CN107502615B

CN107502615B - 海带中编码gdp-甘露糖-4,6-脱水酶的基因、及其蛋白质和用途

Info

Publication number: CN107502615B
Application number: CN201710960605.9A
Authority: CN
Inventors: 刘涛; 池姗; 刘翠
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2017-10-16
Filing date: 2017-10-16
Publication date: 2020-05-05
Anticipated expiration: 2037-10-16
Also published as: CN107502615A

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体是一种海带中编码GDP‑甘露糖‑4,6‑脱水酶的基因、及其蛋白质和用途。所述基因来源于海带(Sacchrina japonica)，命名为SjaGM46D1基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列，其编码蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的序列，该蛋白质为GDP‑甘露糖‑4,6‑脱水酶。本发明通过基因克隆技术克隆出该基因序列，构建原核表达载体，通过对重组蛋白进行酶活性检测，证实了其具有催化GDP‑甘露糖转化为GDP‑4‑酮‑6‑脱氧甘露糖的功能，可应用于GDP岩藻糖的合成；且比活力明显高于目前所公开的其他GDP‑甘露糖‑4,6‑脱水酶。

Description

海带中编码GDP-甘露糖-4,6-脱水酶的基因、及其蛋白质和用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体属于基因工程领域，更具体涉及一种海带(Sacchrina japonica)中编码GDP-甘露糖-4,6-脱水酶的基因、及其编码的蛋白质和用途。

背景技术

多糖在脂类和蛋白质的翻译后修饰中有重要的作用，如众所周知在肿瘤的恶性转移中低聚糖的结构会发生变化，肿瘤细胞的生物学行为都伴随着细胞表面的糖蛋白和糖脂的重构，而糖蛋白和糖脂的重构是通过改变结合在上面的多糖的结构来实现的。岩藻糖(Fucose)作为多糖的重要组成部分，尤其与癌症和炎症相关。

岩藻糖是一种脱氧己糖，它广泛存在于不同的生物体中。岩藻糖主要参与组成N-和O-链接的多糖和糖脂，并且它在多糖的结构中经常以末端修饰，可以使多糖具有特定的功能。所有的岩藻糖基转移酶都使用岩藻糖的核苷酸活性形式GDP-岩藻糖，作为岩藻糖的供体来合成岩藻糖基化的多糖。因此GDP-岩藻糖作为岩藻糖的活性核糖形式，参与多种生物反应，包括寡糖、糖蛋白和糖脂的合成。岩藻糖基化需要GDP-岩藻糖作为岩藻糖转移酶的供体，其产物岩藻糖化复合物可参与多种生物和病理过程，包括组织发育、受精、细胞粘附、肿瘤转移、炎症反应和血管生成。GDP-岩藻糖是一种相对稀有的核糖，价格昂贵，化学合成较为复杂，科学家一直在探寻GDP-岩藻糖的更多来源。

微生物可作为GDP-岩藻糖的另一来源，但利用微生物发酵生产GDP-岩藻糖受多种因素的影响。目前，GDP-岩藻糖的生物合成途径主要有两大类：从头合成途径和补救合成途径，从头合成途径是由两个蛋白，GDP-甘露糖-4,6-脱水酶(GDP-mannose-4,6-dehydratase，GM46D)和GDP-岩藻糖合成酶(GDP-fucose synthase，GFS)，通过三步酶促反应将GDP-甘露糖转化成GDP-岩藻糖。补救途径是直接使用来自胞外或者溶菌酶体中的自由岩藻糖来合成GDP-岩藻糖。通过研究发现，在细胞体中，90％的GDP-岩藻糖是来自从头合成途径。

GDP-岩藻糖的从头合成途径在进化上是保守的。它首先在细菌中被发现确定，然后先后在植物中，哺乳动物中，和无脊椎动物中发现。从头合成途径的第一步反应是从GDP-甘露糖生成GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖，这一步反应由GDP-甘露糖-4,6-脱水酶(GM46D)催化完成，这一步反应中GM46D将甘露糖C-4位置的羟基氧化成酮基，并将C-6位置的羟基还原成甲基，辅因子NADP+在整个反应过程中起着电子传递的作用，在反应最后被还原成NADPH。生成的GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖进一步被转化成GDP-岩藻糖，这个过程包含两步反应，由具有异构酶和还原酶双功能酶活性的GDP-岩藻糖合成酶(GFS)催化完成。在GFS催化的第一步反应中，使GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖的C-3位置的羟基和C-5位置的甲基发生异构生成GDP-4-酮-6-脱氧半乳糖，随后在C-4位置的酮基上发生还原反应，将辅因子NADPH上的H+转移到C-4位置的酮基上生成GDP-岩藻糖和NADP+。

在从头合成途径中，GM46D为该途径中的关键酶，来源不同的生物体中的GM46D已经完成了分子水平的鉴定，包括人、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、草履虫小球藻病毒等。但本领域的科研工作者仍在一直继续寻找其他物种来源的GM46D酶，以更全面地对该酶进行研究，包括其在进化上的保守性和活性中心等方面的研究，另外，任何新物种来源的GM46D的发现都会为GDP-岩藻糖的生物合成代谢通路设计提供更多的可选择的酶。

综上所述，本发明完成对海带(Sacchrina japonica)中GM46D的克隆、表达和功能鉴定，构建了GM46D的表达载体，并对GM46D进行了诱导表达和纯化，纯化后的目的蛋白具有催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖的活性，且该酶的比活力远高于现有技术。因此本发明的GM46D为GDP-岩藻糖的生物制备提供了优异的基因资源和酶资源。

发明内容

本发明提供了来源于海带(Sacchrina japonica)的编码GDP-甘露糖-4,6-脱水酶的GM46D基因，所述的GM46D基因的编码产物为GDP-甘露糖-4，6-脱水酶，该酶具有催化GDP-D-甘露糖转化为GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖的活性。

一方面，本发明提供了来源于海带的GM46D基因，所述的GM46D基因的编码产物为GDP-甘露糖-4,6-脱水酶，所述的GM46D基因为SjaGM46D1基因；所述的SjaGM46D1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列。

另一个方面，本发明提供了一种GDP-甘露糖-4,6-脱水酶，所述的GDP-甘露糖-4,6-脱水酶由上述GM46D基因所编码；所述的GDP-甘露糖-4,6-脱水酶由上述SjaGM46D1基因所编码；所述的GDP-甘露糖-4,6-脱水酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的序列。

再一个方面，本发明还提供了含有上述GM46D基因的载体或基因工程细胞。

所述的载体可以为原核细胞表达载体或真核细胞表达载体。

所述的真核细胞表达载体选自：酵母表达载体、昆虫细胞表达载体或哺乳动物细胞表达载体。

所述的原核细胞表达载体可以为pGEX表达载体或pET表达载体。

所述的pGEX表达载体包括但不限于：pGEX-2T载体、pGEX-2TK载体、pGEX-4T载体、pGEX-3X载体、pGEX-5X载体、pGEX-6P载体、pGEX-KG载体等。

所述的pET表达载体包括但不限于：pET-22载体、pET-28载体、pET-30载体、pET-32载体、pET-34载体、pET-40载体或pET-42载体等。

所述的基因工程细胞包括但不限于：大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、乳酸菌细胞或毕赤酵母细胞等。

再一个方面，本发明还提供了上述GM46D基因在制备GDP-岩藻糖中的用途。所述的用途指将该GM46D基因导入基因工程细胞，从而使基因工程细胞能够产生GDP-岩藻糖。

另一个方面，本发明还提供了由上述GM46D基因所编码的GDP-甘露糖-4,6-脱水酶在制备GDP-岩藻糖中的用途。

本发明的有益效果为：本发明不同于GDP-岩藻糖的常规制备工艺，也就是化学提取法。本发明提供的GM46D基因编码的GDP-甘露糖-4,6-脱水酶是GDP-岩藻糖生物合成中的重要酶，该基因或酶为GDP-岩藻糖的生物制备提供了重要的生物资源。本发明中的GM46D基因所编码的GDP-甘露糖-4,6-脱水酶具有效的催化活性，且该酶的比活力远高于现有技术，本发明为GDP-岩藻糖的生物制备提供了优异的基因资源和酶资源。

附图说明

图1为本发明的SjaGM46D1基因转化大肠杆菌BL21表达产物纯化后的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图2为本发明的SjaGM46D1基因转化大肠杆菌BL21表达蛋白的酶活检测的质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。

实施例1海带中SjaGM46D1基因的获取

海带采集自山东省荣成市，采用Trizol法提取海带雌配子体总RNA，使用TAKARA公司PrimeScript II 1^st Strand cDNA Synthesis试剂盒以海带配子体总RNA反转录得到第一链cDNA。以该cDNA为模板对海带SjaGM46D1基因的CDS全长序列进行扩增，同时在两端引入EcoRI和SalI酶切位点(扩增引物为5’-GAATTCATGGCTGAGCCGGAGACG-3’和5’-GTCGACTTAGGCGTGCTCGTTGCC-3’)。PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，59℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min。PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外灯下切割含有目的条带的胶块，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，于-20℃保存。回收的目的片段，于16℃金属浴过夜连接至克隆载体pMD19-T，并转化到大肠杆菌感受态细胞E.coli Top10中，涂布于含有100mg/mL Amp的LB固体培养基上，37℃过夜培养，经过IPTG/X-gal蓝白斑筛选后，挑取4-10个阳性克隆进行测序。将测序结果通过序列比对，分离到了一个海带GM46D基因，命名为SjaGM46D1。SjaGM46D1CDS序列全长为1128bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码375个氨基酸，以ATG为起始密码子，TAA为终止密码子。

实施例2SjaGM46D1基因的克隆表达

将实施例1得到的SjaGM46D1基因片段连接至pGEX-6p-1载体(购自GE Healthcare公司)的EcoRI和SalI位点之间，获得pGEX-SjaGM46D1重组载体；将获得的pGEX-SjaGM46D1重组载体转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞(购自Takara公司)中，并涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养平板上，37℃培养过夜；将阳性克隆接种至含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌液OD600为0.4时，加入终浓度为0.1mMIPTG，在16℃、160rpm的诱导条件下，经16h诱导目的蛋白的表达。

实施例3SjaGM46D1蛋白的分离纯化

收集实施例2诱导表达得到的菌体，每升菌液以50ml PBS重悬，加入1％Triton X-100，1％β-巯基乙醇；在冰上对菌体进行超声破碎，12000rpm，10min离心取上清，在上清中加入适量GST-beads，轻轻晃动令其吸附蛋白1h；5000rpm，3min离心弃上清；加入至少10倍体积PBS，轻摇至beads悬浮于溶液中，5000rpm，3min离心弃上清，重复本步骤两次；加入1mLGST Elution Buffer，轻摇10min；5000rpm，3min离心，收集上清；重复前两个步骤两次后得到纯化后的蛋白，该重组蛋白为SjaGM46D1基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，命名为SjaGM46D1蛋白，功能为GDP-甘露糖-4,6-脱水酶。

实施例4重组蛋白的鉴定

对实施例3获得的SjaGM46D1蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳图如图1所示，SjaGM46D1蛋白的分子量大小符合预期值67.3kDa。

实施例5SjaGM46D1蛋白的功能验证

酶活测定方法：

由于GDP-甘露糖到GDP-岩藻糖的中间产物较为不稳定，因此本发明向反应体系加入GDP-岩藻糖合成酶(GFS)，直接检测最终产物GDP-岩藻糖，从而对待测酶的功能进行验证。

①酶的催化反应：反应体系1000μl：100mM MOPS，pH 7.0,100mM NaCl，10mM二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)，5mM EDTA，1mM GDP-甘露糖(Sigma)，0.4mM NADPH，1mM NADP。反应起始加入1.5mg/ml SjaGM46D1蛋白，37℃反应3h，然后加入1.5mg/ml GFS酶，调整NADPH浓度至1.5mM。37℃反应2h，然后加热至100℃，2min后终止反应。

②样品处理：用2％胰蛋白酶，0.5％碱性蛋白酶，37℃处理3h去除反应体系中的蛋白，使用最小截留分子量的透析袋(索莱宝，截留分子量500)去除反应体系中的盐离子。

③LC-MS/MS分析：过滤上一步得到的反应液，除去不溶性样品，进行下一步分析。固定相使用多孔石墨碳柱(Hypercarb，100×2.1mm，5μm，Thermo Scientific)并匹配相应的流动相。起始缓冲液为0.1％甲酸(用氨水调节pH为9.0)。柱平衡后使用10-50％的乙腈梯度洗脱，流速100μl/min，时间36min。检测装置使用API3000液相色谱-质谱-质谱联用仪，对样品进行电喷雾负离子化，质谱部分采用三重四级杆质量分析器，参数设定为：去簇电压(DP)为50V，聚焦电压(EP)为300V，碰撞电压(CE)为30V，源温度为375℃。

测定结果：

检测结果如图2所示，在质谱图中可以找到对应大小的底物GDP-甘露糖(Sigma，MW605.34)和产物GDP-L-岩藻糖(MW 589.3417)。该实验结果验证了本发明的SjaGM46D1基因表达的蛋白具有催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖的功能。

实施例6SjaGM46D1蛋白的比活力测定

酶活测定：反应体系如下：50mM Tris-glycine buffer、1mM NADP(购自罗氏公司)、10μM NADPH(购自罗氏公司)和合适量实施例3制备的重组SjaGM46D1蛋白，总反应体系为1ml，加入底物GDP-甘露糖(购自西格玛公司)起始反应。将上述除去底物的体系混合后在相应温度条件下孵育2min后起始反应，以相应的缓冲液为空白对照，在340nm处分别测定反应0min、6min和12min吸光值的变化，每个反应设置4个平行样。经检测，酶活为9.8μmol/min/mg，最适反应温度为30℃，最适pH为8.0。

目前来源于其他物种的GM46D酶已经得到了检测，例如人类Homo sapiens(参见非专利文献Sullivan X,Kumar R,Kriz R,Stah M,Xu GY,Rouse G,Chang XJ.Molecularcloning of human GDP-mannose 4,6-Dehydratase and reconstitution of GDP-fucosebiosynthesis in vitro.Biol.Chem.1998.273；8193-8202)，草履虫小球藻病毒Paramecium bursaria Chlorella virus-1(参见非专利文献Fruscione F,Sturla L,Duncan G,Van Etten L,Valbuzzi P,De Flora A,Di Zanni E,Tonetti M.Differentialrole of NADP+and NADPH in the activity and structure of GDP-D-mannose 4,6-dehydratase from two Chlorella viruses.Biol Chem.2008.283；184-193)，肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae(参见非专利文献Yamamoto K,Katayama I,Onoda Y,Inami M,Kumagai H,Tochikura T.Evidence that the enzyme catalyzing the conversion ofguanosine diphosphate D-mannose to a 4-keto sugar nucleotide intermediaterequires nicotinamide adenine dinucleotide phosphate.Arch BiochemBiophys.1993.300；694-698)，大肠杆菌Escherichia coli(参见非专利文献Elbein A.D,Heath EC.The biosynthesis of cell wall lipopolysaccharide in Escherichiacoli.J Biol Chem.1965.240；1926-1931)，由测定结果可知，上述几种酶的比活力都远小于本发明的SjaGM46D1蛋白，上述几种酶与本发明海带中SjaGM46D1蛋白的酶比活力对比如下：

来源	比活力(μmol/min/mg)
		本发明实施例3	9.8
人类Homo sapiens	0.7
		草履虫小球藻病毒Paramecium bursaria Chlorella virus-1	0.63
肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae	7.09
		大肠杆菌Escherichia coli	8.4

上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110> 青岛海大蓝科生物科技有限公司、中国海洋大学

<120> 海带中编码GDP-甘露糖-4,6-脱水酶的基因、及其蛋白质和用途

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1128

<212> DNA

<213> 海带(Sacchrina japonica)

<400> 1

atggctgagc cggagacgaa gaaggtgaag gtggcccccg ctgccgcgga agggggcgag 60

tcctctgggt gcgctaagaa ggctatcatc acgggcatca ccggccagga tggctcctac 120

ctcgcagagt tcctcctaga gaagggatac gaggtgcacg gcatcatcag gcggtcatcg 180

agcttcaaca cccagcgcat cgaccacatc taccgcgaca ggcacgagag tgccgtgcgc 240

ctgaagctcc actacggtga cctcaccgac tcgaccaacc tcatgcacat catctacgag 300

gtgcaaccgg acgagatcta caacttgggg gccatgtccc acgtgaaggt gtccttcgag 360

atgtcggagt acactgccga ggcagacggg gtgggcgtgc tgcgcttgct gaacgccatc 420

cgttctgccg gcctagagca gaagacacgc ctctaccagg cgtctacctc cgagctgtac 480

ggcaaggtgc aggagatccc ccagaaggaa accacgccgt tctacccccg ctccccttac 540

ggtgtggcca agcagttcgg cttctggatg ctcgtcaact accgcgaggc gtacggcatg 600

cacttgacga acggcatcct cttcaaccac gagagccccc gccgcgggcc cacgttcgtc 660

acaagaaaga tcacccgcgc cgtcgcccgc atccaccgcg ggaagcagaa gtgcatatac 720

ctcgggaacc tcgacgctaa gcgtgactgg gggcacgcga aggactacat caagggcatg 780

tggctcatgg tacagaggga cgagcccagc gactacgtgc tgtccaccgg agagtgccac 840

agcgttaagg agttcgtcga ggagtctttc aaatacgtgg ggacggagat cacctgggtg 900

ggcgaggggg tggaggagtt cgggcacgtg aaggacgagc cggacaacat cctcgtccgc 960

gtggaccccc gctacttccg gccgactgag gtggaactcc tcctgggtga ctgcacgaag 1020

gctaagaacg agctggggtg ggtgcccgag atcaccttca aggagctcgt caaggacatg 1080

atgaagtccg acatcgccaa cgtcgatgct ggcaacgagc acgcctaa 1128

<210> 2

<211> 375

<212> PRT

<213> 海带(Sacchrina japonica)

<400> 2

Met Ala Glu Pro Glu Thr Lys Lys Val Lys Val Ala Pro Ala Ala Ala

1 5 10 15

Glu Gly Gly Glu Ser Ser Gly Cys Ala Lys Lys Ala Ile Ile Thr Gly

20 25 30

Ile Thr Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys

35 40 45

Gly Tyr Glu Val His Gly Ile Ile Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr

50 55 60

Gln Arg Ile Asp His Ile Tyr Arg Asp Arg His Glu Ser Ala Val Arg

65 70 75 80

Leu Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Asn Leu Met His

85 90 95

Ile Ile Tyr Glu Val Gln Pro Asp Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Met

100 105 110

Ser His Val Lys Val Ser Phe Glu Met Ser Glu Tyr Thr Ala Glu Ala

115 120 125

Asp Gly Val Gly Val Leu Arg Leu Leu Asn Ala Ile Arg Ser Ala Gly

130 135 140

Leu Glu Gln Lys Thr Arg Leu Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr

145 150 155 160

Gly Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro

165 170 175

Arg Ser Pro Tyr Gly Val Ala Lys Gln Phe Gly Phe Trp Met Leu Val

180 185 190

Asn Tyr Arg Glu Ala Tyr Gly Met His Leu Thr Asn Gly Ile Leu Phe

195 200 205

Asn His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Pro Thr Phe Val Thr Arg Lys Ile

210 215 220

Thr Arg Ala Val Ala Arg Ile His Arg Gly Lys Gln Lys Cys Ile Tyr

225 230 235 240

Leu Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr

245 250 255

Ile Lys Gly Met Trp Leu Met Val Gln Arg Asp Glu Pro Ser Asp Tyr

260 265 270

Val Leu Ser Thr Gly Glu Cys His Ser Val Lys Glu Phe Val Glu Glu

275 280 285

Ser Phe Lys Tyr Val Gly Thr Glu Ile Thr Trp Val Gly Glu Gly Val

290 295 300

Glu Glu Phe Gly His Val Lys Asp Glu Pro Asp Asn Ile Leu Val Arg

305 310 315 320

Val Asp Pro Arg Tyr Phe Arg Pro Thr Glu Val Glu Leu Leu Leu Gly

325 330 335

Asp Cys Thr Lys Ala Lys Asn Glu Leu Gly Trp Val Pro Glu Ile Thr

340 345 350

Phe Lys Glu Leu Val Lys Asp Met Met Lys Ser Asp Ile Ala Asn Val

355 360 365

Asp Ala Gly Asn Glu His Ala

370 375

Claims

1.一种海带中编码GDP-甘露糖-4,6-脱水酶的基因，其特征在于：所述基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种由权利要求1所述基因编码的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.如权利要求2所述的蛋白质，其特征在于：所述的蛋白质为GDP-甘露糖-4,6-脱水酶，其功能是催化GDP-甘露糖转化为GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖。

4.含有权利要求1所述基因的载体。

5.如权利要求4所述的载体，其特征在于：所述的载体为pGEX表达载体或pET表达载体。

6.含有权利要求1所述基因的基因工程细胞。

7.如权利要求6所述的基因工程细胞，其特征在于：所述的基因工程细胞为大肠杆菌细胞。

8.权利要求1所述基因在制备GDP-岩藻糖中的用途，所述的用途指将该基因导入基因工程细胞，从而使基因工程细胞能够产生GDP-岩藻糖。

9.权利要求2所述的蛋白质在制备GDP-岩藻糖中的用途。