CN107505301B - 高荧光强度的荧光探针的合成方法及用其进行β受体激动剂检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高荧光强度的荧光探针的合成方法及用其进行β受体激动剂检测的方法，属于食品安全检测领域。该高荧光强度的荧光探针的合成方法，以2,3‑萘二胺、苯甲酰氯为反应物，以1‑丁基‑3‑甲基咪唑六氟磷酸盐为催化剂制得。该荧光探针荧光强度高，合成简便，针对含有氨基化合物反应特异性强。所生成的荧光探针与β‑受体激动剂衍生速度快，荧光强度高。增加该类药物检测灵敏度，降低了检测成本。

Description

高荧光强度的荧光探针的合成方法及用其进行β受体激动剂 检测的方法

技术领域

本发明属于食品安全检测领域，具体涉及一种高荧光强度的荧光探针的合成方法及用其进行β受体激动剂检测的方法。

背景技术

β-受体激动剂被广泛使用在禽畜饲养过程中，可以促进动物生长，提高瘦肉产率。但长期使用会富集在动物组织中，人食用该动物组织会产生很严重的毒副作用，从而危害人类健康。国家食品安全领域强制执行检测动物源性制品中莱克多巴胺、沙丁胺醇、克伦特罗三种传统的β-受体激动剂，而对新型的β-受体激动剂暂时没有相应的检测标准，如：西马特罗、苯乙醇胺A、特布他林、福莫特罗等等。上述β-受体激动剂都存在共同的特征结构，即苯乙醇胺。

目前已报到的文献中，对β-受体激动剂的检测方法有酶联免疫法、胶体金免疫法，免疫学方法针对性强，速度快，但是同时只能检测其中一种物质。液相色谱-质谱串联法，该方法灵敏度高，重复性好，但对仪器设备要求高，操作繁琐，不适合基层实验室操作。气相色谱-质谱串联法，该方法的分离效果没有液相色谱良好。液相色谱-紫外检测器法，该方法重复性良好，但是β-受体激动剂的紫外吸收不强，导致方法灵敏度受到限制，一般最低响应浓度为100ng/mL左右。液相色谱-荧光检测器法，该方法克服了紫外检测器灵敏度不高的缺点，最低响应浓度为10ng/mL左右。但是β-受体激动剂根据结构不同，并不是每种物质都有荧光性，如：克伦特罗、福莫特罗、苯乙醇胺A等物质荧光强度很弱甚至没有。所以荧光检测方法任然有很大的限制。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用离子液体催化合成的荧光强度高，反应位阻小，衍生速度快，易于得到的荧光探针的合成方法。

本发明的另一个目的是提供一种用高荧光强度的荧光探针进行β受体激动剂检测的方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种高荧光强度的荧光探针的合成方法，以2,3-萘二胺、苯甲酰氯为反应物，以1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐为催化剂制得。

进一步地，其具体步骤为，

A、按质量比分别称取反应物2,3-萘二胺7.8-8.2份，苯甲酰氯6.8-7.2份，催化剂1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐0.8-1.2份，均匀搅拌30min，得到混合溶液；

B、用14.8-15.2份pH值为2的盐酸水溶液萃取上述混合溶液，3次；合并盐酸溶液;

C、用8-12%氢氧化钠水溶液调节盐酸溶液pH值为10，此时会析出白色晶体状沉淀,过滤，用冷水多次洗涤滤饼;

D、用45-55%的乙醇水溶液将滤饼重结晶，干燥，得到白色针状晶体，即为2-苯基萘并咪唑;

E、取6.8-7.2份氯磺酸于圆底烧瓶中，在冰盐浴中充分冷却，加入步骤D制得的2-苯基萘并咪唑2.8-3.2份，充分搅拌，60℃加热溶解10min迅速倒入冰水中，静止，此时有针状沉淀析出，过滤，用冰水洗涤滤饼，干燥，得到黄色针状晶体1-(4-磺酰氯基苯基)萘并咪唑。

上述的荧光探针进行检测的方法，包括如下步骤：

步骤1：试剂准备，将0.2mol/L盐酸溶液，20g/L氯化钠溶液，甲醇按体积比1:1:1混合，得到样品提取液，该样品提取液可以有效的从动物源性制品中将目标物萃取到液相中，又不会溶解大量油脂等杂质影响实验结果；

配制0.1mol/L碳酸钠水溶液，并用盐酸调节其pH值为9.5-10.1，得到衍生缓冲液，该缓冲液保证衍生试剂有效的与目标物中的仲胺基反应，不与酚类物质，醇类物质反应，让衍生试剂专一性较强；称取1-(4-磺酰氯基苯基)萘并咪唑0.2g溶于100mL丙酮中，得到衍生剂溶液；

步骤2：称取5.00g样品于离心管中，加入25mL样品提取液，10000rpm匀浆1min，4℃，8000rpm离心5min，得到上清液和沉淀物，将该上清液转入鸡心瓶中，用5mL提取液洗涤该沉淀物，将洗涤后液体合并到盛放上清液的鸡心瓶中，50℃旋转蒸发至5mL以下，加入10mL正己烷，摇晃1min，静置分层，弃去上层正己烷层，将下层用水定容至5.00mL；

步骤3：取上述样液1mL于具塞试管中，加入1mL衍生缓冲液，1mL衍生剂溶液，加塞，避光，90℃反应15min，加入0.05mL浓盐酸，摇匀后，过滤孔直径为0.45μm的滤膜；然后进行高效液相色谱仪测定；

步骤4：以水为溶剂，配制七种β-受体激动剂个不同质量体积浓度的混合标准溶液，该七种β-受体激动剂系列混合标准溶液的质量体积浓度均为：1.00ng/mL、5.00ng/mL、10.00ng/mL、50.00ng/mL、100.00ng/mL；将七种β-受体激动剂系列混合标准溶液按步骤3进行衍生处理，于附带荧光检测器的高效液相色谱仪中测定；由该色谱图得到系列标准溶液中七种β-受体激动剂的荧光衍生物在该色谱条件下的出生时间和不同浓度的峰面积，并以标准溶液质量体积浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘七种β-受体激动剂标准溶液的工作曲线；

步骤5：根据步骤3测得的样品制备液的峰面积值，从步骤4绘制的系列标准溶液的工作曲线上找到峰面积值对应的七种β-受体激动剂的含量，计算待测样品中七种β-受体激动剂的含量。

进一步地，所述步骤3和步骤4中的色谱条件为，色谱柱：C18 4.6×250 mm分析柱；流动相：pH=3.5乙酸铵缓冲液40v+乙腈60v；流速：1 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：20 μL；激发波长：365 nm，发射波长：405nm。

本发明步骤2前处理方法操作简单，成本低。而且本发明所使用的检测器为液相色谱-荧光检测器。

本发明创新点之一是该荧光探针，荧光强度高，合成简便，针对含有氨基化合物反应特异性强。

本发明根据β-受体激动剂结构中含有仲胺基的特点，合成了针对仲胺基反应的荧光探针1-(4-磺酰氯基苯基)萘并咪唑，该衍生剂空间位阻小，反应活性高，荧光性强。在合成该衍生剂时区别于传统方法，创新性的采用离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐催化反应，在离子液体催化下，无需其他溶剂，反应绿色无污染，反应速度快，产率较高，容易净化分离得到纯品。

所生成的荧光探针与β-受体激动剂衍生速度快，荧光强度高。衍生产物48h内，常温下稳定。与反相液相色谱流动相兼容性好。

创新点之二是首次将荧光探针应用在β受体激动剂检测中。增加该类药物检测灵敏度，降低检测成本。用上述荧光探针测定动物源性制品中β-受体激动剂（包括：西马特罗、苯乙醇胺A、特布他林、福莫特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、克伦特罗等含有苯乙醇胺结构的其他β-受体激动剂）的方法成本低、灵敏度高。

本发明建立一种灵敏度高（最低响应浓度为1ng/mL，方法检出限为0.3～0.4ng/g），回收率高（88.6%～91.4%），检测结果稳定（RSD%≤3.5%），操作简单，无需固相萃取净化，低成本的β-受体激动剂的检测方法。

附图说明

图1是采用本发明合成的荧光衍生试剂快速检测7种β-受体激动剂的色谱图。

具体实施方式

下面的实施例可以进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1高荧光强度的荧光探针合成方法如下：

按质量比分别称取反应物2,3-萘二胺8g，反应物苯甲酰氯7g，催化剂兼溶剂1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐1g于圆底烧瓶中，均匀搅拌30min，得到混合溶液。用15g的pH值为2的盐酸水溶液萃取上述混合溶液，3次。合并盐酸溶液。用10%氢氧化钠水溶液调节盐酸溶液pH值为10，此时会析出白色晶体状沉淀。过滤，用冷水多次洗涤滤饼。用50%的乙醇水溶液将滤饼重结晶，干燥，得到白色针状晶体，即为2-苯基萘并咪唑，产率81.5%。取7g氯磺酸于圆底烧瓶中，在冰盐浴中充分冷却，加入2-苯基萘并咪唑3g，充分搅拌，60℃加热溶解10min迅速倒入冰水中，静止，此时有针状沉淀析出，过滤，用冰水洗涤滤饼，干燥，得到黄色针状晶体1-(4-磺酰氯基苯基)萘并咪唑萘并咪唑，产率80.7%，该荧光探针在-20到4℃可稳定保存2年。

实施例2-高荧光强度的荧光探针合成方法如下：

按质量比分别称取反应物2,3-萘二胺8.2g，反应物苯甲酰氯7.2g，催化剂兼溶剂1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐1.2g于圆底烧瓶中，均匀搅拌30min，得到混合溶液。用15.2g的pH值为2的盐酸水溶液萃取上述混合溶液，3次。合并盐酸溶液。用10%氢氧化钠水溶液调节盐酸溶液pH值为10，此时会析出白色晶体状沉淀。过滤，用冷水多次洗涤滤饼。用50%的乙醇水溶液将滤饼重结晶，干燥，得到白色针状晶体，即为2-苯基萘并咪唑，产率81.5%。取7.2g氯磺酸于圆底烧瓶中，在冰盐浴中充分冷却，加入2-苯基萘并咪唑3.2g，充分搅拌，60℃加热溶解10min迅速倒入冰水中，静止，此时有针状沉淀析出，过滤，用冰水洗涤滤饼，干燥，得到黄色针状晶体1-(4-磺酰氯基苯基)萘并咪唑萘并咪唑，产率80.7%，该荧光探针在-20到4℃可稳定保存2年。

实施例3-高荧光强度的荧光探针合成方法如下：

按质量比分别称取反应物2,3-萘二胺7.8g，反应物苯甲酰氯6.8g，催化剂兼溶剂1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐0.8g于圆底烧瓶中，均匀搅拌30min，得到混合溶液。用14.8g的pH值为2的盐酸水溶液萃取上述混合溶液，3次。合并盐酸溶液。用10%氢氧化钠水溶液调节盐酸溶液pH值为10，此时会析出白色晶体状沉淀。过滤，用冷水多次洗涤滤饼。用50%的乙醇水溶液将滤饼重结晶，干燥，得到白色针状晶体，即为2-苯基萘并咪唑，产率81.5%。取6.8g氯磺酸于圆底烧瓶中，在冰盐浴中充分冷却，加入2-苯基萘并咪唑2.8g，充分搅拌，60℃加热溶解10min迅速倒入冰水中，静止，此时有针状沉淀析出，过滤，用冰水洗涤滤饼，干燥，得到黄色针状晶体1-(4-磺酰氯基苯基)萘并咪唑萘并咪唑，产率80.7%，该荧光探针在-20到4℃可稳定保存2年。

实施例4-检测方法

用上述荧光探针能快速和样液中β-受体激动剂反应，生成高荧光强度的产物。该产物荧光强度和其含量在一定线性范围内成正比，通过液相色谱荧光检测器，检测其含量。具体测定步骤为：

步骤1：试剂准备，将0.2mol/L盐酸溶液，20g/L氯化钠溶液，甲醇按体积比1:1:1混合，得到样品提取液，该样品提取液可以有效的从动物源性制品中将目标物萃取到液相中，又不会溶解大量油脂等杂质影响实验结果；配制0.1mol/L碳酸钠水溶液，并用盐酸调节其pH值为9.5-10.1，得到衍生缓冲液，该缓冲液保证衍生试剂有效的与目标物中的仲胺基反应，不与酚类物质，醇类物质反应，让衍生试剂专一性较强；称取1-(4-磺酰氯基苯基)萘并咪唑0.2g溶于100mL丙酮中，得到衍生剂溶液。

步骤2：称取5.00g样品（可以包括：生肉、内脏、血液、尿液、饲料、及各种肉类制品）于离心管中，加入25mL样品提取液。10000rpm匀浆1min。4℃，8000rpm离心5min。得到上清液和沉淀物，将该上清液转入鸡心瓶中，用5mL提取液洗涤该沉淀物，将洗涤后液体合并到盛放上清液的鸡心瓶中，50℃旋转蒸发至5mL以下，加入10mL正己烷，摇晃1min，静置分层，弃去上层正己烷层，将下层用水定容至5.00mL。

步骤3：取上述样液1mL于具塞试管中，加入1mL衍生缓冲液，1mL衍生剂溶液，加塞，避光，90℃反应15min，加入0.05mL浓盐酸。摇匀后，过滤孔直径为0.45μm的滤膜；然后进行高效液相色谱仪测定。色谱条件：色谱柱：C18 4.6×250 mm分析柱；流动相：pH=3.5乙酸铵缓冲液v+乙腈v=40+60；流速：1 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：20 μL；激发波长：365 nm，发射波长：405nm；

步骤4：以水为溶剂，配制七种β-受体激动剂个不同质量体积浓度的混合标准溶液，该七种β-受体激动剂系列混合标准溶液的质量体积浓度均为：1.00ng/mL、5.00ng/mL、10.00ng/mL、50.00ng/mL、100.00ng/mL；将七种β-受体激动剂系列混合标准溶液按步骤3进行衍生处理，于附带荧光检测器的高效液相色谱仪中测定。色谱柱：色谱柱：C18 4.6×250mm分析柱；流动相：pH=3.5乙酸铵缓冲液v+乙腈v=40+60；流速：1 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：20 μL；激发波长：365 nm，发射波长：405nm；得图1所示的色谱图（采用本发明合成的荧光衍生试剂快速检测7种β-受体激动剂，用高效液相色谱仪测定得到的色谱图。）

由该色谱图得到系列标准溶液中七种β-受体激动剂的荧光衍生物在该色谱条件下的出生时间和不同浓度的峰面积。并以标准溶液质量体积浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘七种β-受体激动剂标准溶液的工作曲线；

该标准曲线的线性范围、回归方程、相关系数、检出限（3倍信噪比）、RSD%（n=10）值见表1：

步骤5：根据步骤3测得的样品制备液的峰面积值，从步骤4绘制的系列标准溶液的工作曲线上找到峰面积值对应的七种β-受体激动剂的含量，按下式计算待测样品中七种β-受体激动剂的含量X：

式中：X表示试样中的每种β-受体激动剂含量，单位ng/g；C₁表示步骤3测得的样品制备液的峰面积所对应的每种β-受体激动剂的含量，单位ng/mL；C₀表示试样空白液中每种β-受体激动剂的含量，单位ng/mL；m表示试样质量，单位g；V表示步骤2中定容体积，单位mL。

下面通过本发明测定方法与现有测定方法进行比较，突出该方法的优越性：

1）操作过程与成本对比：

现有方法对样品处理过程都需要提取，再经固相萃取小柱净化，而固相萃取会导致整个实验操作繁琐，回收率不稳定，成本高等问题。本发明前处理方法操作简单，成本低。而且本发明所使用的检测器为液相色谱-荧光检测器。而文献中多用液相色谱-质谱检测器，该设备价格高昂，使用复杂。本发明用低价格的设备做到与质谱同等数量级的检测下限。检出限数据见表2（三倍信噪比、仪器检出限、稀释倍数、方法检出限）：

2）稳定性实验对比：

本发明中， RSD%≤3.5%。由于简化了固相萃取过程，稳定性大大提高。

3）回收率对比：

有文献提供的方法回收率为86.7%～114.3%，还有文献提供的方法回收率为87.1～108.6%，另有文献提供的方法回收率为89.7～106.7%，用现有方法测定β-受体激动剂时，回收率不够稳定，这也是固相萃取柱的弊端。应用本发明快速测定方法时，β-受体激动剂回收率为88.6%～91.4%%，可见本发明快速测定方法的回收率高，而且稳定。

实施例5

检测除文中提到的7种β-受体激动剂喷布特罗。已验证该发明的广谱适用性。

步骤1：试剂准备，将0.2mol/L盐酸溶液，20g/L氯化钠溶液，甲醇按体积比1:1:1混合，得到样品提取液，该样品提取液可以有效的从动物源性制品中将目标物萃取到液相中，又不会溶解大量油脂等杂志影响实验结果；

配制0.1mol/L碳酸钠水溶液，并用盐酸调节其pH值为9.8±0.3，得到衍生缓冲液，该缓冲液保证衍生试剂有效的与目标物中的仲胺基反应，不与酚类物质，醇类物质反应，让衍生试剂专一性较强；称取1-(4-磺酰氯基苯基)萘并咪唑0.2g溶于100mL丙酮中，得到衍生剂溶液。步骤2：称取5.00g样品（可以包括：生肉、内脏、血液、尿液、饲料、及各种肉类制品）于离心管中，加入25mL样品提取液。10000rpm匀浆1min。4℃，8000rpm离心5min。得到上清液和沉淀物，将该上清液转入鸡心瓶中，用5mL提取液洗涤该沉淀物，将洗涤后液体合并到盛放上清液的鸡心瓶中，50℃旋转蒸发至5mL以下，加入10mL正己烷，摇晃1min，静置分层，弃去上层正己烷层，将下层用水定容至5.00mL。

步骤3：取1.00mL上述样液于具塞试管中，加入1mL衍生缓冲液，1mL衍生剂溶液，加塞，避光，90℃反应15min，加入0.05mL浓盐酸。摇匀后，过滤孔直径为0.45μm的滤膜；然后进行高效液相色谱仪测定。色谱条件：色谱柱：C18 4.6×250 mm分析柱；流动相：pH=3.5乙酸铵缓冲液v+乙腈v=40+60；流速：1 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：20 μL；激发波长：365 nm，发射波长：405nm；

步骤4：以水为溶剂，配制喷布特罗不同质量体积浓度的混合标准溶液，该喷布特罗系列混合标准溶液的质量体积浓度均为：1.00ng/mL、5.00ng/mL、10.00ng/mL、50.00ng/mL、100.00ng/mL；将喷布特罗系列混合标准溶液按步骤3进行衍生处理，于附带荧光检测器的高效液相色谱仪中测定。色谱柱：色谱柱：C18 4.6×250 mm分析柱；流动相：pH=3.5乙酸铵缓冲液v+乙腈v=40+60；流速：1 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：20 μL；激发波长：365 nm，发射波长：405nm；由该色谱图得到系列标准溶液中喷布特罗的荧光衍生物在该色谱条件下的出生时间和不同浓度的峰面积。并以标准溶液质量体积浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘喷布特罗标准溶液的工作曲线；

步骤5：根据步骤3测得的样品制备液的峰面积值，从步骤4绘制的系列标准溶液的工作曲线上找到峰面积值对应的喷布特罗的含量，按实施例4中的计算公式算待测样品中喷布特罗的含量X。

试验例

按照实施例1的操作步骤，检测除文中提到的7种β-受体激动剂非诺特罗。已验证该发明的广谱适用性。

与实施例1不同之处在于所述步骤4：以水为溶剂，配制非诺特罗不同质量体积浓度的混合标准溶液，该非诺特罗系列混合标准溶液的质量体积浓度均为：1.00ng/mL、5.00ng/mL、10.00ng/mL、50.00ng/mL、100.00ng/mL；将非诺特罗系列混合标准溶液按步骤3进行衍生处理，于附带荧光检测器的高效液相色谱仪中测定。色谱柱：色谱柱：C18 4.6×250 mm分析柱；流动相：pH=3.5乙酸铵缓冲液v+乙腈v=40+60；流速：1 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：20 μL；激发波长：365 nm，发射波长：405nm；由该色谱图得到系列标准溶液中非诺特罗的荧光衍生物在该色谱条件下的出生时间和不同浓度的峰面积。并以标准溶液质量体积浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘非诺特罗标准溶液的工作曲线；

根据步骤3测得的样品制备液的峰面积值，从步骤4绘制的系列标准溶液的工作曲线上找到峰面积值对应的非诺特罗的含量，按实施例4中的计算公式算待测样品中喷布特罗的含量X。

通过上述例子证明该荧光探针和该检测方法可以广泛的用于对含有苯乙醇胺类药物的测定中。

Claims (3)

1.一种高荧光强度的荧光探针的合成方法，其特征在于：以2,3-萘二胺、苯甲酰氯为反应物，以1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐为催化剂制得；具体步骤为：

A、按质量比分别称取反应物2,3-萘二胺7.8-8.2份，苯甲酰氯6.8-7.2份，催化剂1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐0.8-1.2份，均匀搅拌30min，得到混合溶液；

B、用14.8-15.2份pH值为2的盐酸水溶液萃取上述混合溶液，3次；合并盐酸溶液;

C、用8-12%氢氧化钠水溶液调节盐酸溶液pH值为10，此时会析出白色晶体状沉淀,过滤，用冷水多次洗涤滤饼;

D、用45-55%的乙醇水溶液将滤饼重结晶，干燥，得到白色针状晶体，即为2-苯基萘并咪唑;

E、取6.8-7.2份氯磺酸于圆底烧瓶中，在冰盐浴中充分冷却，加入步骤D制得的2-苯基萘并咪唑2.8-3.2份，充分搅拌，60℃加热溶解10min迅速倒入冰水中，静止，此时有针状沉淀析出，过滤，用冰水洗涤滤饼，干燥，得到黄色针状晶体1-(4-磺酰氯基苯基)萘并咪唑。

2.用权利要求1所述的荧光探针进行检测的方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤1：试剂准备，将0.2mol/L盐酸溶液，20g/L氯化钠溶液，甲醇按体积比1:1:1混合，得到样品提取液，该样品提取液可以有效的从动物源性制品中将目标物萃取到液相中，又不会溶解大量油脂等杂质影响实验结果；

配制0.1mol/L碳酸钠水溶液，并用盐酸调节其pH值为9.5-10.1，得到衍生缓冲液，该缓冲液保证衍生试剂有效的与目标物中的仲胺基反应，不与酚类物质，醇类物质反应，让衍生试剂专一性较强；称取1-(4-磺酰氯基苯基)萘并咪唑0.2g溶于100mL丙酮中，得到衍生剂溶液；

步骤2：称取5.00g样品于离心管中，加入25mL样品提取液，10000rpm匀浆1min，4℃，8000rpm离心5min，得到上清液和沉淀物，将该上清液转入鸡心瓶中，用5mL提取液洗涤该沉淀物，将洗涤后液体合并到盛放上清液的鸡心瓶中，50℃旋转蒸发至5mL以下，加入10mL正己烷，摇晃1min，静置分层，弃去上层正己烷层，将下层用水定容至5.00mL；

步骤3：取样液1mL于具塞试管中，加入1mL衍生缓冲液，1mL衍生剂溶液，加塞，避光，90℃反应15min，加入0.05mL浓盐酸，摇匀后，过滤孔直径为0.45μm的滤膜；然后进行高效液相色谱仪测定；

步骤4：以水为溶剂，配制各不同质量体积浓度的七种β-受体激动剂系列混合标准溶液，该七种β-受体激动剂系列混合标准溶液的质量体积浓度均为：1.00ng/mL、5.00ng/mL、10.00ng/mL、50.00ng/mL、100.00ng/mL；将七种β-受体激动剂系列混合标准溶液按步骤3进行衍生处理，于附带荧光检测器的高效液相色谱仪中测定；由色谱图得到系列标准溶液中七种β-受体激动剂的荧光衍生物在色谱条件下的出生时间和不同浓度的峰面积，并以标准溶液质量体积浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘七种β-受体激动剂标准溶液的工作曲线；

步骤5：根据测得的样品制备液的峰面积值，从步骤4绘制的系列标准溶液的工作曲线上找到峰面积值对应的七种β-受体激动剂的含量，计算待测样品中七种β-受体激动剂的含量。

3.根据权利要求2所述的荧光探针进行检测的方法，其特征在于：所述步骤3和步骤4中的色谱条件为，色谱柱：C18 4.6×250 mm分析柱；流动相：pH=3.5乙酸铵缓冲液40v+乙腈60v；流速：1 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：20 μL；激发波长：365 nm，发射波长：405nm。

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