒温培养箱静置24h。
4、分别取完成步骤3的侵染体系，弃液相，加入MEF培养基，置于37℃、5％CO2恒温培养箱静置24h(图2中中间态1)。
5、完成步骤4后，分别加入G418，得到体系1；体系1中，G418的浓度为1mg/mL。
6、完成步骤5后，分别取所述体系1，置于37℃、5％CO2恒温培养箱静置培养5d(图2中中间态2)。其中，培养第3-4d需更换培养基，更换的培养基为含1mg/mL G418的MEF培养基。
7、分别取完成步骤6的体系1，弃培养基，加入含10％(v/v)FBS的DMEM/F12培养基，得到体系2。
8、完成步骤7后，分别取所述体系2，置于37℃、5％CO2恒温培养箱静置培养3-7d。
9、分别取完成步骤8的体系2，采用流式细胞术分析。
流式分析的结果见图3。结果表明，步骤2中病毒液中重组慢病毒表达的蛋白质组合为表1中编号为3、7、10、13、14、16、18、19、21、22、25、26、27、29、30或31时，均可获得AMH:GFP+Sertoli细胞(以下简称hiSCs(dH1))。
10、取完成步骤8的体系2，收集发出绿色荧光的细胞，即hiSCs(dH1)。
将病毒液中重组慢病毒表达的NR5A1蛋白和GATA4蛋白(表1中编号13)获得的AMH:GFP+Sertoli细胞简称为2F-hiSCs(dH1)。
将病毒液中重组慢病毒表达的NR5A1蛋白、GATA4蛋白、WT1蛋白、SOX9蛋白和DMRT1蛋白(表1中编号31)获得的AMH:GFP+Sertoli细胞简称为5F-hiSCs(dH1)。
按照上述步骤2至9，将1mL含重组慢病毒和Polybrene的病毒液替换为1mL含空载体慢病毒(将慢病毒质粒p2K7-NEO、帮助质粒vsvg和慢病毒载体包装质粒pCMVΔR8.9共转染293FT细胞获得)和Polybrene的病毒液(空载体慢病毒为200μL，用MEF培养基补至1mL)，其它步骤均不变。流式分析结果表明，完成步骤8的体系2中为dH1-2K7细胞(以下简称dH1-2K7)，几乎没有获得hiSCs(dH1)。
按照上述步骤2至9，将dH1·AMH:GFP替换为dH1成纤维细胞株，其它步骤均不变。流式分析结果表明，完成步骤8的体系2中，几乎没有获得hiSCs(dH1)。
二、人肺成纤维细胞株体外重编为hiSCs(HPF)
按照步骤一，将dH1成纤维细胞株替换为人肺成纤维细胞株，其它步骤均不变。结果表明，步骤2中病毒液中重组慢病毒表达的蛋白质组合为表1中编号为3、7、10、13、14、16、18、19、21、22、25、26、27、29、30或31时，均可获得AMH:GFP+Sertoli细胞(以下简称hiSCs(HPF))。将病毒液中重组慢病毒表达的NR5A1蛋白和GATA4蛋白(表1中编号13)获得的AMH:GFP+Sertoli细胞简称为2F-hiSCs(HPF)。将病毒液中重组慢病毒表达的NR5A1蛋白、GATA4蛋白、WT1蛋白、SOX9蛋白和DMRT1蛋白(表1中编号31)获得的AMH:GFP+Sertoli细胞简称为5F-hiSCs(HPF)。
按照步骤一中2至9，将1mL含重组慢病毒和Polybrene的病毒液替换为1mL含空载体慢病毒(将慢病毒质粒p2K7-NEO、帮助质粒vsvg和慢病毒载体包装质粒pCMVΔR8.9共转染293FT细胞获得)和Polybrene的病毒液(空载体慢病毒为200μL，用MEF培养基补至1mL)，将dH1·AMH:GFP替换为HPF·AMH:GFP其它步骤均不变。流式分析结果表明，完成步骤8的体系2中为HPF-2K7细胞(以下简称HPF-2K7)，几乎没有获得hiSCs(HPF)。
实施例3、实施例2中人源成纤维细胞体外重编为hiSCs的特性
一、转录图谱的分析
采用RNA测序方法比较待测细胞(2F-hiSCs(dH1)、5F-hiSCs(dH1)、2F-hiSCs(HPF)、5F-hiSCs(HPF)、成人Sertoli细胞、或dH1-2K7)的转录图谱，然后GO分析。
部分转录图谱见图4(dH1-2K7-1和dH1-2K7-2均为dH1-2K7，作为对照；hiSCs-1和hiSCs-2均为5F-hiSCs(dH1)，aSCs-1和aSCs-2均为成人Sertoli细胞)。
部分GO分析结果见图5(dH1-2K7-1和dH1-2K7-2均为dH1-2K7，作为对照；2F-hiSCs(dH1)-1和2F-hiSCs(dH1)-2均为2F-hiSCs(dH1)，5F-hiSCs(HPF)-1为5F-hiSCs(HPF)，5F-hiSCs(dH1)-1和5F-hiSCs(dH1)-2均为5F-hiSCs(dH1)，aSCs-1和aSCs-2均为成人Sertoli细胞)。结果表明，与dH1-2K7或HPF-2K7相比，2F-hiSCs(HPF)、5F-hiSCs(HPF)、2F-hiSCs(dH1)、5F-hiSCs(dH1)和成人Sertoli细胞的整体下调的基因数目均为689，整体上调的基因数目均为512。
上述结果表明，2F-hiSCs(HPF)、5F-hiSCs(HPF)、2F-hiSCs(dH1)、5F-hiSCs(dH1)和成人Sertoli细胞表达相似的基因，且在Sertoli细胞重要的生物学过程中出现富集；与dH1-2K7或HPF-2K7的表达情况显著不同。
二、2F-hiSCs(dH1)中KRT18的表达水平上调
KRT18(GeneID：3875)是Sertoli细胞的一个标记蛋白，代表Sertoli细胞的上皮化特征。
取待测细胞(2F-hiSCs(dH1)或dH1-2K7)，进行细胞免疫荧光染色。dH1-2K7作为对照。
实验结果见图6(2F-hiSCs为2F-hiSCs(dH1)，蓝色标记细胞核(DAPI)，Anti-KRT18为KRT18蛋白免疫荧光，AMH:GFP为细胞内AMH:GFP报告系统的荧光，Merged为染色叠加效果图，比例尺为100μm)。结果表明，与dH1-2K7相比，2F-hiSCs(dH1)中KRT18的表达水平显著提高。
三、2F-hiSCs(dH1)吸引人脐静脉内皮细胞能力的检测
1、取6孔板，每孔加入ECM培养基，然后接种2F-hiSCs(dH1)，接种密度为50％。
2、完成步骤1后，取所述6孔板，置于37℃、5％CO2恒温培养箱静置培养24h。
3、完成步骤2后，取所述6孔板，弃培养基，然后加入ECM培养基，置于37℃、5％CO2恒温培养箱静置培养48h，收集培养液。该培养液即为2F-hiSCs(dH1)的条件培养基。
按照上述步骤，将2F-hiSCs(dH1)替换为dH1-2K7，其它步骤均不变，得到dH1-2K7的条件培养基，作为对照。
4、另取6孔板，每孔加入ECM培养基，然后接种HUVCEC细胞，接种密度为30％。
5、完成步骤4后，取所述6孔板，置于37℃、5％CO2恒温培养箱静置培养24h。
6、完成步骤5后，取所述6孔板，加入钙绿素，得到体系甲。体系甲中，钙绿素的浓度为2.5μM。
7、完成步骤6后，取所述6孔板，置于37℃、5％CO2恒温培养箱静置培养1h，然后充分消化，收集细胞。
8、完成步骤7后，取收集的细胞，用ECM培养基重悬，得到浓度为106个/mL的细胞悬液。
9、向基底室中加入600μL步骤3制备的条件培养基(2F-hiSCs(dH1)的条件培养基或dH1-2K7的条件培养基)，然后放入迁移小室，浸润5min。
10、完成步骤9后，向所述迁移小室中加入100μL步骤8制备的细胞悬液，置于37℃、5％CO2恒温培养箱静置培养20h，然后在荧光显微镜下观察并计数。
实验结果见图7(左上为检测装置示意图，右上为5个不同区域的HUVEC的迁移数目，左下为在荧光显微镜下的观察结果，右下为发出荧光的HUVEC数目统计结果，2F-hiSCsCM为2F-hiSCs(dH1)，dH1-2K7CM为dH1-2K7)。结果表明，2F-hiSCs(dH1)的条件培养基具有吸引更多HUVEC的能力。
四、2F-hiSCs(dH1)脂滴形成能力的检测
BODIPY存储液：取BODIPY染料，加入DMSO稀释至1mg/mL，-20℃避光保存。
PBS缓冲液为pH7.2、0.01mM的PBS缓冲液。
1、取6孔板，每孔加入MEF培养基，然后接种2F-hiSCs(dH1)，接种密度为50％。
2、完成步骤1后，取所述6孔板，置于37℃、5％CO2恒温培养箱静置培养24h。
3、完成步骤2后，取所述6孔板，弃培养基，用PBS缓冲液洗涤1次，每次5min；然后加入4％(v/v)PFA水溶液，37℃静置20min(目的为固定)。
4、完成步骤3后，取所述6孔板，弃液相，用PBS缓冲液洗涤1次，每次5min；然后加入BODIPY工作液(由1体积份BODIPY存储液和500体积份PBS缓冲液混合而成)，避光染色60min。
5、完成步骤4后，取所述6孔板，弃液相，用PBS缓冲液洗涤3次，每次5min；然后加入含1μg/mL DAPI的PBS缓冲液，静置10min(目的为进行细胞核染色)。
6、完成步骤4后，取所述6孔板，弃液相，用PBS缓冲液洗涤3次，每次5min；然后在荧光显微镜下观察并统计BODIPY阳性细胞数。
按照上述步骤，将2F-hiSCs(dH1)替换为dH1-2K7，其它步骤均不变，作为对照。
实验结果见图8(DAPI为DAPI染色结果，BODIPY-488为BODIPY染料染色结果，Merged为染色叠加效果，2F-hiSCs为2F-hiSCs(dH1))。结果表明，2F-hiSCs(dH1)具有脂滴形成的能力。
五、2F-hiSCs(dH1)和生殖细胞互作能力的检测
小鼠精原细胞来自出生后6d的C57BL/6雄性小鼠，分离方法参考如下文献：KanatsuShinohara M，et al.Long-term proliferation in culture and germline transmissionofmousemalegermlinestemcells.BiologyofReproduction69.2(2003):612.
1、取48孔板，每孔接种5×104个2F-hiSCs(dH1)。
2、完成步骤1后，取所述48孔板，弃液相，用PBS缓冲液洗涤3次(目的为洗去死亡脱落的细胞)。
3、完成步骤2后，取所述48孔板，每孔加入500μL小鼠精原细胞重悬液(用DMEMF/12培养基重悬小鼠精原细胞而成，浓度为2×105个/mL)，置于37℃、5％CO2恒温培养箱静置培养48h。
4、完成步骤3后，取所述48孔板，进行KRT18(指示Sertoli细胞)和DAZL(指示精原细胞)标记蛋白的免疫荧光鉴定。
按照上述步骤，将2F-hiSCs(dH1)替换为dH1-2K7，其它步骤均不变，作为对照。
实验结果见图9(蓝色标记细胞核(DAPI)，Merged为染色叠加效果，with 2F-hiSCs为2F-hiSCs(dH1)，with dH1为dH1-2K7)。结果表明，2F-hiSCs(dH1)可以更好支持小鼠生殖细胞的贴附，即具有与生殖细胞的互作能力。
六、2F-hiSCs(dH1)免疫豁免能力的检测
1、2F-hiSCs(dH1)抑制JurKat E6-1细胞增殖
(1)取6孔板，每孔加入MEF培养基，然后接种2F-hiSCs(dH1)，接种密度为50％。
(2)完成步骤(1)后，取所述6孔板，置于37℃、5％CO2恒温培养箱静置培养24h。
(3)完成步骤(2)后，取所述6孔板，弃培养基，然后加入含10％(v/v)FBS、1％(m/v)谷氨酸、1％(m/v)非必需氨基酸、1％(m/v)mercaptoethanol的1640培养基，置于37℃、5％CO2恒温培养箱静置培养48h，收集培养液。该培养液即为条件培养基。
(4)取条件培养基，加入1640培养基进行稀释(条件培养基和1640培养基的体积比为4:1、2:3、3:2或1:4)，得到条件培养基稀释液。
(5)用条件培养基稀释液重悬JurKat E6-1细胞，得到细胞悬液。用条件培养基重悬JurKat E6-1细胞，得到细胞悬液(作为空白对照)。
(6)完成步骤(5)后，取96孔板，每孔加入步骤(5)得到的细胞悬液，每孔接种2×104个JurKat E6-1细胞(约120μL)，置于37℃、5％CO2恒温培养箱静置培养72h。
(7)完成步骤(6)后，取所述96孔板，每孔加入12μL WST-1溶液，置于37℃、5％CO2恒温培养箱静置培养(避光)3h。
(8)完成步骤(7)后，取所述96孔板，用酶标仪读取各孔溶液在OD450nm处吸光值，然后计算各孔中JurKat E6-1细胞的相对数目。某孔中JurKat E6-1细胞的相对数目＝该孔在OD450nm处吸光值/空白对照在OD450nm处吸光值。
将空白对照所在孔中JurKat E6-1细胞的相对数目设定为1。
按照上述步骤，将2F-hiSCs(dH1)替换为dH1-2K7，其它步骤均不变，作为对照。
实验结果见图10中A(2F-hiSCs CM为2F-hiSCs(dH1)，dH1-2K7CM为dH1-2K7)。结果表明，2F-hiSCs(dH1)的分泌物可以抑制JurKat E6-1细胞的增殖。
2、抑制JurKat细胞白细胞介素IL-2的产生
(1)取6孔板，每孔加入MEF培养基，然后接种2F-hiSCs(dH1)，接种密度为50％。
(2)完成步骤(1)后，取所述6孔板，置于37℃、5％CO2恒温培养箱静置培养24h。
(3)完成步骤(2)后，取所述6孔板，弃培养基，加入含10％(v/v)FBS、1％(m/v)谷氨酸、1％(m/v)非必需氨基酸、1％(m/v)mercaptoethanol的1640培养基，置于37℃、5％CO2恒温培养箱静置培养48h，收集培养液。该培养液即为条件培养基。
(4)将1体积份条件培养基和1体积份1640培养基混合，得到稀释液。用该稀释液重悬JurKat E6-1细胞，得到细胞悬液。
(5)完成步骤(4)后，取6孔板，每孔加入步骤(4)得到的细胞悬液，每孔接种2×105个JurKat E6-1细胞(约2mL)，置于37℃、5％CO2恒温培养箱静置培养72h。
(6)完成步骤(5)后，离心收集沉淀，然后加入200μL RIPA溶液裂解，得到裂解液。采用ELASA试剂盒检测裂解液中的IL-2浓度。
按照上述步骤，将2F-hiSCs(dH1)替换为dH1-2K7，其它步骤均不变，作为对照。
实验结果见图10中B(2F-hiSCs CM为2F-hiSCs(dH1)，dH1-2K7CM为dH1-2K7)。结果表明，2F-hiSCs(dH1)的分泌物可以抑制白细胞介素IL-2的产生。
3、人类293FT细胞进行小鼠体内共移植实验
(1)含荧光素酶报告系统的293FT细胞的构建
a、向pENTR/1A质粒的限制性内切酶EcoRI的识别位点插入luciferase基因(genebank号为：MF693179.1)，得到载体pENTR/1A-luc。
b、向pENTR/5’topo质粒的限制性内切酶EcoRI的识别位点插入序列表中序列2所示的双链DNA分子(EF1α启动子的核苷酸序列)，得到载体pENTR/5’topo-EF1α。
c、取载体pENTR/1A-luc、载体pENTR/5’topo-EF1α和慢病毒质粒p2K7-NEO，通过同源重组制备慢病毒载体。
d、将步骤c制备的慢病毒载体、帮助质粒vsvg和慢病毒载体包装质粒pCMVΔR8.9共转染293FT细胞，获得含荧光素酶报告系统的293FT细胞。
(2)将100μL Matrigel原液、约1.3×106个含荧光素酶报告系统的293FT细胞和约2.5×105个2F-hiSCs(dH1)混合，得到混合液1。将100μL Matrigel原液、约1.3×106个含荧光素酶报告系统的293FT细胞和约2.5×105个dH1-2K7混合，得到混合液2。将混合液1和混合液2均置于冰上带入动物操作平台。
(3)取3只健康的C57B6/6J小鼠，通过腹腔注射1.2％(m/v)Avertin溶液进行麻醉，注射剂量为0.2mL/10g体重。
(4)完成步骤(3)后，将混合液1皮下注射至小鼠左前肢腋下，混合液2皮下注射至小鼠右前肢腋下，待Matrigel原液凝固后，将C57B6/6J小鼠放回培养笼中，然后利用活体成像仪监测小鼠移植部位(即小鼠前肢腋下)293FT的存活情况。活体成像的具体操作如下：监测前15min，通过腹腔注射浓度为15mg/mL的荧光素酶底物水溶液，注射剂量为10μL/1g体重；然后置于活体成像仪中检测生物荧光的强度。
实验结果见图11(从左至右依次为注射第1d、第4d和第6d)。结果表明，2F-hiSCs(dH1)可以延长293FT细胞的异体生存能力，具有免疫豁免的功能。
按照上述二至六的步骤，将2F-hiSCs(dH1)替换为5F-hiSCs(dH1)、2F-hiSCs(HPF)或5F-hiSCs(HPF)，其它步骤均不变。结果表明，与2F-hiSCs(dH1)相比，5F-hiSCs(dH1)、2F-hiSCs(HPF)和5F-hiSCs(HPF)的结果无显著差异。
按照上述步骤，将2F-hiSCs(dH1)分别替换为其它hiSCs(dH1)(即实施例2步骤一中2病毒液中重组慢病毒表达的蛋白质组合为表1中编号为3、7、10、14、16、18、19、21、22、25、26、27、29或30)和其它hiSCs(HPF)(即实施例2步骤二中病毒液中重组慢病毒表达的蛋白质组合为表1中编号为3、7、10、14、16、18、19、21、22、25、26、27、29或30)，其它步骤均不变。结果表明，与2F-hiSCs(dH1)相比，其它hiSCs(dH1)和其它hiSCs(HPF)的结果无显著差异。
综上所述，实施例2制备的hiSCs(dH1)和hiSCs(HPF)高表达KRT18且呈现上皮化外观，其基因在Sertoli细胞重要的生物学过程中出现富集，且具有吸引内皮细胞、形成脂滴、与生殖细胞互作、抑制淋巴细胞的生长及白细胞介素的产生、免疫豁免能力等特性，完全获得了人Sertoli细胞的特征。由此可见，实施例2制备的hiSCs(dH1)和hiSCs(HPF)均为Sertoli细胞。
实施例4、AMH:GFP报告系统对获得Sertoli细胞的影响
一、AMH-D:GFP报告系统的构建
1、本发明的发明人从人类基因组DNA克隆了AMH基因的启动子乙。AMH基因的启动子乙长约726bp，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。
2、完成步骤1后，向AMH基因的启动子乙的3’末端连接荧光蛋白eGFP的编码基因(即eGFP基因)，得到AMH-D:GFP报告系统。AMH-D:GFP报告系统中，由AMH基因的启动子乙驱动荧光蛋白eGFP的表达。
二、含AMH-D:GFP报告系统的重组慢病毒的构建
1、向pENTR/1A质粒的限制性内切酶EcoRI的识别位点插入eGFP基因，得到载体pENTR/1A-eGFP。
2、向pENTR/5’topo质粒的限制性内切酶EcoRI的识别位点插入序列表中序列3所示的双链DNA分子，得到载体pENTR/5’topo-AMH-D。
3、取载体pENTR/1A-eGFP、载体pENTR/5’topo-AMH-D和慢病毒质粒p2K7-NEO，通过同源重组制备慢病毒载体。
4、将步骤3制备的慢病毒载体、帮助质粒vsvg和慢病毒载体包装质粒pCMVΔR8.9共转染293FT细胞，获得含AMH-D:GFP报告系统的重组慢病毒。
三、按照实施例1中三、实施例2和实施例3的步骤，将实施例1中三的AMH:GFP报告系统替换为AMH-D:GFP报告系统，其它步骤均不变。
部分结果如下：采用AMH-D:GFP报告系统时，实施例2一中完成步骤8的体系2中(病毒液中重组慢病毒表达的NR5A1蛋白和GATA4蛋白)，1.23％的细胞为AMH-D:GFP+Sertoli细胞；实施例2二中完成步骤8的体系2中(病毒液中重组慢病毒表达的NR5A1蛋白、GATA4蛋白、WT1蛋白、SOX9蛋白和DMRT1蛋白)，0.86％的细胞为AMH-D:GFP+Sertoli细胞。这些AMH-D:GFP+Sertoli细胞高表达KRT18且呈现上皮化外观，其基因在Sertoli细胞重要的生物学过程中出现富集，且具有吸引内皮细胞、形成脂滴、与生殖细胞互作、抑制淋巴细胞的生长及白细胞介素的产生、免疫豁免能力等特性，完全获得了Sertoli细胞的特征。由此可见，采用AMH-D:GFP报告系统也可以获得Sertoli细胞，但获得Sertoli细胞的比例显著降低。
<110> 清华大学
<120> 一种将成纤维细胞体外重编为Sertoli细胞的方法及其应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1558
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
tgctgaacct ttctccgtct ctctagttct tcctccagtt ccactttaag atggagaagc 60
ccccggctcc acccagcctc cctgctggcc cccctggggt gaagcggcct ccacccccgc 120
tgatgaacgg tctgccccct cggccaccgc tgcctgagtc tttgccaccg cccccgccag 180
gaggcctgcc tctgccaccc atgcccccca cagggcctgc gccctcaggg cccccgggac 240
caccccagct acccccgcca gctccagggg tccacccccc ggccccagtg gtgcatcccc 300
ctgcatctgg ggtccatccc ccagctcctg gcgtccaccc cccagctcct ggcgtccatc 360
ccccagcccc tggggtccac ccaccaacct ctggggtcca ccccccagct cctggagtcc 420
accctccagc ccccggggtt cacccaccag cccccggagt ccacccacca gcccctgggg 480
ttcacccacc agccccaggg gtccatcctc ccccatcagc gggggttcac ccccaggccc 540
cgggggtgca cccagcagcc cccgccgttc accctcaggc cccaggggtg cacccaccag 600
ccccagggat gcaccctcag gccccggggg tccaccccca acctcccggg gtccatccgt 660
cggctcctgg ggtccaccct cagcctccgg gagttcaccc ctcaaatcct ggggtgcacc 720
ccccaactcc catgccccca atgctgaggc ccccacttcc ctccgaaggc ccagggaaca 780
tacctccccc tcccccaacc aactgagaag ctgctccctc ccccagcaag cccagcgcca 840
ggtgctcttg ccttttccca ctgagagaag gctgctcttt tgtactgccc cccgctcatt 900
aaacagcctc ccccagccct gagtgcactg atgtccgcag cgccgcccta ctgtgtcagt 960
gtgtgtggga gtgccaggca cagcaccatc ccccagtttg ggccgactgg ggagggcctg 1020
gggcccgcca ggagacacct gtgggaggcc tgagagatgg ctgtaccttg gagatggcct 1080
ggtggaggac agaccccacc agccagctag gaggggatct ggggtcctgt tctggggagg 1140
gaagagcaga ctccacgata tccttggggt ctccagatag cccaccaggg gtggggaggg 1200
tgagcaggga cagggcgccc ccactgactt gggaccctcc tcctccaggc ccacacctca 1260
gcacccagga catctgggcc ccccgccccc agcgctgtct agtttggttg cctggccgtc 1320
actcccagcc tggttcccac tcctgtgtct tctggggatg gccctcaagg acggcatgtt 1380
gacacatcag gcccagctct atcactgggg agggagatag gctgccaggg acagaaaggg 1440
ctctttgaga aggccactct gcctggagtg ggggcgccgg gcactgtccc ccaaggtcgc 1500
ggcagaggag ataggggtct gtcctgcaca aacaccccac cttccactcg gctcactt 1558
<210> 2
<211> 1172
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc ccacagtccc cgagaagttg gggggagggg 60
tcggcaattg aaccggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt aaactgggaa agtgatgtcg 120
tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc gtatataagt gcagtagtcg 180
ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac acaggtaagt gccgtgtgtg 240
gttcccgcgg gcctggcctc tttacgggtt atggcccttg cgtgccttga attacttcca 300
cctggctgca gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg tgggagagtt 360
cgaggccttg cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc tggcctgggc 420
gctggggccg ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct gctttcgata 480
agtctctagc catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac gctttttttc tggcaagata 540
gtcttgtaaa tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg gccgcgggcg 600
gcgacggggc ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg cgagcgcggc 660
caccgagaat cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg cctggcctcg 720
cgccgccgtg tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca ccagttgcgt 780
gagcggaaag atggccgctt cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg aggacgcggc 840
gctcgggaga gcgggcgggt gagtcaccca cacaaaggaa aagggccttt ccgtcctcag 900
ccgtcgcttc atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc gattagttct 960
cgagcttttg gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg atggagtttc 1020
cccacactga gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg taattctcct 1080
tggaatttgc cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc 1140
aaagtttttt tcttccattt caggtgtcgt ga 1172
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<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
caggtgctct tgccttttcc cactgagaga aggctgctct tttgtactgc cccccgctca 60
ttaaacagcc tcccccagcc ctgagtgcac tgatgtccgc agcgccgccc tactgtgtca 120
gtgtgtgtgg gagtgccagg cacagcacca tcccccagtt tgggccgact ggggagggcc 180
tggggcccgc caggagacac ctgtgggagg cctgagagat ggctgtacct tggagatggc 240
ctggtggagg acagacccca ccagccagct aggaggggat ctggggtcct gttctgggga 300
gggaagagca gactccacga tatccttggg gtctccagat agcccaccag gggtggggag 360
ggtgagcagg gacagggcgc ccccactgac ttgggaccct cctcctccag gcccacacct 420
cagcacccag gacatctggg ccccccgccc ccagcgctgt ctagtttggt tgcctggccg 480
tcactcccag cctggttccc actcctgtgt cttctgggga tggccctcaa ggacggcatg 540
ttgacacatc aggcccagct ctatcactgg ggagggagat aggctgccag ggacagaaag 600
ggctctttga gaaggccact ctgcctggag tgggggcgcc gggcactgtc ccccaaggtc 660
gcggcagagg agataggggt ctgtcctgca caaacacccc accttccact cggctcactt 720
aaggca 726

Claims (19)

1.一种利用人源成纤维细胞制备Sertoli细胞的方法，包括步骤a2-1）或a2-2）：
a2-1）只增加人源成纤维细胞中NR5A1蛋白的表达量；
a2-2）只增加人源成纤维细胞中NR5A1蛋白的表达量和蛋白质组合的表达量；所述蛋白质组合由GATA4蛋白、WT1蛋白、SOX9蛋白和DMRT1蛋白中的至少一种组成，但不包括由GATA4蛋白、WT1蛋白、SOX9蛋白和DMRT1蛋白组成的情况。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述a2-1）中，只增加人源成纤维细胞中NR5A1蛋白的表达量通过向人源成纤维细胞中只导入编码NR5A1蛋白的核酸分子实现。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述a2-2）中，只增加人源成纤维细胞中NR5A1蛋白的表达量和蛋白质组合的表达量通过向人源成纤维细胞中只导入编码NR5A1蛋白的核酸分子和编码所述蛋白质组合的核酸分子实现。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述蛋白质组合为B1）-B14）中的任意一种：
B1）由GATA4蛋白组成的蛋白质组合；
B2）由SOX9蛋白组成的蛋白质组合；
B3）由WT1蛋白组成的蛋白质组合；
B4）由DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B5）由WT1蛋白和DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B6）由SOX9蛋白和DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B7）由SOX9蛋白和WT1蛋白组成的蛋白质组合；
B8）由SOX9蛋白、WT1蛋白和DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B9）由GATA4蛋白和DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B10）由WT1蛋白和GATA4蛋白组成的蛋白质组合；
B11）由SOX9蛋白和GATA4蛋白组成的蛋白质组合；
B12）由WT1蛋白、GATA4蛋白和DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B13）由SOX9蛋白、GATA4蛋白和DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B14）由SOX9蛋白、WT1蛋白和GATA4蛋白组成的蛋白质组合。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括a1）：向人源成纤维细胞中导入在Sertoli细胞中特异表达的荧光蛋白报告系统；所述在Sertoli细胞中特异表达的荧光蛋白报告系统中，由在Sertoli细胞中特异表达的启动子启动荧光蛋白的表达；
在进行所述a2-1）或a2-2）前先进行所述a1）。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述在Sertoli细胞中特异表达的启动子为AMH基因的启动子。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述AMH基因的启动子的核苷酸序列如序列表中的序列1所示。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白或红色荧光蛋白。
9.如权利要求1至8任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括a3）-a6）：
a3）完成a2-1）或a2-2）后，向人源成纤维细胞的培养体系中加入G418，得到药筛体系；
a4）完成a3）后，取所述药筛体系，培养3-7d；
a5）完成a4）后，弃液相，加入用于培养人源成纤维细胞的培养基，继续培养3-7d；
a6）从完成a5）后的培养体系中分离Sertoli细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述a6）中，分离Sertoli细胞是通过分离可以发出荧光的细胞实现的。
11.一种应用，为S1）或S2）：
S1）NR5A1蛋白在制备Sertoli细胞中的应用；所述应用为利用人源成纤维细胞制备Sertoli细胞，在制备过程中只增加人源成纤维细胞中NR5A1蛋白的表达量；
S2）NR5A1蛋白和蛋白质组合在制备Sertoli细胞中的应用；所述应用为利用人源成纤维细胞制备Sertoli细胞，在制备过程中只增加人源成纤维细胞中NR5A1蛋白的表达量和所述蛋白质组合的表达量；所述蛋白质组合由GATA4蛋白、WT1蛋白、SOX9蛋白和DMRT1蛋白中的至少一种组成，但不包括由GATA4蛋白、WT1蛋白、SOX9蛋白和DMRT1蛋白组成的情况；
或者，所述蛋白质组合为B1）-B14）中的任意一种：
B1）由GATA4蛋白组成的蛋白质组合；
B2）由SOX9蛋白组成的蛋白质组合；
B3）由WT1蛋白组成的蛋白质组合；
B4）由DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B5）由WT1蛋白和DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B6）由SOX9蛋白和DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B7）由SOX9蛋白和WT1蛋白组成的蛋白质组合；
B8）由SOX9蛋白、WT1蛋白和DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B9）由GATA4蛋白和DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B10）由WT1蛋白和GATA4蛋白组成的蛋白质组合；
B11）由SOX9蛋白和GATA4蛋白组成的蛋白质组合；
B12）由WT1蛋白、GATA4蛋白和DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B13）由SOX9蛋白、GATA4蛋白和DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B14）由SOX9蛋白、WT1蛋白和GATA4蛋白组成的蛋白质组合。
12.一种应用，为T1）或T2）：
T1）编码NR5A1蛋白的核酸分子在制备Sertoli细胞中的应用；所述应用为利用人源成纤维细胞制备Sertoli细胞，在制备过程中向人源成纤维细胞中只导入编码NR5A1蛋白的核酸分子；
T2）编码NR5A1蛋白的核酸分子和编码蛋白质组合的核酸分子在制备Sertoli细胞中的应用；所述应用为利用人源成纤维细胞制备Sertoli细胞，在制备过程中向人源成纤维细胞中只导入编码NR5A1蛋白的核酸分子和编码所述蛋白质组合的核酸分子；
所述蛋白质组合由GATA4蛋白、WT1蛋白、SOX9蛋白和DMRT1蛋白中的至少一种组成，但不包括由GATA4蛋白、WT1蛋白、SOX9蛋白和DMRT1蛋白组成的情况；
或者，所述蛋白质组合为B1）-B14）中的任意一种：
B1）由GATA4蛋白组成的蛋白质组合；
B2）由SOX9蛋白组成的蛋白质组合；
B3）由WT1蛋白组成的蛋白质组合；
B4）由DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B5）由WT1蛋白和DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B6）由SOX9蛋白和DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B7）由SOX9蛋白和WT1蛋白组成的蛋白质组合；
B8）由SOX9蛋白、WT1蛋白和DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B9）由GATA4蛋白和DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B10）由WT1蛋白和GATA4蛋白组成的蛋白质组合；
B11）由SOX9蛋白和GATA4蛋白组成的蛋白质组合；
B12）由WT1蛋白、GATA4蛋白和DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B13）由SOX9蛋白、GATA4蛋白和DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B14）由SOX9蛋白、WT1蛋白和GATA4蛋白组成的蛋白质组合。
13.一种人源成纤维细胞在制备Sertoli细胞的应用；所述人源成纤维细胞是通过以下两种方式制备得到的：
方式f1）向人源成纤维细胞中只导入编码NR5A1蛋白的核酸分子，从而增加人源成纤维细胞中NR5A1蛋白的表达量；
方式f2）向人源成纤维细胞中只导入编码NR5A1蛋白的核酸分子和编码所述蛋白质组合的核酸分子，从而增加人源成纤维细胞中NR5A1蛋白的表达量和蛋白质组合的表达量；所述蛋白质组合由GATA4蛋白、WT1蛋白、SOX9蛋白和DMRT1蛋白中的至少一种组成，但不包括由GATA4蛋白、WT1蛋白、SOX9蛋白和DMRT1蛋白组成的情况；
或者，所述蛋白质组合为B1）-B14）中的任意一种：
B1）由GATA4蛋白组成的蛋白质组合；
B2）由SOX9蛋白组成的蛋白质组合；
B3）由WT1蛋白组成的蛋白质组合；
B4）由DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B5）由WT1蛋白和DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B6）由SOX9蛋白和DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B7）由SOX9蛋白和WT1蛋白组成的蛋白质组合；
B8）由SOX9蛋白、WT1蛋白和DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B9）由GATA4蛋白和DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B10）由WT1蛋白和GATA4蛋白组成的蛋白质组合；
B11）由SOX9蛋白和GATA4蛋白组成的蛋白质组合；
B12）由WT1蛋白、GATA4蛋白和DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B13）由SOX9蛋白、GATA4蛋白和DMRT1蛋白组成的蛋白质组合；
B14）由SOX9蛋白、WT1蛋白和GATA4蛋白组成的蛋白质组合。
14.序列表中的序列1所示的特异DNA分子。
15.权利要求14所述特异DNA分子在启动目的基因表达中的应用。
16.一种表达目的基因的方法，包括如下步骤：将权利要求14所述特异DNA分子插入到任何目的基因的上游，以此来启动目的基因表达。
17.如权利要求15所述的应用或权利要求16所述的方法，其特征在于：所述目的基因表达为目的基因在Sertoli细胞中表达。
18.一种在Sertoli细胞中特异表达的荧光蛋白报告系统，其特征在于：所述在Sertoli细胞中特异表达的荧光蛋白报告系统中，由在Sertoli细胞中特异表达的启动子启动荧光蛋白的表达；
所述在Sertoli细胞中特异表达的启动子的核苷酸序列如序列表中的序列1所示。
19.权利要求18所述荧光蛋白报告系统的应用，为c1）-c4）中的至少一种：
c1）作为Sertoli细胞的指示标记；
c2）作为Sertoli细胞的分离标记；
c3）作为Sertoli细胞的富集标记；
c4）制备Sertoli细胞。
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Mutated elements of a complex promoter (Amh) can help to demonstrate the role of certain elements in controlling differential gene expression;David W. Dresser;《American Journal of Molecular Biology》;20121231;第2卷(第4期);第351-358页，参见摘要、第352-354页、图1-2 *
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