CN107501431A

CN107501431A - 一种水溶性虎杖多糖提取物及其制备方法与用途

Info

Publication number: CN107501431A
Application number: CN201710846763.1A
Authority: CN
Inventors: 李仲昆
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-09-19
Filing date: 2017-09-19
Publication date: 2017-12-22

Abstract

本发明涉及植物多糖技术领域，是一种虎杖水溶性多糖提取及其制备方法，虎杖水溶性多糖具有良好的抗炎、镇痛、调节免疫的作用。虎杖水溶性多糖提取物按下述制备方法得到：第一步，脱脂；第二步，水提；第三步，脱蛋白；第四步，醇沉；第五步，干燥。本发明提供了一种对虎杖水溶性多糖进行提取的方法，弥补了虎杖水溶性多糖及其制备方法在植物多糖领域尚属空白的缺陷，为后期虎杖水溶性多糖的开发利用提供依据。

Description

一种水溶性虎杖多糖提取物及其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及从植物虎杖中提取得到的水溶性多糖提取物、其提取方法、含有该多糖提取物的药物组合物以及该多糖提取物或其药物组合物作为抗炎、镇痛、调节免疫方面药物的用途。

背景技术

中药虎杖为蓼科植物虎杖的根茎。多生于山谷，溪旁或岸边，为多年生灌木状草本。虎杖是常用中药，中医认为它性味苦，平，具有祛风，利湿，破淤，通经的功效。虎杖分布于江苏，浙江，江西，福建，山东，河南等中南部地区，春秋均可采挖。

对于虎杖的药理作用有许多文献报道。现代药理实验也充分证明虎杖具有扩血管、抗休克、降血脂、抗病毒、抗炎、抗菌等作用。

从虎杖中提取虎杖水不溶性提取物的生产工艺较成熟，有许多文献报道，但未见有与本发明完全相同的提取虎杖水溶性多糖的制备方法，且将其用于抗炎、镇痛、调节免疫，也未有申请或获得发明专利的报道。

发明内容

本发明提供了一种虎杖水溶性多糖提取物及其制备方法，能有效解决酸提法、碱提法、酶解法以及超声提取法在进行虎杖水溶性多糖的提取时，存在生产成本高、产品质量差和不宜进行大规模生产的问题。

本发明的虎杖水溶性多糖提取物可单独或以药物组合物形式使用，其给药方式可根据具体情况而定，可通过口服、非肠道或局部给药，给药剂型可以是例如片剂，胶囊，膏剂，贴剂，注射剂等。

本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种虎杖水溶性多糖提取物，按下述方法得到：第一步，将虎杖药材95%的乙醇提取一次或多次，收集提取液后回收乙醇，挥干虎杖中残余乙醇；第二步，将虎杖和蒸馏水按质量比1:30至1:50混合在一起后，在温度为85℃至100℃条件下水提4小时至6小时，将水提后的混合溶液进行过滤并收集滤液，将滤液浓缩至质量为虎杖质量的25倍至35倍得到浓缩液；第三步，将浓缩液和sevage试剂按体积1:1至1:2混合在一起后，在转速为120r/min至150r/min 条件下振荡30分钟至50分钟进行脱蛋白处理，振荡结束后，将混合溶液进行静置分层，静置至当层界面清晰后，弃去上层sevage 层后留下下层料液层；第四步，向料液层中按体积比1:4至1:6加入醇沉溶剂进行醇沉，醇沉至溶液中再无棕色絮状物生成即得到醇沉混合溶液，将醇沉混合溶液在转速为3000r/min至4500r/min条件下进行离心5分钟至6分钟，离心后醇沉混合溶液分层得到虎杖水溶性多糖层和醇沉溶剂层，然后进行分离收集虎杖水溶性多糖层得到虎杖水溶性多糖溶液；第五步，将虎杖水溶性多糖溶液干燥至恒重即得到虎杖水溶性多糖提取物。

下面是对上述发明技术方案的进一步优化或改进：

上述第一步中，先将虎杖粉碎至能过60目筛子至80目筛子的粉末状。

上述第三步中，sevage试剂为三氯甲烷和正丁醇按体积比3:1至5:1混合在一起的混合溶液。

上述第四步中，醇沉溶剂为无水乙醇或质量浓度为 95%的乙醇水溶液。

上述第五步中，将虎杖水溶性多糖溶液在温度为60℃条件下干燥至恒重即得到虎杖水溶性多糖提取物。

本发明相比于目前常用的植物多糖提取方法有较高的得率，同时，本发明提取虎杖水溶性多糖不需特殊设备，生产工艺成本低，安全，适合工业化大生产；并且根据本发明实施例方法提取的虎杖水溶性多糖在溶解状态下色泽澄清无杂质、为固态时呈棕黄色。

具体实施方式

本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体

的实施方式。

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例 1，该虎杖水溶性多糖提取物按下述制备方法得到：第一步，将虎杖药材95%的乙醇提取一次或多次，收集提取液后回收乙醇，挥干虎杖中残余乙醇；第二步，将虎杖和蒸馏水按质量比1:30至1:50混合在一起后，在温度为85℃至100℃条件下水提4小时至6小时，将水提后的混合溶液进行过滤并收集滤液，将滤液浓缩至质量为虎杖质量的25倍至35倍得到浓缩液；第三步，将浓缩液和sevage试剂按体积比1:1至1:2混合在一起后，在转速为120r/min至150r/min 条件下振荡30分钟至50分钟进行脱蛋白处理，振荡结束后，将混合溶液进行静置分层，静置至当层界面清晰后，弃去上层 sevage 层后留下下层料液层；第四步，向料液层中按体积比1:4至1:6加入醇沉溶剂进行醇沉，醇沉至溶液中再无棕色絮状物生成即得到醇沉混合溶液，将醇沉混合溶液在转速为3000r/min至4500r/min条件下进行离心5分钟至6分钟，离心后醇沉混合溶液分层得到虎杖水溶性多糖层和醇沉溶剂层，然后进行分离收集虎杖水溶性多糖层得到虎杖水溶性多糖溶液；第五步，将虎杖水溶性多糖溶液干燥至恒重即得到虎杖水溶性多糖提取物。

实施例 2，

与上述实施例的不同之处在于，先将虎杖粉碎至能过60目筛子至 80目筛子的粉末状。

实施例3，作为上述实施例的优选，第三步中，sevage试剂为三氯甲烷和正丁醇按体积比 3:1至 5:1混合在一起的混合溶液。

实施例4，作为上述实施例的优选，第四步中，醇沉溶剂为无水乙醇或质量浓度为95%的乙醇水溶液。

实施例 5，作为上述实施例的优选，第五步中，将虎杖水溶性多糖溶液在温度为60℃条件下干燥至恒重即得到虎杖水溶性多糖提取物。

本发明为水提醇沉法，相比于目前提取植物多糖常用的酸提法、碱提法、酶解法以及超声提取法，根据本发明实施例方法提取的虎杖水溶性多糖的得率平均为 1.67%，而采用现有常用的植物多糖提取方法进行提取的虎杖水溶性多糖的得率平均值为 0.79%；同时，本发明的水提醇沉法提取在提取虎杖水溶性多糖时不需特殊设备，生产工艺成本低，安全，适合工业化大生产；并且根据本发明实施例方法提取的虎杖水溶性多糖在溶解状态下色泽澄清无杂质、为固态时呈棕黄色。

实施例6，虎杖水溶性多糖提取物的定性鉴别

按照如下方法，定性鉴别本发明的虎杖水溶性多糖提取物。

(1)α- 萘酚反应 (Molish 反应 )

虎杖水溶性多糖提取物以适量水溶解，加 10％ α- 萘酚乙醇溶液三滴，然后沿试管壁

缓缓加入浓硫酸，使形成上下两层，稍后在两层界面处可见紫色环，表示有多糖存在。

(2) 纤维素薄层层析

取虎杖水溶性多糖提取物，经三氟乙酸水解后，与标准单糖共薄层，以吡啶∶乙酸乙酯∶乙酸∶水 (5 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 3) 系统展开，以苯胺 - 邻苯二甲酸显色剂显色，提取物水解液中含多种单糖，表示有多糖存在。

实施例,7，虎杖水溶性多糖提取物的免疫调节作用的实验研究：

1 虎杖水溶性多糖对小鼠溶血素的升高作用

1.1 模型制备：雄性ICR小鼠36只，将小鼠随机分为三组: 第一组为环磷酰胺模型组(Model)，第二组为虎杖水溶性多糖组（A），第三组为空白对照组（Control）。。实验开始后，鸡红细胞模型组、环磷酰胺组每天灌服蒸馏水0.3mL。虎杖水溶性多糖组灌服虎杖水溶性多糖，共给药7天，剂量为0.5 g.kg^-1。虎杖水溶性多糖组、环磷酰胺组、鸡红细胞模型组第1天腹腔注射5%CRBC悬液0.4mL，虎杖组、环磷酰胺组在第2天按照环磷酰胺100mg.kg^-1进行腹腔注射。第8天按照1.2项下进行测定。

1.2 血清溶血素测定给药后第8天小鼠取血加入1.5 mL离心管中,放置1小时，离心后取血清,用0.9%氯化钠稀释200倍,取稀释血清2.0mL、10%补体血清1.0mL 、5%鸡红细胞混悬液1.0mL，混合，放置于37℃恒温箱中孵育30min,然后在0℃冰箱中放置30 min终止反应，3000r.min^-1离心,取上清液，用紫外分光光度计在540nm处，测吸光度OD值。用不加血清的空白对照管上清液作对照比色。

2 虎杖水溶性多糖对免疫低下小鼠IL-2、IFN-γ的影响

2.1模型制备：雄性ICR小鼠36只，将小鼠随机分为三组: 第一组为环磷酰胺模型组(Model)，第二组为虎杖水溶性多糖组（A），第三组为空白对照组（Control）。虎杖水溶性多糖组灌服虎杖水溶性多糖，共给药7天，给药剂量为1.0 g.kg^-1。环磷酰胺模型组、空白对照组每天灌服蒸馏水0.3mL。除空白对照组，虎杖组、环磷酰胺模型组在第2天腹腔注射环磷酰胺100mg.kg^-1。各组第8天取血。

2.2测定：取血清按照IFN-γ、 IL-2试剂盒提供的说明书操作，用酶标仪测定IFN-γ、IL-2的含量。

3结果

3.1 虎杖水溶性多糖对小鼠溶血素的影响：虎杖水溶性多糖可提高环磷酰胺小鼠血清溶血素的含量，与环磷酰胺组比有显著差异。见表1。

表1 溶血素试验结果

Group n OD

Control 12 1.986±0.367﹡﹡

Model 12 1.132±0.134

A 12 1.421±0.116﹡

注：与Model组相比，﹡P＜0.05,﹡﹡P＜0.01

3.2 虎杖水溶性多糖对小鼠IFN-γ、IL-2的影响：虎杖水溶性多糖可增加小鼠血清IFN-γ、IL-2的含量。与环磷酰胺模型组比较有显著差异。结果见表2。

表2 对IL-2、IFN-γ的影响

Group n IFN-γ IL-2

pg.L^-1 pg.L^-1

Control 12 1054.21 ±37.56﹡﹡ 567.22±37.55﹡﹡

Model 12 973.63±90.24 426.54±79.47

A 12 1003.11±54.32﹡﹡ 521.36±38.49﹡﹡

注：与Model组相比，﹡P＜0.05,﹡﹡P＜0.01

实施例8，虎杖水溶性多糖提取物的抗炎、镇痛实验研究：

1 二甲苯致小鼠耳肿胀的抗炎试验

阳性对照药物为阿司匹林，阴性对照为蒸馏水。取ICR小鼠30只(雌雄各半)，随机分为3组，每组10只。按表1剂量灌胃给药，连续给药7天。末次给药30min后用二甲苯0.1ml均匀的涂布于各小鼠右耳的正反面，再过1小时后断颈处死，用6mm打孔器在小鼠两耳的同一部位扎下左右耳片，精密称重。以右耳的重量减去左耳的重量作为耳廓炎性肿胀度，求出肿胀抑制率，用t检验比较组间差异。

2 虎杖水溶性多糖提取物对小鼠的镇痛作用

ICR小鼠30只,体重(18-22) g，雌雄兼有，随机分组，每组10只，按表2剂量灌胃给药，各组口服给药3天后，各鼠均腹腔注射1%醋酸0.2ml/只。观察15分钟内各组出现扭体反应次数（腹部内凹、伸展后肢、臀部抬高），观察镇痛作用。

3 结果

3.1 二甲苯所致小鼠耳肿胀实验结果: 虎杖水溶性多糖提取物对小鼠的急性耳廓肿胀有一定的抑制作用，结果见表3。

表3 小鼠耳廓炎症肿胀度

分组数量（只）剂量（g·kg^-1）耳廓炎症肿胀度（mg）

空白组 10 -- 9.5±2.3

阿司匹林组 10 0.2 6.2±1.9

虎杖水溶性多糖提取物组 10 1.0 6.6±2.1

3.2 镇痛作用结果：虎杖水溶性多糖提取物有一定的镇痛作用，结果见表4。

表4 小鼠扭体次数

分组数量（只）剂量（g·kg^-1）扭体次数

空白组 10 -- 19.3±5.9

阿司匹林组 10 0.2 6.7±3.1

虎杖水溶性多糖提取物组 10 1.0 11.2±5.5

Claims

1.一种虎杖水溶性多糖提取物，其特征在于按下述方法得到：第一步，将虎杖药材95%的乙醇提取一次或多次，收集提取液后回收乙醇，挥干虎杖中残余乙醇；第二步，将虎杖和蒸馏水按质量比1:30至1:50混合在一起后，在温度为85℃至100℃条件下水提4小时至6小时，将水提后的混合溶液进行过滤并收集滤液，将滤液浓缩至质量为虎杖质量的25倍至35倍得到浓缩液；第三步，将浓缩液和sevage试剂按体积比1:1至1:2混合在一起后，在转速为120r/min至150r/min 条件下振荡30分钟至50分钟进行脱蛋白处理，振荡结束后，将混合溶液进行静置分层，静置至当层界面清晰后，弃去上层 sevage层后留下下层料液层；第四步，向料液层中按体积比1:4至1:6加入醇沉溶剂进行醇沉，醇沉至溶液中再无棕色絮状物生成即得到醇沉混合溶液，将醇沉混合溶液在转速为3000r/min至4500r/min条件下进行离心5分钟至6分钟，离心后醇沉混合溶液分层得到虎杖水溶性多糖层和醇沉溶剂层，然后进行分离收集虎杖水溶性多糖层得到虎杖水溶性多糖溶液；第五步，将虎杖水溶性多糖溶液干燥至恒重即得到虎杖水溶性多糖提取物。

2.根据权利要求1所述的虎杖水溶性多糖提取物，其特征在于第一步中，先将虎杖粉碎至能过60目筛子至80目筛子的粉末状。

3.根据权利1所述的虎杖水溶性多糖提取物，其特征在于第三步中，sevage试剂为三氯甲烷和正丁醇按体积比3:1至5:1混合在一起的混合溶液。

4.根据权利要求1所述的虎杖水溶性多糖提取物，其特征在第四步中，醇沉溶剂为无水乙醇或质量浓度为 95% 的乙醇水溶液。

5.根据权利要求1所述的虎杖水溶性多糖提取物，其特征在于第五步中，将虎杖水溶性多糖溶液在温度为60℃条件下干燥至恒重即得到虎杖水溶性多糖提取物。

6.根据权利要求1所述的虎杖水溶性多糖提取物在制备用于抗炎、镇痛、调节免疫方面的药物中的用途。