CN107556398A - 一种水龙骨多糖提取物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物多糖技术领域，是一种水龙骨多糖提取及其制备方法，水龙骨多糖具有良好的抗炎、镇痛、调节免疫的作用。该水龙骨多糖提取物按下述制备方法得到：第一步，脱脂；第二步，水提；第三步，脱蛋白；第四步，醇沉；第五步，干燥。本发明提供了一种对水龙骨的多糖进行提取的方法，弥补了水龙骨多糖及其制备方法在植物多糖领域尚属空白的缺陷，为后期水龙骨多糖的开发利用提供依据。

Description

一种水龙骨多糖提取物及其制备方法

技术领域

本发明涉及从植物水龙骨中提取得到的多糖提取物、其提取方法、含有该多糖提取物的药物组合物以及该多糖提取物或其药物组合物作为抗炎、镇痛、调节免疫方面药物的用途。

背景技术

水龙骨为多年生附生草本。根状茎肉质，细棒状，横走弯曲分歧，鲜时青绿色，干后变为黑褐色，表面光滑或被鳞片，并常被白粉;鳞片通常疏生在叶柄基部或根状茎的幼嫩部，易脱落，深褐色，卵状披针形而先端狭长，网脉较粗而显著，网眼透明。叶疏生，直立;叶柄长3~8厘米，鲜时带绿色，干后变为淡褐色，表面光滑无毛，但散有褐色细点，基部呈关节状;叶片羽状深裂，羽片14~24对，线状矩圆形至线状披针形，先端钝形或短尖，全缘，基部一对羽片通常较短而稍下向，纸质，两面密被褐色短绒毛，叶脉除中肋及主脉外不明显。孢子囊群圆形，位于主脉附近，无囊群盖，孢子囊多数，金黄色。生于阴湿岩石上或树干上。分布浙江、安徽、江西、湖南、湖北、陕西、四川、贵州、等地，药用部分为水龙骨科植物水龙骨的根茎，功用为化湿，清热，祛风，通络，治痧秽泄泻，痢疾，淋病白浊，风痹，腰痛，火眼，疮肿。

根据文献调研结果，目前尚无水龙骨植物中多糖类化学成分的研究报道，更未见有关于其多糖抗炎、镇痛、调节免疫的研究报道。

发明内容

本发明提供了一种水龙骨多糖提取物及其制备方法，能有效解决酸提法、碱提法、酶解法以及超声提取法在进行水龙骨多糖的提取时，存在生产成本高、产品质量差和不宜进行大规模生产的问题。

本发明的水龙骨多糖提取物可单独或以药物组合物形式使用，其给药方式可根据具体情况而定，可通过口服、非肠道或局部给药，给药剂型可以是例如片剂，胶囊，膏剂，贴剂，注射剂等。

本发明的技术方案是通过以下措施来实现的 ：一种水龙骨多糖提取物，按下述方法得到 ：第一步，将水龙骨药材95%的乙醇提取一次或多次，收集提取液后回收乙醇，挥干水龙骨中残余乙醇；第二步，将水龙骨和蒸馏水按质量比1:30至1:50混合在一起后，在温度为85℃至100℃条件下水提4小时至6小时，将水提后的混合溶液进行过滤并收集滤液，将滤液浓缩至质量为水龙骨质量的25倍至35倍得到浓缩液；第三步，将浓缩液和sevage试剂按体积1:1至1:2混合在一起后，在转速为120r/min至150r/min 条件下振荡30分钟至50分钟进行脱蛋白处理，振荡结束后，将混合溶液进行静置分层，静置至当层界面清晰后，弃去上层 sevage 层后留下下层料液层；第四步，向料液层中按体积比1:4至1:6加入醇沉溶剂进行醇沉，醇沉至溶液中再无棕色絮状物生成即得到醇沉混合溶液，将醇沉混合溶液在转速为3000r/min至4500r/min条件下进行离心5分钟至6分钟，离心后醇沉混合溶液分层得到水龙骨多糖层和醇沉溶剂层，然后进行分离收集水龙骨多糖层得到水龙骨多糖溶液；第五步，将水龙骨多糖溶液在干燥至恒重即得到水龙骨多糖提取物。

下面是对上述发明技术方案的进一步优化或改进 ：

上述第一步中，先将水龙骨粉碎至能过60目筛子至80目筛子的粉末状。

上述第三步中，sevage试剂为三氯甲烷和正丁醇按体积比3:1至5:1混合在一起的混合溶液。

上述第四步中，醇沉溶剂为无水乙醇或质量浓度为 95%的乙醇水溶液。

上述第五步中，将水龙骨多糖溶液在温度为60℃条件下干燥至恒重即得到水龙骨多糖提取物。

本发明相比于目前常用的植物多糖提取方法有较高的得率，同时，本发明提取水龙骨多糖不需特殊设备，生产工艺成本低，安全，适合工业化大生产 ；并且根据本发明实施例方法提取的水龙骨多糖在溶解状态下色泽澄清无杂质、为固态时呈棕黄色。

具体实施方式

本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体

的实施方式。

下面结合实施例对本发明作进一步描述 ：

实施例 1，该水龙骨多糖提取物按下述制备方法得到 ：第一步，将水龙骨药材95%的乙醇提取一次或多次，收集提取液后回收乙醇，挥干水龙骨中残余乙醇；第二步，将水龙骨和蒸馏水按质量比1:30至1:50混合在一起后，在温度为85℃至100℃条件下水提4小时至6小时，将水提后的混合溶液进行过滤并收集滤液，将滤液浓缩至质量为水龙骨质量的25倍至35倍得到浓缩液；第三步，将浓缩液和sevage试剂按体积比1:1至1:2混合在一起后，在转速为120r/min至150r/min 条件下振荡30分钟至50分钟进行脱蛋白处理，振荡结束后，将混合溶液进行静置分层，静置至当层界面清晰后，弃去上层 sevage 层后留下下层料液层；第四步，向料液层中按体积比1:4至1:6加入醇沉溶剂进行醇沉，醇沉至溶液中再无棕色絮状物生成即得到醇沉混合溶液，将醇沉混合溶液在转速为3000r/min至4500r/min条件下进行离心5分钟至6分钟，离心后醇沉混合溶液分层得到水龙骨多糖层和醇沉溶剂层，然后进行分离收集水龙骨多糖层得到水龙骨多糖溶液；第五步，将水龙骨多糖溶液在干燥至恒重即得到水龙骨多糖提取物。

实施例 2，与上述实施例的不同之处在于，先将水龙骨粉碎至能过60目筛子至 80目筛子的粉末状。

实施例3，作为上述实施例的优选，第三步中，sevage试剂为三氯甲烷和正丁醇按体积比 3:1至 5:1混合在一起的混合溶液。

实施例4，作为上述实施例的优选，第四步中，醇沉溶剂为无水乙醇或质量浓度为95%的乙醇水溶液。

实施例 5，作为上述实施例的优选，第五步中，将水龙骨多糖溶液在温度为 60℃条件下干燥至恒重即得到水龙骨多糖提取物。

本发明为水提醇沉法，相比于目前提取植物多糖常用的酸提法、碱提法、酶解法以及超声提取法，根据本发明实施例方法提取的水龙骨多糖的得率平均为 1.67%，而采用现有常用的植物多糖提取方法进行提取的水龙骨多糖的得率平均值为 0.79%；同时，本发明的水提醇沉法提取在提取水龙骨多糖时不需特殊设备，生产工艺成本低，安全，适合工业化大生产 ；并且根据本发明实施例方法提取的水龙骨多糖在溶解状态下色泽澄清无杂质、为固态时呈棕黄色。

实施例6，水龙骨多糖提取物的定性鉴别

按照如下方法，定性鉴别本发明的水龙骨多糖提取物。

(1)α- 萘酚反应 (Molish 反应 )

水龙骨多糖提取物以适量水溶解，加 10％ α- 萘酚乙醇溶液三滴，然后沿试管壁

缓缓加入浓硫酸，使形成上下两层，稍后在两层界面处可见紫色环，表示有多糖存在。

(2) 纤维素薄层层析

取水龙骨多糖提取物，经三氟乙酸水解后，与标准单糖共薄层，以吡啶∶乙酸乙酯∶乙酸∶水 (5 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 3) 系统展开，以苯胺 - 邻苯二甲酸显色剂显色，提取物水解液中含多种单糖，表示有多糖存在。

实施例,7，水龙骨多糖提取物的免疫调节作用的实验研究 ：

1 水龙骨对小鼠溶血素的升高作用

1.1 模型制备：雄性ICR小鼠36只，将小鼠随机分为三组:一组为鸡红细胞模型组，一组为水龙骨组，一组为环磷酰胺组。实验开始后，鸡红细胞模型组、环磷酰胺组每天灌服蒸馏水0.3mL。水龙骨组灌服水龙骨，共给药7天，剂量为0.5 g.kg^-1。水龙骨组、环磷酰胺组、鸡红细胞模型组第1天腹腔注射5%CRBC悬液0.4mL，水龙骨组、环磷酰胺组在第2天按照环磷酰胺100mg.kg^-1进行腹腔注射。第8天按照1.2项下进行测定。

1.2 血清溶血素测定 给药后第8天小鼠取血加入1.5 mL离心管中,放置1小时，离心后取血清,用0.9%氯化钠稀释200倍,取稀释血清2.0mL、10%补体血清1.0mL 、5%鸡红细胞混悬液1.0mL，混合， 放置于37℃恒温箱中孵育30min,然后在0℃冰箱中放置30 min终止反应，3000r.min^-1离心,取上清液，用紫外分光光度计在540nm处，测吸光度OD值。用不加血清的空白对照管上清液作对照比色。

2 水龙骨对免疫低下小鼠IL-2、IFN-γ的影响

2.1模型制备：雄性ICR小鼠36只，将小鼠随机分为三组: 一组为环磷酰胺模型组，一组为水龙骨组，一组为空白对照组。水龙骨组灌服水龙骨，共给药7天，给药剂量为1.0 g.kg^-1。环磷酰胺模型组、空白对照组每天灌服蒸馏水0.3mL。除空白对照组，水龙骨组、环磷酰胺模型组在第2天腹腔注射环磷酰胺100mg.kg^-1。各组第8天取血。

2.2测定：取血清按照IFN-γ、 IL-2试剂盒提供的说明书操作，用酶标仪测定IFN-γ、IL-2的含量。

3结果

3.1 水龙骨对小鼠溶血素的影响：水龙骨可提高环磷酰胺小鼠血清溶血素的含量，与环磷酰胺组比有显著差异。见表1。

表1 溶血素试验结果

分组 n OD

空白组 12 1.768±0.324﹡﹡

模型组 12 0.985±0.113

水龙骨组 12 1.234±0.131﹡

注：与模型组相比，﹡P＜0.05,﹡﹡P＜0.01

3.2 水龙骨对小鼠IFN-γ、IL-2的影响：水龙骨可增加小鼠血清IFN-γ、IL-2的含量。与环磷酰胺模型组比较有显著差异。结果见表2。

表2 对IL-2、IFN-γ的影响

分组 n IFN-γ IL-2

pg.L^-1 pg.L^-1

空白组 12 1045.03 ±34.12﹡﹡ 551.32±35.21﹡﹡

模型组 12 951.12±85.65 415.26±83.12

水龙骨组 12 1006.25±45.12﹡﹡ 531.65±32.51﹡﹡

注：与模型组相比，﹡P＜0.05,﹡﹡P＜0.01

实施例8，水龙骨多糖提取物的抗炎、镇痛实验研究 ：

1 二甲苯致小鼠耳肿胀的抗炎试验

阳性对照药物为阿司匹林，阴性对照为蒸馏水。取ICR小鼠30只(雌雄各半)，随机分为5组，每组10只。按表1剂量灌胃给药，连续给药7天。末次给药30min后用二甲苯0.1ml均匀的涂布于各小鼠右耳的正反面，再过1小时后断颈处死，用6mm打孔器在小鼠两耳的同一部位扎下左右耳片，精密称重。以右耳的重量减去左耳的重量作为耳廓炎性肿胀度，求出肿胀抑制率，用t检验比较组间差异。

2 水龙骨多糖提取物对小鼠的镇痛作用

ICR小鼠,体重(18-22) g，雌雄兼有，随机分组，每组10只，按表2剂量灌胃给药，各组口服给药3天后，各鼠均腹腔注射1%醋酸0.2ml/只。观察15分钟内各组出现扭体反应次数（腹部内凹、伸展后肢、臀部抬高），观察镇痛作用。

3 结果

3.1 二甲苯所致小鼠耳肿胀实验结果: 水龙骨多糖提取物对小鼠的急性耳廓肿胀有一定的抑制作用，结果见表3。

表3 小鼠耳廓炎症肿胀度

分组 数量（只） 剂量（g·kg^-1） 耳廓炎症肿胀度（mg）

空白组 10 -- 9.3±2.1

阿司匹林组 10 0.2 5.9±1.7

水龙骨组 10 1.0 6.5±1.7

3.2 镇痛作用结果：水龙骨多糖提取物有一定的镇痛作用，结果见表4。

表4 小鼠扭体次数

分组 数量（只） 剂量（g·kg^-1） 扭体次数

空白组 10 -- 18.1±5.6

阿司匹林组 10 0.2 6.5±3.7

水龙骨组 10 1.0 10.7±6.1

Claims (6)

1.一种水龙骨多糖提取物，其特征在于按下述方法得到：第一步，将水龙骨药材95%的乙醇提取一次或多次，收集提取液后回收乙醇，挥干水龙骨中残余乙醇；第二步，将水龙骨和蒸馏水按质量比1:30至1:50混合在一起后，在温度为85℃至100℃条件下水提4小时至6小时，将水提后的混合溶液进行过滤并收集滤液，将滤液浓缩至质量为水龙骨质量的25倍至35倍得到浓缩液；第三步，将浓缩液和sevage试剂按体积比1:1至1:2混合在一起后，在转速为120r/min至150r/min 条件下振荡30分钟至50分钟进行脱蛋白处理，振荡结束后，将混合溶液进行静置分层，静置至当层界面清晰后，弃去上层 sevage层后留下下层料液层；第四步，向料液层中按体积比1:4至1:6加入醇沉溶剂进行醇沉，醇沉至溶液中再无棕色絮状物生成即得到醇沉混合溶液，将醇沉混合溶液在转速为3000r/min至4500r/min条件下进行离心5分钟至6分钟，离心后醇沉混合溶液分层得到水龙骨多糖层和醇沉溶剂层，然后进行分离收集水龙骨多糖层得到水龙骨多糖溶液；第五步，将水龙骨多糖溶液在干燥至恒重即得到水龙骨多糖提取物。

2.根据权利要求1所述的水龙骨多糖提取物，其特征在于第一步中，先将水龙骨粉碎至能过60目筛子至80目筛子的粉末状。

3.根据权利1所述的水龙骨多糖提取物，其特征在于第三步中，sevage试剂为三氯甲烷和正丁醇按体积比3:1至5:1混合在一起的混合溶液。

4.根据权利要求1所述的水龙骨多糖提取物，其特征在第四步中，醇沉溶剂为无水乙醇或质量浓度为 95% 的乙醇水溶液。

5.根据权利要求1所述的水龙骨多糖提取物，其特征在于第五步中，将水龙骨多糖溶液在温度为60℃条件下干燥至恒重即得到水龙骨多糖提取物。

6.根据权利要求1所述的水龙骨多糖提取物在制备用于抗炎、镇痛、调节免疫方面的药物中的用途。