CN107447050B - 一种利用转录组测序全面快速检测大蒜rna病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用转录组测序全面快速检测大蒜病毒的方法。此技术基于转录组测序的转录组技术，利用从头组装和蛋白比对等生物信息学分析方法，筛选大蒜病毒特异表达基因，设计大蒜病毒的荧光定量PCR引物，短时间内快速全面检测大蒜病毒。这个方法灵敏度高、特异性强、检测全面、速度快、总体成本低，可大规模应用于商业化大规模病毒检测、科学研究、病毒口岸和产地检疫。

Description

一种利用转录组测序全面快速检测大蒜RNA病毒的方法

技术领域

本发明涉及植物RNA病毒检测，具体涉及一种利用转录组测序全面快速检测大蒜RNA病毒的方法。

背景技术

植物病毒有“植物癌症”之称，其繁殖速度快，传播方式多种多样，一旦大面积传播很难加以控制。某些植物病毒常常表现为复合侵染，并难以通过提纯病毒的方法将他们分离，因此传统的病毒检测方法通常难以达到理想的检测目的。大蒜(Allium sativum L.)，作为是百合科葱属最主要的植物之一，有着两千多年的栽培历史，是十分具有营养价值和药用价值的调味品、蔬菜和药材。生产中的大蒜花粉败育，主要以鳞茎进行无性繁殖，病毒一旦入侵大蒜植株，由鳞茎母体带病毒，常年无性繁殖垂直传染给后代，导致病毒逐代传递并积累，造成病毒病害逐年加重和大蒜种性退化，降低产量30％～80％，经济损失巨大，严重时甚至毁种。

大蒜主要受3个病毒属的12种病毒侵染，他们分别是马铃薯Y病毒属的洋葱黄矮病毒、韭葱黄条病毒、葱黄条病毒，香石竹潜隐病毒属的葱潜隐病毒、大蒜普通潜隐病毒、大蒜潜隐病毒，青葱X病毒属的大蒜A病毒、大蒜B病毒、大蒜C病毒、大蒜D病毒、大蒜E病毒和大蒜X病毒等侵染。它们均属于RNA病毒，目前未经选择的商品大蒜至少受以上两种病毒侵染，病毒之间常常表现为复合侵染，并难以通过提纯病毒的方法将他们分离。

现有技术中病毒检测的方法主要有四种，以大蒜为例来进行说明：第一，外观症状检测法。这个方法根据病毒侵染大蒜后在寄主植株上的外观症状进行识别，但是侵染大蒜的病毒种类多且往往是复合侵染，不同病毒在大蒜上表现相似的症状，造成田间症状复杂，有的甚至是不显示症状，不利于观察观察和判断，只能在病毒病害的田间做初步诊断。第二，指示植物鉴别法。这个方法利用病毒在一些模式植物上出现特征性症状，作为鉴别是否存在病毒侵染或某种病毒的依据。这种方法工作量大、检测时间长、灵敏度差，且病毒症状反应常受环境、土壤和气候条件的影响；有些病毒的寄主范围很窄，找不到合适的鉴别寄主；不同病毒在同种植物上常产生相同症状，同种病毒在植物的不同栽培品种上的症状也不尽一致；复合侵染及病毒卫星RNA会影响症状表现；还有一些病毒常会产生潜隐侵染现象，这些都在一定程度上制约了这种方法的应用。第三，电子显微镜法，这个方法利用电镜可以直观地观察病毒形态结构以及病毒侵染寄主后引起的细胞超微结构变化，可以较明确的显示超微结构水平的细胞病理变化。但这个方法对操作技术要求较高，电镜价格偏高，工作比较集中，同时处理的样本数量少。目前电镜分辨率,以观察到的病毒粒子大小只能判断到科或属，科属以下的分类则无法判定，不同球状病毒的形态大小比较相似,同样用电镜无法判定。此方法只能用于实验室少部分样本的检测，无法大量广泛应用。第四，分子生物学技术。分子生物学检测是以病毒核酸为基础的检测方法，目前，植物病毒检测与鉴定常用的分子生物学方法包括核酸分子杂交技术、dsRNA电泳技术、多聚酶链式反应技术、实时荧光定量PCR(qPCR)技术等。其中，双链RNA电泳技术需要一定的技术和知识才能进行准确诊断，且不适合大量样品和DNA病毒的检测。PCR的精确度有待提高，qPCR技术准确度较高，是目前较普遍的检测病毒的方法。但是，qPCR对引物的特异性要求高。针对大蒜各病毒，国内外有超过100对以上的大蒜病毒引物发表，但是对于不同地区或者大蒜品种没有普适性。大蒜在世界范围内分布广泛，所受侵染的病毒种类多，一对一对引物的的筛选和检测，浪费大量时间和金钱。此外，同属病毒之间同源性较高，特别是上面提到的侵染大蒜的青葱X病毒属病毒之间的同源性很高，这对qPCR引物的特异性要求很高。即使是同一病毒，其分布在不同区域，其基因序列也有差异。如2005年测定了侵染日本大蒜的3个韭葱黄条病毒病毒分离物基因组全序列，研究表明它们与中国韭葱黄条病毒分离物基因组全序列基因组序列不完全一致，他们之间的的同源性约为76％，编码蛋白氨基酸序列同源性约为81％。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用转录组测序全面快速检测大蒜RNA病毒的方法，解决现有技术中存在的病毒中提纯病毒困难、检测精度不高、假阳性高和成本较高的问题，为实现上述目的，我们提出的一种基于转录组测序，结合生物信息学分析和分子生物学技术的方法快速全面大量检测大蒜RNA病毒的方法，该方法灵敏度高，特异性强，检测全面、速度快，总体成本低，不需要提纯病毒，操作更简单。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

一种利用转录组测序全面快速检测大蒜RNA病毒的方法，其特征在于，提取侵染病毒的大蒜及所带病毒的RNA，构建测序文库后进行转录组测序，利用生物信息学分析方法分析大蒜中存在的病毒，设计特异的荧光定量PCR引物，检测待测大蒜样本中不同病毒的表达情况，获得检测结果。

本发明中，提取侵染病毒的大蒜及所带病毒的RNA，构建测序文库后进行转录组测序，利用生物信息学分析方法分析大蒜中存在的病毒，设计特异的荧光定量PCR引物的具体方法如下：

1)选取侵染病毒的大蒜样品提取RNA，将RNA片段化并进行反转录、扩增、变性、环化形成单链环状DNA，并进行测序；

2)过滤掉低质量、接头污染以及未知碱基N含量过高的序列，对过滤后的序列进行组装，然后将组装的转录本进行聚类去冗余，得到特异基因(Unigene)；

3)利用Blastx将特异基因与大蒜病毒蛋白数据库进行比对，查找比对到大蒜病毒蛋白数据库的蛋白并做病毒种类注释，根据比对到基因代号，查找对应的核苷酸序列，利用Blastp在NCBI上进行比对，根据同源性找到特异基因对应的大蒜病毒种类进行进一步确认病毒种类：

4)根据注释病毒种类的特异基因设计特异的荧光定量PCR引物。

本发明所用的大蒜样品可以为大蒜的任何一部分器官或组织，如茎尖、叶片、假茎、花序轴、根等，均可实现检测目的。

本发明从大蒜样品中提取RNA，可以选择现有技术中任何提取RNA的方法，如选择RNA提取试剂盒进行提取，或者选用Trizol法进行提取。

优选的，本发明步骤1)中提取的RNA需要满足以下全部条件RNA浓度≥250ng/μL，OD260/280＝1.8～2.2,OD230/260≥2.0，RIN值≥6.5，28S:18S≥1.0，以保证RNA的完成和测序文库的顺利构建。

本发明步骤1)中所用的反转录、扩增、变性、环化和测序方法可以为本领域的现有方法，如测序可以利用不同的转录组测序品台进行测序，如NextSeq,、Hiseq 2000、Hiseq4000或BGISEQ-500等，可以根据各个测序平台的试剂盒添加试剂，也可送样公司测序。

本发明步骤2)中的低质量是指质量值低于20，即一条序列中某位置出错概率高于1％的序列；接头污染是指接头中污染的碱基数大于5bp；未知碱基N含量过高是指未知碱基N含量大于5％。

本发明步骤2)对过滤后的数据进行组装可以为本领域现有的组装方法，如Trinity。

本发明步骤2)中将组装的转录本进行聚类去冗余可以为本领域的现有方法，如使用Tgicl将组装的转录本进行聚类去冗余。

本发明步骤3)大蒜病毒蛋白数据库可以从NCBI中下载所有属种的检测大蒜病毒的蛋白序列，构建大蒜病毒蛋白数据库。

本发明步骤4)根据注释病毒种类的特异基因设计特异的荧光定量PCR引物时，可以选择某病毒中特异性最高的2～6个基因进行设计。

本发明步骤4)引物设计方法可以利用本领域的现有方法，如利用BeaconDesigner设计定量引物，引物的参数优选为：引物长度18～24bp，扩增片段长度75～200bp，Ta值58～62℃。

本发明所述方法适用于所有受RNA病毒侵染严重特点，特别是大蒜，具有很好的特异性。也特别适合基因组测序尚未完成的物种，利用从头组装的生物信息学技术，同时获得大蒜和大蒜RNA的病毒序列，再通过比对后分类筛选。此外，对于病毒侵染较轻的病毒，带毒症状不明显的病毒，也可以精确检测出。

本发明可以通过设计多个特异的荧光定量PCR引物，实现同时检测多种病毒的目的。因此，本发明所述方法尤其适用于为了研究某区域某个特定品种大蒜病毒的分布情况的目的，利用本发明所述方法可以十分精确地检测到各种病毒的表达量，利用生物信息学分析组装的特异基因，利用已有的病毒数据库进行比对，分析大蒜群体里可能存在的病毒，利用qPCR进一步验证，快速全面大量的筛查大蒜的病毒分布。

本发明还提供一种更为具体的利用转录组测序全面快速检测大蒜RNA病毒的方法，包括以下步骤：

步骤(1)利用Trizol法提取大蒜和病毒的RNA：取0.05～0.1g新鲜或-70～-80℃保存的大蒜组织在液氮中研磨，加入0.9～1.1mlTrizol试剂，待充分裂解后离心取上清，氯仿抽提1～2次，离心后取上清，加入等体积预冷的异丙醇置于-10～-30℃20～40min沉降RNA，离心后用70～75％的乙醇洗2～3次，待沉降物自然干燥后，加入15～30ul无RNA酶的纯水中溶解；

步骤(2)RNA浓度和检测：检测总RNA浓度、RIN值、28S/18S和片断大小；选取总RNA浓度≥250ng/μL，OD260/280＝1.8～2.2,，OD230/260≥2.0，RIN值≥6.5，28S：18S≥1.0的样品用于后续实验；

步骤(3)测序文库构建：用带有OligodT的磁珠富集有polyA尾巴的RNA，把获得的RNA片段化，随机的测序专用引物进行反转录，再合成cDNA二链形成双链DNA，把合成的双链DNA末端补平并5’端磷酸化，3'端形成突出一个“A”的粘末端，再连接一个3'端有凸出“T”的鼓泡状的接头，连接产物通过特异的引物进行PCR扩增，PCR产物热变性成单链，再用一段桥式引物将单链DNA环化得到单链环状DNA文库；

步骤(4)转录组测序：检测DNA文库的浓度，根据各种测序平台(如Hiseq2000，BGISEQ-500)的说明书，取稀释到所需浓度的DNA文库，按量加样后进行测序；

步骤(5)转录组数据的过滤和从头组装：去除测序的原始数据中包含低质量、接头污染以及未知碱基N含量过序列，使用Trinity对过滤后的数据进行从头组装，然后使用Tgicl将组装的转录本进行聚类去冗余，得到Unigene。

步骤(6)数据库比对；利用Blastx将组装后Unigene与大蒜病毒蛋白数据库进行比对，查找比对到大蒜病毒蛋白数据库中的Unigene编号，根据Unigene对应的核苷酸序列，利用Blastp在NCBI上进行比对，再次确认Unigene对应的大蒜病毒种类；

步骤(7)荧光定量PCR引物：根据以上被检测出各病毒每个病毒特异的Unigene设计荧光定量PCR引物；

步骤(8)多样本多病毒的检测：从不同样品中提取RNA，反转录为cDNA，根据以上的荧光定量PCR引物检测不同样本不同病毒基因表达情况；

本发明步骤(1)中选择可以侵染病毒的大蒜的多个特定的组织作为材料提取RNA，优先选择症状明显的带毒大蒜叶片组织提取RNA。

本发明步骤(1)中可以选择RNA提取试剂盒抽提高质量的RNA。

本发明步骤(2)中的对测序文库对原始RNA样本的要求较高，因此选择RNA浓度≥250ng/μL，OD260/280＝1.8～2.2,OD230/260≥2.0,RIN≥6.5，28S：18S≥1.0的样品用于后续实验。

本发明步骤(4)中可以利用不同的转录组测序品台进行测序，如NextSeq,Hiseq2000,Hiseq4000,BGISEQ-500等，根据各个测序平台的试剂盒添加试剂，也可送样公司测序。

本发明步骤(6)中在NCBI中下载所有属种检测大蒜病毒的蛋白序列，构建大蒜病毒蛋白数据库。

本发明步骤(7)根据比对结果，选择病毒中特异性最高的2～6个基因，利用设计荧光定量PCR引物，参数为：引物长度18～24bp，扩增片段长度75～200bp，Ta值58～62℃最佳。

本发明步骤(8)中选择大蒜的内参基因作为内参，根据溶解曲线判断引物的特异性，检测大蒜病毒基因的表达量。

本发明所述方法基于转录组测序的转录组技术，利用从头组装和蛋白比对等生物信息学分析方法，筛选大蒜病毒特异表达基因，设计大蒜病毒的荧光定量PCR引物，短时间内快速全面检测大蒜病毒。这个方法灵敏度高、特异性强、检测全面、速度快、总体成本低，可大规模应用于商业化大规模病毒检测、科学研究、病毒口岸和产地检疫，本发明的有益效果：

1、取材广泛：大蒜病毒在叶片中表现最为明显，普通的大蒜病毒检测需要选择病毒病症十分严重的大蒜叶片作为检测材料。本发明所述方法中，可以选择带毒大蒜的任何一部分器官或组织用于病毒检测，如蒜瓣的茎尖、贮藏叶，或者大蒜苗的叶片、假茎、花序轴、根等。

2、灵敏度和检测精度高：一些隐性形状的大蒜病毒、侵染大蒜后没有容易观察到的症状的病毒、对大蒜侵染程度较低的病毒等，均可以利用本发明所述的方法精确检测出其基因表达的情况。

3、取样少：本发明所述方法从大蒜样品中提取RNA进行检测时，只需0.1g大蒜样品来提取RNA即可进行后续实验。

4、特异性强：测序后重新组装的基因都是特异的，避免了同属病毒之间同源性高，qPCR引物不特异的情况，保证了检测的特异性。

5、检测全面：利用一次测序可以检测一株或者一个群体的中可能存在的所有RNA病毒。

6、操作简单：此方法不需要繁复的提纯病毒。

7、检测的样本数量大、检测速度快、省时：利用转录组数据分析后结果设计荧光定量PCR引物，一台384孔板的荧光定量PCR仪1小时左右可以检测384个样品。

8、总体检测成本降低：随着测序平台的进步，测序成本大大降低，检测一个样品的单价近三年来降低了4倍以上，一个样品测序单价在1000-2000元/样。随着后期荧光定量PCR检测样品的数量增加，总体检测成本大大降低，十分适合病毒检测的商业化应用。

附图说明

图1转录组测序检测大蒜RNA病毒的流程图；

图2Unigene的长度分布图。X轴代表Unigene长度，Y轴代表相应Unigene的数目；

图3大蒜韭葱黄条病毒的Unigene2294荧光定量PCR的溶解曲线；

图4大蒜洋葱黄矮病毒的Unigene2923荧光定量PCR的溶解曲线；

图5大蒜大蒜病毒X的CL1251.Contig3荧光定量PCR的溶解曲线；

图6大蒜大蒜病毒A的CL2665.Contig1荧光定量PCR的溶解曲线；

图7大蒜大蒜病毒A的CL2851.Contig2荧光定量PCR的溶解曲线；

图8大蒜大蒜潜隐病毒的CL1018.Contig1基因荧光定量PCR的溶解曲线。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1：

如图1所示实验方法：2016年10月01日，江苏南京农业大学牌楼基地大棚种植贵州麻江红蒜，2017年5月1号，从田间取麻江大蒜单株上分别取3个0.1g叶片，存于冻存管，迅速置于液氮中，带回实验室，加入液氮充分研磨，后加入1ml Trizol裂解液，剧烈摇晃后置于室温静置10min，之后置于4℃预冷的离心机中12000rpm离心5min，取900ul上清，加入180ul氯仿，剧烈震荡后，置于4℃预冷的离心机中12000rpm离心10min后，小心取上清约800ul上清，加入160ul上清，置于4℃预冷的离心机中12000rpm离心10min后，小心去600ul上清，加入600ul遇冷的异丙醇(无RNA酶)，充分混匀后置于-20℃冰箱，30min待RNA沉淀析出后，置于4℃预冷的离心机中12000rpm离心10min后，弃上清，之后加入1ml 70％的乙醇(无RNA酶)，斡旋后静置1分钟，置于4℃预冷的离心机中12000rpm离心5min后，弃上清，之后加1ml70％的乙醇，斡旋后静置1分钟，置于4℃预冷的离心机中12000rpm离心5min后，弃上清，待沉淀物自然干燥后，加入30ul无RNA酶的纯水中溶解。

使用Qubit 3.0检测RNA浓度：200ul缓冲液中加入1ul RNA专用染料，混匀离心后弃1ul，加入1ulRNA样品，静置两分钟，检测RNA浓度。使用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent RNA 6000Nano Kit)检测total RNA的浓度、RIN值、28S/18S和片断大小。选择质量较好(RNA浓度≥250ng/μL，OD260/280＝1.8～2.2,OD230/260≥2.0,RIN≥6.5，28S：18S≥1.0)的5个样本(表1)，每个样品中取5ngRNA，等量混合成测序样本。

表1测序用RNA样本质量

用带有OligodT的磁珠富集有polyA尾巴的mRNA的方法对RNA进行处理，用打断缓冲液把获得的RNA片段化，随机的N6引物进行反转录，再合成cDNA二链形成双链DNA，把合成的双链DNA末端补平并5’端磷酸化，3'端形成突出一个“A”的粘末端，再连接一个3'端有凸出“T”的鼓泡状的接头，连接产物通过特异的引物进行PCR扩增，PCR产物热变性成单链，再用一段桥式引物将单链DNA环化得到单链环状DNA文库。

利用BGISEQ-500上机测序。去除包含接头的序列，去除未知碱基N含量大于5％的reads；去除低质量的reads。我们使用Trinity对过滤后的序列进行从头组装,然后使用Tgicl将组装的转录本进行聚类去冗余，得到Unigene。两个软件的版本的参数如表2：

表2 Trinity和Tgicl软件的参数

查阅文献，查找大蒜相关所有病毒的蛋白序列，建立大蒜病毒蛋白数据库，利用Blastx比对后查找大蒜病毒相关的特异基因序号，根据对应的序列，在NCBI上利用Blastp比对到所有核苷酸的序列。根据比对到的特异基因的序列，利用Beacon Designer设计荧光定量引物，参数设置为：引物长度18～24bp，扩增片段长度75～200bp，Ta值58～62℃。选择测序用的5个样本进行qPCR试验，ABI Quantstudio 3.0的仪器程序设置为95℃10min,然后95℃15秒、60℃3秒s循环40次，溶解曲线设置为95℃15秒，60℃1分钟,然后95℃1秒。

从每个基因的引物中筛选出最后的一对作为检测某个病毒特异的引物。按照以上方法和要求大规模提取96个麻江大蒜的叶片RNA，质量检测合格后，反转录为cDNA，按照以上方法设置qPCR程序，分析数据。实验结果如表3所示：

表3过滤后的reads质量统计

使用BGISEQ-500平台一共测了6.58Gb数据。其中过滤后的序列中质量值大于20和30的碱基数占总碱基数的百分比分别为97.65％和90.82％，说明测序质量很好。

表4转录本和unigene的质量指标

表注：N50：用于衡量组装的连续性，数值越大说明组装效果越好，计算方法为：按转录本长度从大到小排序后逐个累加至所有转录本总长度的50％时，最后一个累加的数值大小即为N50；N70：参考N50；N90：参考N50。

对于无参考基因组的大蒜，过滤原始数据后，对过滤后的数据进行拼接以获取后续分析的参考序列。Unigene的长度分布见图2，Unigene躲在300-3000bp之间。组装后获得转录本和Unigene的数目分别为72770和52697(表4)。按转录本长度从大到小排序后逐个累加至所有转录本总长度的50％时，最后一个累加的数值大小即为N50，N50用于衡量组装的连续性，数值越大说明组装效果越好。转录本和特异基因的N50数值分别达到870和972，说明组装效果较好。组装并去冗余后得到52,697个Unigene，总长度、平均长度、N50以及GC含量分别为35,395,014bp、671bp、972bp和41.43％。

表5转录组中各大蒜病毒的特异基因数量

将Unigene比对到大蒜病毒数据库进行注释，发现37个Unigene可以比对到打算的6个五中的大蒜病毒库(表5)。

表6根据Unigene设计的大蒜病毒检测荧光定量PCR引物

根据Unigene设计15对荧光定量PCR引物，具体序列见表6。

表7筛选后的6种大蒜病毒的荧光定量PCR引物

如表7所示，选取多个大蒜cDNA等量混合的样品进行大蒜PCR检测，每对引物的溶解曲线见图3-图8，每对引物均只有一个单峰，说明引物是特异的，且大蒜中含有此类病毒。每个基因中筛选一对引物作为病毒检测的基因。

表8 96个大蒜样品中大蒜病毒的检测

取96个大蒜单株RNA反转录cDNA后，qPCR检测病毒种类，检测结果发现，所有植株均含有大蒜病毒，且大部分病毒含有至少5种病毒(表8)。

Claims (5)

1.一种利用转录组测序全面快速检测大蒜RNA病毒的方法，其特征在于，具体方法如下：

1）选取侵染病毒的大蒜样品用Trizol法提取RNA，将RNA片段化并进行反转录、扩增、变性、环化形成单链环状DNA，并进行测序；提取的RNA需要满足以下全部条件RNA浓度≥250ng/μL，OD260/280=1.8～2.2, OD230/260≥2.0，RIN值≥6.5，28S:18S≥1.0；

2）过滤掉低质量、接头污染以及未知碱基N含量过高的序列，对过滤后的序列进行组装，然后将组装的转录本进行聚类去冗余，得到特异基因（Unigene）；

3）利用Blastx将特异基因与大蒜病毒蛋白数据库进行比对，查找比对到大蒜病毒蛋白数据库的蛋白并做病毒种类注释，根据比对到基因代号，查找对应的核苷酸序列，利用Blastn在NCBI上进行比对，根据同源性找到特异基因对应的大蒜病毒种类进行进一步确认病毒种类：

4）根据注释病毒种类的特异基因设计特异的荧光定量PCR引物。

2.根据权利要求1所述的利用转录组测序全面快速检测大蒜RNA病毒的方法，其特征在于，所述大蒜样品为茎尖、叶片、假茎、花序轴或根。

3.根据权利要求1所述的利用转录组测序全面快速检测大蒜RNA病毒的方法，其特征在于，步骤2）中的低质量是指质量值低于20，即一条序列中某位置出错概率高于1%的序列；接头污染是指接头中污染的碱基数大于5bp；未知碱基N含量过高是指未知碱基N含量大于5%。

4.根据权利要求1所述的利用转录组测序全面快速检测大蒜RNA病毒的方法，其特征在于，步骤4）根据注释病毒种类的特异基因设计特异的荧光定量PCR引物时，选择病毒中特异性最高的2~6个基因进行设计。

5.根据权利要求1所述的利用转录组测序全面快速检测大蒜RNA病毒的方法，其特征在于，步骤4）引物设计时，引物的参数为：引物长度18~24bp，扩增片段长度75~200bp，Ta值58~62℃。

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