CN107462660A - 婴幼儿食品及奶粉中低聚半乳糖含量离子色谱法测定方法 - Google Patents

婴幼儿食品及奶粉中低聚半乳糖含量离子色谱法测定方法 Download PDF

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吴玉平
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Abstract

本发明提供一种婴幼儿食品及奶粉中低聚半乳糖含量离子色谱法测定方法。该方法包括:(1)将含低聚半乳糖的溶液与淀粉酶接触,得到第一溶液;(2)将等量的两份第一溶液,分别与β‑半乳糖苷酶和磷酸盐缓冲液接触,得到第二溶液和第三溶液;(3)在第二溶液和第三溶液中分别加入乙腈,过滤,然后将第二溶液和第三溶液冷却处理;(4)将步骤(3)冷却处理后的第二溶液和第三溶液稀释,得到稀释液A和稀释液B;以及(5)采用离子色谱法测试稀释液A中的半乳糖浓度,稀释液B中的乳糖浓度和半乳糖浓度,得到低聚半乳糖的含量。本发明能够克服现有婴幼儿食品及奶粉中低聚半乳糖含量测定方法中,干扰物质过多造成的测试结果不准确的缺陷。

Description

婴幼儿食品及奶粉中低聚半乳糖含量离子色谱法测定方法
技术领域
本发明涉及分析化学领域,尤其是涉及含低聚半乳糖的制品中,低聚半乳糖含量的测定方法。采用带积分安培检测器的离子色谱仪,检测制品中的低聚半乳糖含量。
背景技术
低聚半乳糖,简称GOS,是一种具有天然属性的功能性低聚糖,其分子结构一般是在半乳糖或葡萄糖分子上连接1-7个半乳糖基,即Gal-(Gal)n-Glc/Gal(n为0-6),分子量约300-2000。
低聚半乳糖在人母乳中含量较多,婴儿体内的双歧杆菌菌群的建立依赖于母乳中的GOS。GOS直接进入大肠,能够被人体肠内益生菌所利用,能够抑制人体肠内有害菌的生长繁殖,有较强的耐酸性、耐热性。低聚半乳糖成为了婴幼儿食品、奶粉中的重要成分。
低聚半乳糖属于低聚糖,其分离检测一直是当前研究的难点和重点。当前低聚半乳糖的检测主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱质谱法等等。由于样品中游离的乳糖、半乳糖含量,影响测定结果准确性的重要因素。
发明内容
本发明解决的技术问题是:为了克服现有婴幼儿食品及奶粉中低聚半乳糖含量测定方法中,干扰物质过多造成的测试结果不准确的缺陷,提供一种婴幼儿食品及奶粉中低聚半乳糖含量的离子色谱法测定方法。将婴幼儿食品及奶粉样品酶解,将低聚糖转化成单糖,用带积分安培检测器的离子色谱仪分别检测酶解前的样品和酶解后的样品,折算出低聚糖的含量。本发明可以把乳糖和半乳糖目标峰分开,灵敏度和检出限较低。
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种含低聚半乳糖制品中低聚半乳糖含量的测定方法,该方法包括:
(1)将含低聚半乳糖的溶液与淀粉酶接触,得到第一溶液;
(2)将等量的两份第一溶液,分别与β-半乳糖苷酶溶液和磷酸盐缓冲液接触,得到第二溶液和第三溶液;
(3)在第二溶液和第三溶液中分别加入乙腈,过滤,然后将第二溶液和第三溶液冷却处理;
(4)将步骤(3)冷却处理后的第二溶液和第三溶液稀释,得到稀释液A和稀释液B;以及
(5)采用离子色谱法测试稀释液A中的半乳糖浓度,稀释液B中的乳糖浓度和半乳糖浓度,得到低聚半乳糖的含量。
优选的,步骤(4)中,将骤(3)冷却处理后的第二溶液和第三溶液稀释至半乳糖和/或乳糖的线性区间是0.5~20μg/mL,然后0.20-0.30μm滤膜过滤,优选采用0.22μm滤膜过滤。
优选的,所述离子色谱法,流动相:A为H2O,B为100mM NaOH,C为100mM NaOH+500mMNaHAC;
梯度洗脱条件为:0-37min,A:B:C=90:10:0;37-42min,A:B:C=0:0:100;42-67min,A:B:C=90:10:0。
优选的,步骤(1)中,将含低聚半乳糖的溶液与淀粉酶在40-80℃,优选60℃水浴振荡25-60分钟,优选30分钟,然后冷却;其中,淀粉酶的用量为:8-9g/L,优选8.33g/L。
优选的,所述磷酸盐缓冲液的pH值为5.5-6.5,优选6,磷酸盐缓冲液为0.2mol/l
优选的,所述β-半乳糖苷酶溶液为含有β-半乳糖苷酶溶液的磷酸盐缓冲液,其中β-半乳糖苷酶含量为12-17g/100ml磷酸盐缓冲液,优选β-半乳糖苷酶含量15g/100ml磷酸盐缓冲液。
优选的,步骤(2)中,所述β-半乳糖苷酶溶液与第一溶液的体积比用量为10:0.6,所述磷酸盐缓冲液与第一溶液的体积比用量为10:0.6。
优选的,步骤(2)中,将等量的两份第一溶液,分别与β-半乳糖苷酶溶液和磷酸盐缓冲液,50-70℃水浴振荡60-90分钟,优选60℃水浴震荡60分钟,然后100℃沸水浴8-20min,优选10min。
优选的,低聚半乳糖GOS的含量由下述公式计算得到
GOS=K×(T-G-L/1.9);
其中,K为换算系数,由下述公式计算得到,
在该公式中,n为低聚半乳糖的平均聚合度;
T为含低聚半乳糖的溶液中总半乳糖的含量,单位为毫克每百克(mg/100g),由下述公式计算得到,
ct为稀释液A中的半乳糖的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
f为第二溶液的稀释倍数;
m为含低聚半乳糖的溶液中的固含量,单位为克(g);
G为含低聚半乳糖的溶液中天然半乳糖的含量,单位为毫克每百克(mg/100g):
cg为稀释液B中的半乳糖的浓度,单位为微克每毫升(g/mL);
f为第三溶液的稀释倍数;
m为含低聚半乳糖的溶液中的固含量,单位为克(g);
L为含低聚半乳糖的溶液中乳糖的含量,单位为毫克每百克(mg/100g);
cl为稀释液B中乳糖的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
f为第三溶液的稀释倍数;
m为含低聚半乳糖的溶液中的固含量,单位为克(g)。
优选的,当f=100时,蔗糖含量的计算公式为为:L=40000cl/3m。
采用本发明的技术方案,至少具有如下有益效果:本发明避免了干扰物质成分的干扰,提高了精密度,缩短了进样时间,故也节约了试剂用量。本发明离子色谱法实验条件使得目标峰按顺序洗脱,对称性好,乳糖和半乳糖目标峰能够分开。另外,本发明洗脱所需时间短。
附图说明
图1是实施例1的脉冲积分安培检测波形图。
图2是半乳糖、乳糖标准品的离子色谱图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的内容,下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步的说明,但具体的实施方式并不是对本发明所做的限制。
本发明将婴幼儿食品及奶粉样品酶解(例如在60℃水浴下酶解),将低聚糖转化成单糖,用带积分安培检测器的离子色谱仪分别检测酶解前的样品和酶解后的样品,折算出低聚糖的含量。
具体的,一种含低聚半乳糖制品中低聚半乳糖含量的测定方法,该方法包括:
(1)将含低聚半乳糖的溶液与淀粉酶接触,得到第一溶液;
(2)将等量的两份第一溶液,分别与β-半乳糖苷酶溶液和磷酸盐缓冲液接触,得到第二溶液和第三溶液;
(3)在第二溶液和第三溶液中分别加入乙腈,过滤,然后将第二溶液和第三溶液冷却处理,例如0-10℃冷藏5-25小时,优选4℃冷藏过夜;
(4)将步骤(3)冷却处理后的第二溶液和第三溶液稀释,得到稀释液A和稀释液B;以及
(5)采用离子色谱法测试稀释液A中的半乳糖浓度,稀释液B中的乳糖浓度和半乳糖浓度,得到低聚半乳糖的含量。
低聚半乳糖GOS的含量由下述公式计算得到
GOS=K×(T-G-L/1.9);
其中,K为换算系数,由下述公式计算得到,
在该公式中,n为低聚半乳糖的平均聚合度;
T为含低聚半乳糖的溶液中总半乳糖的含量,单位为毫克每百克(mg/100g),由下述公式计算得到,
ct为稀释液A中的半乳糖的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
f为第二溶液的稀释倍数;
m为含低聚半乳糖的溶液中的固含量,单位为克(g);
G为含低聚半乳糖的溶液中天然半乳糖的含量,单位为毫克每百克(mg/100g):
cg为稀释液B中的半乳糖的浓度,单位为微克每毫升(g/mL);
f为第三溶液的稀释倍数;
m为含低聚半乳糖的溶液中的固含量,单位为克(g);
L为含低聚半乳糖的溶液中乳糖的含量,单位为毫克每百克(mg/100g);
cl为稀释液B中乳糖的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
f为第三溶液的稀释倍数;
m为含低聚半乳糖的溶液中的固含量,单位为克(g)。
实施例
试剂和材料
实施例中所用试剂除特殊规定外,所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。请补充下表
表1
名称 厂家 性能
磷酸二氢钾 分析纯
磷酸氢二钾 分析纯
β-半乳糖苷酶 Amano Enzyme Inc.
Taka淀粉酶 sigma,129U/mg
50%氢氧化钠 FLUKA
溶液的配制
磷酸盐缓冲液(GOS缓冲液):分别准确称取22.0g KH2PO4和6.0g K2HPO4·3H2O,以水溶解定容于1L容量瓶,现用现配。
β-半乳糖苷酶溶液(GOS酶):称取约1.5gβ-半乳糖苷酶溶液,溶解于10mL磷酸盐缓冲溶液,现用现配。
标准物质和溶液
标准物质
半乳糖(sigma纯度为98.5%)、乳糖(sigma纯度为99.5%)
标准储备液
半乳糖和乳糖:105℃烘干4小时,分别称取约100mg,以水定容至100mL,4℃冰箱中可密封储存1个月。
标准工作液
半乳糖和乳糖:准确移取储备液3.3.2.2各50μL、100μL、200μL、500μL、1mL、2mL,以水定容至100mL,得到0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0mg/L的标准系列,现用现配。
仪器和设备
表2
实施例1
称取试样2.5g(精确至0.001g),置于50mL容量瓶中,加入0.25g Taka淀粉酶(3.1.8),约30mL温水,摇匀溶解。将容量瓶放入60℃水浴振荡30分钟。冷却至室温后以水定容至50mL,得到第一溶液。
分别移取得到第一溶液(酶解后的溶液)0.6mL、0.6mL至50mL离心管中,对应标记为GOSA、GOSB。
在GOSA和GOSB中各加入9.4mlGOS缓冲液,然后在GOSA中加入1.0mlGOS酶,在GOSB中加入1.0mL GOS缓冲液,60℃水浴振荡下酶解1小时,100℃沸水浴10min。得到第二溶液和第三溶液。
第二溶液和第三溶液冷却后,在第二溶液和第三溶液中加入5ml质量百分浓度为20wt%的乙腈溶液,涡旋1分钟后离心分离,滤液可在4℃下密封冷藏过夜。
滤液稀释100倍后过0.22μm滤膜,得到稀释液A和稀释液B待测,可根据样品中目标物质含量调整稀释倍数。
采用色谱法测定稀释液A中的半乳糖浓度,稀释液B中的乳糖浓度和半乳糖浓度。
色谱条件:
a.色谱柱:CarboPac PA20 150×3mm或相当者;
b.色谱柱温度:30℃
c.进样量:10μL
d.流量:0.4mL/min
e.流动相:A:H2O
B:100mM NaOH
C:——
D:100mM NaOH+500mM NaHAC
表3低聚半乳糖测定的流动相梯度
分别将半乳糖和乳糖混合标准溶液、稀释液A、稀释液B注入离子色谱中测定相应的峰高,使用脉冲积分安培检测模式,AgCl参比电极,Au工作电极,糖检测标准四电位波形,如图1所示。
根据样液中各组分浓度的实际情况,调整稀释倍数,以使其处于标准溶液的线性区间内。糖类物质在离子色谱分离过程中具有保留时间不稳定的特性,因此除了在序列开始时必须进样一套标准外,每分析5到10针样品,必须插入一针标准品以做对比。
测得稀释液A中的半乳糖浓度为5.5562μg/ml,稀释液B中的乳糖浓度为9.4521ug/ml,半乳糖浓度为1.4562μg/ml。
经过如下公式计算得到低聚半乳糖GOS的含量为4.982ug/ml
低聚半乳糖GOS的含量由下述公式计算得到
GOS=K×(T-G-L/1.9);
其中,K为换算系数,由下述公式计算得到,
在该公式中,n为低聚半乳糖的平均聚合度;
该实施例中,n为3,K为1.233333。
T为含低聚半乳糖的溶液中总半乳糖的含量,单位为毫克每百克(mg/100g),由下述公式计算得到,
ct为稀释液A中的半乳糖的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
f为第二溶液的稀释倍数;
m为含低聚半乳糖的溶液中的固含量,单位为克(g);
G为含低聚半乳糖的溶液中天然半乳糖的含量,单位为毫克每百克(mg/100g):
cg为稀释液B中的半乳糖的浓度,单位为微克每毫升(g/mL);
f为第三溶液的稀释倍数;
m为含低聚半乳糖的溶液中的固含量,单位为克(g);
L为含低聚半乳糖的溶液中乳糖的含量,单位为毫克每百克(mg/100g);
cl为稀释液B中乳糖的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
f为第三溶液的稀释倍数;
m为含低聚半乳糖的溶液中的固含量,单位为克(g)。

Claims (10)

1.一种含低聚半乳糖制品中低聚半乳糖含量的测定方法,该方法包括:
(1)将含低聚半乳糖的溶液与淀粉酶接触,得到第一溶液;
(2)将等量的两份第一溶液,分别与β-半乳糖苷酶溶液和磷酸盐缓冲液接触,得到第二溶液和第三溶液;
(3)在第二溶液和第三溶液中分别加入乙腈,过滤,然后将第二溶液和第三溶液冷却处理;
(4)将步骤(3)冷却处理后的第二溶液和第三溶液稀释,得到稀释液A和稀释液B;以及
(5)采用离子色谱法测试稀释液A中的半乳糖浓度,稀释液B中的乳糖浓度和半乳糖浓度,得到低聚半乳糖的含量。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(4)中,将骤(3)冷却处理后的第二溶液和第三溶液稀释至半乳糖和/或乳糖的线性区间是0.5~20μg/mL,然后0.20-0.30μm滤膜过滤,优选采用0.22μm滤膜过滤。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述离子色谱法,流动相:A为H2O,B为100mM NaOH,C为100mM NaOH+500mM NaHAC;
梯度洗脱条件为:0-37min,A:B:C=90:10:0;37-42min,A:B:C=0:0:100;42-67min,A:B:C=90:10:0。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,将含低聚半乳糖的溶液与淀粉酶在40-80℃,优选60℃水浴振荡25-60分钟,优选30分钟,然后冷却;其中,淀粉酶的用量为:8-9g/L,优选8.33g/L。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法,其特征在于,所述磷酸盐缓冲液的pH值为5.5-6.5,优选pH值为6,磷酸盐缓冲液浓度为0.2mol/l。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述β-半乳糖苷酶溶液为含有β-半乳糖苷酶溶液的磷酸盐缓冲液,其中β-半乳糖苷酶含量为12-17g/100ml磷酸盐缓冲液,优选β-半乳糖苷酶含量15g/100ml磷酸盐缓冲液。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述β-半乳糖苷酶溶液与第一溶液的体积比用量为10:0.6,所述磷酸盐缓冲液与第一溶液的体积比用量为10:0.6。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,将等量的两份第一溶液,分别与β-半乳糖苷酶溶液和磷酸盐缓冲液,50-70℃水浴振荡60-90分钟,优选60℃水浴震荡60分钟,然后100℃沸水浴8-20min,优选10min。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法,其特征在于:
低聚半乳糖GOS的含量由下述公式计算得到
GOS=K×(T-G-L/1.9);
其中,K为换算系数,由下述公式计算得到,在该公式中,n为低聚半乳糖的平均聚合度;
T为含低聚半乳糖的溶液中总半乳糖的含量,单位为毫克每百克(mg/100g),由下述公式计算得到,
ct为稀释液A中的半乳糖的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
f为第二溶液的稀释倍数;
m为含低聚半乳糖的溶液中的固含量,单位为克(g);
G为含低聚半乳糖的溶液中天然半乳糖的含量,单位为毫克每百克(mg/100g):
<mrow> <mi>G</mi> <mo>=</mo> <mn>400</mn> <mo>&amp;times;</mo> <mfrac> <mrow> <mi>f</mi> <mo>&amp;times;</mo> <msub> <mi>c</mi> <mi>g</mi> </msub> </mrow> <mrow> <mn>3</mn> <mo>&amp;times;</mo> <mi>m</mi> </mrow> </mfrac> </mrow>
cg为稀释液B中的半乳糖的浓度,单位为微克每毫升(g/mL);
f为第三溶液的稀释倍数;
m为含低聚半乳糖的溶液中的固含量,单位为克(g);
L为含低聚半乳糖的溶液中乳糖的含量,单位为毫克每百克(mg/100g);
<mrow> <mi>L</mi> <mo>=</mo> <mfrac> <mrow> <mi>f</mi> <mo>&amp;times;</mo> <msub> <mi>c</mi> <mi>l</mi> </msub> </mrow> <mrow> <mn>1000</mn> <mo>&amp;times;</mo> <mi>m</mi> </mrow> </mfrac> <mo>&amp;times;</mo> <mfrac> <mn>16</mn> <mn>0.5</mn> </mfrac> <mo>&amp;times;</mo> <mn>50</mn> <mo>&amp;times;</mo> <mn>100</mn> </mrow>
cl为稀释液B中乳糖的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
f为第三溶液的稀释倍数;
m为含低聚半乳糖的溶液中的固含量,单位为克(g)。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,当f=100时,蔗糖含量的计算公式为为:L=40000cl/3m。
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Title
李建文 等: "高效离子色谱法测定糖浆中低聚半乳糖含量", 《卫生研究》 *
林慧 等: "高效阴离子交换色谱法测定食品中的低聚半乳糖", 《第六届华东地区色谱质谱学术报告会论文集》 *
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CN111537662A (zh) * 2020-06-01 2020-08-14 江苏中烟工业有限责任公司 一种同时测定烟草及烟草制品中纤维素、半纤维素和木质素的检测方法
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