CN116059444A - Ddm-fg复合物的制备方法及在骨移植材料上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了DDM‑FG复合物的制备方法及在骨移植材料上的应用，尤其将DDM‑FG复合物用于牙槽骨缺损骨移植修复中；本研究中FG的加入使得DDM不易松散移位，提高了DDM的可操作性，尤其是配比为1：0.5时，DDM‑FG具有优秀的塑形性。DDM组、1：0.1组、1：0.5组材料的孔隙率和体外降解率基本满足作为骨移植材料的需要。当配比为1：0.1的DDM‑FG与MC3T3‑E1共培养时促进细胞黏附的作用最优。不同配比DDM‑FG复合物促进MC3T3‑E1细胞成骨分化的能力优于DDM和FG，配比为1：0.1时对ALP活性的影响及矿化结节的形成作用明显，配比为1：0.5时促进OC分泌的作用明显。动物实验中，配比为1：0.5时成骨效果最明显。综上，当DDM的颗粒大小为400‑1000μm时，混合比例为1：0.5(g/ml)的DDM‑FG复合物更适用于临床。

Description

DDM-FG复合物的制备方法及在骨移植材料上的应用
技术领域
本发明属于骨移植材料技术领域的应用，具体涉及DDM-纤维蛋白胶复合物的制备方法及在骨移植材料上的应用。
背景技术
近年来，因外伤、感染、肿瘤术后造成的牙槽骨损伤，经常需要植入骨或骨移植材料。随着种植技术的日渐成熟，骨增量技术在种植修复中的应用越来越广泛，对骨移植材料的研究也越来越多。目前的骨移植材料有自体骨、同种异体骨、异种异体骨及异质骨。自体骨一般来源于髂骨、腓骨、肋骨、下颌骨甚至部分颅骨，因其具有骨传导性、骨诱导性及骨生成性，被认为是骨移植的“金标准”。同种异体骨来源于活体(截肢/假体置换术)或死者捐献，具有骨传导性，而骨诱导性较弱，临床上常用的有脱钙人骨。异种异体骨有牛骨、猪骨等，临床上常用脱钙小牛骨。异质骨有羟磷灰石、生物玻璃、磷酸钙等，虽来源广泛，但其只具有骨传导性。
脱矿牙本质基质(demineralized dentinmatrix，DDM)是将离体牙去除牙釉质，牙骨质和牙髓组织，对剩余的牙本质进行处理后而制成的天然复合物；DDM可释放骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)、转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)等多种生长因子，被认为是一种具有骨诱导作用的骨替代材料。
纤维蛋白胶(fibrin glue，FG)是在凝血级联的最后一步纤维蛋白原和凝血酶聚合形成的天然生物大分子材料。商用的FG也称为纤维蛋白粘合剂(fibrin sealant，FS)，是一种以纤维蛋白原和凝血酶为主要成分的自体或商用组织粘合剂。FG因其具有组织封闭、止血、促进伤口愈合及成胶稳定且迅速的功能，广泛应用于心脏手术止血、整形外科及烧伤治疗等。
针对DDM或FG的实验研究都表明DDM和FG均有良好的生物相容性，且可以作为骨形态蛋白BMPs及部分生长因子的载体，用于建立生长因子的缓释系统。研究显示DDM含有丰富的天然孔隙结构，这些孔隙有利于细胞生长因子和骨活性物质的聚集和进入。多种研究证明DDM可以释放多种生长因子，如骨形成蛋白BMPs,TGF-β，VEGF等，均有利于成骨。但是DDM存在所有骨粉都有的缺点，在局部应用时松散且易移位，不利于细胞迁移与血管新生，容易影响骨愈合。发明人通过研究发现，将DDM与FG以适当比例混合后，FG可以即刻成胶，DDM-FG成为类似粘性骨的骨移植材料(可以使用镊子夹取团块状粘性骨)使骨移植材料相对稳定地附着于骨缺损处，创造并维持新骨生成的空间，DDM可释放生长因子，如BMP,VEGF，TGF-β等，FG发挥生长因子的载体作用，可增加生长因子在局部释放的浓度，延长生长因子的释放周期，十分有利于骨愈合及新骨生成；DDM-FG复合物作为骨移植材料具有显著的临床应用价值和前景。
发明内容
为了将DDM-纤维蛋白胶复合物作为骨移植材料，本发明设计了DDM-纤维蛋白胶复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：取40周岁以下拔牙患者的无龋坏、无牙周病的因阻生或正畸需要而拔除的牙齿；
S2：用预冷生理盐水反复冲洗，牙科高速手机磨除牙齿根尖区约3mm，去除所附的软组织、牙本质外部的釉质和牙骨质及内部牙髓；
S3：将所得的牙本质于液氮中冻干，在牙本质研磨器中粉碎，得到牙本质颗粒；颗粒大小约400-1000μm；
S4：然后用乙醇/乙醚液4℃脱脂4小时，倾去有机溶剂，再用去离子水洗涤两次，而后用盐酸脱矿，倾去溶剂；
S5：将S4中脱矿后的材料用去离子水洗涤两次，乙醇梯度脱水干燥，超净工作台中自然风干；称取牙本质颗粒以每份0.1g，0.5g和1g分装于EP管中，标名，封口；
S6：用25kGy钴60辐射消毒灭菌12小时，-20℃以下保存备用；制备得到DDM材料；
S7：将主体胶溶解液注入主体胶冻干粉中(主要成分纤维蛋白原30mg/ml)，静置30-60秒，再轻轻震摇，使其完全溶解，恢复室温，再静置1-2分钟；将催化剂溶液注入催化剂冻干粉中(主要成分为凝血酶650U/ml)，静置30-60秒，再轻轻震摇，使其完全溶解，恢复室温，再静置1-2分钟；
S8：将S7中已经溶解的主体胶溶液与催化剂溶液按照1:1的比例进行混合，静置3-5分钟，使其完全凝固，制备得到FG材料；
S9：将S6中制备得到的DDM材料与S8中制备得到的FG材料按照1:0.1或1:0.5中的任意一种比例进行混合配置，得到两种DDM-纤维蛋白胶复合物；
优选的，所述DDM与FG的比例为1:0.5；
优选的，所述S4中所使用盐酸浓度为0.6mol/L，脱矿温度为4℃，持续时间为72小时；
DDM-FG复合物应用于牙槽骨损伤骨移植材料。
本发明的有益效果是：通过本发明设计的DDM-FG复合物，将其应用于骨移植材料，尤其是牙槽骨损伤修复时的骨移植材料，按照本发明的制备方法和比例在DDM材料中加入FG材料，使得DDM不易松散移位，用于骨移植和骨修复之后，人体生物相容性和稳定性相较现有骨移植材料有明显改善，有突出的应用价值。
附图说明
图1是制备DDM材料流程图；
图2是Transwell示意图；
图3是MC3T3-E1细胞在不同DDM-FG复合物上的早期黏附率示意图；
图4是MC3T3-E1细胞在不同DDM-FG复合物上的增殖情况示意图；
图5是碱性磷酸酶活性标准曲线示意图；
图6是不同DDM-FG复合物对MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性的影响示意图；
图7是不同DDM-FG复合物与MC3T3-E1细胞培养14、21天时茜素红染色(A：空白对照组；B：DDM组；C：1：0.1组；D：1：0.5组；E：FG组。×40)；
图8是不同DDM-FG复合物与MC3T3-E1细胞培养后矿化结节的含量示意图；
图9是骨钙素标准曲线；
图10是不同DDM-FG复合物对MC3T3-E1细胞分泌骨钙素的影响示意图；
图11是DDM颗粒，DDM与FG1混合，DDM与FG2混合状态示意图；
图12是骨缺损模型及本发明制备的植骨材料填充实验过程示意图；
图13是DDM颗粒植入骨缺损区后成骨所需的成骨细胞，破骨细胞，新生血管，新生骨生长情况图；
图14是新生骨组织，成骨细胞，新生血管，破骨细胞放大示意图；其中NB代表新生骨组织，绿色箭头代表成骨细胞，红星代表新生血管，黄色箭头代表破骨细胞；A为放大50倍，B为放大200倍，C为放大400倍。
具体实施方式
本发明关于DDM-FG复合物的制备方法及DDM-FG复合物的应用及作用效果，通过以下实施例进行说明；
实施例1
DDM-纤维蛋白胶复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：取40周岁以下拔牙患者的无龋坏、无牙周病的因阻生或正畸需要而拔除的牙齿；
S2：用预冷生理盐水反复冲洗，牙科高速手机磨除牙齿根尖区约3mm，去除所附的软组织、牙本质外部的釉质和牙骨质及内部牙髓；
S3：将所得的牙本质于液氮中冻干，在牙本质研磨器中粉碎，得到牙本质颗粒；颗粒大小约400-1000μm；
S4：然后用乙醇/乙醚液4℃脱脂4小时，倾去有机溶剂，再用去离子水洗涤两次，而后用盐酸脱矿，倾去溶剂；
S5：将S4中脱矿后的材料用去离子水洗涤两次，乙醇梯度脱水干燥，超净工作台中自然风干；称取牙本质颗粒以每份0.1g,0.5g和1g分装于EP管中，标名，封口；
S6：用25kGy钴60辐射消毒灭菌12小时，-20℃以下保存备用；制备得到DDM材料；
S7：将主体胶溶解液注入主体胶冻干粉中(主要成分纤维蛋白原30mg/ml)，静置30-60秒，再轻轻震摇，使其完全溶解，恢复室温，再静置1-2分钟；将催化剂溶液注入催化剂冻干粉中(主要成分为凝血酶650U/ml)，静置30-60秒，再轻轻震摇，使其完全溶解，恢复室温，再静置1-2分钟；
S8：将S7中已经溶解的主体胶溶液与催化剂溶液按照1:1的比例进行混合，静置3-5分钟，使其完全凝固，制备得到FG材料；
S9：将S6中制备得到的DDM材料与S8中制备得到的FG材料按照1:0.1或1:0.5中的任意一种比例进行混合配置，得到两种DDM-纤维蛋白胶复合物；
实施例2
研究MC3T3-E1细胞在不同DDM-FG复合物上的早期黏附情况；
实验MC3T3-E1细胞准备：MC3T3-E1细胞复苏—MC3T3-E1细胞传代—MC3T3-E1细胞冻存；
实验分组：实验分为5组，分别为：DDM组、1:0.1组(DDM:FG配比为1:0.1)、1:0.5组(DDM:FG配比为1:0.5)、FG组、空白对照组；
实验方法：
1)按照如上分组配置不同的DDM-FG复合物，DDM组为1gDDM，1:0.1组为1gDDM：0.1mlFG，1:0.5组为1gDDM：0.5mlFG，FG组为0.1mlFG，空白对照组为单纯细胞组；
2)将配置好的不同DDM-FG复合物置于24孔板中，待FG完全成胶；将生长状况良好的MC3T3-E1细胞消化悬浮；
3)自动细胞计数仪计数，调节细胞浓度为2×104/ml，接种到不同DDM-FG复合物表面，每孔500μl，于37℃培养箱中培养；
4)在1，3和6小时时弃去原培养液，PBS冲洗不同DDM-FG复合物表面上未黏附的细胞2次，胰酶消化后收集从不同DDM-FG复合物上消化下来的细胞，用细胞计数仪计数，按如下公式计算不同DDM-FG复合物上的细胞黏附率；
细胞黏附率(％)＝细胞黏附量/细胞接种量×100％。
实施例3
研究不同DDM-FG复合物对MC3T3-E1细胞增殖的影响。
实验MC3T3-E1细胞准备：MC3T3-E1细胞复苏—MC3T3-E1细胞传代—MC3T3-E1细胞冻存；
实验分组：实验分为5组，分别为：DDM组、1:0.1组(DDM:FG配比为1:0.1)、1:0.5组(DDM:FG配比为1:0.5)、FG组、空白对照组；
实验方法：
1)按照如上分组配置不同的DDM-FG复合物，DDM组为1gDDM，1:0.1组为1gDDM：0.1mlFG，1:0.5组为1gDDM：0.5mlFG，FG组为0.1mlFG，空白对照组为单纯细胞组；
2)将生长状况良好的MC3T3-E1细胞消化悬浮，自动细胞计数仪计数，调节细胞浓度为1×104/ml；
3)在24孔板用Transwell的下室中接种细胞，每孔500μl，于37℃培养箱中孵育4小时后进行下一步；
4)按分组配制不同DDM-FG复合物加入Transell上室中，每组三个样本，待FG完全成胶后置于已接种细胞的24孔板中，37℃培养箱中孵育，在1、3、5和7天时进行检测(如图13)；
5)在检测时间点弃去原培养液，PBS冲洗2次，加入新配的含10％CCK-8的培养液，每孔500μl，37℃培养箱中孵育4h；
6)取孵育后的液体每孔100μl于96孔板，用酶标仪检测波长为450nm的吸光度(OD值)。
实施例4
研究不同DDM-FG复合物对MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性的影响；
实验MC3T3-E1细胞准备：MC3T3-E1细胞复苏—MC3T3-E1细胞传代—MC3T3-E1细胞冻存；
实验分组：实验分为5组，分别为：DDM组、1:0.1组(DDM:FG配比为1:0.1)、1:0.5组(DDM:FG配比为1:0.5)、FG组、空白对照组；
实验方法：
1)按照如上分组配置不同的DDM-FG复合物，DDM组为1gDDM，1:0.1组为1gDDM：0.1mlFG，1:0.5组为1gDDM：0.5mlFG，FG组为0.1mlFG，空白对照组为单纯细胞组；
2)按如上分组配制不同DDM-FG复合物，置于6孔板中，待FG完全成胶；
3)将生长状况良好的MC3T3-E1细胞消化悬浮，自动细胞计数仪计数，调节细胞浓度为1×104/ml，接种到不同DDM-FG复合物表面，每孔2ml，37℃培养箱中培养；
4)在3天和7天时，弃去原培养液，加入细胞裂解液充分吹打裂解细胞，收集液体于离心管，1200rpm/min 4℃高速冷冻离心机离心25分钟，取上清液待测；
5)提前取出碱性磷酸酶活性试剂盒恢复至室温，按照说明书配制显色底物溶液和标准品工作液。使用96孔板设置空白对照孔、标准品孔和样品孔，空白对照孔为检测缓冲液50μl加显色底物50μl；标准品的用量分别为4、8、16、24、32和40μl加检测缓冲液补足100μl；样品孔为待测上清液50μl加显色底物50μl，用枪头轻轻吹打混匀，37℃孵育20分钟；
6)每孔加入100μl反应终止液终止反应，用酶标仪在405nm测定吸光度。根据酶活性单位的定义：37℃条件下，每分钟水解para-nitrophenyl phosphate显色底物产生1微摩尔p-nitrophenol所需的ALP的量定义为一个酶活力单位，计算碱性磷酸酶活性。
实施例5
研究不同DDM-FG复合物对MC3T3-E1细胞矿化结节形成的影响；
实验MC3T3-E1细胞准备：MC3T3-E1细胞复苏—MC3T3-E1细胞传代—MC3T3-E1细胞冻存；
实验分组：实验分为5组，分别为：DDM组、1:0.1组(DDM:FG配比为1:0.1)、1:0.5组(DDM:FG配比为1:0.5)、FG组、空白对照组；
实验方法：
1)按照如上分组配置不同的DDM-FG复合物，DDM组为1gDDM，1:0.1组为1gDDM：0.1mlFG，1:0.5组为1gDDM：0.5mlFG，FG组为0.1mlFG，空白对照组为单纯细胞组；
2)将生长状况良好的MC3T3-E1细胞消化悬浮，自动细胞计数仪计数，调节细胞浓度为1×104/ml；
3)在6孔板用Transwell的下室中接种细胞，每孔2ml。按如上分组配制不同DDM-FG复合物于Transwell上室，待FG完全成胶后，将Transwell小室置于已接种细胞的6孔板中，37℃培养箱中培养；
4)在14天和21天时，收集上清液待用。PBS冲洗2次，中性甲醛固定30分钟，PBS冲洗2次，0.1％茜素红染液染色5分钟，PBS冲洗2次，拍照记录；
5)配制10％十六烷基吡啶，加入6孔板中，每孔500μl，37℃孵育15分钟溶解矿化结节，取孵育后溶液于96孔板，每孔100μl，用酶标仪在570nm处测吸光度。
实施例6
研究不同DDM-FG复合物对MC3T3-E1细胞分泌骨钙素的影响；
实验MC3T3-E1细胞准备：MC3T3-E1细胞复苏—MC3T3-E1细胞传代—MC3T3-E1细胞冻存；
实验分组：实验分为5组，分别为：DDM组、1:0.1组(DDM:FG配比为1:0.1)、1:0.5组(DDM:FG配比为1:0.5)、FG组、空白对照组；
实验方法：
1)按照如上分组配置不同的DDM-FG复合物，DDM组为1gDDM，1:0.1组为1gDDM：0.1mlFG，1:0.5组为1gDDM：
0.5mlFG，FG组为0.1mlFG，空白对照组为单纯细胞组；
2)实验分组及细胞接种培养同2.6，收集不同DDM-FG复合物与MC3T3-E1细胞共同培养14天和21天时的原培养液于离心管，1000rpm/min离心20分钟，取上清液待测；
3)提前取出骨钙素含量检测试剂盒恢复至室温，按照说明书配制洗涤液、标准品工作液、生物素化抗体工作液和酶结合物工作液。将标准品工作液倍比稀释成浓度分别为12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39和0ng/mL的液体，依次加入到酶标板前两列孔中，每个浓度的工作液并列加两孔，每孔100μL。待测上清液加入到其它孔,每孔100μL，轻轻晃动混匀，避免产生气泡，给酶标板覆膜，37℃孵育90分钟；
4)弃去液体，甩干，不用洗涤，每个孔中加入生物素化抗体工作液100μL，混匀，酶标板加上覆膜，37℃孵育1小时。甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350μL，浸泡1-2分钟，甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干，重复此洗板步骤3次。每孔加酶结合物工作液100μL，加上覆膜，37℃孵育30分钟；
5)弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同前。每孔加90μL底物溶液，酶标板加上覆膜37℃避光孵育25分钟。每孔加终止液50μL，终止反应，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的吸光度值，绘制标准曲线，计算OC的含量。
实施例7
Micro-CT扫描后三维重建骨缺损区骨愈合状况，研究不同DDM-FG复合物植入日本大耳兔颅顶骨骨缺损后对骨愈合状况的影响；
1)实验准备：实验动物适应性饲养，全麻下在40只实验兔颅顶骨区环钻制备相同四个骨缺损，分别植入DDM颗粒，DDM-FG1(DDM:FG配比为1:0.1)，DDM-FG2(DDM:FG配比为1:0.5)，饲养到2，4，8，12周时截取骨样本，Micro-CT扫描后三维重建骨缺损区骨愈合状况。
2)实验分组：实验分为4组，分别为：空白对照组、DDM组、1:0.1组(DDM:FG配比为1:0.1)、1:0.5组(DDM:FG配比为1:0.5)；
3)动物准备：健康成年日本大耳兔约12个月大，体重约3.5公斤。选用20只雄性成年日本大耳兔(年龄：12±3个月，平均体重：3.5±0.3公斤)作为试验动物。所有动物均饲养于中国云南省昆明市昆明医科大学动物实验科。动物饲养于标准实验室条件下的单独兔笼中，平均气温21℃，相对湿度35％-65％，动物随意进食高脂高能饲料和饮用纯净水。适应性饲养4周后正式开始实验。
4)麻醉方法：
用0.2ml/kg体重的盐酸赛拉嗪注射液，商品名陆眠宁，(华牧动物保健品有限公司，吉林省，中国)，肌肉注射诱导全身麻醉。局部麻醉使用2％盐酸利多卡因(三秦药业，哈尔滨，中国)。
5)外科手术：
大约需要20分钟完成。用手术刀，在兔子头皮上切开约3.0cm的切口，完整剥离骨膜，使用直径为6毫米的环骨钻制备骨缺损，用骨膜剥离器轻轻抬起并逐步分离环形骨块，按试验设计填入不同的植骨材料，缝合创口。试验中所有操作严格遵守外科无菌操作原则。详见图12。
6)术后护理：术后在术区注射0.5ml庆大霉素注射液，碘伏消毒缝合伤口，术后三天食物内加入阿莫西林克拉维酸钾75mg预防感染,并加入布洛芬混悬液1ml减轻动物术后疼痛。
7)动物的处死：注射过量盐酸赛拉嗪注射液。于2，4，8，12周时分别处死10只实验兔，使用超声骨刀截取兔子实验区域颅骨，进行下步Micro-CT和组织学观察试验。
8)样本收集：完成手术后2，4，8，12周分别处死10只实验兔，切取目标部位颅骨，使用Micro-CT扫描骨样本，3D重建图像，并制作组织学石蜡切片，HE染色观察骨愈合及新骨生成状况。
9)Micro-CT：将样本从邻近的骨头中分离出来后，在不损伤骨头的情况下尽可能清除组织，然后把骨组织样本使用10％福尔马林固定标本，存储在-20℃。Micro-CT扫描仪设置为扫描分辨率11.4μm标准，旋转360°角，扫描时间150分钟。扫描样本后，重建数据，还原成在电脑中可分析的3D图像。
实施例8
不同骨愈合阶段，HE染色的组织学切片分析不同DDM-FG复合物植入日本大耳兔颅顶骨骨缺损后对骨愈合状况的影响；
1)实验准备：实验动物适应性饲养，全麻下在40只实验兔颅顶骨区环钻制备相同四个骨缺损，分别植入DDM颗粒，DDM-FG1(DDM:FG配比为1:0.1)，DDM-FG2(DDM:FG配比为1:0.5)，饲养到2，4，8，12周时截取骨样本，制作石蜡切片，苏木精-伊红染色。
2)实验分组：实验分为4组，分别为：空白对照组、DDM组、1:0.1组(DDM:FG配比为1:0.1)、1:0.5组(DDM:FG配比为1:0.5)；
3)实验方法：
取植入骨移植材料区域骨组织，置于10％生理盐甲醛溶液中40～50h进行固定；取出后的骨组织通过生理盐水或清水冲洗后，置于脱钙液中进行脱钙；将脱钙处理后的骨组织放入60～70％乙醇溶液中，并将骨组织依次放入体积分数为75％～85％乙醇溶液中10～15h、体积分数为95％～100％乙醇溶液中6～10h进行脱水处理，将脱水后的骨组织置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中进行透明处理；取出透明处理后的骨组织块进行浸蜡处理，并对浸蜡处理后的骨组织进行包埋直至凝固成蜡块，将蜡块切成蜡片，置于38～45℃的水浴中展开，烘干蜡片；将烘干后的蜡片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各8～15min，并将脱蜡后的所述蜡片经无水乙醇、85～95％乙醇逐级复水至65～70％乙醇，每级1～3min，将逐级复水后的蜡片置于蒸馏水2～5min，在蒸馏水中取出蜡片并进行苏木精-伊红染色8～10min；将染色后的蜡片经逐级脱水和透明处理后，采用中性树胶封固。
结果分析
1)DDM，DDM-FG1，DDM-FG2物理性状分析：
DDM颗粒肉眼状态为淡黄色硬质颗粒；DDM与FG按照固液比1:0.1混合，可见DDM颗粒聚集成团，但不可整体夹持；DDM与FG按照固液比1:0.5混合，具有一定的塑形性，DDM颗粒不再松散，植骨材料可整块夹持；如图11。
2)研究MC3T3-E1细胞在不同DDM-FG复合物上的早期黏附情况结果分析：
采用细胞计数法检测细胞早期黏附情况。不同DDM-FG复合物与MC3T3-E1细胞共培养后，随着时间的增加，细胞黏附率增加(如图3、表1)。结果发现，接种1小时时1：0.1组黏附率最高，为24.91±0.04％，空白组最低，为15.57±0.02％，每两组间均存在差异(P＜0.05)；接种3小时和6小时时，1：0.1组黏附率依然最高，分别为61.60±0.03％、82.74±0.03％，而FG组最低，分别为39.25±0.03％、42.47±0.03％，每两组之间均存在差异(P＜0.05)。
表1 MC3T3-E1细胞在不同DDM-FG复合物上的早期黏附率
Figure BDA0004037046360000131
注：*表示DDM组与1：0.1组比较P＜0.05；#表示DDM组与1：0.5组比较P＜0.05；△表示DDM组与FG组比较P＜0.05；○表示1：0.1组与1：0.5组比较P＜0.05；□表示1：0.1组与FG组比较P＜0.05；◇表示1：0.5组与FG组比较P＜0.05；▲表示空白组与DDM组比较P＜0.05；●表示空白组与1：0.1组比较P＜0.05；■表示空白组与1：0.5组比较P＜0.05；◆表示空白组与FG组比较P＜0.05。
3)不同DDM-FG复合物对MC3T3-E1细胞增殖的影响结果分析：
不同DDM-FG复合物与MC3T3-E1细胞共培养后，各组的吸光度值均随着培养时间的增加逐渐增加(如图4、表2)。吸光度值增加，表明细胞增殖良好，到7天时空白组略高于其余各组，与DDM组、1：0.5组、FG组相比差异有统计学意义(P＜0.05)，但与1：0.1组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。
表2 MC3T3-E1细胞在不同DDM-FG复合物上的增殖情况
Figure BDA0004037046360000132
注：*表示DDM组与1：0.1组比较P＜0.05；#表示DDM组与1：0.5组比较P＜0.05；△表示DDM组与FG组比较P＜0.05；○表示1：0.1组与1：0.5组比较P＜0.05；□表示1：0.1组与FG组比较P＜0.05；◇表示1：0.5组与FG组比较P＜0.05；▲表示空白组与DDM组比较P＜0.05；●表示空白组与1：0.1组比较P＜0.05；■表示空白组与1：0.5组比较P＜0.05；◆表示空白组与FG组比较P＜0.05。
4)不同DDM-FG复合物对MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性的影响结果分析：
根据测得的OD值与酶活性单位的对应关系，可得出标准曲线的直线回归方程式为：y＝1.023x-0.008，R2＝0.9995(如图5)。根据所得标准曲线得出不同DDM-FG复合物与MC3T3-E1细胞共培养后的ALP活性，各组的ALP活性均随着培养时间的增加逐渐增加(如图6)。3天和7天时均是DDM组、1：0.1组、1：0.5组ALP活性高于空白组，差异有统计学意义(P＜0.05)，其中1：0.1组明显高于其余各组，差异有统计学意义(P＜0.05)，7天时空白组及FG组差异无统计学意义(P＞0.05)。表明DDM、DDM-FG复合物对MC3T3-E1细胞的ALP活性产生了有效的影响，其中1：0.1组材料对细胞ALP活性的影响较DDM组及1：0.5组明显，都可以促进MC3T3-E1细胞的成骨分化。
5)不同DDM-FG复合物对MC3T3-E1细胞矿化结节形成的影响结果分析：
不同DDM-FG复合物与MC3T3-E1细胞共培养后，各组的矿化结节形成均随着培养时间的增加逐渐增多(如图7)。14天和21天时，肉眼可见DDM组、1：0.1组、1：0.5组、FG组均形成大小不一的矿化结节，呈现红色，其中1：0.1组及1：0.5组较明显；显微镜下的矿化结节呈现出大小不一的红色，随着时间的延长，沉积的团块不断增加，团块的颜色也不断加深。用10％十六烷基吡啶对茜素红染色后的矿化结节进行半定量检测(如图8、表3)。DDM组、1：0.1组、1：0.5组、FG组OD值均高于空白组，差异有统计学意义(P＜0.05)，其中1：0.1组显著高于其余各组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
表3不同DDM-FG复合物与MC3T3-E1细胞培养后矿化结节的含量
Figure BDA0004037046360000151
注：*表示DDM组与1：0.1组比较P＜0.05；#表示DDM组与1：0.5组比较P＜0.05；△表示DDM组与FG组比较P＜0.05；○表示1：0.1组与1：0.5组比较P＜0.05；□表示1：0.1组与FG组比较P＜0.05；◇表示1：0.5组与FG组比较P＜0.05；▲表示空白组与DDM组比较P＜0.05；●表示空白组与1：0.1组比较P＜0.05；■表示空白组与1：0.5组比较P＜0.05；◆表示空白组与FG组比较P＜0.05。
6)不同DDM-FG复合物对MC3T3-E1细胞分泌骨钙素的影响的结果分析：
根据测得的OD值与标准品浓度的对应关系，可得出标准曲线的直线回归方程式为：y＝7.4767x-0.2394，R2＝0.9974(如图9)。根据所得标准曲线得出不同DDM-FG复合物与MC3T3-E1细胞共培养后的OC含量，各组的OC含量均随着培养时间的增加逐渐增加(如图10、表4)。培养14天和21天时，1：0.5组骨钙素分泌最多，DDM组和1：0.1组次之，空白组和FG组最少，差异有统计学意义(P＜0.05)，而DDM组和1：0.1组之间、空白组和FG组之间差异均无统计学意义(P＞0.05)。复合材料能够促进MC3T3-E1细胞OC的分泌，尤其是1：0.5组。
表4不同DDM-FG复合物对MC3T3-E1细胞分泌骨钙素的影响
Figure BDA0004037046360000161
注：*表示DDM组与1：0.1组比较P＜0.05；#表示DDM组与1：0.5组比较P＜0.05；△表示DDM组与FG组比较P＜0.05；○表示1：0.1组与1：0.5组比较P＜0.05；□表示1：0.1组与FG组比较P＜0.05；◇表示1：0.5组与FG组比较P＜0.05；▲表示空白组与DDM组比较P＜0.05；●表示空白组与1：0.1组比较P＜0.05；■表示空白组与1：0.5组比较P＜0.05；◆表示空白组与FG组比较P＜0.05。
7)根据DDM-FG复合物植入后在整个骨创恢复的整个代表性阶段2，4，8，12周时使用Micro-CT扫描植入区域的骨样本，三维重建骨缺损区的骨愈合状况分析：
空白组(未植入任何材料)从2周到12周虽有新骨生成，但新生骨并未填满骨缺损区，且新生骨组织很薄，形态不规则。DDM,DDM-FG1,DDM-FG2，的骨愈合状况相似，但是8周开始DDM组的DDM颗粒明显小于DDM-FG1,DDM-FG2组，最佳的骨愈合状况见于12周时的DDM-FG2组，DDM颗粒很好的维持了骨缺损区的新骨生成空间，新生骨从周围开始逐步包裹DDM颗粒，且新生骨形态更接近于正常的骨皮质。如图13。
8)组织学切片结果分析：
组织学切片发现DDM颗粒植入骨缺损区后成骨所需的成骨细胞，破骨细胞，新生血管，新生骨都清晰可见，尤其是新生骨组织呈环形，环绕DDM颗粒。同时可见DDM降解现象，表明DDM具有生物降解性，植入后可缓慢降解，并逐渐被新生骨替代；如图14所示，(NB：新生骨组织，绿色箭头：成骨细胞，红色五角星：新生血管，红色箭头：破骨细胞)。
综上所述
1)配比为1：0.1的DDM-FG复合物与MC3T3-E1共培养时促进细胞黏附的作用优于其它组。
2)不同配比DDM-FG复合物促进MC3T3-E1细胞成骨分化的能力优于单独的DDM和单独的FG，配比为1：0.1时对ALP活性的影响及矿化结节的形成作用明显，配比为1：0.5时促进OC分泌的作用明显。
3)动物实验中，DDM-FG2(1gDDM:0.5mlFG)组成骨效果优于DDM-FG1(1gDDM:0.1mlFG)，优于DDM组。
4)DDM-FG2(1gDDM:0.5mlFG)制备过程较DDM-FG1(1gDDM:0.1mlFG)简单，DDM-FG2(1gDDM:0.5mlFG)制备完成后具有优秀的塑形性，综上，当DDM的颗粒大小为400-1000μm时，混合比例为1gDDM:0.5mlFG的DDM-FG复合物更适用于临床。

Claims (4)

1.DDM-纤维蛋白胶复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：取40周岁以下拔牙患者的无龋坏、无牙周病的因阻生或正畸需要而拔除的牙齿；
S2：用预冷生理盐水反复冲洗，牙科高速手机磨除牙齿根尖区约3mm，去除所附的软组织、牙本质外部的釉质和牙骨质及内部牙髓；
S3：将所得的牙本质于液氮中冻干，在牙本质研磨器中粉碎，得到牙本质颗粒；颗粒大小约400-1000μm；
S4：然后用乙醇/乙醚液4℃脱脂4小时，倾去有机溶剂，再用去离子水洗涤两次，而后用盐酸脱矿，倾去溶剂；
S5：将S4中脱矿后的材料用去离子水洗涤两次，乙醇梯度脱水干燥，超净工作台中自然风干；称取牙本质颗粒以每份0.1g,0.5g和1g分装于EP管中，标名，封口；
S6：用25kGy钴60辐射消毒灭菌12小时，-20℃以下保存备用；制备得到DDM材料；
S7：将主体胶溶解液注入主体胶冻干粉中，静置30-60秒，再轻轻震摇，使其完全溶解，恢复室温，再静置1-2分钟；将催化剂溶液注入催化剂冻干粉中，静置30-60秒，再轻轻震摇，使其完全溶解，恢复室温，再静置1-2分钟；
S8：将S7中已经溶解的主体胶溶液与催化剂溶液按照1:1的比例进行混合，静置3-5分钟，使其完全凝固，制备得到FG材料；
S9：将S6中制备得到的DDM材料与S8中制备得到的FG材料按照1:0.1或1:0.5中的任意一种比例进行混合配置，得到两种DDM-纤维蛋白胶复合物。
2.根据权利要求1所述DDM-纤维蛋白胶复合物的制备方法，其特征在于，所述DDM与FG的比例为1:0.5。
3.根据权利要求1所述DDM-纤维蛋白胶复合物的制备方法，其特征在于，所述S4中所使用盐酸浓度为0.6mol/L，脱矿温度为4℃，持续时间为72小时。
4.DDM-纤维蛋白胶复合物应用于牙槽骨缺损，作为骨移植材料。
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