CN107496441A - 环糊精在治疗和/预防脓毒症中的应用 - Google Patents

环糊精在治疗和/预防脓毒症中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了环糊精在治疗和/预防脓毒症中的应用。本发明发现通常作为药用辅料应用的CDs的新药理作用，即具有预防和/治疗脓毒症的作用。本发明利用激光共聚焦荧光显微镜及MTT法检测发现，CDs可以阻止LPS与小鼠腹腔巨噬细胞的结合，且未见明显的细胞毒性；高浓度下五种CDs均未有治疗脓毒症的效果，但γ‑CD和HP‑β‑CD在低浓度下却具有良好的治疗脓毒症的效果；γ‑CD和HP‑β‑CD与抗生素联合用药对脓毒症小鼠有明显的治疗作用，可有效降低其死亡率，对于脓毒症的防治具有重要的意义。

Description

环糊精在治疗和/预防脓毒症中的应用
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，涉及环糊精在预防和/治疗细菌感染所致脓毒症中的应用，尤其涉及γ-CD或HP-β-CD在治疗和/预防脓毒症中的应用。
背景技术
脓毒症是指由感染引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatoryresponse syndrome，SIRS)，脓毒症是一种严重危及生命的疾病，是重症监护室(IntensiveCare Unit，ICU)病人死亡的重要原因。脓毒症主要由感染性因素引起，如革兰氏阳性(G+)菌、革兰氏阴性(G-)菌、真菌、病毒等致病微生物侵入所致，它的临床表现包括原发感染病灶、全身炎症反应、呼吸系统、心血管系统、肝脏等脏器功能以及代谢改变。脓毒症有高达30％～70％的死亡率，全世界每天约有14000人死于脓毒症，是目前ICU所面临的最严峻的问题之一，已有研究表明，G-菌释放的内毒素是造成脓毒症的临床和实验室表现的主要原因。
内毒素是G-菌细胞壁外膜的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)成分，是一种分子量为70万的类脂多糖体。LPS分子由菌体特异性多糖、非特异性核心多糖和脂质A三部分构成，脂质A(LipidA)是内毒素的主要毒性组分。LPS在G-死亡溶溃后释放入血，进入血液循环，进而引发脓毒症。进入血液的LPS,通过脂质A与血液中内毒素结合蛋白(Lipopolysaccharide-Binding Protein,LBP)相结合，形成LPS-LBP复合物，继而被单核巨噬细胞表面的CD14分子受体识别，形成LBP-LPS-CD14三元复合物，再与巨噬细胞表面的跨膜受体TLR4(Toll like receptor 4，TLR4)结合，将刺激信号传入细胞内从而导致单核/巨噬细胞的活化，释放TNF-α、IL-1、IL-6等细胞因子。受LPS刺激单核/巨噬细胞产生的细胞因子，迅速活化不同组织器官的细胞，导致神经内分泌、机体代谢和激素水平的改变，进而导致细胞功能的异常和不同组织器官的进行性衰竭，最终导致脓毒症的产生。此外，体内LPS水平与脓毒症预后也密切相关。因此,关于LPS的研究一直是脓毒症生理病理和防治研究的热点课题。
脓毒症一直是现代医学面临的一个复杂的难题，多年来，人们一直希望找到一种方法治疗细菌感染所导致的脓毒症。脓毒症的治疗包括抗感染、调节宿主反应性以及血液动力学复苏即改善器官功能障碍等，而抗生素治疗是当前治疗细菌感染的主要策略。但是大量研究表明，抗生素在治疗G-感染时，虽然能有效的杀灭细菌，却同时导致存在于G-细胞外膜上的LPS释放，势必会加重脓毒症的程度，因此，抗生素治疗脓毒症存在一定的局限性。
CDs是由环糊精葡萄糖转移酶作用于淀粉所产生的一组环状低聚糖，广泛应用于分离有机化合物及用于有机合成，也用作医药辅料、食品添加剂等。CDs可以与一些不具备生物相容性的药物分子制备成包合物，不但增加了药物的生物相容性，还可以起到缓释作用。有研究利用聚阴离子化的环糊精或DMA7-β-CyD来治疗脓毒症，但其对于脓毒症的治疗研究仍极为有限。CDs结构最显著的特征就是具有一个环外亲水、环内疏水且有一定尺寸的立体手性空腔，而LPS是具有亲水区阴离子(磷酸基团)和疏水区(5-7个亲脂链)的两亲性物质，在自然状态下，LPS具有自组装的特性，形成分子量较大的分子，基于此性质，开发CDs的体内治疗作用，利用CDs的疏水性空腔可以包和类脂A的疏水链的作用从而阻断LPS作为脓毒症时炎症风暴始动因素的作用，进行抗生素联合CDs治疗脓毒症的方式未有报道。
发明内容
针对上述现有技术尤其是对于G-感染的抗生素治疗脓毒症的局限性问题，本发明拟利用CDs的疏水性空腔包和类脂A的疏水链的作用，阻断LPS作为脓毒症时炎症风暴始动因素的作用，提出抗生素联合CDs治疗脓毒症的新策略，在抗生素治疗的基础上，清除体内的内毒素或者阻断其引发脓毒症的过程对于脓毒症的防治具有重要的意义。
本发明的目的之一在于提供CDs在预防和/治疗脓毒症中的应用研究，所述CDs的特性作用于引起脓毒症的源头LPS，利用CDs的分子特性包合LPS中的关键部位—脂质A；本发明综合选择了五种不同空腔大小的CDs，分别为α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD以及β-CD-聚合物。
本发明的目的之二在于提供CDs与抗生素联合用药在预防和/治疗脓毒症中的应用研究，所述脓毒症为重度脓毒症，选取的脓毒症模型为盲肠结扎和穿孔(CLP)小鼠脓毒症模型，本发明所选用了脓毒症治疗中常规使用的β-内酰胺类抗生素--亚胺培南为代表。本发明通过所述的五种CDs干扰LPS与巨噬细胞结合的检测，采用激光共聚焦荧光显微镜观察测定；四种CDs的细胞毒性实验选用MTT法检测；进而选取效果较好的两种CDs，分别是γ-CD和HP-β-CD，应用CLP脓毒症小鼠模型，考察其与抗生素联合用药对CLP脓毒症小鼠死亡率的影响。
对于上述发明目的，具体的，本发明涉及以下技术方案：
首先，本发明公开了环糊精在制备治疗和/预防脓毒症的药物中应用，所述环糊精为γ-CD或HP-β-CD。
优选的，所述脓毒症为G-感染引起的脓毒症，更为优选的，为LPS(脂多糖)或脂质A(LipidA)引起的脓毒症。
优选的，所述药物为体内用药，更为优选的，所述药物形式为固态或液态。固态形式的制剂包括粉剂、片剂、分散颗粒、胶囊、药丸及栓剂，粉剂及片剂可包含约5％至约95％的活性成分，适当的固体辅料可以是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖或者乳糖，片剂、粉剂、药丸及胶囊为适于口服用的固态剂型；液态形式的制剂包括溶液、悬浮液及乳液，此外，还可制成注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。
优选的，所述药物用药量为对应于小鼠细胞或小鼠5-50mM治疗活性的当量，小鼠细胞优选为RAM264.7细胞，小鼠为LPS造模小鼠；更为优选的，所述药物用药量为对应于小鼠细胞或小鼠50mM治疗活性的当量。
其次，本发明还公开了CDs与抗生素联合用药在预防和/治疗脓毒症中的应用，所述环糊精为γ-CD或HP-β-CD。
优选的，所述抗生素为治疗G-感染引起的脓毒症的抗生素种类，例如头孢5类(头孢吡肟、头孢他啶、头孢曲松)、亚胺培南、美罗培南等；本发明优选的实施例中采用β-内酰胺类抗生素--亚胺培南。所述抗生素要达到治疗脓毒症的有效浓度，如使用过程中要考虑MIC(抗菌药物最小抑菌浓度)、MBC(抗菌药物最小杀菌浓度)、Cmax/MIC(血药峰浓度/最小抑菌浓度)、t1/2(药物在体内代谢半衰期)等。
优选的，所述药物为体内用药，更为优选的，所述药物形式为固态或液态。固态形式的制剂包括粉剂、片剂、分散颗粒、胶囊、药丸及栓剂，粉剂及片剂可包含约5％至约95％的活性成分，适当的固体辅料可以是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖或者乳糖，片剂、粉剂、药丸及胶囊为适于口服用的固态剂型；液态形式的制剂包括溶液、悬浮液及乳液，此外，还可制成注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。
优选的，所述药物中CDs用药量为对应于小鼠细胞或小鼠5-50mM治疗活性的当量，小鼠细胞优选为RAM264.7细胞，小鼠为CLP小鼠；更为优选的，所述药物中CDs用药量为对应于小鼠细胞或小鼠25mM治疗活性的当量。
此外，本发明还公开了CDs在制备抑制LPS与巨噬细胞结合的药物或试剂中的应用，所述CDs选自α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD以及β-CD-聚合物中的一种。
优选的，CDs的浓度为5mM以上。本发明具体实施例中，五种CDs(5mM浓度)均能够显著抑制LPS与RAM264.7细胞的结合，减少LPS进入巨噬细胞。
本发明取得了以下有益效果：
(1)本发明发现了CDs除作为药用辅料外的新药理作用，即CDs在5mM浓度能显著阻止LPS与小鼠腹腔巨噬细胞的结合，这样便可阻断LPS引发的炎症风暴发生；而且CDs在低浓度下具有较低的细胞毒性，五种CDs中HP-β-CD和γ-CD抑制LPS与巨噬细胞结合作用更强、毒性更低；
(2)本发明发现在高浓度(100mM浓度)下五种CDs(α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD以及β-CD-聚合物)均未有治疗脓毒症的效果(与LPS对照组差异不显著)，但γ-CD和HP-β-CD在低浓度下(50nM)却具有良好的治疗脓毒症的效果(与LPS对照组相比具有显著性差异)；
(3)本发明发现CDs(γ-CD和HP-β-CD)与抗生素联合用药对脓毒症小鼠有明显的治疗作用，可有效降低其死亡率；两种CDs联合抗生素治疗，与抗生素单独用药相比，均显著提升脓毒症小鼠的死亡率(P＜0.05)，分别提供20％和30％，HP-β-CD、γ-CD分别联合抗生素给药较单独使用抗生素具有更为有效治疗脓毒症的效果。
附图说明
图1为五种CDs阻止LPS与小鼠腹腔巨噬细胞结合的激光共聚焦显微图片。
图2为五种CDs阻止LPS进入小鼠腹腔巨噬细胞的作用的量化结果，图中▲▲表示LPS组与空白组比较P＜0.01；*表示CDs组与LPS组比较，P＜0.05；**表示CDs与LPS组比较，P＜0.01；#表示两组CDs相互比较，P＜0.05。
图3为四种CDs在不同浓度下对小鼠腹腔巨噬细胞活性影响的折线图。
图4为五种CDs(100mM)对LPS造模的脓毒症小鼠生存率影响图。
图5为HP-β-CD(50mM)对小鼠生存率的影响，*表示HP-β-CD与LPS对照组相比，P＜0.05。
图6为实施例2脓毒症小鼠血浆中H4的浓度测定，+表示LPS组与正常组比较，P＜0.05；*表示CDs与LPS组标记P＜0.05。
图7为实施例2小鼠血浆中TNF-α的浓度测定，**表示LPS组与正常组比较，P＜0.01；++表示CDs与LPS组比较，P＜0.01；+表示CDs组与LPS组比较，P＜0.05；#表示两组CDs之间比较，P＜0.05。
图8为实施例2小鼠血浆中IL-6的浓度测定，*表示CDs与LPS组比较，P＜0.05；+表示两组CDs之间比较，P＜0.05。
图9为γ-CD和HP-β-CD联合抗生素给药在7天内对CLP所致的脓毒症小鼠的生存率(％)的影响，*表示，与生理盐水组相比，P＜0.05；#表示与亚胺培南组相比，P＜0.05。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
本发明利用CDs的疏水性空腔包和类脂A的疏水链，在LPS的疏水链和颗粒内部之间形成疏水键，破坏LPS与巨噬细胞的结合，减少LPS进入巨噬细胞，本发明综合选择了五种不同空腔大小的CDs，分别为α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD以及β-CD-聚合物进行试验，五种CDs的分子式、分子量以及结构式如下。
α-CD：分子式(C6H10O5)6分子量972.84，结构式如下式I所示:
β-CD：分子式(C6H10O5)7分子量1135.0，结构式如式II所示：
γ-CD：分子式(C6H10O5)8分子量1297.13,结构式如式III所示：
HP-β-CD：分子式C54H102O39分子量1375.36,结构式如式IV所示：
β-CD-聚合物：结构示意图如式V所示，分子量＜10000，水溶性，
本发明采用的CDs的结构如下所示，五种CDs如表1所示：
表1本发明采用的CDs
CDs n R1 R2 R3
α-CD 6 -H -H -H
β-CD 7 -H -H -H
γ-CD 8 -H -H -H
HP-β-CD 7 -H或-CH2CH(CH3)OH
β-CD-聚合物 7n -H -H -H
本发明首先应用激光共聚焦荧光显微镜观察FITC标记的LPS与小鼠腹腔巨噬细胞(RAM264.7)的结合，并以胞内荧光强度量化比较CDs存在时对两者结合的影响，结果发现五种CDs(5mM浓度)均能够显著抑制LPS与RAM264.7细胞的结合，减少LPS进入巨噬细胞(与LPS组比，P<0.05)。第二，本发明采用MTT法测定四种CDs的细胞毒性，发现低剂量(0-10mM)的CDs基本无细胞毒性，细胞活力接近100％(与不加CDs组比，P＞0.05)；在高剂量时，γ-CD和HP-β-CD的细胞毒性较其他种CDs弱(50mM浓度下，α-CD和β-CD分别与γ-CD和HP-β-CD比较，P值均小于0.05)。选取两种CDs，即，γ-CD和HP-β-CD进行动物体内实验，系采用盲肠结扎穿孔法(CLP)复制小鼠重度脓毒症模型，检测γ-CD和HP-β-CD与抗生素亚胺培南联合应用对脓毒症小鼠生存率的影响，发现这两种环糊精联合亚胺培南均能显著提高脓毒症小鼠的生存率。
下面结合实施例对本发明做进一步的说明
本发明所采用实验材料如下：
1.KM小鼠(雄性，6-8周，20-30g)；无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级的BALB/c小鼠，雄性，6～8周龄，体重20～25g，购于山东大学实验动物中心；
2.RAW264.7细胞株；
3.五种CDs：α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD以及β-CD-聚合物五种环糊精；
4.FITC-LPS；
5.亚胺培南；
6.MTT等试剂；
7.激光共聚焦荧光显微镜、酶标仪等仪器；
8.CLP造模用器械：眼科剪、小号平镊、手术缝合针、4-0缝合线、穿刺针等。
实施例1 五种CDs对LPS与巨噬细胞结合的抑制作用以及对巨噬细胞活性的影响
1.利用激光共聚焦显微镜检测五种CDs对LPS与巨噬细胞结合的抑制作用
实验分为空白组、LPS对照组以及α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD和β-CD-聚合物五种CDs给药组。
取对数期的RAM264.7细胞，胰酶消化后离心，弃上清，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基制成细胞悬液，于细胞计数板上计数。将细胞铺板于激光共聚焦小皿中(2×105/皿细胞)，后置于37℃,5％CO2培养箱中培养24h，弃去培养基，加入PBS清洗三遍。空白组不做任何药物干预；LPS组，即加入终浓度为100ng/ml的FITC-LPS刺激细胞30min；五种CDs组分别加入终浓度为5mM的上述五种CDs的一种与100ng/ml的LPS共同刺激细胞30min。取出激光共聚焦小皿，吸去培养基，PBS清洗三遍。加入Hoechst 33258(5μg/mL)染核20min，PBS洗涤三遍，于激光共聚焦显微镜下分别观察FITC-LPS在巨噬细胞中的定位(绿色荧光，激发光波长为460～550nm)和细胞核染色(蓝色荧光，激发光波长为420～485nm)并拍照(蓝色荧光表示细胞核染色，绿色荧光表示FITC-LPS的定位，以及两种荧光重合情况)，对细胞内的绿色荧光强度进行定量。
激光共聚焦显微镜检测五种CDs对LPS与巨噬细胞结合的抑制作用结果如图1所示，五种CDs均抑制LPS与小鼠腹腔巨噬细胞的结合。本发明发现，各组均有较强的蓝色荧光，表明细胞核染色无明显差异，其次，对于FITC-LPS定位，空白组无绿色荧光，而其余各组均有不同强度的绿色荧光，观察两种荧光的结合图发现，LPS对照组绿色荧光已进入细胞核，荧光强度最强；五个CDs组绿色荧光的胞内分布范围较LPS组明显减少，荧光强度减弱。
将各组绿色荧光强度用IPP图像分析软件进行量化，如图2所示。计算得出的各组的平均荧光强度(MFI)。结果显示：与LPS组相比，五种CDs组的荧光强度均显著降低(P＜0.05)，表明五种CDs在5mM时均显著抑制LPS进入巨噬细胞。对五种CDs进行组间统计学分析：五种CDs对LPS与巨噬细胞结合的抑制作用由强到弱的排序为HP-β-CD＞γ-CD≈α-CD＞β-CD聚合物≈β-CD。
2.CDs对巨噬细胞活性的影响
由于β-CD-聚合物溶解度小，在100mM浓度下不溶，因此本发明选取四种CDs，即α-CD、β-CD、γ-CD及HP-β-CD，利用MTT法，分别检测各CDs在100mM，50mM，25mM，10mM，5mM浓度下对RAM264.7巨噬细胞活性的影响，同时设置空白组(无细胞，不加药)和阴性对照组(有细胞，无药物刺激)组。
取RAW264.7巨噬细胞，消化后加入完全培养基终止消化。800rpm转速下离心3min。小心吸弃上清液，加入完全培养基1ml，吹打混匀后用细胞计数板计数，调整浓度至1×104/ml，以4×104/孔细胞接种于96孔细胞培养板(空白组除外)。将各浓度CDs加入96孔板(每孔100μl)，每孔设置3～5个复孔。将96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养6h。取出，在避光条件下加入MTT(5mg/ml)继续孵育4h。然后每孔加入150μl二甲基亚砜，常温振摇10min，使用酶标仪在490nm处测定其吸光度(OD值)。
不同浓度的四种CDs对巨噬细胞RAM264.7活性的影响见图3。结果显示：在5mM、10mM浓度时，巨噬细胞活性接近100％，表明CDs基本无细胞毒性；但随着其浓度的增高，细胞活性逐渐下降，显示CDs的细胞毒性增强；在50mM、100mM的高浓度下，γ-CD和HP-β-CD的细胞毒性较其他两种CDs低(50mM浓度下，α-CD和β-CD分别与γ-CD和HP-β-CD比较，P值均小于0.05；γ-CD和HP-β-CD两组比较，P＝0.58，无显著性差异；α-CD和β-CD组，P＜0.05)。因此，四种CDs细胞毒作用排序为α-CD>β-CD>HP-β-CD≈γ-CD。
实施例2 五种CDs对脓毒症的治疗作用
1、五种CDs对LPS造模的脓毒症小鼠生存率的影响
实验分组：实验分为LPS对照组以及α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD和β-CD-聚合物五种CDs给药组。
实验方法：BALB/c小鼠按照数字法随机分为六组，每组7只。LPS对照组小鼠腹腔注射LPS(20mg/kg)，作为脓毒症小鼠生存率模型。α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD和β-CD-聚合物五种CDs给药组腹腔注射20mg/kg的LPS与100mM或50mM的各CDs混合溶液。造模后，各组小鼠在实验室正常饲养，观察并记录60h内小鼠的死亡情况。
各组小鼠60h内的生存率情况如图4所示，由图4可知：LPS对照组24h内小鼠全部死亡，生存率为0；α-CD给药组、β-CD给药组以及β-CD-聚合物组24h内小鼠亦全部死亡，生存率为0；；γ-CD组24h生存率为57.1％，60h内小鼠总生存率为14.3％；HP-β-CD给药组24h小鼠生存率为28.6％，60h总生存率为14.3％。对各组小鼠生存率进行统计分析显示：α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD和β-CD-聚合物五种CDs给药组与LPS对照组相比，均未有显著性差异(P值均＞0.05)，结果表明在100mM浓度下五种CDs均未有治疗脓毒症的效果，但是γ-CD和HP-β-CD可以延长脓毒症小鼠的生存时间。
本发明进一步研究低浓度条件下CDs(50mM)五种CDs治疗脓毒症的效果，发现50mM浓度下γ-CD、HP-β-CD具有治疗脓毒症的效果(与α-CD、β-CD、β-CD-聚合物组差异显著)，并且γ-CD和HP-β-CD可以显著延长脓毒症小鼠的生存时间。HP-β-CD(50mM)对LPS造模的脓毒症小鼠生存率的影响如图5所示，HP-β-CD与LPS对照组相比，P＝0.0359＜0.05，具有显著性差异。
2、脓毒症小鼠血浆中炎症因子的测定
脓毒症小鼠模型的建立、干预及血样采集：SPF级BALB/c小鼠，6～8周，体重20～25g，适应性喂养1周，环境温度25～28℃，自由饮食，饮水。采用数字法随机分成4组，即正常对照组、LPS阴性对照组、LPS+γ-CD用药组以及LPS+HP-β-CD用药组。LPS组采用小鼠腹腔注射10mg/kg的LPS建立脓毒症模型；LPS+γ-CD用药组以及LPS+HP-β-CD用药组腹腔注射10mg/kg的LPS以及50mM的γ-CD或HP-β-CD；空白组腹腔注射等量的生理盐水。造模完成后6h、12h和24h三个时间点，每组每个时间点分别取5只小鼠，摘眼球取血，加入EDTA抗凝。，血液于3000r/min离心10min，收集血浆，-80°保存待测。
小鼠血浆细胞外组蛋白水平以及细胞因子水平的测定：每只小鼠取10μL血浆，按照细胞外组蛋白ELISA检测试剂盒说明步骤，以酶标仪与450nm处测定脓毒症小鼠血浆中细胞外组蛋白的水平；每只小鼠取20μL血浆，分别按照TNF-α、IL-6细胞因子检测试剂盒说明书操作步骤，以酶标仪与450nm和630nm处测定脓毒症小鼠血浆中炎症细胞因子TNF-α和IL-6的含量。
小鼠血浆中细胞外组蛋白的水平结果如图6所示，图6结果显示：LPS对照组与正常对照组相比，小鼠血浆中H4的含量显著性增高(P＜0.05)；6h时，LPS+γ-CD用药组以及LPS+HP-β-CD用药组与LPS对照组相比，血浆中H4的含量显著性降低(P＜0.05)；12h各组之间无显著性差异；24h，LPS对照组血浆中H4含量降低，但γ-CD与LPS对照组相比仍然存在显著性差异(P＜0.05)，而HP-β-CD用药组与LPS对照组相比无显著性差异。因此，得出结论：γ-CD与HP-β-CD在脓毒症早期(6h)均能降低脓毒症小鼠血浆中细胞外组蛋白的水平。
小鼠血浆中TNF-α的水平如图7所示，图7结果显示：LPS对照组与正常对照组相比，小鼠血浆中TNF-α的含量显著性增高(P＜0.01)；6h、12h与24h三个时间点，LPS+γ-CD用药组以及LPS+HP-β-CD用药组与LPS对照组相比，血浆中TNF-α的浓度均显著性降低(P＜0.01)；另外，在12h，LPS+γ-CD用药组与LPS+HP-β-CD用药组相比，亦存在显著性差异(P＜0.05)。因此，得出结论：γ-CD与HP-β-CD均有降低脓毒症小鼠血浆中TNF-α浓度的作用。
小鼠血浆中IL-6的水平如图8所示，图8结果显示：与正常对照组相比，LPS对照组小鼠血浆中IL-6的浓度显著性增高(P＜0.05)；6h时，LPS+γ-CD用药组以及LPS+HP-β-CD用药组与LPS对照组相比，无显著性差异；12h，与LPS对照组相比，LPS+γ-CD用药组有显著性差异(P＜0.05)，而LPS+HP-β-CD用药组无显著性差异；24h，LPS+γ-CD用药组以及LPS+HP-β-CD用药组与LPS对照组相比均存在显著性差异(P＜0.05)，此外LPS+γ-CD用药组与LPS+HP-β-CD用药组之间亦存在显著性差异。因此，得出结论：γ-CD与HP-β-CD在晚期(12h以及24h)均有降低脓毒症小鼠血浆中IL-6浓度的作用，其中，γ-CD的作用较HP-β-CD组更好。
实施例3 γ-CD和HP-β-CD与抗生素联合用药对脓毒症小鼠的治疗作用
1.CLP小鼠脓毒症模型的建立
选用KM小鼠，于其右下腹腹腔注射4％水合氯醛(0.1ml/10g)麻醉，用医用胶布固定小鼠四肢以及尾部于手术台，使其腹部朝上。用碘酒将小鼠腹部皮肤进行消毒，用剪刀在剑突部位下偏左约0.2～0.5cm处，开平行于中线的长约0.5～1cm的纵向切口，暴露盲肠，分离盲肠，用4-0手术线在距盲肠末端约1cm处结扎，在结扎的盲肠中点，用18号穿刺针穿孔2次，穿孔必须穿透盲肠，完成穿孔后用镊子轻轻挤压穿孔处至挤出少量粪便，将盲肠放回腹腔，注意避免挤出的粪便接触手术创口。消毒切口后用4-0手术线逐层关腹。再次消毒，立即腹腔注射0.5ml的生理盐水。
2.CDs对脓毒症小鼠生存率的影响
实验分为生理盐水组、亚胺培南组、假手术组、HP-β-CD联合用药组以及γ-CD联合用药组，每组10只小鼠。CLP造模后，术后3h，生理盐水组腹腔注射0.5ml生理盐水，抗生素组腹腔注射100mg/kg亚胺培南溶液0.5ml，之后每8h按组别给予生理盐水或亚胺培南一次，至小鼠死亡或满3天；HP-β-CD与γ-CD联合用药组除与抗生素组一样注射抗生素外，术后3h腹腔注射25mM HP-β-CD或γ-CD溶液0.5ml，之后每天给予一次至满3天。假手术组与生理盐水组给药相同。观察小鼠7天内的死亡情况，并计算生存率。
7天内CLP所致的脓毒症小鼠的生存率(％)结果如图9所示。结果表明，假手术组7天内的生存率为100％；生理盐水组未用任何药物干预组，7天内的生存率为20％；亚胺培南组7天内的生存率为70％；亚胺培南+γ-CD组7天内的生存率为90％；亚胺培南+HP-β-CD组7天内的生存率为100％。
与生理盐水组相比，亚胺培南组以及两种CDs联合亚胺培南组均能显著提高脓毒症小鼠的生存率(P＜0.05)；与亚胺培南抗生素相比，两种CDs联合亚胺培南组亦有显著性提高脓毒症小鼠生存率的作用(P＜0.05)；亚胺培南+γ-CD组和亚胺培南+HP-β-CD组比较，P＝0.3173＞0.05，无显著性差异。因此，结果表明：亚胺培南组以及两种CDs分别联合亚胺培南组均对脓毒症小鼠有明显的治疗作用，可有效降低其死亡率；两种CDs联合抗生素治疗，与抗生素单独用药相比，均显著提升脓毒症小鼠的死亡率(P＜0.05)，分别提供20％和30％。上述结果表明，HP-β-CD、γ-CD分别联合抗生素给药较单独使用抗生素更有治疗脓毒症的效果。
本发明所举实施方式或者实施例对本发明的目的、技术方案和优点进行了进一步详细说明,所应理解的是,以上所举实施方式或者实施例仅为本发明的优选实施方式而已，并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内对本发明所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.环糊精在制备治疗和/预防脓毒症的药物中应用，所述环糊精为γ-CD或HP-β-CD。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，脓毒症为G-感染引起的脓毒症，优选的，脓毒症为LPS或脂质A引起的脓毒症。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物为体内用药；优选的，所述药物形式为固态或液态；
更为优选的，固态形式的制剂选自粉剂、片剂、分散颗粒、胶囊、药丸或栓剂，优选的，粉剂及片剂可包含约5％至约95％的活性成分，适当的固体辅料可以是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖或者乳糖；
优选的，片剂、粉剂、药丸及胶囊为适于口服用的固态剂型；
更为优选的，液态形式的制剂选自溶液、悬浮液或乳液，还可制成注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，药物用药量为对应于小鼠细胞或小鼠5-50mM治疗活性的当量；优选的，小鼠细胞为RAM264.7细胞，小鼠为CLP小鼠；更为优选的，所述药物用药量为对应于小鼠细胞或小鼠50mM治疗活性的当量。
5.环糊精与抗生素联合用药在预防和/治疗脓毒症中的应用，所述环糊精为γ-CD或HP-β-CD。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述抗生素为治疗G-感染引起的脓毒症的抗生素种类；
优选的，抗生素为头孢类或β-内酰胺类抗生素，更优选的，头孢类抗生素选自头孢吡肟、头孢他啶、头孢曲松；β-内酰胺类抗生素选自亚胺培南、美罗培南。
7.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述药物为体内用药；优选的，所述药物形式为固态或液态；
更为优选的，固态形式的制剂选自粉剂、片剂、分散颗粒、胶囊、药丸或栓剂，优选的，粉剂及片剂可包含约5％至约95％的活性成分，适当的固体辅料可以是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖或者乳糖；
优选的，片剂、粉剂、药丸及胶囊为适于口服用的固态剂型；
更为优选的，液态形式的制剂选自溶液、悬浮液或乳液，还可制成注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。
8.根据权利要求5所述应用，其特征在于，药物中CDs用药量为对应于小鼠细胞或小鼠5-50mM治疗活性的当量，优选的小鼠细胞为RAM264.7细胞，小鼠为CLP小鼠；更为优选的，药物中CDs用药量为对应于小鼠细胞或小鼠25mM治疗活性的当量。
9.CDs在制备抑制LPS与巨噬细胞结合的药物或试剂中的应用，所述CDs选自α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD以及β-CD-聚合物中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，CDs的浓度为5mM以上。
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