CN107475283B - 一种超声波辅助农杆菌介导花粉的玉米转基因方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种使用超声波辅助农杆菌介导花粉的非组培转基因方法，属于基因工程技术领域。步骤为：（1）液体培养含有目的基因的农杆菌菌株，用营养液稀释至0.6～0.8OD；（2）将花粉溶于浓度为10～20%的蔗糖溶液中，超声波处理后静置，倒掉上清液；（3）将农杆菌悬浊液和花粉受体混合，加入50～200μmol/L乙酰丁香酮，静置5～15分钟，用细刷将沉淀的处理花粉授到待转化植物柱头上，并套袋挂牌标记，隔两天处理一次，反复2～3次，待转化植物籽粒成熟后收获播种，用筛选标记基因筛选即可获得转基因植株。本发明方法转化机理清楚，易于操作，可提高转化率和结实率，稳定性好，具有较大的实用价值。

Description

一种超声波辅助农杆菌介导花粉的玉米转基因方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种使用超声波辅助农杆菌介导花粉的非组培转基因方法。
背景技术
转基因技术能够使优良基因跨物种交流，从而实现对农作物的品质和产量等性状进行定向、精确的改良。转基因作物在产量、抗逆性和营养品质等方面较传统作物有显著改进，还能大大降低生产成本，减少农业生产中的环境污染。自1983年第一例转基因植物（转基因烟草）问世以来，科学家就试图不同的转基因方法，改良不同作物的不同性状，探索出了多种植物转基因方法。目前植物转基因研究采用主要有两种方法，一是农杆菌介导的遗传转化法，二是DNA直接导入的转化法。后者主要包括基因枪、花粉管通道法、子房注射法、PEG法、电击法、超声波介导法。
农杆菌介导的遗传转化法是植物转基因技术中经常采用的一种方法。具有转化机理清楚，转化率高，方法成熟，简便易行，转移基因明确 (T-DNA 左右边界之间序列)，能够转化大片段的DNA，转化的外源基因以单或低拷贝整合到植物基因组中，遗传稳定性好，符合孟德尔定律等特点。然而，由于一些植物种或品种的组织培养再生困难而使得这种方法具有很大基因型依赖性，因而受到很大的局限。同时由于植物组织培养过程中易造成体细胞变异、再生苗移栽过程中夭亡等，使本已不高的转化率又大打折扣，这些缺陷都大大限制了植物转基因技术的广泛应用。因此简化植物转化方法是不少相关研究人员的努力方向。
超声波处理花粉介导植物基因转化方法是DNA直接导入转化法中的一种。是一种不需要组织或细胞培养的植物遗传转化方法。由孙毅（1999）等人提出，通过使用超声波细胞粉碎仪处理花粉悬浮液，花粉为新鲜花粉，溶液为 5—15％蔗糖溶液加入不低于 40μg/L外源 DNA，超声波每次处理 5 秒，间隔 10 秒，共处理 5—8 次，收集超声波处理后的花粉授于植物柱头上，并从受体上收获种子，在后代中筛选转化植株。该方法不需经过冗长繁琐的组织培养过程，具有简便、有效、快速和经济等特点，因此实用性强，能够与常规育种方法有机结合被广大作物育种工作者直接应用。但该方法的主要缺点之一是授粉后结实率较低，这显然是由于经过超声波处理的花粉大多数丧失了生活力，无法正常完成受精过程。
2011年孙毅等人提出了改良版的超声波辅助花粉介导植物转基因方法，明确了超声波细胞粉碎仪的使用功率范围，减轻了超声波对花粉的破坏力，提高了结实率，进而提高每次处理获得的转化体数。然而，由于DNA片段没有自主性，不能实现外源基因自主向植物细胞转移并且整合的能力，造成该方法存在不能很好的转化大片段的DNA，DNA片段越大转化的效率越低，且后代遗传稳定性不好。
为了解决现有超声波辅助花粉介导植物转基因方法中存在的大片段DNA转化率低，稳定性差的问题，本发明研发了一种新的使用超声波辅助农杆菌介导花粉的非组培转基因方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种使用超声波辅助农杆菌介导花粉的非组培转基因方法，是将无自主转移和结合能力的质粒载体，换成活体农杆菌菌株，这样既可以省去了植物组培过程的冗长繁琐，同时具备了农杆菌介导通过再生途径获得转基因苗的遗传转化方法的全部优点。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种使用超声波辅助农杆菌介导花粉的非组培转基因方法，步骤为：
（1）液体培养含有目的基因的农杆菌菌株，用营养液稀释至0.6～0.8OD，获得农杆菌悬浊液；
（2）将花粉溶于浓度为10～20%的蔗糖溶液中，经超声波处理后静置，倒掉上清液，获得超声处理后的花粉受体；
（3）将农杆菌悬浊液和花粉受体混合，加入50～200μmol/L乙酰丁香酮，静置处理5～15分钟，用细刷将沉淀的处理花粉授到待转化植物柱头上，并套袋挂牌标记，每隔两天处理一次，反复处理2～3次，待转化植物籽粒成熟后收获播种后，利用筛选标记基因筛选即可获得转基因植株。
进一步地，所述的农杆菌悬浮液含有蔗糖，蔗糖的浓度为5～10％，糖的粘性能够使农杆菌充分与植物花粉细胞相结合。
所述的步骤（2）是将在0～4℃保存5天以内的花粉溶于蔗糖溶液。
所述的花粉加入蔗糖溶液前，首先使用空气泵给蔗糖溶液连续通气30分钟以上，使蔗糖溶液中的空气含量达到饱和状态，同时将蔗糖溶液置于0～4℃冰浴或冰箱中预处理，然后再加入花粉，混合后加入乙酰丁香酮可以诱导农杆菌Vir区基因的活化与表达，促进T-DNA的加工与转移，从而使农杆菌T-DNA更易进入植物基因组并与其整合
所述的超声波处理所用超声波功率为50～500W，时间为5秒～2分钟。
所述的花粉受体和农杆菌悬浊液混合，混合液中蔗糖浓度保持在5～15%，混合液的液面高度不得超出花粉沉淀层面的0.5cm。
所述含有目的基因的农杆菌的获得是将目的基因插入植物表达载体中，再将该表达载体导入农杆菌菌株中，其中所述的植物表达载体为pCB系列载体、pBin 系列载体、pBI系列载体、Gateway 系列载体、或pCAMBIA系列载体，如pCB2004、pBin19、pBI121、pH2GW7、或pCAMBIA1302。
所述的农杆菌菌株为LBA4404或EHA105。
所述的转化材料为单子叶的玉米、或者双子叶植物。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
（1）可以显著提高授粉植株结实率，98.5%以上的植株都能收获种子，进而提高每次处理获得的转化体数；
（2）克服了超声波辅助植物花粉介导转基因方法的稳定性不好、大片段不好转化的缺点和不足；
(3)避开了繁冗、操作要求高的植物组织培养过程，同时具备了农杆菌介导通过再生途径获得转基因苗的遗传转化方法的全部优点。
综上所述，本发明方法转化机理清楚，易于操作，可提高转化率和结实率，稳定性好，具有较大的实用价值。
附图说明
图 1 是实施例1中植物表达载体pCB2004-AtHDG11的T-DNA区域；
图 2是实施例1中 PCR 检测 T1 代转基因植株HDG11基因的电泳结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一、材料与方法（1）玉米材料：玉米材料选用优良自交系昌7-2。
（2）菌种：农杆菌 LBA4404。
（3）载体：pCB2004-AtHDG11，如图1所示；植物表达载体，启动子为 35S Promoter，终止子为 Tnos；第一个表达盒编码基因为草铵膦抗性基因Bar基因，第二个表达盒编码基因为AtHDG11基因。
（4）工具酶和试剂盒：各种酶和试剂盒购自三博远志公司、NEB公司及Fermentas公司。
（5）化学试剂：化学药品均为国内外分析纯。
（6）引物合成：由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。
二、超声波辅助农杆菌介导花粉非组培转化获得玉米转基因植株农杆菌的培养及转化菌液的准备：
（1）挑取含有质粒：pCB2004-AtHDG11的农杆菌单克隆子，接种于5mL YEB( 含卡那霉素 50mg/L、壮观霉素 50mg/L、利福平25mg/L)液体培养基中，28℃ 250rpm过夜培养；吸取过夜培养菌液 1mL 接种于100mL YEB(含卡那霉素50mg/L、壮观霉素 50mg/L、利福平25mg/L)液体培养基中，28℃ 250rpm 过夜培养，直至OD600 ＝0.8～1，将培养好的菌液在4000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀，用稀释液（含有5～10％蔗糖溶液）重悬至OD600＝0.6～0.8，用于植物转化；
（2）花粉准备与处理：大田春播玉米花粉在0-4℃冰箱培养皿内，干燥保存可达5天仍有一定萌发率，并且发现刚采回的花粉易破萌发率低，保存2h以上萌发率明显提高，48h以内花粉具有较高的生活力；选取生长处于盛花期，生长健壮的植株的花粉作为受体；盛花期收集当天10点到12点开花的玉米花粉，过筛去杂，置于培养皿内（加盖），冰箱4℃保存；第一天下午给雄穗套袋时应把旧花粉去除，授粉当日用干净洁净的纸袋从田间取花粉；将花粉从冰箱中取出置于15%-20%蔗糖溶液中，超声波处理(超声波处理参数为：声强100W～200W, 工作时间为5s，间隔6s, 工作次数6次)，处理后将花粉悬浮液略微静置后倒掉上清液；
（3）农杆菌菌液侵染玉米花粉：以一定比例将花粉和农杆菌混合，同时加入50～200μmol/L乙酰丁香酮，静置处理5～15分钟，用细刷将沉淀的处理花粉涂抹于套袋隔离的玉米花丝上，并套袋挂牌标记；每隔两天处理一次，反复处理2～3次；
（4）T0代种子收获及T1代筛选：种子成熟后将T0代种子混收，播种于大田，使用除草剂筛选抗性植株；选在5～6片真叶时期对转化植株的真叶涂抹0.2% 的草铵膦溶液，无斑点或者黄叶出现的植株即为转基因候选；
（5）T1代转基因阳性植株 PCR 检测：对表现草铵膦抗性的植株， PCR 检测HDG11基因，基因组提取方法采用改良的CTAB法，设计引物序列如下 ：
HDG11基因引物
H-Fp( 正向引物 ) ATGAGTTTCGTCGTCGGCGT
H-Rp( 反向引物 ) TGCCGGTCATAATAGGCTTATC
利用 HDG11基因引物以抗性转基因植株基因组为DNA模板，扩增 HDG11基因，扩增体系为 ：
PCR Buffer 5μl
10mM dNTP 1μl
正向引物 (10μM) 1μl
反向引物 (10μM) 1μl
Taq 0.5μl(2.5U)
模板 1μl(10pg)
ddH2O 40.5μl。
PCR 条 件 ：94 ℃，5min ；94 ℃，45Sec ；58 ℃，45Sec ；72 ℃，45Sec ；35cycle；72 ℃， 10min；
反应结束后，对 PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，转化成功可检测到700bp的HDG11基因片段，结构如图2所示；
本实验共进行了10次独立的转基因事件，每次涂抹60棵植株，共获得了623颗种子，大田种植后409颗出苗，除草剂检测获得126株转基因植株，PCR检测得到84株转基因植株，即本发明方法对玉米进行高效的遗传转化，对玉米基因工程及分子育种具有重要意义。

Claims (9)

1.一种使用超声波辅助农杆菌介导花粉的非组培转基因方法，其特征在于，步骤为：
（1）液体培养含有目的基因的农杆菌菌株，用营养液稀释至0.6～0.8OD，获得农杆菌悬浊液；
（2）将花粉溶于浓度为10～20%的蔗糖溶液中，经超声波处理后静置，倒掉上清液，获得超声处理后的花粉受体；
（3）将农杆菌悬浊液和花粉受体混合，加入50～200μmol/L乙酰丁香酮，静置处理5～15分钟，用细刷将沉淀的处理花粉授到待转化植物柱头上，并套袋挂牌标记，每隔两天处理一次，反复处理2～3次，待转化植物籽粒成熟后收获播种后，利用筛选标记基因筛选即可获得转基因植株；
所述的花粉受体和农杆菌悬浊液混合，混合液中蔗糖浓度保持在5～15%，混合液的液面高度不得超出花粉沉淀层面的0.5cm。
2.根据权利要求1所述的使用超声波辅助农杆菌介导花粉的非组培转基因方法，其特征在于，所述的农杆菌悬浮液含有蔗糖，蔗糖的浓度为5～10％。
3.根据权利要求1或2所述的使用超声波辅助农杆菌介导花粉的非组培转基因方法，其特征在于，所述的步骤（2）是将在0～4℃保存5天以内的花粉溶于蔗糖溶液。
4.根据权利要求1或2所述的使用超声波辅助农杆菌介导花粉的非组培转基因方法，其特征在于，所述的花粉加入蔗糖溶液前，首先使用空气泵给蔗糖溶液连续通气30分钟以上，使蔗糖溶液中的空气含量达到饱和状态，同时将蔗糖溶液置于0～4℃冰浴或冰箱中预处理，然后再加入花粉。
5.根据权利要求1或2所述的使用超声波辅助农杆菌介导花粉的非组培转基因方法，其特征在于，所述的超声波处理所用超声波功率为50～500W，时间为5秒～2分钟。
6.根据权利要求1或2所述的使用超声波辅助农杆菌介导花粉的非组培转基因方法，其特征在于，所述含有目的基因的农杆菌的获得是将目的基因插入植物表达载体中，再将该表达载体导入农杆菌菌株中，其中所述的植物表达载体为pCB系列载体、pBin系列载体、pBI系列载体、Gateway系列载体、或pCAMBIA系列载体。
7.根据权利要求6所述的使用超声波辅助农杆菌介导花粉的非组培转基因方法，其特征在于，所述的植物表达载体为pCB2004、pBin19、pBI121、pH2GW7、或pCAMBIA1302。
8.根据权利要求1或2所述的使用超声波辅助农杆菌介导花粉的非组培转基因方法，其特征在于，所述的农杆菌菌株为LBA4404或EHA105。
9.根据权利要求1或2所述的使用超声波辅助农杆菌介导花粉的非组培转基因方法，其特征在于，所述的转化材料为单子叶的玉米、或者双子叶植物。
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