CN107496985A - 一种制备骨诱导成骨制剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种制备骨诱导成骨制剂的方法，该方法包括如下步骤：1.对人牙基质进行脱钙处理；2.然后再经过脱钙处理的牙基质中添加外源活性蛋白BMP，即骨形态发生蛋白，从而形成诱导成骨制剂。

Description

一种制备骨诱导成骨制剂的方法
技术领域
本发明涉及一种修复骨损伤的制剂，特别的，尤其涉及一种一种诱导骨生成，促进骨组织形成或者修复骨损伤的制剂以及方法。
背景技术
骨诱导成骨技术是目前外科整复和牙周重建常用的一种技术，主要利用骨诱导因子激活骨增长和生产功能产生新骨。骨诱导因子较多，现研究主要集中于骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein。BMP)家族蛋白研究，骨形态发生蛋白属低分子糖蛋白类，现已发现了骨形态发生蛋白l-14多种蛋白成分，其中骨形态发生蛋白2的骨诱导活性最强，其它骨形态发生蛋白成分对骨形态发生蛋白2有协同作用，共同参与诱导成骨过程。有学者认为骨形态发生蛋白是转化生长因子13(TGF一13)超家族的一种，它具有明显的骨再生和骨整合能力，能够诱导软骨和骨形成，并且能够诱导血管周围的间充质细胞转化为骨干细胞，它与细胞外基质大分子相互作用形成的骨形态发生蛋白是调节骨形成作用的基础。骨形态发生蛋白广泛存在于哺乳动物的骨基质和牙基质中，是一种无种属特异性的，属局部生长因子的酸性糖蛋白，但骨中骨形态发生蛋白随年龄的增大而逐渐减少，而牙基质中的骨形态发生蛋白未见减少。还有研究显示脱钙牙基质(demineralized dental matrix，DDM)中骨形态发生蛋白的粗提物是同质量脱钙骨基质(demineralized bone matrix，DBM)中的10倍，相应地脱钙牙基质在肌肉中诱导成骨量应为同质量脱钙骨基质的10倍。但是，单纯的骨形态发生蛋白在体内扩散太快，也易被蛋白酶分解，因而不能在有效的时间内作用于更多的靶细胞，其诱导活性难以得到充分的发挥；骨形态发生蛋白的纯化制取比较困难，成本较高，难以在临床广泛推广使用；有研究发现纯化高的骨形态发生蛋白并不能取得较高的生物诱导活性，只有与相应骨基质联合使用，才能有效诱导成骨，这是因为胶原和基质可能影响了羟基磷灰石晶体中的钙和磷酸盐根离子，有机物也可能扮演了一个结晶化的中心。关于骨形态发生蛋白的载体研究虽有许多报道，如采用羟基磷灰石、磷酸盐三钙、聚酯、胶原、脱矿骨基质、氧化钛、血块等载体，但是骨形态发生蛋白与载体间的结合方式、复合方法、复合比例，仍未有统一的结论。因此，当前研究的方向转为复合性骨诱导材料的研制。
研究认为脱钙牙基质(demineralized dentin matrix，DDM)是一种富含骨形态发生蛋白、胶原及其它蛋白多糖的复合物，是一种新型的具有骨诱导作用的人类同源性的生物活性材料，它富含多种骨诱导蛋白及其载体的复合物，形成了一种骨形态发生蛋白的天然缓慢释放系统。例如中国发明专利95112416.1；或者中国发明专利申请，申请号201310602830.7；申请号201310602878.8中介绍了通过处理牙齿获得这些可以促进骨头伤口愈合或者再生的材料。另外，也在牙基质中添加一些成分，进而改进牙基质的效果，例如中国发明专利申请，申请号201510089391.3和申请号201110129457.9中的描述。
当然，还有采用体外表达BMP蛋白然后和骨骼粉末或者其他粉末混合，这种方法制备的修复材料，实际效果并不理想，主要是BMP蛋白在体外容易失去活性，和这些粉末混合后，被施加到损伤的骨骼中，容易被酶降解也失去活性。因此只有在体内保持BMP的活性，才能更好的达到促进骨组织的生长。
以上描述的方法，虽然对骨头损伤的修复具有一定的效果，但是仍然存在很多固有的缺陷，主要体现在以下几点：(1)牙齿作为活性BMP的来源有限，不能满足日益增长的市场需要，毕竟光靠牙基质作为原料，限制了行业的发展；(2)对牙齿、骨骼进行粉碎处理后，通常在酸性溶液进行脱钙，获得含有活性蛋白BMP的粉末，但酸碱等处理虽然可以释放钙离子，暴露BMP蛋白，同时也对BMP的蛋白具有极大的损伤，因为BMP容易在酸性条件下变性而失去活性；这样就降低了BMP蛋白的利用效率。
因此，有必要对现行方法进行改进，或者采用新的方法获得骨修复材料。
发明内容
一方面，本发明提供一种制备骨诱导成骨制剂的方法，该方法包括如下步骤：1.对牙基质进行脱钙处理；2.然后再向经过脱钙处理的牙基质中添加外源活性蛋白BMP，即骨形态发生蛋白，从而形成诱导成骨制剂。
另一方面，本发明提供一种制备骨诱导成骨制剂的方法，该方法包括如下步骤：1.对2份牙基质进行脱钙处理；2.然后再对经过脱钙处理的2份牙基质进行去除骨形态发生蛋白处理；3.最后让提取的骨形态发生蛋白与其中的1份脱钙处理的牙基质进行混合，从而形成诱导成骨制剂。
另一方面，本发明提供一种制备骨诱导成骨制剂的方法，该方法包括如下步骤：1.对外源骨基质进行脱钙处理；2.然后再对经过脱钙处理的骨基质进行去除蛋白处理；3.让外源骨形态发生蛋白与经过步骤2处理的骨基质进行混合，让外源蛋白与骨基质形成诱导成骨制剂。
在一些优选的实施方式中，对一种脱钙人牙齿进行脱钙处理的方法包括如下步骤：(1)、用机械方法将牙组织粉碎成颗粒剂或者冻干粉；(2)、将牙组织颗粒剂或者冻干粉置于到0.65-0.72当量盐酸液浸泡，在36摄氏度下浸泡12小时完成脱钙；(3)、脱钙后产品低温干燥获得冻干粉末。
优选的，冻干粉末在摄氏35度3％的双氧水中浸泡30分钟即得到脱钙人牙基质。
优选的，所述的人牙基质冻干粉末或者颗粒，在摄氏温度5℃的条件下置于70％酒精液中贮存备用。
优选的，脱钙后产品为人牙基质颗粒置于酒精液中贮存备用。其中，酒精的浓度为任意浓度下的酒精溶液，例如70％，60％，50％，75％，78％，80％，85％或者95％。
在优选的方式中，先将牙用50％的消毒液(例如含有有效成分1.2％的次氯酸钠)浸泡消毒原料牙，浸泡消毒时间为45分钟、温度为摄氏36度；用机械方法去除牙体上无使用价值的部分；用1.2次氯酸钠浸泡消毒粉碎成颗粒剂或者冻干粉的牙组织，浸泡消毒时间为45分钟、温度为摄氏36度。然后在进行牙齿的粉碎处理。
这里的牙可以是人的牙齿，也可是任何哺乳动物的牙齿。优选的为人牙。
在一些优选的方式中，对已经经过脱钙处理的牙齿基质添加外源BMP蛋白，添加外源蛋白的方法如下：首先让脱钙的牙基质粉末悬浮在PH＝6.0-7.5的磷酸盐缓冲液中(100克配置1升缓冲液)，然后把外源BMP用相同PH＝6.0-7.5的磷酸盐缓冲液溶解(浓度为1.0M每升)，然后两者混合在一起，放到搅拌机器上进行匀速缓慢搅拌，搅拌的速率为12-120转/分钟，同时在室温下进行搅拌12-24小时，在搅拌的时候，每隔3小时测量一次混合溶液中BMP蛋白的浓度，直到浓度下降到初始BMP浓度的20％－35％(0.2-0.35M/L)以下停止搅拌，然后离心，去掉上清液体，剩下的粉末进行过滤，然后经过低温干燥得到人牙基质，在摄氏温度5℃的条件下置于70％酒精液中贮存备用。
在一些优选的方式中，对2份人牙基质进行脱钙处理，然后对脱钙处理的基质进行蛋白的提取，然后让提取的BMP蛋白与其中的一份人牙基质进行混合处理。处理方法为：首先让经过脱钙，脱蛋白(BMP活性蛋白和或者其他杂蛋白)提取的牙基质粉末悬浮在PH＝7.0的磷酸盐缓冲液中(120克配置1升缓冲液)，然后把外源BMP(从2份基质中提取的BMP蛋白)用磷酸盐缓冲液(PH＝7.0)溶解，然后两者混合在一起，放到搅拌机器上进行匀速缓慢搅拌，搅拌的速率为为15-120转/分钟，同时在室温下进行搅拌12-24小时，在搅拌的时候，每隔3小时测量一次混合溶液的BMP蛋白的浓度，直到浓度下降到初始BMP浓度的20％－35％以下停止搅拌，然后离心，去掉上清液体，剩下的粉末进行过滤，然后低温干燥得到人牙基质。优选的，在摄氏温度5℃的条件下置于酒精液中贮存备用.
在一些优选的方式中，对新鲜的外源骨骼(人骨或者哺乳动物的骨头)(这里的人骨主要是医生从患者身体上取下的人体骨骼或者捐献的新鲜的人体骨骼)进行脱钙处理，脱钙处理的方法如下：用机械方法将骨骼组织粉碎成颗粒剂或者冻干粉；(2)、将骨骼制成的颗粒剂或者冻干粉置于到0.65-0.72当量的盐酸液中浸泡，在36摄氏度下浸泡24-48小时完成脱钙；(3)脱钙后产品低温干燥获得脱钙的骨骼粉末或者颗粒。再用35摄氏度3％的双氧水浸泡30分钟即得到脱钙基质；或者，所述的基质，在摄氏温度5℃的条件下置于酒精液中贮存备用。优选的，脱钙后产品为人牙基质颗粒置于酒精液中贮存备用。其中，酒精的浓度为任意浓度下的酒精溶液，例如70％，60％，50％，75％，78％，80％，85％或者95％。
然后对脱钙的骨骼粉末进行脱蛋白的处理，脱蛋白的处理过程如下：脱钙后的骨骼粉末加适量水，在水浴锅内加热处理56-72小时，温度为35-40摄氏度，然后进行离心，去掉上清液体，对上清液体进行BMP蛋白的提取、浓缩和杂蛋白的去除。或者，骨骼粉末加入胰酶或者木瓜酶缓冲溶液中，在温度为37-40摄氏度下处理3-4天以上，然后进行离心去上清液体，从而通过酶处理让蛋白分解，保留离心后的沉淀，从而提供脱蛋白的骨骼粉末。
优选的，让脱钙和脱蛋白处理的骨骼粉末与外源BMP蛋白混合处理，处理的步骤如下：首先让脱钙后经过BMP蛋白提取的骨骼粉末悬浮在PH＝7.0的磷酸盐缓冲液中(120克每升，然后把外源BMP用磷酸盐缓冲液溶解(1.2M每升)，然后两者混合在一起，放到搅拌机器上进行匀速缓慢搅拌，搅拌的速率为为30-80转/分钟，同时在室温下或者25-30摄氏度下进行搅拌12-24小时，在搅拌的时候，每隔3小时测量一次混合溶液的BMP蛋白的浓度，直到浓度下降到初始BMP浓度的20％－25％(0.24-0.25M/L)以下停止搅拌，然后通过离心，去掉上清液体，剩下的粉末进行过滤，然后经过低温干燥得到基质。优选的，在摄氏温度5℃的条件下置于70％酒精液中贮存备用。
优选的，外源BMP蛋白为BMP-2、BMP-4和BMP-7(上海麦仓生物技术有限公司)。优选的，外源BMP蛋白为BMP-2。或者，优选的，其中，所述的外源BMP蛋白为BMP-2、BMP-1、BMP-3BMP-4、BMP-5、BMP-6或BMP-7中的一种或者几种。这些商用的BMP活性蛋白都可以通过商用的途径购买得到。
这里的粉末或者制剂都为冻干粉末或者其它形式的制剂。这里的制剂与试剂、成分或者物质为等同的意思。
有益效果
经过本发明提供的促进骨骼组织生长或者修复的制剂和常规人牙基质的效果相当，有的还好于现有的人牙基质，从而提供一些可以替代的产品，降低产品的成本，满足日益增长的市场需要。
附图说明
图1为实施例子1-3和对照CK对成骨细胞增殖的影响比较结果图。
图2为实施例子1,4,5和对照CK对成骨细胞增殖的影响比较结果图。
图3为实施例子1-3和对照CK对MC-3T3细胞ALP活性影响比较试验结果图。
图4为实施例子1，4和5与对照CK对MC-3T3细胞ALP活性影响比较试验结果图。
具体实施方式
实施例子1：人牙基质进行脱钙处理添加外源BMP蛋白。
1.人牙基质进行脱钙处理的步骤如下：
(1)、将收集的人牙置于清水容器内，在5摄氏度以下条件储存；
(2)、用1.2％次氯酸钠浸泡消毒原料牙，时间为55分钟、温度为30摄氏度(或者其它问题，例如35、30、,38、40摄氏度)；
(3)、去除牙体上无使用价值的部分；
(4)、用机械方法将牙组织粉碎成颗粒剂或者冻干粉，平均粒径为0.25毫米(例如可以为0.2、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0、1.2毫米)；
(5)、再用1.2％次氯酸钠浸泡消毒粉碎成颗粒剂或者冻干粉的牙组织，浸泡消毒时间为45分钟，温度为摄氏35-40度；
(6)、将牙组织颗粒剂或者冻干粉置于到0.65(或者0.67、0.68、0.67、0.72)当量盐酸液浸泡，在38摄氏度下浸泡16小时完成脱钙；
(7)、低温干燥，再用35摄氏度3％的双氧水浸泡30分钟。经过检测，经过该方法脱钙处理的牙基质颗粒剂或者冻干粉细小均匀，形态一致，呈圆棒状，长度约为100-200nm，直径约为50-lOOnm。
2，外源BMP蛋白的添加。
a、对步骤(7)已经经过脱钙牙基质处理的牙齿基质1000克添加外源BMP蛋白，添加外源蛋白的方法如下：
b、首先把步骤(7)处理的脱钙牙基质除去双氧水，用灭菌水冲洗多次直至无双氧水存在；获得100克的人牙基质粉末；
c、然后让脱钙的牙基质粉末悬浮在1升PH＝7.2的磷酸盐缓冲液中；
d、把外源BMP-2(1.0克，购买自上海麦仓生物技术有限公司)用相同体积的PH＝7.2的磷酸盐缓冲液溶解，然后两者混合在一起，放到搅拌机器上进行匀速缓慢搅拌，搅拌的速率为30-80转/分钟进行搅拌，同时处于变温的水浴锅内，温度顺次如下：26摄氏度，8小时；30摄氏度；6小时；28摄氏度；8小时，28摄氏度，12小时；然后保持在恒温30摄氏度下进行继续搅拌，每隔3小时测量一次混合溶液中BMP-2蛋白的浓度，直到浓度下降到初始BMP-2浓度的20％－25％以下停止搅拌，然后通过离心，去掉上清液体，剩下的粉末进行过滤，然后经过低温干燥得到人牙基质冻干粉末。经过检测，经过该方法脱钙处理的牙基质颗粒剂或者冻干粉细小均匀，形态一致，呈圆棒状，长度约为100—220nm，直径约为40一11Onm。
实施例子2：人牙基质进行脱钙处理添加外源BMP蛋白。
与实施例子1不同之处在于，外源蛋白为BMP-7，其它条件都一样。
实施例子3：人牙基质进行脱钙处理添加外源BMP蛋白。
与实施例子1不同之处在于，同时处于恒温的水浴锅内，温度为15、20、35、38摄氏度，时间为34小时以上，每隔3小时测量一次混合溶液中BMP-2蛋白的浓度，直到浓度下降到初始BMP-2浓度的20％－25％以下停止搅拌，然后通过离心，去掉上清液体，剩下的粉末进行过滤，然后经过低温干燥得到人牙基质，在摄氏温度5℃的条件下置于70％酒精液中贮存备用。经过检测，经过该方法脱钙处理的牙基质颗粒剂或者冻干粉细小均匀，形态一致，呈圆棒状，长度约为100—220nm，直径约为40一11Onm。
实施例子4：2份人牙基质进行脱钙和脱蛋白(BMP)处理，处理把提取的BMP蛋蛋白 和一份经过脱钙脱蛋白处理的人牙基质粉末混合。
1.人牙基质进行脱钙处理的步骤如下：
(1)、将收集的人牙置于清水容器内，在5摄氏度以下条件储存；
(2)、用1.2％次氯酸钠浸泡消毒原料牙，时间为55分钟、温度为摄氏30度(或者其它问题，例如35、30、38、40摄氏度)；
(3)、去除牙体上无使用价值的部分；
(4)、用机械方法将牙组织粉碎成颗粒剂或者冻干粉，平均粒径为0.25毫米(例如可以为0.2、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0、1.2毫米)；
(5)、再用1.0％次氯酸钠浸泡消毒粉碎成颗粒剂或者冻干粉的牙组织，浸泡消毒时间为45分钟，温度为摄氏35-40度；
(6)、将牙组织颗粒剂或者冻干粉置于到0.65(或者0.67、0.68、0.67、0.72)当量盐酸液浸泡，在38摄氏度下浸泡20小时完成脱钙；
(7)、低温干燥，再用35摄氏度3％的双氧水浸泡30分钟。
2.进行BMP蛋白的提取处理。
对步骤(7)已经经过脱钙牙基质处理的牙齿基质1000克粉末进行提取蛋白的处理，提取BMP的蛋白的方法如下：
a、首先把步骤(7)处理的脱钙牙基质除去双氧水，用灭菌水冲洗多次直至无双氧水存在；获得1000克的人牙基质粉末；
b、然后让脱钙的牙基质粉末1000克悬浮在5升PH＝7.2的磷酸盐缓冲液中；
c、在水浴锅内加热处理b步骤的磷酸盐缓冲液280小时，温度为40摄氏度，在加热处理的过程中，不断的搅拌；然后进行离心，分离上清液和沉淀物质，对上清液用分子筛分离目的蛋白的纯化和浓缩，最终获得BMP蛋白活性提取物，经过测定，其分子量为BMP的分子量为20--50kda。对沉淀粉末进行过滤，干燥，回收，获得980克经过脱蛋白处理的牙基质粉末。
d、让脱钙和脱蛋白处理的牙基质粉末与提取的BMP蛋白混合处理，处理的步骤如下：首先让脱钙后经过BMP蛋白提取的牙基质粉末悬浮在PH＝7.0的磷酸盐缓冲液中(100克每升，配置5升溶液，合计500克)然后把从1000克人牙基质中提取的BMP蛋白(步骤c)用磷酸盐缓冲液溶解，然后两者混合在一起，放到搅拌机器上进行匀速缓慢搅拌，搅拌的速率为为30-80转/分钟，同时在室温下或者25-30摄氏度下进行搅拌12-24小时，在搅拌的时候，每隔3小时测量一次混合溶液的BMP蛋白的浓度，直到浓度下降到初始BMP浓度的10％－15％以下停止搅拌，然后通过离心，去掉上清液体，剩下的粉末进行过滤，然后经过低温干燥得到基质，在摄氏温度5℃的条件下置于70％酒精液中贮存备用。
经过检测，经过该方法脱钙处理的牙基质颗粒剂或者冻干粉细小均匀，形态一致，呈圆棒状，长度约为80—180nm，直径约为30一7Onm。
实施例子5：外源人骨进行脱钙、脱蛋白处理，然后添加外源BMP蛋白。
1.人骨进行脱钙处理的步骤如下：
(1)、将收集的人骨放入清水容器内，在5摄氏度以下条件储存；
(2)、用2.0％次氯酸钠浸泡消毒原料骨骼，时间为55分钟、温度为37摄氏度(或者其它温度，例如35、30、38、40摄氏度)；
(3)、去除骨骼上无使用价值的部分；
(4)、用机械方法将骨骼组织粉碎成颗粒剂，平均粒径为0.25毫米(例如可以为0.2、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0、1.2毫米，或者其他粒径的纳米颗粒，例如50-100,120-200纳米的颗粒)；
(5)、再用1.5％次氯酸钠浸泡消毒粉碎成颗粒剂，浸泡消毒时间为45分钟、温度为35-40摄氏度；
(6)、将骨骼组织颗粒剂或置于0.65(或者0.67、0.68、0.67、0.72)当量的盐酸液中浸泡，在38摄氏度下浸泡16小时完成脱钙；
(7)、低温干燥获得冻干粉末或者颗粒，再用35摄氏度3％的双氧水浸泡30分钟。
经过检测，该方法脱钙处理后的骨骼质颗粒剂或者冻干粉细小均匀，形态一致，呈圆棒状，长度约为120—240nm，直径约为60一120nm。
2.进行BMP蛋白的降解处理。
对步骤(7)中已经经过脱钙骨骼处理后的骨骼基质1000克粉末提取蛋白的处理方法如下：
a、首先除去步骤(7)脱钙处理骨骼基质中的双氧水，用灭菌水冲洗多次直至无双氧水存在；获得1000克的骨骼基质粉末；然后让1000克脱钙的骨骼粉末悬浮在2升PH＝7.2的磷酸盐缓冲液中；
b、为使酶解反应达到理想的程度，并结合生产投入成本，在实验中选用胰酶，酶解锅内温度调至48-50℃，pH值调至8.5时加入胰酶O.35g；酶的反应时间均为12-56小时，进行蛋白降解处理；处理结束后，进行离心分离上清液和沉淀，去除上清液，保留沉淀，并进行干燥，获得900克脱钙脱蛋白的骨骼粉末。
c、然后让脱钙脱蛋白的骨骼粉末1000克悬浮在5升PH＝7.2的磷酸盐缓冲液中；
d、把外源BMP-2(1.0克，购买自上海麦仓生物技术有限公司)用相同体积的PH＝7.2的磷酸盐缓冲液溶解，然后两者混合在一起，放到搅拌机器上进行匀速缓慢搅拌，搅拌的速率为30-80转/分钟进行搅拌，同时处于变温的水浴锅内，温度顺次如下：26摄氏度，8小时；30摄氏度；6小时；28摄氏度；8小时，28摄氏度，12小时；然后保持在恒温30摄氏度下进行继续搅拌，每隔3小时测量一次混合溶液中BMP-2蛋白的浓度，直到浓度下降到初始BMP-2浓度的5％－6％以下停止搅拌，然后离心，去掉上清液体，剩下的粉末进行过滤，然后经过低温干燥得到骨骼基质，在摄氏温度5℃的条件下置于70％酒精液中贮存备用。
经过检测，经过该方法脱钙处理的骨骼基质颗粒剂或者冻干粉细小均匀，形态一致，呈圆棒状，长度约为122—240nm，直径约为60一110nm。
实施例子6：骨诱导成骨制剂的效果验证
1.材料和方法
1.1实验仪器
酶标板(24孔，96孔)，酶标仪(Model 550)，电动离心机(80-2型)，细胞培养箱(Heraeus BB6220型)，双向磁力加热搅拌器(江苏省金坛市医疗仪器厂)，酸度计(上海精密科学仪器有限公司)，恒温水浴锅(江苏省金坛市医疗仪器厂)，医用超净工作台(苏州净化设备厂。
1.2实验材料
来源于本发明的实施例子1-5的材料和深圳市光明创博生物制品发展有限公司的商用牙基质进行平行对照(CK)处理实验，类标准胎牛血清(杭州四季青)，DMEM培养基(Sigma)，0.25％胰蛋白酶(Sigma)，Tritonx-100(上海生工)，ALP标准制剂盒(上海生工)。
2实验方法
2.1 MC-3T3成骨细胞培养：
MC-3T3成骨细胞常规复苏于含10％胎牛血清的培养基，在50ml/L CO2、饱和湿度、37℃环境下培养，24h后换液，生长至80％后，2.5/L胰蛋白酶消化后，转代，以3-4代细胞做实验
2.2 MC-3T3成骨细胞增殖研究
实验前将本发明的实施例子1-5的基质粉末和深圳市光明创博生物制品发展有限公司的商用牙基质粉末称取0.1克加入24孔板，每种样品平均3孔，紫外线照射30分钟灭菌。将对数生长期的细胞消化制成细胞悬浮液，调整浓度，使接种密度为1×104/ml，加入24孔板，每孔l ml，在50ml/L CO2：饱和湿度、37℃环境下培养2、4、6d后，于各培养板依次选定4孔，加入MTT液160ul(微升)，继续培养4h，弃去培养液，加入DMSO 1.2ml，振荡10min，将200μl(微升)置于96孔板中，每样平均三孔，以酶联免疫检测仪在490nm波长测定吸光度A值，采用MTT法细胞计数标准曲线估算细胞密度。通过SPSS统计软件的单因变量多因素方差分析对以上实验结果进行分析。
结果如下:
不同处理的MTT测试结果见图1-2。随着培养时间的延长，各组细胞数量均有所增加。本发明的实施方式1、3、4、5的材料接种组细胞增殖数明显高于对照组CK，经统计学分析，实施方式1、3、4、5的材料与对照CK之间有统计学意义(P<O.05)(图1和图2)。这样进一步说明本发明获得的成骨基质相比现有技术中的商用基质具有更高的活性。具有极大的应用前景。
2.3 MC-3T3细胞ALP活性测定
细胞接种方法同上，培养2，4，6d后，弃去培养液，PBS(0.01mol/L)冲洗3次，加入2ml/L Triton X 800μl((微升))，4℃冰箱过夜，再加入300微升ALP底物，37℃保持40min，以0.1mol/L KOH中止反应，将200μl((微升)移入96孔板，每样平均三孔，以酶联免疫检测仪在410纳米处测定吸光度A值，即代表细胞碱性磷酸酶活性。为排除增殖率不同对碱性磷酸酶活性的影响，进行如下修正：成骨细胞平均碱性磷酸酶活性＝测得吸光度A值/同期成骨细胞增殖率。通过SPSS统计软件的单因变量多因素方差分析对以上实验结果进行分析。
结果如下：
见图3、4。从图3可以看出，本发明的实施例子1和3获得的牙基质的活性明显高于现有技术中牙基质的活性。另外，也进一步证实了BMP-2蛋白为主要的活性蛋白，对于骨骼修复或增长具有重要的作用。随培养时间延长，各组细胞碱性磷酸酶活性都有所增加，实施例子1和3的碱性磷酸酶活性高于对照组，经统计学分析，实施例子1与对照CK，实施例子3、4和5分别与对照CK两组之间有统计学意义(P<0.05)，呈显著性差异。这样进一步说明本发明获得的成骨基质相比现有技术中的商用基质具有更高的活性。
另外，通过我们另外的实验证明(采用的方法如实施例子1中添加外源蛋白和实施例子5中添加的外源蛋白)，在所有外源BMP蛋白中，例如，外源BMP蛋白为BMP-2、BMP-1、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6或BMP-7中的一种或者几种，单独采用一种外源蛋白的时候，外源蛋白BMP-2，BMP-3和BMP-7的效果要好于其它的蛋白。
另外，,我们对实施例子1、3、4、5获得的基质颗粒或者干粉和深圳市光明创博生物制品发展有限公司的商用牙基质进行平行对照(CK)处理实验，考察对于老年性骨折、二次骨折以及三期，四期股骨头坏死骨的修复效果。结果发现，相对于现有的商业销售的牙基质材料(成骨颗粒或者制剂)，本发明的实施例子1、3、4、5获得的基质颗粒或者干粉的疗效明显好于目前商用的牙基质材料，特别是实施例子1、3、4获得的牙基质的材料的疗效最好，特别是实施例子1和4效果更好。这可能是因为，现有牙基质材料是直接经过脱钙处理的，其中含有的活性蛋白本来就比较少，而且在酸性脱钙处理过程中，可能对活性BMP蛋白造成大量的变性损害，从而效果不是很理想，而且脱钙处理具有较大的随意性，产品的性能具有很大的批间差异。而本发明通过简单的处理，可以明显提高疗效；另外，从2014年1月-2016年1月在常温下保存，进行活性实验的结果表明，常温保藏下2年左右，活性虽然有所稍微降低(大约降低了5-10％左右)(具体实验过程和具体数据略)，但是仍然保持较高的活性，储存2年后，活性几乎是目前商用产品活性2-4倍。这为大量进行标准化商业化生产，效果更为显著的诱导成骨产品提供了一个新的途径。
实施例子7
本发明实施例子1，3，4，5中形成的最终产品以1000克的量添加维生素B2分别为：1毫克，2毫克，3毫克，4毫克，5毫克，6毫克，7毫克，20毫克,30毫克,50毫克,100毫克并通过实施例子6所阐述的2.2和2.3的方法进行效果的验证，同时不添加维生素B2作为对照1，和单独维生素B2与没有活性的BMP蛋白的粉末混合作为对照2。
结果如下：
1.不同处理的MC-3T3测试结果表明。
随着培养时间的延长，各组细胞数量均有所增加。本发明的实施方式1、3、4、5的材料添加了维生素B2后接种组细胞增殖数高于对照1和对照2，其中对照2基本没有任何可测试的细胞增殖效果。经统计学分析，实施方式1、3、4、5的材料中某些处理与对照1之间有统计学意义(P<O.05)。当添加的量为1-30毫克的时候，与对照1具有极显著性差异(P<O.01)，具体分析结果和过程略。同时发现，在各个处理中添加不同量的维生素B2对增值效果也有差异，当添加的量在1毫克-30毫克之间的时候，可以明显提高细胞的细胞增殖数，而大于30毫克的各个处理与对照1之间没有显著差异，而且增值效果不明显。
当以上各个处理对应的碱性磷酸酶活性的处理结果上，与成骨细胞增值的效果类似。具体实验过程略。这似乎证明当添加一定合适比例的维生素B2的时候，可以协同BMP蛋白进行成骨细胞的增值，这样进一步说明本发明获得的成骨基质相比现有技术中的商用基质具有更高的活性。具有极大的应用前景。

Claims (10)

1.一种制备骨诱导成骨制剂的方法，该方法包括如下步骤：1.对人牙基质进行脱钙处理；2.然后再经过脱钙处理的牙基质中添加外源活性蛋白BMP，即骨形态发生蛋白，从而形成诱导成骨制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，经过步骤1对牙基质进行脱钙处理后获得牙基质颗粒剂或者冻干粉。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，在步骤2中，经过脱钙处理的牙基质中添加外源活性蛋白BMP的方法如下：把外源BMP和牙基质颗粒剂或者冻干粉分别用PH＝7.2的磷酸盐缓冲液溶解，然后两者混合在一起，放到搅拌机器上进行匀速缓慢搅拌，搅拌的速率为20-120转/分钟进行搅拌，同时处于变温的水浴锅内。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，水浴锅内的温度顺次如下：26摄氏度，8小时；30摄氏度；6小时；28摄氏度；8小时，28摄氏度，12小时；然后保持在恒温30摄氏度下进行继续搅拌。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，在搅拌过程中，每隔3小时测量一次混合溶液中BMP蛋白的浓度，直到浓度下降到初始BMP浓度的20％－25％以下停止搅拌。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，停止搅拌后，然后通过离心，去掉上清液体，剩下的粉末进行过滤，然后经过低温干燥得到骨诱导成骨制剂。
7.根据权利要求1-6所述的方法，其中，所述的外源BMP蛋白为BMP-2、BMP-1、BMP-3BMP-4、BMP-5、BMP-6或BMP-7中的一种或者几种。
8.根据权利要求1-7所述的方法，其中，在诱导成骨制剂中包括有维生素B2。
9.一种通过权利要求1-8之一制备的骨诱导成骨颗粒剂或者冻干粉制剂，其中所述的制剂的颗粒剂或者冻干粉呈圆棒状，长度约为100—220nm，直径约为40一l1Onm。
10.根据权利要求9所述的成骨颗粒剂或者冻干粉制剂，所述的成骨颗粒剂或者冻干粉制剂中包括维生素B2。
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