CN107478821B - 用于检测孢子丝菌病的试剂盒 - Google Patents

用于检测孢子丝菌病的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本案涉及一种用于检测孢子丝菌病的试剂盒，包括有独立分装的预包被有标志抗原的反应板、酶标标志抗原、显色液和终止液。本案通过对特异性抗原的设计，利用双抗原夹心法Elisa实现血清样本中抗体的检测，有效克服了从菌株中直接提取标志抗原含量不足、纯度不高等缺陷，进而解决了由其引起的检测敏感性不足、耗时较长等问题；本试剂盒操作简单，程序简化，易于重复，易于自动化检测。

Description

用于检测孢子丝菌病的试剂盒
技术领域
本发明属于生物试剂盒领域，特别涉及一种用于检测孢子丝菌病的试剂盒。
背景技术
孢子丝菌病是由孢子丝菌复合体中的一种真菌感染所致慢性化脓性肉芽肿性的疾病，可以引起皮肤、皮下组织及附近淋巴系统的亚急性或慢性感染,另外也可引起黏膜、骨骼甚或系统性病变。孢子丝菌复合体包括：申克氏孢子丝菌，白色孢子丝菌、巴西孢子丝菌、球形孢子丝菌、卢里孢子丝菌和墨西哥孢子丝菌。
当前该病的诊断方法主要为真菌培养和组织病理检查，其中，真菌培养是孢子丝菌病诊断的金标准。但是这两种方法存在耗时长、操作繁琐、技术要求高等缺点，同时阳性率、特异性均较低。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种用于检测孢子丝菌病的试剂盒，本试剂盒基于孢子丝菌的六种亚种表面抗原的筛选分析，选择了一种共同的标志性抗原，通过构建体外真核表达系统，实现特异性抗原的量产，并据此研发灵敏度高、稳定性好的孢子丝菌病酶联免疫试剂盒，以期彻底解决传统诊断技术中敏感性不足和耗时较长等问题。
为实现上述目的，本发明的技术方案概述如下：
一种用于检测孢子丝菌病的试剂盒，其包括有独立分装的预包被有标志抗原的反应板、酶标标志抗原、显色液和终止液；
其中，所述标志抗原的序列为：
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAHPTSGHYYDDAESEACLNGKAVYVTSNTEHNSVVAIPIARNGSLLLNHATSTATGGRGGNGINPRGMPAGPDALFSQGSITSAGNYLFAVNAGSNTVTMLAIDEHDPTKVTVVGEPAELPGEFPTTVGASDKFNLVCVGLTGAKAGVSCASYSWYGLGPFDELRTFDLHQTTPPHGPTNTVSHVFFSGDQETVFTTVKGDPAVNNTGFLAAYPVEHIHSSCYAIPSVSHKGVISSPDGTAVLFGSTPIPDTTNLFVTDASFGAAILGIDDYEEASTLYKTVIPGQDATCWVAICPATHTAFVTDIRMNRLVEMSLVNAEIIGEPIDLTTFNTDPGLTEIRSGGSFVYALSPGNGTTEAWITVLNALTKKPVQHALLTPLGLDRNAMGMAILV。
优选的是，所述的用于检测孢子丝菌病的试剂盒，其中，所述酶标标志抗原通过将辣根过氧化物酶采用过碘酸钠法偶联于所述标志抗原上制得。
优选的是，所述的用于检测孢子丝菌病的试剂盒，其中，所述显色液为TMB显色液。
优选的是，所述的用于检测孢子丝菌病的试剂盒，其中，所述终止液为2mol/L的硫酸。
优选的是，所述的用于检测孢子丝菌病的试剂盒，其中，所述预包被有标志抗原的反应板通过以下步骤制得：
1)包被：选用透明96孔酶标板，以pH＝9.6的碳酸盐溶液作为包被缓冲液，将5μg/mL的所述标志抗原加入96孔酶标板中包被，4℃过夜孵育；
2)洗涤：用PBST缓冲液洗涤，拍干后于4℃保存；
3)封闭：向96孔酶标板中加入蛋白保护剂，以塑料膜封口，于37℃水浴2h，随后以PBST缓冲液洗涤，拍干，于4℃保存。
优选的是，所述的用于检测孢子丝菌病的试剂盒，其中，所述蛋白保护剂包括有氯化钾、甘油和PBST缓冲液。
优选的是，所述的用于检测孢子丝菌病的试剂盒，其中，所述氯化钾的比重为0.4-0.6％。
优选的是，所述的用于检测孢子丝菌病的试剂盒，其中，所述甘油的比重为3-4％。
优选的是，所述的用于检测孢子丝菌病的试剂盒，其中，所述标志抗原通过以下方法制得：将基因序列克隆至酵母表达载体pPICZalpha B，随后电转至毕赤酵母X-33，利用毕赤酵母X-33持续表达标志抗原。
本发明的有益效果是：本案通过对特异性抗原的设计，利用双抗原夹心法Elisa实现血清样本中抗体的检测，有效克服了从菌株中直接提取标志抗原含量不足、纯度不高等缺陷，进而解决了由其引起的检测敏感性不足、耗时较长等问题；本试剂盒操作简单，程序简化，易于重复，易于自动化检测。
附图说明
图1为本案标志抗原的凝胶电泳图。
图2为本案实施例1的酶联免疫检测结果柱状图。
图3为本案对比例1的酶联免疫检测结果柱状图。
图4为本案对比例2的酶联免疫检测结果柱状图。
图5为本案对比例3的酶联免疫检测结果柱状图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本案开发了一种用于检测孢子丝菌病的试剂盒，其包括有独立分装的预包被有标志抗原的反应板、酶标标志抗原、显色液和终止液；
其中，标志抗原的序列为：
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAHPTSGHYYDDAESEACLNGKAVYVTSNTEHNSVVAIPIARNGSLLLNHATSTATGGRGGNGINPRGMPAGPDALFSQGSITSAGNYLFAVNAGSNTVTMLAIDEHDPTKVTVVGEPAELPGEFPTTVGASDKFNLVCVGLTGAKAGVSCASYSWYGLGPFDELRTFDLHQTTPPHGPTNTVSHVFFSGDQETVFTTVKGDPAVNNTGFLAAYPVEHIHSSCYAIPSVSHKGVISSPDGTAVLFGSTPIPDTTNLFVTDASFGAAILGIDDYEEASTLYKTVIPGQDATCWVAICPATHTAFVTDIRMNRLVEMSLVNAEIIGEPIDLTTFNTDPGLTEIRSGGSFVYALSPGNGTTEAWITVLNALTKKPVQHALLTPLGLDRNAMGMAILV。该序列开头MRFP→EAEA段为信号肽序列。信号肽序列是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短(长度5-30个氨基酸)肽链，蛋白合成后，指引蛋白分泌到细胞外。
其中，标志抗原通过以下方法制得：将基因序列克隆至酵母表达载体pPICZalphaB，随后电转至毕赤酵母X-33，利用毕赤酵母X-33持续表达标志抗原。(电泳图见图1)
其中，酶标标志抗原通过将辣根过氧化物酶采用过碘酸钠法偶联于标志抗原上制得。过碘酸钠法是成熟技术，即在实验中NaIO4先将辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase，HRP)表面与酶活性无关的多糖羟基氧化成醛基，然后再与抗体蛋白上的游离氨基相结合形成Schiff碱，再进一步用硼氢化钠(NaBH4)还原生成稳定的酶标记抗体。所获酶标记抗体的产率高，酶与抗体的活性无重大损失，是目前最常用的方法。酶标的标记比优选控制在1:2-1:6。
其中，显色液为TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)显色液。终止液为2mol/L的硫酸。
其中，预包被有标志抗原的反应板通过以下步骤制得：
1)包被：选用透明96孔酶标板，以pH＝9.6的碳酸盐溶液作为包被缓冲液，将5μg/mL的标志抗原加入96孔酶标板中包被，4℃过夜孵育；
2)洗涤：用PBST缓冲液洗涤，拍干后于4℃保存；
3)封闭：向96孔酶标板中加入蛋白保护剂，以塑料膜封口，于37℃水浴2h，随后以PBST缓冲液洗涤，拍干，于4℃保存。
其中，蛋白保护剂包括有氯化钾、甘油和PBST缓冲液。氯化钾的比重优选为0.4-0.6％，甘油的比重优选为3-4％。
实施例1
采用上述方案，蛋白保护剂中氯化钾的比重为0.4％，甘油的比重为3％。
试剂盒的使用方法为：
1)：将待检血清10倍稀释，酶标标志抗原稀释5000-8000倍后备用；
2)：向预包被有标志抗原的反应板(包被浓度1μg/mL)的每孔加入50μL待检血清后，加入50μL酶标标志抗原，轻轻摇晃混匀，每孔100μL，37℃下水浴2h；
3)：洗涤五次，底物显色100μL/孔，避光室温孵育10-15min，随后每孔加50μL 2M硫酸终止反应。
4)：酶标仪检测450nm下的吸光值。
酶联免疫检测结果如图2所示，其中1-10为正常人血清；11-20为确认病人血清(通过培养镜检方法确定)。本试剂盒检测结果可见，假阳性率为0(1-10结果可见)。确诊病例中(11-20)可见，检测阳性率达90％。
对比例1
删去蛋白保护剂中的氯化钾，其余与实施例1相同。
酶联免疫检测结果如图3所示，假阳性率为0(1-10结果可见)。确诊病例中(11-20)可见，检测阳性率达80％。
对比例2
删去蛋白保护剂中的氯化钾，将3％的甘油替换为3％的BSA(牛血清白蛋白)，其余与实施例1相同。
酶联免疫检测结果如图4所示，假阳性率为0(1-10结果可见)。确诊病例中(11-20)可见，检测阳性率达70％。
对比例3
分别采用实施例1的条件和对比例2的条件将图2中13号样本试验重复10次，以考察本试剂盒的重复性和稳定性。
酶联免疫检测结果如图5所示，实施例1(1-10)的变异系数明显小于对比例2(11-20)的，说明本案采用的蛋白保护剂可使试剂盒具有更优的重复性和稳定性。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
标志抗原的序列为：
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAHPTSGHYYDDAESEACLNGKAVYVTSNTEHNSVVAIPIARNGSLLLNHATSTATGGRGGNGINPRGMPAGPDALFSQGSITSAGNYLFAVNAGSNTVTMLAIDEHDPTKVTVVGEPAELPGEFPTTVGASDKFNLVCVGLTGAKAGVSCASYSWYGLGPFDELRTFDLHQTTPPHGPTNTVSHVFFSGDQETVFTTVKGDPAVNNTGFLAAYPVEHIHSSCYAIPSVSHKGVISSPDGTAVLFGSTPIPDTTNLFVTDASFGAAILGIDDYEEASTLYKTVIPGQDATCWVAICPATHTAFVTDIRMNRLVEMSLVNAEIIGEPIDLTTFNTDPGLTEIRSGGSFVYALSPGNGTTEAWITVLNALTKKPVQHALLTPLGLDRNAMGMAILV。
基因序列为：CTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCATCCAACCTCTGGTCACTACTACGACGACGCTGAATCTGAAGCCTGCTTGAACGGTAAGGCCGTCTACGTTACCTCCAATACCGAGCACAACTCCGTCGTCGCCATTCCAATTGCCCGTAACGGTTCCTTGTTGTTGAACCACGCTACCTCTACCGCTACTGGTGGAAGAGGTGGTAACGGTATCAACCCTAGAGGAATGCCAGCCGGTCCAGATGCCTTGTTCTCCCAGGGATCTATCACTTCCGCTGGTAACTATTTGTTCGCCGTCAACGCCGGTTCCAATACTGTCACCATGTTGGCCATCGACGAGCATGACCCAACCAAGGTCACCGTCGTTGGTGAGCCAGCTGAGTTGCCAGGTGAGTTTCCAACTACCGTCGGTGCCTCTGACAAGTTCAACTTGGTCTGTGTTGGTTTGACCGGTGCCAAGGCTGGTGTCTCTTGTGCTTCCTACTCCTGGTACGGTTTGGGACCATTCGACGAGTTGAGAACCTTCGACTTGCACCAAACTACCCCTCCTCATGGTCCTACCAACACTGTCTCCCATGTCTTCTTCTCCGGTGACCAGGAGACCGTTTTCACTACTGTCAAGGGTGACCCAGCCGTTAACAACACCGGATTTTTGGCTGCTTACCCTGTCGAGCATATCCACTCCTCTTGCTACGCTATTCCATCCGTCTCTCACAAGGGTGTCATTTCTTCCCCAGATGGTACCGCTGTCTTGTTTGGATCCACCCCTATCCCTGACACCACCAACTTGTTCGTCACTGACGCCTCTTTCGGTGCCGCTATCTTGGGTATCGATGACTACGAGGAGGCTTCCACCCTTTACAAGACCGTTATCCCAGGTCAGGACGCCACTTGTTGGGTTGCTATCTGCCCTGCTACTCATACCGCCTTTGTCACCGACATCCGTATGAACAGATTGGTCGAAATGTCCTTGGTCAACGCCGAGATCATCGGAGAGCCAATTGATTTGACCACCTTTAATACTGATCCTGGTTTGACTGAGATTCGTTCCGGTGGTTCCTTCGTTTACGCCTTGTCCCCTGGAAACGGTACTACCGAGGCCTGGATCACCGTTCTTAACGCCCTTACCAAGAAGCCAGTTCAGCACGCCTTGTTGACCCCATTGGGTTTGGACCGTAACGCTATGGGTATGGCCATTTTGGTCGAAAACTTGTACTTCCAGGGTCACCACCACCACCATCATTAATCTAGA。

Claims (9)

1.一种用于检测孢子丝菌病的试剂盒，其特征在于，包括有独立分装的预包被有标志抗原的反应板、酶标标志抗原、显色液和终止液；
其中，所述标志抗原的序列为：
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAHPTSGHYYDDAESEACLNGKAVYVTSNTEHNSVVAIPIARNGSLLLNHATSTATGGRGGNGINPRGMPAGPDALFSQGSITSAGNYLFAVNAGSNTVTMLAIDEHDPTKVTVVGEPAELPGEFPTTVGASDKFNLVCVGLTGAKAGVSCASYSWYGLGPFDELRTFDLHQTTPPHGPTNTVSHVFFSGDQETVFTTVKGDPAVNNTGFLAAYPVEHIHSSCYAIPSVSHKGVISSPDGTAVLFGSTPIPDTTNLFVTDASFGAAILGIDDYEEASTLYKTVIPGQDATCWVAICPATHTAFVTDIRMNRLVEMSLVNAEIIGEPIDLTTFNTDPGLTEIRSGGSFVYALSPGNGTTEAWITVLNALTKKPVQHALLTPLGLDRNAMGMAILV。
2.根据权利要求1所述的用于检测孢子丝菌病的试剂盒，其特征在于，所述酶标标志抗原通过将辣根过氧化物酶采用过碘酸钠法偶联于所述标志抗原上制得。
3.根据权利要求1所述的用于检测孢子丝菌病的试剂盒，其特征在于，所述显色液为TMB显色液。
4.根据权利要求1所述的用于检测孢子丝菌病的试剂盒，其特征在于，所述终止液为2mol/L的硫酸。
5.根据权利要求1所述的用于检测孢子丝菌病的试剂盒，其特征在于，所述预包被有标志抗原的反应板通过以下步骤制得：
1)包被：选用透明96孔酶标板，以pH＝9.6的碳酸盐溶液作为包被缓冲液，将5μg/mL的所述标志抗原加入96孔酶标板中包被，4℃过夜孵育；
2)洗涤：用PBST缓冲液洗涤，拍干后于4℃保存；
3)封闭：向96孔酶标板中加入蛋白保护剂，以塑料膜封口，于37℃水浴2h，随后以PBST缓冲液洗涤，拍干，于4℃保存。
6.根据权利要求5所述的用于检测孢子丝菌病的试剂盒，其特征在于，所述蛋白保护剂包括有氯化钾、甘油和PBST缓冲液。
7.根据权利要求6所述的用于检测孢子丝菌病的试剂盒，其特征在于，所述氯化钾的比重为0.4-0.6％。
8.根据权利要求6所述的用于检测孢子丝菌病的试剂盒，其特征在于，所述甘油的比重为3-4％。
9.根据权利要求1所述的用于检测孢子丝菌病的试剂盒，其特征在于，所述标志抗原通过以下方法制得：将基因序列克隆至酵母表达载体pPICZalpha B，随后电转至毕赤酵母X-33，利用毕赤酵母X-33持续表达标志抗原。
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